SARS-CoV-2 S protein x hemagglutinin

摘要：疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病负担方面发挥着重要作用。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限的资源下迅速设计和生产出安全有效的疫苗。在这里，我们关注从传统的预防性疫苗到针对慢性疾病和癌症的治疗性疫苗的广泛领域的疫苗开发，提供了八种不同疫苗形式（减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗）以及针对五种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌）、三种传染病（人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒引起的疾病）和三种常见慢性疾病（高血压、糖尿病和血脂异常）的治疗性疫苗的最新进展的全面概述。我们旨在提供有关疫苗技术、平台、应用和潜在下一代预防性和治疗性疫苗技术的新的见解，为未来疫苗设计铺平道路。 1.引言 疫苗接种是保护易感人群和控制传染病最经济有效的手段。因此，疫苗被认为是20世纪十大公共卫生成就之一。疫苗的使用使人类能够在全世界范围内根除天花，消除大多数国家的脊髓灰质炎，并控制白喉、百日咳、破伤风、腮腺炎、麻疹、风疹、流感嗜血杆菌B型等传染病，在世界部分地区显著降低了发病率和死亡率。然而，由SARS-CoV-2引起的当前COVID-19大流行已导致超过5亿确诊病例和超过600万人死亡。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限资源下迅速开发安全有效的疫苗。此外，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和Epstein-Barr病毒（EBV）在内的几种由传染性病原体引起的严重疾病尚未开发出疫苗，需要新的疫苗开发策略。总的来说，疫苗使人们能够过上更健康、更长寿的生活。然而，随着预期寿命的增加，非传染性疾病（NCDs）的负担，如癌症、自身免疫疾病、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病等，已经增加。NCDs，也称为慢性疾病，是由遗传疾病以及生理、环境和生活方式因素的组合引起的，并且可以持续很长时间。根据世界卫生组织报告，每年有4100万人死于NCDs，占全球死亡人数的71%。这种疾病负担的转变加剧了治疗NCDs的疗法的迫切需求。传统的预防性疫苗通过向健康个体接种抗原来预防疾病，从而建立特异性免疫，这主要发生在传染病上。治疗性疫苗用作暴露后治疗，以增强免疫系统对抗诸如慢性感染、癌前病变或癌症等先前存在的疾病。治疗性疫苗旨在调节人体免疫系统，并诱导细胞介导的免疫反应，以针对与NCDs相关的细胞或分子，而不是病原体或病原体感染的细胞。治疗性疫苗与预防性疫苗在一些重要方面有所不同。由于预防性疫苗通常给予健康人，这些人对不良事件的容忍度很低。相比之下，治疗性疫苗通常是暴露后治疗，并且患者高度耐受。成熟的传统疫苗和快速增长的新型疫苗技术促进了全球预防性和治疗性疫苗的开发。近年来，免疫学、分子生物学和基因组学的进步导致了更有效的疫苗成功。mRNA疫苗（Comirnaty、Spikevax、AWcorna）和病毒载体疫苗（Convidecia、AZD1222、Ad26.COV2.S）针对COVID-19大流行，是有史以来开发最快的疫苗。肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗（Prevnar13、Prevnar 20）基于蛋白结合疫苗技术。人乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Gardasil、Gardasil 9、Cervarix、Cecolin和Wozehui），基于基因工程技术设计，通过表达病毒样颗粒（VLP）预防与HPV相关的癌症。脑膜炎球菌B型疫苗（Trumenba、Bexsero）代表了从基因组到疫苗的“反向疫苗学”策略。最后，新型佐剂重组带状疱疹疫苗，Shingrix，扩大了免疫功能低下人群的免疫力。疫苗的不断发展提高了我们对免疫学和免疫基础的理解，针对NCDs的疫苗成为研究的新“热点”。目前，有前列腺癌疫苗（Provenge）、膀胱癌疫苗（TheraCys）、结肠癌疫苗（OncoVAX）、黑色素瘤疫苗（M-VAX和Melacine）、肾细胞癌疫苗（Oncophage）、肺癌疫苗（Racotumomab和CIMAvaxEGF）等。此外，治疗性疫苗在高血压、慢性乙型肝炎等疾病领域也取得了巨大进展。本综述旨在提供我们对最新疫苗技术、平台、应用和潜在下一代疫苗技术的当前进展和理解的概述。本综述将讨论预防性疫苗和治疗性疫苗。根据疫苗的成分，预防性疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、多肽疫苗、DNA和mRNA疫苗。此外，根据疾病分类，治疗性疫苗可分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性疾病的疫苗。我们相信，本综述将为疫苗技术和开发提供见解。 2.预防性疫苗开发的进展 2.1.减毒活疫苗 减毒活疫苗是通过保留抗原性但通过化学或其他方法遗传工程改造或减毒（减弱）的有机体创建的。通常，这些疫苗能够诱导具有长期持久性的体液和细胞免疫反应；然而，仍然存在毒力逆转的风险，这使得疫苗不适合对抗高度致病性变体。此外，减毒疫苗的有效期较短，热稳定性差，对储存和运输有严格的要求；这在大流行情况下会导致响应缓慢。由于减毒疫苗可能恢复到有毒形式，它们也可能在免疫功能低下的人中引起严重疾病。尽管存在这些问题，并且因为好处大于风险，减毒活疫苗仍然是疫苗开发中一个宝贵的平台。目前许可的减毒疫苗列表包括天花（牛痘）（ACAM2000）、麻疹、腮腺炎和风疹病毒（M-M-RII）、结核病（卡介苗（BCG））、霍乱（Vaxchora）、流感（FluMist）、登革热（Dengvaxia；四价）、轮状病毒（Rotarix）、水痘病毒、伤寒（Vivotif）、黄热病（YF-Vax）等等（表1）。 表1 中国目前许可的疫苗类型 根据世界卫生组织发布的一份文件（https://www-who-int.libproxy1.nus.edu.sg/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines），有两种减毒活COVID-19疫苗正在进行临床试验：由Codaenixin与印度血清研究所合作开发的COVI-VAC，以及由Meissa Vaccines，Inc.开发的MV-014-212。正在进行研究以提高减毒活疫苗的安全性并进一步减少其毒力；这通过增加复制保真度、通过密码子去优化以及通过病毒基因组的工程改造进行了测试。Vignuzzi等人试图利用通过增加复制保真度限制病毒种群多样性的观察，这可以显著降低组织嗜性和病毒致病性。结果表明，在动物感染模型中，具有减少遗传多样性的脊髓灰质炎病毒变种激发了保护性免疫反应。这种限制病毒准种群多样性为RNA病毒的稳定减毒疫苗工程提供了一种新方法。密码子对去优化（CPD）是另一种有效的病毒减毒策略，它利用次优密码子对来减毒重编码病毒。Groenke等人通过改变同步密码子的位置，在重编码基因组中增加了次优密码子对和CpG二核苷酸的数量。他们在流感A病毒上的研究显示，次优密码子对引起了减毒，而CpG二核苷酸比例的增加没有效果。此外，他们表明次优密码子对可以降低去优化密码子对mRNA的稳定性和翻译效率。因此，蛋白质产量的减少直接导致病毒减毒。最近，Trimpert等人构建了一个COVID-19候选减毒活疫苗，名为sCPD9，通过大规模编码SARS-CoV-2基因组（通过CPD方法修改），并在罗布罗夫斯基矮仓鼠中评估了疫苗的免疫原性和保护效果。作者表明，sCPD9的单次鼻内接种激发了针对当前四个SARS-CoV-2变体的交叉中和抗体反应：B.1.1.7（阿尔法）、B.1.351（贝塔）、B.1.1.28.1（伽马）和B.1.617.2（德尔塔），保护免受类似COVID-19的疾病。一种减毒活COVID-19疫苗，COVI-VAC，通过使用同义次优密码子对编码病毒刺突蛋白的一部分而开发。作者发现，该疫苗在仓鼠模型中刺激了高水平的中和抗体，高度减毒的COVI-VAC在单次鼻内剂量下具有保护性。该疫苗现在正在进行III期临床试验（ISRCTN15779782）。安伯（amb）突变是使减毒活疫苗更安全、更有效的一种新策略。这种方法通过将遗传密码扩展到流感病毒基因组中，显示出在产生活体但复制无能力的病毒疫苗方面的前景。研究人员通过含有正交翻译机制的转基因细胞系扩展了流感A病毒基因组的遗传密码。这种方法在转基因细胞系中创建了早终止密码子（PTCs）——携带病毒足够具有感染力但在常规细胞中无法复制，同时在转基因细胞系中产生高繁殖力和遗传稳定的后代病毒。在小鼠、雪貂和豚鼠模型中，这种活疫苗激发了对亲本和抗原性不同的菌株的强大免疫反应。另一种有前景的基因工程减毒病毒的方法是工程化病毒基因组。研究人员报告了一种脊髓灰质炎病毒2型疫苗株（nOPV2）的开发，他们在其中引入了对Sabin2基因组的50个非翻译区域的修改，以稳定减毒决定因素。在这种方法中，2C编码区域防止重组，3D聚合酶限制了病毒的适应性。这种菌株在遗传上比原始的Sabin2菌株更稳定，不太可能恢复毒力。在临床前和临床研究中，nOPV2具有免疫原性，并可能导致脊髓灰质炎病毒的完全根除。另一组合理设计了一种减毒水痘疫苗候选物，v7D，其中删除了毒力因子ORF7。该病毒在MRC-5成纤维细胞和人类PBMC（VZV传播载体）中的复制类似于野生型病毒，但在感染人类皮肤和神经细胞时严重受损。然而，v7D在体外和各种小动物中具有与vOka相当的免疫原性。最后，v7D在非人类灵长类动物中耐受性良好且具有免疫原性。这种疫苗目前正在中国进行II期试验（ChiCTR1900022284）。未来减毒疫苗的开发应该专注于选择更稳定的病毒株，并采用基因编辑策略来稳定减毒因素。 2.2.灭活疫苗 灭活疫苗是从病原体（如病毒或细菌）的灭活形式中提取的，这些病原体经过培养后，通过物理或化学方法灭活，使其不再具有传染性或毒性。灭活疫苗包括全灭活疫苗或部分灭活疫苗（Toxoid疫苗）。Toxoid疫苗使用细菌产生的灭活毒素，这些毒素的毒性已被抑制，但保留了免疫原性。与减毒疫苗和基因工程疫苗相比，灭活疫苗具有开发周期短、生产工艺相对成熟、非传染性、高安全性等优点。灭活疫苗的生产成本通常较低，并且由于它们耐温，可以长时间储存。灭活疫苗通常诱导体液免疫反应，而细胞免疫较弱。通常需要多次接种才能产生保护性免疫，从而降低疫苗依从性。在灭活过程中，病毒抗原可能在结构上受损，导致抗原性降低，疫苗的免疫原性降低。有许多批准的灭活疫苗：代表性的例子包括甲型肝炎病毒疫苗（HAVRIX和VAQTA）、脊髓灰质炎病毒疫苗（IPOL）、日本脑炎病毒（IXIARO）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳（INFANRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳吸附和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（KINRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗吸附（DAPTACEL）疫苗、流感疫苗（Fluarix四价）、人类狂犬病疫苗（RabAvert和Imovax）、肠道病毒71型（Inlive）、肾综合征出血热疫苗、蜱传脑炎疫苗（FSME-Immun），以及COVID-19疫苗（CoronaVac、WIBP-CorV、BBIBP-Cor）（表1）。在撰写本文时，全球已有11种针对COVID-19疾病的灭活疫苗获得有条件或紧急使用批准（包括中国5种疫苗）。从其他病原体研究中，已开发出一种寨卡病毒灭活疫苗候选物（PIZV）。在两次免疫剂量后，含铝佐剂的候选PIZV在CD-1和AG129小鼠中显示出高度免疫原性，从而支持PIZV候选物进入临床开发（NCT03343626）。历史上，手足口病（HFMD）的爆发主要由肠道病毒71和柯萨奇病毒A16引起。最近，柯萨奇病毒A6和A10与全球散发HFMD病例和爆发的增加有关。在一项研究中，柯萨奇病毒A6、A10和A16（CA6、CA10和CA16）在不同条件下通过甲醛或b-丙内酯（BPL）灭活，并检查了免疫效果。作者发现，CA10和CA16在BPL灭活（BI）后的免疫效果优于甲醛处理。此外，双三价治疗诱导了足够的中和抗体和细胞介导的免疫反应，表明BI-CA6、CA10和CA16作为潜在的多价疫苗候选物。灭活疫苗平台相对成熟，高度安全，可用于快速应对新出现的病原体，因此对于应对爆发至关重要。 2.3.多糖和多糖-蛋白结合疫苗 多糖疫苗是由基于碳水化合物的聚合物制成的，如来自细菌病原体的荚膜结构的壁酸或肽聚糖。一些针对细菌荚膜多糖的疫苗，例如脑膜炎球菌A/C/Y/W-135疫苗（Meningune-A/C/Y/W-135）、肺炎球菌疫苗（Pneumovax 23）和伤寒Vi多糖疫苗（Typhim Vi）（表1），已被批准用于预防侵袭性脑膜炎和伤寒疾病。然而，由于多糖不像蛋白质那样在主要组织相容性复合体（MHC）分子上被处理和展示，多糖疫苗通常显示出较弱的免疫原性、持久性差，并且只产生T细胞非依赖性免疫反应。没有T细胞的参与，这些疫苗不会引起记忆免疫反应或亲和力成熟，并且诱导的抗体——主要是IgM和IgG2——不适合激活补体，导致免疫保护无效且短暂。 多糖结合疫苗可以克服多糖疫苗的缺点。多糖结合疫苗是通过将病原体的荚膜多糖共价连接到蛋白载体上制备的，例如白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、改良的白喉毒素称为CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物（OMPC）或H. influenzae蛋白D HiD。蛋白载体和多糖同时出现在MHC-II上，导致T细胞受体（TCR）识别并激活Th反应。Th与B细胞之间的相互作用将改善和塑造抗体的滴度和质量以及B细胞记忆反应。共价结合方法包括标准化学交联和生物结合技术。目前批准的多糖结合疫苗通常是通过化学方法生产的，包括肺炎球菌13价、15价和20价结合疫苗（Prevnar 13, Vaxneuvance, Prevnar 20）、B型流感嗜血杆菌结合疫苗（Liquid PedvaxHIB, HIBERIX, ActHIB）和两种脑膜炎球菌结合疫苗（A, C, Y, W, MenQuadfi；A, C, Y和W-135, MENVEO, Menactra）（表1），等等。最近，Enotarpi等人报告了使用MenA，一种稳定的糖模拟结合疫苗，诱导针对A群脑膜炎奈瑟菌的保护性抗体。该团队生成了一系列未乙酰化的carbaMenA寡聚体，这些寡聚体被证明比荚膜多糖（CPS）更稳定，并表明八聚体（DP8）的随机O-乙酰化改善了抗MenA CPS抗体结合的抑制，并在与CRM197结合后诱导了抗MenA保护性小鼠抗体。这种方法可用于生成稳定的新糖结合疫苗。 生物结合技术允许多糖和载体蛋白在微生物内生物合成，通常是大肠杆菌。然后通过来自N-连接蛋白糖基化系统的特定寡糖转移酶在体内偶联蛋白质。近年来，生物合成因其经济性、快速性和效率而受到青睐。由这项技术生产的第一种多糖结合疫苗候选物是志贺氏菌多糖结合疫苗（GVXN SD133），由瑞士GlycoVaxyn AG开发，已完成I期临床试验（NCT01069471）。研究证明了GVXN SD133疫苗的良好安全性，所有测试剂量均能引起对志贺氏菌O1多糖的显著体液反应。蛋白载体也产生了功能性抗体，证明了这种新技术在保持碳水化合物和结合蛋白表位方面的优势。另一种针对志贺氏菌flexneri 2a（Flexyn2a）的生物结合疫苗在I期研究（NCT02388009）的所有时间点和所有组别中，接种后均引起了统计学上显著的S. flexneri 2a脂多糖（LPS）特异性体液反应。结果表明Flexyn2a具有令人满意的安全性，产生了强大的体液反应。这种疫苗目前正在进行IIb期（NCT02646371）。总体而言，多糖结合疫苗平台比其他平台显示出更多的潜力，并提供了解决细菌疫苗紧迫问题和挑战的解决方案，通过逐步使用生物合成技术。 2.4.重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗采用基因工程方法，在合适的宿主细胞中表达病原体特异性基因，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。重组亚单位疫苗通常具有良好的安全性和稳定性。然而，由于外源蛋白通常显示MHC II类反应，通常不会产生强烈的T细胞反应，因此需要佐剂刺激和多次接种以增强免疫原性，这可能不适用于呼吸道黏膜免疫。目前批准的人类重组亚单位蛋白疫苗包括流感疫苗（FluBlok）、带状疱疹疫苗（Shingrix）、脑膜炎球菌B群疫苗（Trumenba、Bexsero）和COVID-19疫苗（ZF2001、Nuvaxovid）（表1）。近年来，随着反向疫苗学、结构生物学、基因组学和蛋白质组学理论和技术的进步，重组亚单位疫苗免疫原逐渐进入理性设计的新时代。反向疫苗学的过程是利用自下而上的方法从基因组到疫苗开发疫苗。2013年批准的Bexsero脑膜炎B群疫苗是反向疫苗学的经典案例。它基于对致病微生物的关键保护或毒力抗原的全基因组预测和筛选，然后开发新疫苗；这样的例子包括三个抗原：淋病奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）、因子H结合蛋白（fHbp）和淋病奈瑟菌粘附素A（NadA）。Shingrix是葛兰素史克开发的重组亚单位佐剂疫苗，由水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE重组蛋白组成，并补充了新的佐剂AS01B。对带状疱疹的整体疫苗效力在老年人（≥50岁）中为97.2%。Shingrix的成功强调了佐剂在疫苗开发中的关键作用。NVXCoV2373（Nuvaxovid）是一种含有昆虫细胞表达的S-三聚体和Matrix-M佐剂的重组蛋白疫苗。最近的临床结果显示，该疫苗对任何关注或感兴趣的变体的疫苗效力为92.6%。结核病亚单位疫苗M72/AS01E（葛兰素史克）包含两个M72重组融合免疫原（MTB32A和MTB39A）与佐剂系统AS01E结合，并为M. tuberculosis感染、HIV阴性成年人提供约50%的疾病进展到活动性肺结核的保护约3年。此外，另一种重组亚单位结核病疫苗（GamTBvac）被证明由两个结核分枝杆菌抗原融合（Ag85A和ESAT6-CFP10）组成，与明胶结合域固定在明胶上，并与由DEAE-明胶核心和CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）组成的佐剂混合。II期的结果显示出有希望的安全性和耐受性，诱导了抗原特异性干扰素-γ反应、表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞和IgG反应。结构生物学也有助于疫苗的理性设计。RSV表面融合（F）蛋白存在于两种构象中：前融合（pre-F）和后融合（post-F）构象。基于前F和抗体的高分辨率复合物结构，F蛋白被修改以在前融合状态下稳定（DS-Cav1）。I期临床显示，针对前融合特异性表面RSV F的血清抗体的中和活性增加了10倍以上。其他人设计并获得了一种基于结构探究的稳定RBD-sc-dimer疫苗分子。RBD的C末端的N602残基与另一个RBD的N末端串联设计，提高了RBD二聚体的稳定性和中和抗体反应。根据官方报告，疫苗的III期临床数据显示，该疫苗对18岁及以上人群的任何严重程度的COVID-19的保护效力为81.43%（NCT04646590）。这些结果代表了基于结构的疫苗设计的临床证据，预示着精准疫苗学的新时代的曙光。重组亚单位疫苗平台具有技术优势，如安全性和效率，以及良好的稳定性和成熟的产业。然而，安全有效的佐剂对提高疫苗效力至关重要。结构生物学、反向疫苗学和新型佐剂的新技术将促进重组蛋白疫苗的设计。 2.5.病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗 病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米尺寸（20-200纳米）颗粒，它们的结构和免疫原性与天然病毒相似。VLPs不包含病毒遗传物质，因此可以模拟病毒抗原性而不具致病性。VLPs具有高度重复的抗原表位阵列，有利于被树突状细胞（DCs）吞噬并呈现给MHC I类和II类分子。它们可以激活身体，诱导强烈的细胞和体液免疫反应，使其成为疫苗开发的理想平台。目前批准的VLPs疫苗包括乙型肝炎疫苗（Hepavax-B、Engerix-B、Recombivax HB、HBVaxPro、Heplisav-B、Fendrix、Hepavax-Gene）、HPV疫苗（Cervarix、Gardasil、Gardasil 9、Cecolin和Wozehui）、乙型肝炎E疫苗（Hecolin）、疟疾疫苗（Mosquirix）和COVID-19疫苗（Covifenz）（表1）。此外，多种基于VLPs的预防性疫苗已进入临床试验阶段，主要针对诺如病毒、轮状病毒、BK多瘤病毒、狂犬病、RSV、HIV、流感病毒等。疟疾疫苗的研发仍然是一个巨大的挑战。GSK的科学家使用截短的环孢子蛋白（CSP）结合乙型肝炎表面抗原（HBsAg）生成名为RTS的蛋白质。然后，RTS与另一个游离的HBsAg在酵母细胞中共表达，生成RTS,S VLPs。然而，尽管RTS,S/AS01的三剂疫苗最初对临床疟疾具有一定的保护作用，但疫苗的效力随时间减弱，在高于平均水平的疟疾寄生虫暴露中效果较差。然而，RTS,S疫苗的开发大大提高了我们实现开发有效安全疟疾疫苗的长期目标的机会。最近，提出了VLPs的嵌合设计，以保护免受多型病原体的侵害。作者用系统发育上密切相关的环区域替换了HPV L1环区域。HPV33/58/52 VLPs的三型嵌合体在小鼠和非人灵长类动物中诱导的中和滴度与三种野生型VLPs混合物相当。作者目前正在开发基于这一策略的七种交叉疫苗，针对20种HPV变体。Medicago Inc.开发的一种基于植物的VLPs COVID-19疫苗最近在加拿大获得授权使用。该疫苗含有SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（原始菌株）的VLPs以及AS03佐剂，显示出71%的效力，保护18至64岁的试验参与者（https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines/medicago.html）。 纳米颗粒疫苗（NPVs）使用纳米材料作为载体、链接器或免疫调节剂，通过物理或化学方法将特定抗原和佐剂连接起来。这种基于纳米载体的传递系统可以保护疫苗免于过早降解，提高其稳定性，并促进免疫原传递到抗原呈递细胞（APCs），特别是DCs。此外，纳米颗粒提供了合适的疫苗给药途径，并增强了具有缓慢释放特性的抗原摄取，从而产生强烈的体液、细胞和粘膜免疫反应。纳米颗粒可以来自脂质体、VLPs以及金属或非金属无机、聚合物和脂质。但与其他疫苗候选物一样，NPVs的生产充满了许多困难和挑战。例如，一些NPVs可能会引发系统性或局部炎症反应，而一些纳米材料会在细胞中积累，导致其在体内长期保留，可能导致血管血栓形成。此外，在生产和储存成本方面仍存在一些限制。 自组装蛋白支架也在疫苗开发中得到广泛应用；例如I53-50、铁蛋白、mi3和IMX313颗粒。I53-50是通过计算工程设计的双组分蛋白，可自组装成二十面体纳米颗粒。该系统已用于RSV、流感病毒和HIV疫苗的开发，这些I53-50疫苗候选物在动物模型中诱导了强烈的抗体反应。在COVID-19疫苗开发中，一种多价SARS-CoV-2刺突受体结合域纳米颗粒（RBD-NP）疫苗在小鼠中显示出保护作用，仅需一次免疫。这种RBD-NP疫苗在非人灵长类动物中引发了多样化的多克隆抗体反应，目前正在进行临床试验（NCT04742738，NCT05007951）。另一项研究展示了一种疫苗，该疫苗显示了SARS-CoV-2刺突蛋白的多个副本，以诱导强烈的中和抗体反应，从而提供对高剂量SARS-CoV-2挑战的保护。铁蛋白是一种天然蛋白笼，由24聚体结构组成，具有八个三重轴，可用于展示三聚体抗原，如流感血凝素（HA）或HIV Env蛋白。一种基于铁蛋白的疫苗候选物目前正在进行针对EBV（传染性单核细胞增多症、各种癌症和自身免疫疾病的原因）的I期临床试验（NCT04645147）。一些COVID-19疫苗也被设计为使用铁蛋白来展示RBD或刺突三聚体，形成纳米颗粒，这两种疫苗候选物在临床前研究中都显示出了提高的抗体反应。最后，mi3 NP是理性设计的i301纳米笼的突变形式，显示出比原始形式更高的产量、均匀性和稳定性。基于RBD的mi3疫苗可以诱导针对SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的中和抗体。mi3已被用于开发流感、典型猪瘟和疟疾疫苗。通过遗传融合、标签/捕手组装或化学交联可以实现抗原到支架的展示。与基于蛋白质的纳米颗粒疫苗相关的主要挑战是在融合到或展示在支架上时保持抗原的结构构象。纳米颗粒疫苗是一个激动人心的平台，用于灵活的抗原展示，在疫苗开发中具有巨大的潜力。 2.6.病毒载体疫苗 病毒载体疫苗使用减毒病毒疫苗株或非复制病毒作为载体，有效地将抗原基因代码传递到宿主细胞核中以诱导免疫反应。病毒基因组可以稳定地接受大基因片段的插入并表达特定抗原，从而可以使用病毒载体技术开发多种疫苗。抗原可以精确合成、修改并针对宿主中的特定细胞。病毒载体诱导的身体反应类似于对自然感染的反应，导致强烈的体液和细胞免疫反应。病毒基础疫苗的主要关注点是针对载体的预先存在的免疫力，这削弱了疫苗引起的抗体诱导和T细胞反应。目前，许多病毒载体，如人类和黑猩猩腺病毒（Ad和ChAd）、水泡性口炎病毒（VSV）、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）、麻疹病毒（MV）、痘病毒、新城疫病毒（NDV）和其他病毒已被用作疫苗开发的载体。批准的病毒载体疫苗包括埃博拉病毒疫苗和COVID-19疫苗。由CanSino Biotechnology, Inc.开发的首个获得许可的埃博拉病毒疫苗基于腺病毒（Ad5）载体，已获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准（表1）。其他包括由Merck开发并由食品药品监督管理局（FDA）批准的复制能力VSV基础埃博拉疫苗ERVEBO；由Janssen Cilag International N.V.（Janssen）开发的编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的腺病毒Ad26，Zabdeno；Mvabea，一种MVA，编码扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和马尔堡病毒的糖蛋白，以及由Janssen开发的Tai Forest埃博拉病毒的核蛋白。迄今为止，已有五种批准的病毒载体COVID-19疫苗：由CanSino开发的基于腺病毒载体的Ad5；基于重组ChAdOx1腺病毒载体（ChAd）平台的AZD1222（Vaxzevria），由AstraZeneca开发；由印度血清研究所有限公司开发的Covishield（ChAdOx1_nCoV-19）；由Janssen开发的Ad26.CoV2.S疫苗；以及基于Ad26和Ad5载体的Sputnik V，由俄罗斯加马利亚研究所开发。 中国疾病预防控制中心（中国疾控中心）已开发出一种基于DNA疫苗与复制能力天坛牛痘（rTV）疫苗结合的HIV疫苗（DNA/rTV），该疫苗包含gag、pol和env基因。这种疫苗在恒河猴中对同源和异源挑战后的病毒获取具有保护作用。DNA/rTV疫苗在I期（ChiCTR-PRC-10001287）中安全并诱导免疫反应。2021年11月，使用DNA/rTV疫苗的II期临床试验（ChiCTR1900021422）已完成。研究人员还构建了一种包含刺突蛋白的复制能力重组病毒（rVSV-SARS-CoV-2）的COVID-19疫苗。结果显示，通过鼻内（i.n.）给药的rVSV-SARS-CoV-2疫苗在猕猴中诱发的中和抗体水平是肌肉注射（i.m.）途径的8倍。同样，基于NS1-del基础的减毒流感病毒载体的结核病疫苗也已进入I期临床试验（NCT03017378）。厦门大学、香港大学和北京万泰生物药业开发了一种基于减毒流感病毒的COVID-19疫苗，DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1（鼻内流感基础-RBD），目前正在进行III期临床试验（ChiCTR2100051391）。 由于其制造平台的多功能性和在流行病或大流行期间的响应时间，病毒载体疫苗越来越多地用于预防性疫苗的生产。然而，罕见的风险事件仍然是一个需要解决的重要问题，以充分利用这一平台在未来的潜力，这在传染病和癌症中具有重要意义。 2.7.肽疫苗 免疫系统对抗原作出反应，通常集中在少数氨基酸（aa）或肽段上，主要是B细胞和T细胞表位。肽疫苗旨在识别病原体上的肽序列，这些序列能够诱导保护性免疫反应，然后使用这些肽序列来全合成疫苗物质。由于它们是合成的，没有突变或逆转的风险，肽抗原可以快速修改以产生特定的反应。然而，这种方法在实践和理论上仍然存在困难。肽疫苗本身通常免疫原性不足，需要多次免疫才能有效。免疫原性可以通过将表位肽与载体蛋白融合、将表位肽与载体蛋白化学链接或人工合成相关肽的重复序列来增强。表位通常不是简单的氨基酸序列；然而，结构表位——具有精确构象——有时可能是抗体结合所必需和充分的。因此，以构象依赖的方式呈现肽是肽疫苗设计的重要考虑因素。先进的肽疫苗目前正在临床试验中，包括针对流感病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1、疟疾和阿尔茨海默病的疫苗。 最近，图宾根大学医院开发了一种基于肽的COVID-19疫苗候选物，名为CoVac-1，由来自SARS-CoV-2的多个病毒蛋白（刺突、核衣壳、膜、包膜和开放阅读框8（ORF8））的T细胞表位组成。这与Toll样受体1/2激动剂XS15结合，在Montanide ISA51 VG中乳化。在I期，开放标签试验（NCT04546841）中，CoVac-1显示出有利的安全性，并且在所有参与者中诱导了针对多种疫苗肽的SARS-CoV-2特异性T细胞反应，由多功能Th1 CD4+和CD8+ T细胞介导。这些发现表明CoVac-1诱导了一种广泛、强大且与关注变体无关的T细胞反应。 一种疟疾疫苗PEV3B含有来自恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）和环孢子蛋白（CSP）的两个多肽。临床试验Ia（NCT00400101）和Ib（NCT00513669）阶段证明了病毒体配方的PEV3B的安全性和免疫原性。事实上，在大多数时间点上，AMA-1和CSP肽抗原特异性IgG滴度显著高于对照组。这些发现为进一步开发针对疟疾的多价病毒肽疫苗提供了坚实的基础。 一种新型通用流感疫苗Multimeric-001（M-001），由BiondVax Pharmaceuticals Ltd.开发，包含来自A型和B型流感病毒的HA、NP和M1蛋白的保守表位，旨在保护免受多株和多季节流感病毒株的侵害。七个已完成的临床试验表明，该疫苗安全、耐受性好，并对广泛的流感毒株具有免疫原性。然而，在2020年10月，M-001的III期临床试验（NCT03450915）并未显示安慰剂组和接种组在减少流感疾病方面有显著差异。在HIV疫苗研究中，一种融合肽（FP）共价链接到关键孔虫血蓝蛋白（KLH）的赖氨酸残基上，命名为FP-KLH，被设计为在Env三聚体初次免疫后作为增强剂。这种组合免疫方案在小鼠中诱发了单克隆抗体，中和了高达31%的208种HIV-1跨亚型菌株。对豚鼠和猕猴的免疫诱导了类似的广泛的融合肽导向的中和反应，表明HIV-1融合肽是疫苗诱导广泛中和抗体的靶标。 肽疫苗的开发作为一种方法吸引了各种治疗领域的关注，包括癌症、阿尔茨海默病和丙型肝炎病毒。尽管如此，肽疫苗仍然存在挑战，包括较弱的免疫原性和不一致的免疫反应，这应该通过表位设计、载体优化和新佐剂的结合进一步改进和发展。 2.8.DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗由DNA疫苗和mRNA疫苗组成。DNA疫苗使用编码蛋白质的细菌质粒，在哺乳动物启动子下，然后驱动宿主细胞中的抗原表达。DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫，具有长期免疫反应，并且易于制造和扩大规模。针对流感、乙型肝炎、HIV、疟疾、SARS-CoV-2和癌症等传染性和非传染性疾病的DNA疫苗已在数百项人类临床试验中进行了测试。最近，印度在2022年批准了第一种用于人类紧急使用的DNA疫苗。由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D疫苗采用了非复制和非整合的质粒DNA，携带SARS-CoV-2的基因。ZyCoV-D使用无针系统，将免疫以狭窄的流体流形式传递到皮肤中，显著减少了副作用。在III期临床试验的中期报告中，ZyCoV-D疫苗的有效性达到了约66.6%。治疗组中诱发的不良事件的发生相似。总的来说，ZyCoV-D疫苗在III期试验中被验证为有效、安全和具有免疫原性。然而，许多DNA疫苗的免疫原性低于其他疫苗平台，并且与在其他哺乳动物中看到的临床结果相比，临床结果令人失望。此外，安全性问题，如质粒DNA整合到基因组DNA中。过去对DNA疫苗整合进行了广泛研究，但没有证据表明发生了整合。DNA疫苗受到其较弱的免疫原性的限制，需要施用更大的剂量。此外，它们有效的递送仍然是未来研究的问题。 mRNA疫苗通过将与病原体特定蛋白相对应的信使RNA（mRNA）引入宿主细胞而发挥作用。mRNA疫苗主要包括传统的非复制型mRNA和自复制mRNA（SAM）。获得许可的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273都是非复制型mRNA疫苗。自复制RNA（SAM）具有编码RNA复制因子的完整基因。与传统mRNA相比，SAM具有更持久和更高水平的抗原表达。SAM疫苗所需的剂量也远低于传统mRNA疫苗。非复制型和SAM疫苗在引入细胞质时表达高水平的异源基因。mRNA疫苗可以激活先天免疫系统并发挥固有的佐剂效应。mRNA疫苗具有免疫原性；被模式识别受体（PRRs）如TLR3和TLR7/8识别；在接种部位产生细胞因子；并招募和驱动先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的激活和成熟。对于适应性免疫，mRNA的翻译过程在细胞质中完成以产生目标抗原，然后被有效加工成多肽并呈现给MHC-I分子，引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。翻译后的抗原随后被分泌并在MHC-II蛋白上呈现给辅助T细胞（Th），以引发CD4+ T细胞反应，这通过炎症细胞因子刺激B细胞产生中和抗体并激活吞噬细胞。与传统疫苗类似，为了克服脂质双层并将mRNA疫苗转移到细胞质中，已开发了各种mRNA疫苗的递送方法，包括基因枪、电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）等。 COVID-19 mRNA疫苗Comirnaty（BioNTech/Pfizer）是FDA于2021年8月首次批准用于人类的mRNA药物；Spikevax（Moderna）疫苗也于2022年1月在美国获得授权，并随后在其他国家使用（表1）。Comirnaty和SpikeVax是LNP配方的、修饰核苷的mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2的S蛋白的前融合稳定形式。在一项涉及43,548名参与者的研究中，接种两剂疫苗后BNT162b2预防COVID-19的有效性为95%。严重不良事件的发生率很低，疫苗组和安慰剂组之间相似。在涉及30,420名志愿者的III期临床试验中，mRNA-1273疫苗预防COVID-19的有效性为94.1%，同样，严重不良事件很少见。另一种mRNA疫苗（CVnCoV），由CureVac开发，已进入IIb/III期临床试验。然而，CVnCoV对有症状的COVID-19的有效性为48.2%，随着SARS-CoV-2变种的出现，该试验被暂停。另一种mRNA疫苗ARCoV，由中国的Walvax Biotechnology开发，已于2022年9月获得印尼药品机构的紧急使用授权。ARCoV热稳定，可在室温下至少存放一周。ARCoV在I期临床研究中被证明是安全且耐受性良好，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应，支持进一步的大规模临床研究和人类使用。 目前，有超过25种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物正在进行临床试验。此外，还有许多针对其他传染病的mRNA疫苗的临床试验，包括寨卡病毒（NCT04064905）、流感病毒（NCT03345043, NCT03345043）、巨细胞病毒（NCT04232280, NCT03382405, NCT03382405）、RSV（NCT04528719）、基孔肯雅病毒（NCT03829384, NCT03325075）和狂犬病（NCT02241135, NCT04062669）。 环状mRNA（circRNA）是一种非编码单链RNA，通过添加内部核糖体进入位点（IRES）和/或通过在5′UTR中纳入特定的核苷修饰，可以实现蛋白表达。这一新平台已被证明由于转录本的延长半衰期，在真核细胞中产生强大且稳定的翻译。最近，Qu等人报告了一种SARS-CoV-2 Omicron circRNA疫苗，该疫苗在小鼠和猴子中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并有效抵抗SARS-CoV-2。 与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有类似活病毒的免疫反应机制，没有感染或整合到宿主基因组的风险，更稳定，能够有效表达抗原蛋白，并且通过快速且成本效益高的大型生产过程生产。从理论上讲，mRNA疫苗的开发只需要在成熟的技术平台上替换抗原序列；因此，在预防和控制新出现的传染病方面提供了相当大的优势。然而，mRNA疫苗在翻译效率和稳定性方面仍然存在一些挑战。此外，了解安全性和抗体反应的持续时间需要更长期的数据。总体而言，mRNA技术为疫苗、治疗以及更多领域提供了一个令人兴奋和有希望的途径。 2.9.当前和未来的中国预防性疫苗市场 中国是目前少数几个能够通过其工业基础设施提供足够疫苗供应能力的国家之一。近年来，中国在疫苗研发方面做出了巨大努力，并取得了显著进展，其疫苗市场正逐渐繁荣起来。根据NMPA批准的药品信息，中国市场上有94种预防性疫苗，可以预防38种疾病（表2）。其中，80种疫苗是国内生产的，11种来自国外；国产疫苗作为市场的主力，而一些战略性疫苗的供应，如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗（DTwP/Hib）、五价轮状病毒疫苗、四价和九价HPV疫苗以及带状疱疹疫苗仍然依赖外部制造商。最近，国产HPV疫苗和肺炎球菌疫苗的批准展示了中国在疫苗开发和制造领域的巨大潜力。中国还开发了手足口病疫苗（EV71）、戊型肝炎疫苗和埃博拉疫苗等新型疫苗。这些成就为SARS-CoV-2出现后多技术疫苗突破的快速部署奠定了坚实的基础。目前中国市场上的传染病疫苗包括流感、水痘、脑膜炎球菌性脑膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、白喉、百日咳、破伤风、b型流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、结核病、霍乱、轮状病毒、脓疱疮、气管炎、手足口病、破伤风、伤寒、副伤寒、黄热病、钩端螺旋体病、蜱传脑炎、日本脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹、鼠疫、肺炎球菌肺炎、炭疽、布鲁氏菌病、COVID-19、宫颈癌、细菌性痢疾、埃博拉出血热、肾综合征出血热、带状疱疹。然而，与全球市场相比，中国仍然缺乏一些疾病的疫苗，如登革热、B群脑膜炎球菌和疟疾。同时，值得注意的是，中国大多数疫苗目前基于传统疫苗平台，如灭活或减毒活疫苗、基因工程疫苗。第三代疫苗技术如病毒载体和核酸疫苗的开发才刚刚开始，中国市场上还没有核酸疫苗。 表2 中国当前许可的疫苗市场 对于重要疾病，如HIV、RSV、寨卡病毒和巨细胞病毒疫苗，尚未在全球成功开发和上市。此外，主要传染病病原体的其他亚型或突变逃逸株也在不断演变。因此，带来了许多挑战，如现有疫苗覆盖不足，如COVID-19、流感、结核病等疫苗。此外，一些现有的传染病疫苗对某些特定类型预防效果较差，如B群脑膜炎球菌疫苗、人类乳头瘤病毒疫苗、肠道病毒EVD68、超级细菌疫苗等。此外，中国无法独立满足高风险或特殊人群的疫苗需求，如老年人的带状疱疹疫苗。最后，联合疫苗是一线可以预防多种疾病并让人们通过较少的注射获得保护的疫苗。未来，应加强新一代疫苗技术的开发，如病毒载体疫苗和核酸疫苗。 3.治疗性疫苗的发展进展 与预防性疫苗不同，治疗性疫苗是指在已经感染病原体或患有特定疾病的患者中诱导特异性或非特异性免疫反应以治疗疾病进展的生物制品。因此，治疗性疫苗的主要目标是诱导肿瘤消退、根除微小残留病、建立持久的抗肿瘤记忆以及避免非特异性或不良反应。治疗性疫苗主要分为四类：基于肽/蛋白的疫苗、基于细胞的疫苗、基于DNA或RNA的疫苗和基于病毒载体的疫苗。根据疾病分类，治疗性疫苗可以分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性病的疫苗。首个获得FDA批准的癌症疫苗，Sipuleucel-T（Provenge，由Dendreon公司商业化），目前用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。Provenge是一种自体的、基于树突状细胞的疫苗，装载有与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）融合的前列腺酸性磷酸酶（PAP）抗原；这种疫苗首次实现了利用患者的自身免疫细胞攻击癌细胞的理念。迄今为止，已有超过30,000名男性患者接受了Provenge治疗，临床上已证明可以延长晚期疾病男性患者的生命。Provenge的批准在治疗性疫苗领域内具有重要意义，并强调了抗癌疫苗可以发挥作用的事实，从而为进一步投资癌症疫苗开发提供了动力。 3.1.治疗性疫苗在癌症方面的应用 3.1.1.治疗性疫苗在肺癌方面的应用 肺癌（LC）是最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因，由于预后不佳和临床结果差，给全球公共卫生带来了沉重负担，5年生存率为19%；实际上，肺癌占癌症总病例的11.4%，占全球癌症总死亡人数的18.0%。LC分为两个主要组织类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。传统的抗癌疗法（手术、放疗和化疗）在遏制进展方面的有效性有限，因此，全球范围内正在积极开展针对LC的治疗性疫苗设计研究（表3）。2008年，古巴开发了世界上第一个有效的治疗性疫苗CIMAvax EGF用于NSCLC，后来在古巴、秘鲁和委内瑞拉批准用于一线化疗后的晚期（IIIB和IV期）NSCLC治疗。CIMAvax EGF由人重组表皮生长因子（EGF）与脑膜炎奈瑟菌重组P64K蛋白共价结合而成。EGF调节细胞生长和分裂，NSCLC患者中EGF的过度表达与细胞生长和分裂失控有关。CIMAvax EGF通过刺激免疫系统产生特异性针对EGF的抗体，抑制其与癌细胞上的相应受体结合，从而减缓癌细胞的无控制生长。II期和III期临床试验表明，CIMAvax EGF耐受性良好，并延长患者生存期，特别是60岁以下患者的中位总生存期（OS）分别为18.53个月和7.55个月。另一种疫苗Vaxira是一种免疫治疗剂，由小鼠γ型抗异型单克隆抗体Racotumomab和氢氧化铝组成。Racotumomab特异性诱导针对在多种实体瘤中过度表达的Neu-糖基化GM3神经节苷脂（NeuGcGM3）的抗体反应。目前正在评估多种癌症适应症，包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。Vaxira治疗NSCLC的临床试验结果显示，中位生存时间为8.23个月，略高于对照组的6.8个月；Vaxira治疗组的中位无进展生存时间为5.33个月，对照组为3.9个月，证明了Vaxira优于安慰剂。基于II/III期研究的有希望的结果，Racotumomab于2013年在古巴和阿根廷推出，作为晚期NSCLC患者的皮下注射治疗。Tedopi是一种基于新表位的疫苗，具有针对HLA-A2+的限制性修饰新表位，针对肺癌中经常表达的五种肿瘤相关抗原：CEA、HER2、MAGE2、MAGE3和P53。在II期试验中，Tedopi在预处理的晚期NSCLC患者中显示出17.3个月的OS，并具有可管理的安全性。ATALANTE-1——一项随机、开放标签、两步、III期研究——比较了Tedopi与标准治疗（SoC）在HLA-A2+ NSCLC患者中的疗效，这些患者在ICI治疗后疾病进展的第二或第三线治疗。Tedopi通过刺激杀手T细胞，使它们能够发现并消除癌细胞，这是治疗疾病的关键过程。结果显示，在63名Tedopi组患者中，有29名患者至少存活了12个月，12个月生存率为46%，远高于预定的25%。一名54岁的晚期LC患者，在接受了五次Tedopi注射后，肿瘤迅速缩小（从39毫米缩小到23毫米）。在本报告发布时，患者的生存期已超过20.6个月，仍在观察中。现在，由于其出色的临床数据，Tedopi已获得美国FDA的孤儿药指定，用于治疗HLA-A2阳性NSCLC。 表3 市场上或处于临床开发阶段的针对不同疾病的治疗性疫苗 3.1.2.治疗性疫苗在乳腺癌方面的应用 乳腺癌（BC）是全球第二常见的恶性肿瘤，每年有超过226万例新病例。它也是女性癌症相关死亡的主要原因。迄今为止，截至2021年6月23日，共有44项正在进行的（即活跃的、不招募；招募；尚未招募）临床试验正在研究BC的治疗性疫苗。就疫苗平台而言，大多数BC疫苗是基于肽的（N=20，45.5%），而大约有10项（22.7%）的临床试验正在测试基于细胞的BC疫苗；新技术开发的病毒载体疫苗占6项（13.6%），而基于基因的BC疫苗正在8项（18.2%）临床试验中进行评估。 人表皮生长因子受体-2（HER2）是乳腺癌疫苗的理想靶点，是一种细胞表面受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在高达75%的BC中表达。HER2在细胞生长、存活和分化中发挥着极其重要的作用。针对HER2的基于肽的疫苗能够诱导持久的特异性细胞和体液免疫反应，以抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长，显示出高免疫原性、强特异性和良好的安全性。在II期临床试验（NCT00524277）中，HER2衍生的肽疫苗GP2，即HER2跨膜域（TMD）的亚优势表位，与GM-CSF（一种FDA批准的免疫佐剂）结合使用。这种组合刺激了抗原呈递细胞（如DC等）的增殖，并进一步诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别和摧毁表达HER2/neu的癌细胞。此外，GP2疫苗耐受性良好，没有严重的不良反应，接受GP2疫苗治疗的BC患者在手术后以及Herceptin治疗后5年的无病生存率达到100%。此外，与单独接受GM-CSF治疗的患者相比，BC复发率为0%，而后者为89.4%。基于E75（HER2/neu 369-377，KIFGS LAFL）的疫苗是治疗BC患者最广泛研究的策略。然而，目前的结果表明，E75疫苗仅对三阴性BC患者并且在治疗与曲妥珠单抗联合使用时对表达HLA-A24的患者提供了显著的临床益处；需要进一步评估这些效果。其他基于肽的疫苗也在临床试验中（表3）：AE37（HER2/Neu 776-790，GVGSPYVSRLLGICL；II期临床试验中），TPIV100（一种使用sargramostim作为佐剂的多表位疫苗，针对HER2；II期临床试验中），MVFHER-2（aa597-626；I期临床试验中）和MVF-HER-2（aa266-296；I期临床试验中）（MVF-HER2是两种嵌合型曲妥珠单抗样（MVF-HER2，aa597-626）和小扰素样（MVF-HER2，aa266-296）HER2 B细胞肽基疫苗的组合）。此外，基于细胞的治疗性疫苗是患者特定的，需要一种安全的方法进行个性化疫苗开发（Arab等人，2020年）。目前有多种针对HER2的基于细胞的疫苗正在开发中（表3）：DC细胞（NCT02061423，NCT04348747），PBMC细胞（APC8024），以及同种异体细胞（NCT00847171）已被用作免疫原进行免疫。初步结果表明，这些疫苗耐受性良好，并提供了特异性抗HER2细胞免疫反应。目前，正在考虑用于提高BC治疗性疫苗效果的各种方法：包括选择合适的细胞亚群、佐剂的选择以及不同的工程方法（如基于VLP或基于基因的疫苗）。然而，这些优化的临床益处仍有待验证。 3.1.3.治疗性疫苗在结直肠癌方面的应用 结直肠癌（CRC）是世界上第三常见的癌症，仅次于LC和BC，发病率为10.0%，死亡率为9.4%。CRC的标准治疗是手术、化疗和放疗，这些治疗可能结合使用。然而，这些治疗有许多副作用，许多患者在一系列治疗后仍然会复发。因此，为这一患者群体开发替代的有效治疗方法至关重要。尽管，目前还没有FDA批准的CRC疫苗，但已评估了多种疫苗用于治疗CRC，包括自体、DC、肽和基于病毒载体的疫苗。OncoVAX是一种自体结肠癌疫苗，与活的卡介苗（BCG）混合，用作CRC切除术后患者的辅助治疗。III期临床试验（NCT02448173）结果表明，OncoVAX对III期结肠癌患者没有显著影响，但在平均5.8年的随访期间。OncoVAX显著延长了II期结直肠癌患者的无复发期，并降低了总体复发风险和死亡风险。作为一种主动特异性免疫治疗（ASI），OncoVAX在免疫调节佐剂（BCG）的帮助下增强了患者肿瘤细胞的免疫原性，以刺激患者对自体（患者特定）肿瘤细胞的免疫反应。基于ASI的治疗程序通常假定患者肿瘤细胞上存在不同的肿瘤抗原，并且这些抗原在正常细胞中不存在或浓度较低。 最近的研究报告了一种基于腺病毒的疫苗，用于治疗结直肠癌（CRC），并在I期临床试验（NCT01972737）中取得了积极结果。研究发现，CRC抗原鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）能够在小鼠中引发针对肿瘤的抗原特异性CD8+ T细胞反应，而不是CD4+ T细胞，从而在不引起自身免疫的情况下提供抗肿瘤免疫。由人类5型腺病毒（Ad5）（作为载体）、PADRE（在大多数人类HLA分子背景下活跃的CD4+ T细胞表位）和GUCY2C组成的Ad5-GUCY2C-PADRE疫苗也经过了测试：在I/II期临床试验中，10名CRC患者接受了疫苗接种，并在6个月内进行了随访。作者发现Ad5-GUCY2C-PADRE安全地产生了针对抗原的细胞毒性CD8+细胞，但没有产生自身免疫性CD4+ T细胞，且没有严重的不良反应。 在2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，梅奥诊所报告了一种新的治疗方法疫苗PolyPEPI1018，专门为MSS型CRC设计，可以有效延缓肿瘤进展。PolyPEPI1018是一种多肽疫苗，由六种合成肽组成。这些肽段包括来自7种保守的癌症睾丸抗原（CTAs）（TSP50、EpCAM、Survivin、CAGE1、SPAG9、MAGE-A8、FBXO39）的12个独特的免疫原性表位，这些抗原在mCRC中经常表达。这种疫苗经过优化，以诱导持久的CRC特异性T细胞反应。在OBERTO临床I/II期试验（NCT03391232）中，共有11名患者接受了PolyPEPI1018疫苗接种：3名患者进一步肿瘤进展，5名患者病情稳定，3名患者部分肿瘤缓解，2名患者的肿瘤缩小到可以接受手术的程度。值得注意的是，在手术后原发肿瘤中没有发现存活的肿瘤细胞，表明肿瘤细胞被杀死了。因此，这些初步发现表明PolyPEPI1018对MSS mCRC肿瘤具有早期临床活性，可以有效延缓肿瘤进展。因此，需要进一步研究以调查PolyPEPI1018的疗效。此外，还有多项旨在寻找正确的抗原刺激物的试验正在进行中。 3.1.4.治疗性疫苗在肝癌方面的应用 肝癌是全球最常见的癌症之一，发病率为4.7%，死亡率为8.3%。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，通常发生在由酗酒、代谢综合征或乙型肝炎（HBV）或丙型肝炎（HCV）病毒感染引起的慢性肝病背景下。事实上，HBV和HCV感染被认为是HCC的主要风险因素。尽管HCC有各种治疗方法，包括预防性疫苗，包括HBV疫苗，已被报告可以降低HCC的发病率；尽管如此，患者总体生存率的变化仍然远未令人满意，对于更有效的治疗方法存在巨大的未满足需求。癌胚抗原糖蛋白-3（GPC3）在80%的HCC中特异性高表达，但不在正常组织中表达，因此被认为是抗原特异性免疫治疗的理想靶点。事实上，Nobuhiro等人已经发现GPC3肽可以在小鼠中诱导免疫反应，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗肿瘤活性，而不会引发自身免疫现象。因此，大多数基于肽的HCC疫苗主要针对GPC3抗原。 在一项II期临床病例对照研究（UMIN-CTR，UMIN000002614）中，比较了接种和未接种GPC3肽疫苗的患者的无病生存（DFS）、总生存（OS）和CTL诱导。研究证实，无论是否接种GPC3肽疫苗，80%的患者都会复发。然而，术后辅助疫苗接种可能会使1年复发率降低约15%，5年和8年生存率分别提高约10%和30%。此外，GPC3 IHC染色阳性的患者更有可能诱导CTLs，60%的患者生存超过5年。另外两种肽鸡尾酒疫苗（ONO-7268MX1 [JapicCTI-121933]和ONO-7268MX2 [JapicCTI-142477]），包含GPC3、在HCC中上调的含有WD重复的蛋白（WDRPUH）和类似内切核酸酶VIII的三个表位（NEIL3），在两项I期研究中评估了晚期HCC。除了GPC3，WDRPUH和NEIL3也被确定为HCC中的潜在免疫治疗靶点。其中，WDRPUH具有促进生长的活性，抑制WDRPUH可以延缓癌细胞的生长，而NEIL3作为一种肿瘤抗原，其编码基因在HCC中表现出高频的杂合性丧失，表明它可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，在DNA修复中发挥作用。接种ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的HCC患者显示出良好的耐受性，并诱导了CTL反应。一些患者还表现出长期疾病控制，ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的疾病控制率分别为52.9%和35.7%，报告了9名和5名患者的病情稳定。这些结果暗示了这些疫苗在治疗HCC方面的潜在用途。 IMA970A是一种由16种新发现的在HCC患者肿瘤组织中过度表达的肿瘤相关肽（TUMAPs）组成的基于肽的HCC疫苗。IMA970A与免疫刺激剂CV8102一起给药，可以诱导平衡的Th1/Th2免疫反应。在这些TUMAPs中，有7种限制在HLA-A02上，5种限制在HLA-A24上，4种限制在HLA-II类上。处于非常早期、早期和中期HCC的患者被纳入接受单次低剂量环磷酰胺的预疫苗输注，然后是9次皮内疫苗接种。初步结果显示疫苗具有良好的安全性，但免疫原性数据尚未公布（NCT03203005）。此外，甲胎蛋白（AFP）作为HCC最广泛使用的血清标志物，可以改善预后并用于监测治疗反应；AFP衍生肽疫苗的安全性和有效性也在临床试验中得到了验证。 另一种HCC的治疗性疫苗是基于个性化肽疫苗。2017年，一项I/II期研究评估了一种新的治疗方法对晚期HCC的疗效和安全性：基于个性化肽疫苗（PPV-DC-CTL）的细胞免疫治疗与放疗相结合。结果显示疫苗耐受性良好，未引起严重副作用，研究中的9名患者病情控制良好，有效率（RR）为33%，疾病控制率（DCR）为66%。治疗效果明显优于单独报告的经导管动脉化疗栓塞（TACE）、索拉非尼和化疗。另一种个性化肽疫苗是使用仅来自恶性肿瘤细胞的非同义突变表位肽作为抗原（称为新抗原）；这些肽与MHC一起在肿瘤中表达，因此被T细胞特异性识别，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。最近，刘团队发现个性化新抗原疫苗策略在预防HCC术后复发方面安全、可行且有效，并且通过ctDNA中的相应新抗原突变监测HCC进展也很有用；实际上，这为HCC患者的个性化医疗提供了可靠信息。在一项I期临床试验（ChiCTR1900020990）中，10名有血管侵犯的HCC患者在接受HCC诊断后2个月内进行了根治性手术切除和预防性TACE。通过肿瘤和周围组织全外显子测序鉴定非同义体细胞单核苷酸变异。对于疫苗，使用了6-20个体细胞点突变或RNA编辑新抗原长肽（27aa），并与ploy:IC佐剂混合作为抗HCC复发治疗。结果显示没有明显的治疗相关不良事件：新抗原疫苗可以有效地诱导和激活HCC患者的特异性免疫反应，并相应地延长这些患者的无复发生存期。患者的中位RFS为7.4个月，证实了个性化新抗原疫苗预防HCC患者术后复发的安全性和可行性。总之，我们讨论了几个涵盖癌症治疗肽疫苗的积极结果的例子，表明在人类中诱导CTLs是有希望的。但到目前为止，还没有观察到完全和明确的康复病例。需要进一步设计和筛选具有高免疫原性的有效的肽序列，辅以高效佐剂，或与其他免疫疗法结合，以实现更好的肿瘤消退。 3.1.5.治疗性疫苗在胃癌方面的应用 人们一直在推动研究癌症疫苗在各种肿瘤组中的作用，包括胃肠道癌症。胃癌（GC）是世界第五大癌症，2020年的发病率为5.6%，死亡率为7.7%。大多数GC患者在晚期被发现，局部晚期疾病或转移性扩散导致的不可切除病变的5年OS率仅为5%至15%。近年来，在免疫检查点抑制剂的治疗下，GC取得了巨大进展，但GC的治疗性疫苗仍处于临床阶段（表3）。因此，许多研究正在探索将免疫检查点抑制剂与化疗和其他药物或疫苗结合使用的潜力。例如，在之前的一项研究中，晚期GC患者接受了人类白细胞抗原（HLA）-A24限制性的人类血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）-1084和VEGFR2-169多肽疫苗与S-1加顺铂的组合治疗，中位生存时间达到14.2个月。另一种选择，胃泌素-17-白喉毒素免疫原（G17DT；Gastrimmune），一种抗胃泌素17免疫原，已确认可以提高针对胃泌素17的高亲和力中和抗体，可以阻断胃泌素刺激的生长并抑制胃泌素与CCK-2受体的相互作用。G17DT现在已经在许多肿瘤治疗中用于被动和主动免疫治疗，包括原发性和转移性疾病。实际上，作者证实，当与5-氟尿嘧啶加顺铂结合使用时，G17DT可以刺激体内的免疫反应，并且有免疫反应的患者生存时间更长。 如上所述，肿瘤特异性抗原是免疫治疗的潜在靶点。通过比较GC样本和正常组织之间的差异蛋白表达研究，已经鉴定出四种癌症特异性抗原——FOXM1、DEPDC1、KIF20A和URLC10；这四种抗原在肺癌、食管癌、膀胱癌和其他癌症中也上调。 血管生成是肿瘤进展的关键机制，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最有效和特异性最强的血管生成促进因子，因此，它被用作许多疫苗的靶点。OTSGC-A24是一种针对FOXM1、DEPDC1、KIF20A、URLC10和VEGFR1的HLA-A24:02结合肽疫苗混合物。在I/Ib期临床试验（NCT01227772）中，观察到24名携带HLA-A24:02单倍型的晚期胃癌患者的显著CTL反应，患者的总生存期为5.7个月（Sundar等人，2018年）。 除了肿瘤抗原，新抗原或识别新抗原的T细胞存在于大多数癌症中，为个性化疫苗设计提供了特异性和高度免疫原性的目标。I/II期临床试验（NCT03480152）评估了一种名为mRNA-4650的mRNA疫苗，该疫苗由多达20种不同的mRNA组成，编码定义的新抗原、驱动基因的突变和HLA-I预测的表位。在转移性胃肠道癌症患者中，疫苗被证明是安全的，并诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，这些反应在疫苗接种前未被检测到。然而，尚未观察到客观的临床反应，疫苗可能只与其他免疫疗法结合使用以增强治疗效果。 最近，Ursula Wiedermann团队开发了一种治疗性B细胞表位疫苗（IMU-131/HER-Vaxx），并在Ib期临床试验（NCT02795988）中验证了其在HER2/neu过度表达的胃食管腺癌（GEA）患者中的免疫原性和有效性。IMU-131/HER-Vaxx由来自HER2/neu细胞外域的三个融合B细胞表位（P4、P6和P7）组成，与CRM197偶联，并用Montanide佐剂。针对IMU-131肽的抗体通过结合HER2受体的三个不同区域并参与二聚体环，阻止两个HER2受体的二聚体化，从而抑制细胞内信号传导。这种阻断HER2信号通路被认为比单独使用曲妥珠单抗更有效。相比之下，CRM197（CRM；交联材料），一种酶失活的非类毒素白喉毒素形式，已被成功用作各种疫苗的伴侣，可以快速激活具有异质性Th1和Th2细胞因子谱的CD4+ T细胞，用于激活B细胞和调节诱导抗体的数量。在大多数14名接种GEA患者中，检测到针对HER2的特异性抗体和T细胞反应，IMU-131显示出良好的耐受性和安全性。 3.2.治疗性疫苗在病毒性传染病方面的应用 3.2.1.治疗性疫苗在乙型肝炎病毒方面的应用 乙型肝炎病毒（HBV）属于Hepadnaviridae家族，是一种部分双链的包膜DNA病毒。如上所述，HBV感染是导致HCC的重要因素之一，但并非所有HBV感染都会发展成癌症。相反，由HBV引起的慢性乙型肝炎（CHB）对公共卫生的影响更大。尽管经过数十年的积极疫苗接种，全球有20亿人的乙型肝炎血清学特征，其中2.5亿人患有慢性乙型肝炎。目前，只有两种批准用于CHB的药物：核苷类似物和聚乙二醇干扰素（IFN），这两种药物在抑制病毒复制方面有效，但无法清除病毒基因组或从感染肝细胞的血清中清除HBV表面抗原（HBsAg）。因此，迫切需要探索新的治疗途径。目前，有2种治疗性疫苗（NASVAC和YIC）已完成III期临床试验。此外，还有3种疫苗已完成II期临床试验，其中2种（GS-4774和HB02 VAC-ADN）未达到主要终点，1种（εPA-44）达到了治疗终点并进入III期临床试验。还有3种治疗性疫苗（CVI-HBV-002、VBI-2601和HepTcell）处于II期临床试验中，许多处于I期临床试验中（表3）。 乙型肝炎病毒（HBV）衣壳主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HbxAg组成。目前，大多数HBV治疗性疫苗侧重于HBsAg和HBcAg作为主要免疫原。在一项III期临床试验中，对CHB的初治患者使用NASVAC进行治疗，NASVAC是一种包含HBsAg和HBcAg的治疗性疫苗。作者发现，在80名接受NASVAC疫苗接种的患者中，有85%的患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，并清除了HBeAg。另一项III期临床试验评估了一种含铝佐剂的治疗性乙型肝炎疫苗（YIC），由抗原（HBsAg）-抗体（HBIG[乙型肝炎免疫球蛋白]）免疫复合物组成。本研究旨在通过改变患者体内HBV抗原的过程和存在来消除免疫耐受。不幸的是，疫苗的III期结果未能达到临床终点，即在患者中实现HBeAg血清转换。 一项II期试验（NCT02174276）评估了GS-4774疫苗的疗效，该疫苗由HBs、HBc和HBx融合抗原组成。结果显示，尽管GS-4774安全并对CD8+ T细胞有强烈的免疫刺激作用，但它未能降低患者体内的HBsAg水平。计划探索该药物与其他抗病毒药物联合使用的疗效。 最近的一项研究报告了HBxAg单独作为主要免疫原的潜力。HBxAg在携带HBV的小鼠中诱导了全身HBx特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，并显示出明显的HBs和HBV-DNA耗竭，保护作用至少持续30天。尽管这项研究仅处于临床前阶段，疫苗展示的HBV清除效果使其未来的发展充满希望。另一种目前有前景的疫苗是基于脂质体的纳米脂肽疫苗εPA-44（NCT00869778）。在HLA-A2阳性的进展性CHB患者中，900微克的εPA-44有限浓度导致HBeAg血清转换率显著高于安慰剂组，并具有持续的停药后效果。正在进行一项III期临床试验（ChiCTR2100043708）。 基于病毒载体或基因组的其他CHB治疗性疫苗也在进行中。一项I期临床试验（NCT02431312）评估了INO-1800（编码HBsAg和HBcAg的DNA质粒）单独或与INO-9112（编码人类白细胞介素12的DNA质粒）疫苗联合使用的安全性、耐受性和免疫原性。初步免疫学数据显示，接受INO-1800治疗的患者可以产生识别HBV核心成分的T细胞，并通过干扰素γ释放的方式从肝脏清除HBV。此外，INO-1800可以激活和扩增CD8+杀手T细胞；尽管其他临床数据尚未公布（https://clinicaltrials.gov）。 在另一项I/II期临床试验中，一种名为ANRS HB02 VAC-AND的基于DNA的疫苗，编码HBsAg，在用NAs治疗的CHB患者中诱导了持久的HBV特异性CD4+ T细胞反应，但大多数患者在停用NAs后经历了病毒学反弹。 3.2.2.人乳头瘤病毒治疗性疫苗 宫颈癌是女性中第四常见的癌症，主要由持续感染高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）引起。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有604,127名女性新诊断为宫颈癌，死亡341,831人。尽管有多种预防性疫苗可用，宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高，没有批准的非手术治疗方法。因此，研究HPV治疗性疫苗是必要的。与专注于HPV L1蛋白的预防性疫苗不同，治疗性疫苗主要针对在肿瘤细胞中高度表达的HPV早期蛋白E5、E6和E7。基于E6/E7蛋白的疫苗有多种不同形式已进入临床试验（表3），数据显示具有良好的开发潜力。实际上，五种不同的DNA治疗性疫苗（GX-188E、VGX-3100、pNGVL4a-CRT/E7（解毒）、pNGVL4a-Sig/E7（解毒）/HSP70、MEDI0457）被证明耐受性良好且临床有效。其中，VGX-3100疫苗已进入III期临床试验。 VGX-3100是第一种针对与HPV相关的宫颈癌前病变的免疫疗法。它包含HPV16和18的E6和E7 DNA，并使用CELLECTRA 5PSP电穿孔技术进行肌肉注射。结果显示，VGX-3100可以引发全身免疫反应，在三剂疫苗接种者中有49.5%的组织病理学退行，HPV清除率为40.2%，高于安慰剂接种者（30.6%和15.4%）。目前正在进行一项III期试验（REVEAL），以确认VGX-3100在HPV16/18阳性高度鳞状病变（CIN2/3）女性中的疗效、安全性和耐受性。 考虑到与宫颈癌完全缓解相关的疫苗单药治疗结果有限，使用疫苗和免疫疗法药物的联合治疗可能提供更强大的免疫反应。另一种基于DNA的疫苗pgDE7h（编码与1型单纯疱疹病毒（HSV-1）糖蛋白D（gD）融合的HPV16 E7）被发现与吉西他滨（Gem）联合具有协同抗肿瘤效果，吉西他滨是一种在临床上用于多种肿瘤的核苷类似物。这种组合诱导了肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T细胞并根除了现有肿瘤。此外，一项研究发现，pembrolizumab与GX-188E（一种设计用于表达HPV16和HPV18的E6和E7蛋白，与Flt3L的细胞外域和组织型纤溶酶原激活剂的信号序列融合的基于DNA的疫苗）联合使用为CIN3患者提供了一种新的可能方案。 蛋白基疫苗由抗原呈递细胞（APCs）处理，导致通过HLA I类和II类呈现抗原，用于产生无类型限制的CD8+和CD4+ T细胞反应。TVGV1是一种融合蛋白基疫苗，由两种抗原组成，铜绿假单胞菌外毒素和KDEL内质网保留信号，与HPV16 E7融合，并用CpG ODN或GPI-0100佐剂。这种疫苗已被证明可以诱导T细胞反应，并为HPV16转化的B6肿瘤提供强大的抑制。目前正在进行一项IIa期临床试验，针对高危HPV宫颈感染的女性（NCT02576561）。 还有几种基于多肽的疫苗使用非E6/E7蛋白作为免疫原。PDS0101是一种基于肿瘤相关抗原MUC1的非MHC限制性疫苗，该抗原在肿瘤中高度表达。这种疫苗使用R-1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（R-DOTAP）（一种激活TLR7的脂质体载体）作为佐剂。在I期剂量递增试验（NCT02065973）中，发现PDS0101安全且耐受性良好。疫苗接种以非MHC限制性方式在所有患者中解决了CIN。已启动几项将PDS0101与其他免疫调节疗法结合使用的II期试验（表3）。 3.2.3.治疗性疫苗在人类免疫缺陷病毒方面的应用 自20世纪80年代初首次临床观察到艾滋病并随后分离出病因性逆转录病毒HIV以来，尽管进行了40年的深入研究，HIV/AIDS疫情仍然是对人类构成重大全球健康威胁的疾病。实际上，截至2020年，仍有3800万人感染HIV。目前的治疗策略包括使用抗逆转录病毒疗法（ART），这已帮助将艾滋病从一种危及生命的疾病转变为一种可管理的慢性病，并显著延长了HIV感染者的预期寿命。然而，由于存在由潜伏感染细胞形成的病毒库，患者需要接受终身维持治疗。在缺乏有效的HIV-1根除策略的情况下，HIV研究工作集中在开发治疗方法上。 SARS-CoV-2大流行向世界介绍了一种有效的基于mRNA的疫苗，该疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。ICVAX是一种基于PD1的HIV-1 DNA疫苗，编码由人类可溶性PD1结构域与两个马赛克Gag-p41抗原融合的重组抗原，可以诱导针对不同HIV-1亚型的广泛和多功能T细胞反应；这些发现突出了将基于PD1的DNA疫苗方法转化为临床使用的巨大潜力。一项II期临床试验（NCT01492985）评估了基于DNA的疫苗（GTU-MultiHIV B clade）与基于多肽的疫苗（HIV-LIPO-5）联合治疗的疗效，并发现DNA和LIPO-5疫苗的主要-增强免疫接种比单独疫苗诱导了更广泛的多功能T细胞，但在中断抗逆转录病毒治疗后未能控制病毒血症，表明将疫苗策略与其他基于免疫的干预措施结合的重要性。其他疫苗形式，如AGS-004，由成熟的自体树突状细胞和体外转录的自体HIV抗原编码RNA组成，正在IIb期临床试验中进行验证。与安慰剂组相比，AGS-004诱导了强烈和多功能的HIV特异性T细胞反应。然而，未检测到抗病毒效果。另一项研究将单核细胞衍生的树突状细胞（MD-DC）基疫苗（装载大量HIV-1热灭活自体抗原）与聚乙二醇化干扰素α-2a（IFNα-2a）结合使用，在慢性HIV-1患者中取得了次优结果。总的来说，开发针对HIV的疫苗还有很长的路要走。 3.3.治疗性疫苗在慢性病方面的应用 心血管疾病（CVD）是全球主要的慢性疾病死因，高血压、血脂异常和糖尿病是CVD的主要原因。高血压、血脂异常和糖尿病的疫苗研究已有60多年的历史。随着各种疫苗构建模型的逐步改进，目前许多治疗性疫苗正在进行临床试验，但由于治疗依从性差，还没有疫苗上市。 3.3.1.治疗性疫苗在高血压方面的应用 肾素-血管紧张素系统（RAS），包括肾素、血管紧张素I（Ang I）、血管紧张素II（Ang II）和AT1R，是高血压治疗性疫苗的主要靶点。最早的高血压疫苗针对肾素。然而，由于对肾脏的损害，它们最终被终止。随后，针对AngI的高血压疫苗的疗效，如PMD2850和PMD3117，也在许多临床试验中得到验证，但都以失败告终。Ang II是许多高血压疫苗的另一个主要靶点，如瑞士Cytos公司在2007年开发的CYT006-AngQb（由Ang II结合噬菌体Qβ（AngQb）VLP组成的疫苗）。该疫苗耐受性良好，并在所有受试者中诱导了抗Ang II抗体，半衰期约为4个月。同样基于Ang II，Koriyama等人构建了编码Ang II和HBcAg融合蛋白的Ang II DNA疫苗，可以有效降低血压至少6个月。2022年，进行了一项安慰剂对照剂量递增研究，以调查针对改良Ang II DNA疫苗（AGMG0201）的安全性、耐受性和免疫反应。结果显示AGMG0201耐受性良好，也可以诱导抗血管紧张素II抗体。 除了针对RAS的疫苗外，廖团队还开发了一种针对交感神经系统α1D-肾上腺素受体的降压疫苗（ADRQβ-004），在大鼠中显示出良好的降血压效果，并且能够有效预防高血压动物的血管结构重塑、心肌肥大和纤维化以及肾脏损伤。吴等人设计了来自人类L型钙通道（CaV 1.2）的表位CE12，并分别将其结合到Qβ VLPs和HBcAg VLPs上，以测试该表位在高血压动物中的疗效。Qβ-CE12和HBcAg-CE12-CQ10疫苗都能有效地降低高血压啮齿动物的血压，HBcAg-CE12-CQ10还改善了L-NAME诱导的肾脏损伤。戴等人开发了一种针对内皮素-1（ET-1）类型A受体（ETAR）的疫苗ETRQβ-002，并证实该疫苗可以显著减少由单羧胺（MCT）和Sugen/低氧引起的大鼠肺动脉高压；它还改善了肺动脉的任何病理重塑。总之，针对RAS的Ang II和AT1R、SNS的α1DAR肾脏和LCaCd、ETAR的疫苗构成了一系列高血压治疗性疫苗的候选物，并为高血压疫苗的联合治疗奠定了基础。 3.3.2.治疗性疫苗在糖尿病方面的应用 糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是全球成人中高度流行的慢性疾病。全球估计有3.82亿人患有DM，预计到2035年这一数字将接近6亿。DM可以根据疾病的发病机制分为1型和2型。1型DM是一种自身免疫性疾病，自身免疫T细胞攻击产生胰岛素的β细胞。谷氨酸脱羧酶（GAD）是1型DM自身免疫反应的主要靶点；尽管几项基于GAD的疫苗临床试验产生了矛盾的结果。令人惊讶的是，卡介苗（BCG）疫苗被用于1型DM患者。一项为期8年的随访临床试验显示，BCG疫苗提供了长期效果：它被良好地耐受，并且在DM患者中导致血糖和Treg特征基因的表观遗传变化稳定减少。2017年，李等人设计的D41-IA2(5)-P2-1疫苗被认为是1型DM的一种有希望的治疗方法。D41-IA2(5)-P2-1由DPP4的肽段、胰岛素瘤抗原-2（IA-2）的抗糖尿病B表位和来自人类热休克蛋白60（HSP60）的P277肽的Th2表位（P2：IPALDSLTPANED）组成，可以显著控制高血糖。与D41-IA2(5)-P2-1类似，由李Z等人设计的U-IA-2(5)-P2-1（UIP-1）嵌合疫苗也能在免疫后成功增加小鼠的胰岛素水平并降低血糖水平。 尽管2型DM的病理机制尚不清楚，但已知有4个靶点：脂肪组织抗原、生长抑素、依赖葡萄糖的胰岛素变性多肽（GIP）和胃饥饿素。白细胞介素-1β（IL-1β）是2型DM发病机制中的主要促炎底物，有证据表明减少IL-1β活性可能成为2型DM的新治疗策略。由全长重组IL-1β与Qβ VLPs偶联组成的疫苗hIL1bQb，在2型DM患者的临床前和临床、随机、安慰剂对照、双盲研究中进行了测试。结果显示，针对IL-1β的Hil1bQb疫苗安全且耐受性良好，在这些患者中，接种6剂900微克剂量后可检测到中和IL-1β特异性抗体反应。目前，DM的发病机制和葡萄糖代谢的关键靶点仍然不清楚。在糖尿病疫苗领域的进一步探索预计将提供新的解决方案。 3.3.3.治疗性疫苗在血脂异常方面的应用 血脂异常是CVD的关键风险因素，通常以高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇或高甘油三酯血症为特征。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶9型（PCSK9）通过受体内化和随后的溶酶体降解调节LDL受体表达，是已知的抗高脂血症药物或疫苗靶点。迄今为止，抑制PCSK9最先进的方法是单克隆抗体（mAbs），如众所周知的alirocumab和evolocumab，它们于2015年获得FDA批准，并为PCSK9疫苗的开发提供了坚实的临床证据。AT04A和AT06A是两种AFFITOPE肽疫苗候选物，通过诱导PCSK9特异性抗体治疗高胆固醇血症。I期临床试验（NCT02508896）的结果显示，AT04A和AT06都是安全和免疫原性的，但只有AT04A表现出显著的LDLc降低活性。还有其他针对PCSK9的疫苗；例如，基于Qβ VLP的疫苗PCSK9Qβ-003。这种疫苗可以显著降低Balb/c小鼠和LDLR+/−小鼠的总胆固醇和PCSK9表达，并上调肝脏LDLR、SREBP-2、肝细胞核因子-1α（HNF-1α）和HMG CoA还原酶水平。此外，由PCSK-9短肽与KLH融合组成的疫苗在男性载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠中引起了针对PCSK9的显著长期抗体反应。一个免疫原性肽段，称为免疫原性融合PCSK9-破伤风（IFPT），使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质（L-IFPT）结合到纳米脂质体表面，并吸附到Alhydrogel上（L-IFPTA+）；这种疫苗候选物在高胆固醇血症小鼠中诱导了针对PCSK9肽段的高IgG抗体反应，并降低了高达58.5%的血浆浓度。 最近，血管生成素样蛋白（ANGPTL）3作为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平的新靶点受到了关注。针对ANGPTL3的抗体、反义寡核苷酸和小干扰RNA作为靶向ANGPTL3抑制剂已经开发出来，并正在进行临床试验（NCT03409744、NCT03452228、NCT03747224）。Fukami等人设计了3种针对ANGPTL3的表位肽基疫苗（E1-E3），其中E3（32EPKSRFAMLD41）肽段没有引起细胞毒性，并显著降低了ob/ob小鼠循环中的甘油三酯、LDL-C和小而密的LDL-C（sd-LDL-C）水平；它还减少了肥胖引起的脂肪肝病。除了PCSK9和ANGPTL3的靶点外，还需要研究其他与胆固醇和甘油三酯代谢相关的靶点疫苗，如ApoB-100，以加速推广有效抑制血脂异常的疫苗。 4.结论和未来展望 疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病的负担方面发挥着重要作用。在过去20年中，可以有效预防的疾病类型持续增加到40多种。实际上，HPV疫苗对相关恶性肿瘤的预防效果的出现以及前列腺癌治疗性疫苗的推出，标志着疫苗的效用从传统的预防进一步扩展到治疗。然而，许多重大传染病的病原体因素和潜在干预措施仍然不明确，特别是那些由复杂病原体感染（如艾滋病和结核病）和以肿瘤和代谢性疾病为代表的慢性疾病引起的疾病。这些疾病的疫苗开发是世界级的。对于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2等突发重大传染病，弱免疫反应或意外的免疫反应（如抗体介导的感染增强、ADE）是创新疫苗研究中难以解决的问题。 因此，新一代更有效疫苗的开发需要在以下四个方向上做出努力。 (i) 佐剂：与佐剂相关的有几个重要因素需要考虑。需要控制和改进佐剂的物理化学性质，优化生产流程，并深入研究分析佐剂的作用机制，以充分了解它们对免疫系统的影响。我们还需要继续探索佐剂和肿瘤抗原的最佳组合，以增强疫苗的免疫原性，并致力于设计针对不同病原体的亚单位抗原、蛋白质或肽的新复杂佐剂；这将得到化学和新材料合成技术的帮助，以增强抗原向免疫细胞的靶向传递（下一点），并克服肿瘤免疫抑制微环境对抗原呈递的抑制。这也可能有助于激活肿瘤特异性T细胞在免疫耗竭和衰老状态下，并促进记忆T细胞的形成。 (ii) 传递系统：药物/疫苗传递系统的最终目标是将货物传递到目标部位，并具有预定的释放动力学和作用持续时间。没有单一的工具适合所有形式的治疗，不同的疫苗形式各有优势和劣势，需要优化以实现传递和治疗。实际上，需要了解人与人之间、人与动物之间在药物吸收、分布、代谢和消除方面的差异，并探索不同疫苗抗原或药物与传递系统的最佳组合。COVID-19大流行提醒我们，未来是不确定的，我们需要不断发展新的传递系统，以适应多样化和精确疫苗发展的趋势。还应注意传递系统的效率和靶向性，更多关注传递系统本身的安全性和临床转化可行性。 (iii) 新抗原的发现和筛选：结合临床和实验室研究成果，全面运用和评估多组学数据和其他自动化高通量功能筛选工具，积极发展新的理论和技术，用于各个领域独特或通用疫苗靶点的筛选和发现。此外，通过下一代测序和生物信息技术，需要设计更有效的预测算法，提高发现有效的肿瘤抗原作为疫苗靶点的几率。 (iv) 联合治疗：由于肿瘤的异质性和复杂的免疫抑制微环境，单一免疫治疗往往无法提供良好的结果，通常导致低反应率或继发性耐药。因此，免疫治疗通常倾向于与不同的治疗方法联合使用。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT），已经彻底改变了癌症治疗，特别是对于转移性癌症。实际上，这已经通过在设计肿瘤疫苗时结合多个肿瘤靶点，以及在补充使用免疫疗法来多样化肿瘤治疗中看到。的确，发挥这些优势并避免弱点可以显著改善癌症患者的治疗。 疫苗在历史上已经证明可以提供健康和福祉，新技术为应对传统方法失败的挑战提供了新的可能性。然而，关于新技术的安全性的数据有限，需要考虑疫苗生产和转化的可行性，以及人类免疫反应的复杂性。新技术和策略将有助于解决现在或未来人类面临的复杂或严重疾病，这些知识对于设计有效的疫苗将非常重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:近年来，RNA疫苗在预防各种传染性疾病和肿瘤免疫治疗方面的研究受到越来越多的关注。在临床前和临床研究中观察到的强烈免疫反应，以及其快速和低成本的生产方法使mRNA疫苗技术有望替代传统疫苗技术。然而，要有效递送mRNA疫苗，就需要防止mRNA在细胞外降解。作为将mRNA递送至靶细胞的非病毒载体，脂质纳米颗粒(LNPs) 由于相对容易和可规模化的生产过程已被广泛研究。本综述重点介绍了LNPs开发的主要进展，并综述了基于LNPs的mRNA疫苗在预防传染性疾病和防治肿瘤方面的应用。1.引言接种疫苗被认为是控制传染性疾病的一种有效方法。众所周知，基于减毒活病原体的传统疫苗可激活体液免疫和细胞免疫。然而，这类疫苗存在安全问题，因为减毒病原体有可能恢复成为可引起感染的致病形式。另一方面，亚单位疫苗被认为是减毒活疫苗的安全替代品，但其诱导清除细胞内病原体所需的细胞免疫的效率较低。基于病毒载体和核酸(如质粒DNA和mRNA)的新疫苗技术都能通过疫苗抗原的原位表达，诱导体液和细胞毒性T细胞免疫反应。这种特性使新疫苗在达到保护效果的同时，也可能有助于消除细胞内感染。虽然质粒DNA疫苗在人类临床试验中已被证明是安全有效的，但将质粒DNA递送到细胞核内的方法仍然不够理想。因此，人们开始了对mRNA疫苗的研究，因为可以在不需要跨越任何细胞核的膜屏障情况系，递送这种疫苗并进行抗原表达。如果mRNA通过了细胞核膜，它既不会与宿主细胞基因组进行整合，也不会对其进行编辑。此外，mRNA的如结构、结合和翻译特性等理化性质，不受多种具有各种理化性质的蛋白质编码的影响。与其他类型疫苗相比，mRNA疫苗在获得传染性病原体的基因序列信息之后，就可以简易、快速、低成本的进行生产。一般来说，mRNA疫苗可分为两种类型:非复制或传统型和自扩增型。非复制型结构简单，只有一个小RNA分子。然而，其在体内的稳定性和活性受到细胞内抗原表达有限的持续时间的限制，但可以通过优化递送配方来提高这种mRNA疫苗典型的低抗原表达。对传统mRNA的核苷碱基进行化学修饰和序列优化，可以提高其蛋白质表达和免疫原性。将序列优化mRNA与核苷修饰mRNA的效力进行比较，目前没有明确结论，这是由于序列优化算法、修饰核苷类型、给药途径和其它试验条件等各种参数的差异造成的。然而，据报道，对恒河猴和小鼠接种脂质纳米颗粒(LNPs)递送的序列优化或核苷修饰的mRNA后，除了都会增加接种部位和引流淋巴结的中性粒细胞和树突细胞浸润外，也都能引起强烈的固有免疫反应。Magini等使用流感病毒的核蛋白和M1蛋白、Brito等使用人巨细胞病毒(HCMV)的Hg/gL蛋白复合物，评估了自扩增mRNA编码多种抗原的能力。对动物接种自扩增mRNA后，观察到了对病毒感染的保护作用以及强烈的T细胞免疫反应。自扩增mRNA产生的高水平抗原表达是由于其具有在细胞内自我扩增的能力。非复制mRNA疫苗和自扩增mRNA疫苗均可用于预防传染性疾病。mRNA在生理条件下的稳定性是其在细胞内有效递送的一个重大挑战。在设计这类疫苗时，应考虑到mRNA对普遍存在的核糖核酸酶水解作用的高敏感性。人们采用了各种各样的策略进行mRNA递送。例如，RNA偶联物的形成可能会防止核酸降解，但同时，它也可能会增强其与血清蛋白的结合，从而导致此结合物的聚集和血管阻塞。另一方面，利用病毒载体递送核酸除了会遇到当需要快速和大规模生产时的生产难题外，还存在一些安全隐患。比如，可能会在免疫抑制患者体内过度病毒复制以及产生病毒抗原对疫苗抗原的免疫显性。因此，非病毒载体是mRNA递送的首选载体，特别是可以用于设计这些载体的材料以及可用于生产这些载体的各种配方技术种类繁多。与病毒载体相比，非病毒载体的免疫原性较差，转染效率更低。此外，这些载体更容易生产，能够携带的遗传物质有效载荷更大。如多肽、聚合物、纳米颗粒和脂质等不同的材料均可用于非病毒载体的递送。mRNA与非病毒载体的有效结合可能可以防止核酸在细胞外降解，并有助于确保其在靶细胞膜上的定位。核酸的递送需要细胞摄取递送系统，然后核酸通过内涵体逃逸进入靶细胞的细胞质中。为了实现这个过程，合适的递送系统是至关重要的，它需要克服如图1所示的多种屏障。脂质纳米颗粒是体内递送核酸疫苗方面被研究最广泛的非病毒载体之一。随着美国食品药品管理局(FDA)于2018年批准Onpattro®(patisiran) 用于由蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变的治疗，使LNPs在小干扰RNA (siRNA)系统递送中的应用得到了支持。LNPs也越来越多地应用于基因治疗、蛋白质替代治疗领域以及针对肿瘤和传染性疾病的mRNA疫苗的开发。图1 体外转录(IVT) mRNA递送的细胞内屏障:(1)递送系统与细胞膜的相互作用，(2)内吞作用，(3)内涵体逃逸和mRNA的释放以启动翻译过程。在一项研究中，采用裸mRNA(溶解于林格乳酸中)和商业化脂质转染试剂制备的mRNA纳米颗粒进行体外和体内给药，对基因载体介导的mRNA转染效率进行了评估和比较。这项研究表明，mRNA脂质可以有效地转染人类和小鼠树突状细胞(DCs)。作者还证明，mRNA脂质的体内转染效率与给药途径有关。表1总结了以LNPs或其他脂质制剂制备的针对传染性疾病和肿瘤mRNA疫苗的临床前疗效的一些研究。LNPs（特别是当用于RNA疫苗设计时）除了需要特殊生产流程外，还需要特定类型和比例的脂质成分。本研究综述了用于设计递送mRNA疫苗的LNPs成分，概述了生产LNPs的不同方法以及有助于提高这类疫苗效力和摄入的因素。此外，将重点介绍已经开展的临床前和临床试验，以研究基于LNPs开发的mRNA疫苗在传染性疾病和肿瘤方面的潜在应用。2.用于核酸递送的各种脂质配方概述不同的脂质已被广泛用于构建不同的脂质配方，用于核酸递送。传统的脂质体、脂质复合物、阳离子纳米乳 (CNEs)和纳米结构脂质载体(NLCs)都已被开发为核酸载体系统。此外，与传统的脂质配方相比，已经出现了使核酸递送更加有效(图2)的更高级LNPs递送系统。这些高级LNPs可能没有包围水核的脂质双分子层，相反，它们可能呈现出一种胶束状结构，将药物分子封装在非水结构的核心内。此外，LNPs不会与其包裹的核酸成分产生静电络合作用。2.1 脂质体脂质体是由单层或多层磷脂双分子层组成的球形囊泡，封闭在其中的水核可将所选药物包裹在其中。脂质体也是由具有极性头部(亲水)基团和非极性尾部(疏水)基团的材料制备而成(图2)，这些基团在相互诱导作用下形成囊泡。脂质体由于其可生物降解性、有效性、最小毒性和易用于制剂而被广泛用作药物载体。在mRNA疫苗递送领域，脂质体在传染性疾病以及肿瘤免疫治疗方面有很好应用前景。例如，一项研究表明，与注射DNA-脂质复合物相比，瘤内注射mRNA-脂质复合物在实现原位肿瘤转染效率方面同样是高效的。随后，Zhou等开发了编码人黑色素瘤抗原糖蛋白100 (gp100)的mRNA疫苗中性脂质体。与对照组相比，在小鼠脾脏内直接注射该脂质体可抑制肿瘤生长，显著延长小鼠的生存时间。图2.主要mRNA脂质纳米载体:(A)脂质体、脂质复合物和脂质纳米颗粒;(B)纳米结构脂质载体;(C)阳离子纳米乳液。用于制备核酸递送脂质体的阳离子脂质具有两亲性，由带正电(阳离子)的氨基头部基团通过甘油与碳氢链或胆固醇衍生物连接。这些脂质一个重要特性是其带正电荷的头部基团能够与带负电荷的核酸产生静电作用，从而将核酸封装在脂质纳米颗粒的核心中。早期报道显示，利用阳离子脂质如N-[1-(2,3-二二氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)制备脂质体将mRNA转染小鼠细胞，可以形成一种高效的核酸转染系统。用于生产mRNA疫苗的阳离子脂质既可以封装mRNA，也可以作为一种免疫原性剂。例如，在小鼠皮下注射编码人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 Gag抗原的mRNA-阳离子脂质（1,2-二油乙基-3-三甲基丙烷（DOTAP）和1,2-二油乙基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)）复合物后，观察到了强烈的免疫反应。这种强烈的免疫反应造成了对Gag肽脉冲细胞的特异性杀伤，并产生了体液免疫反应。另一方面，采用mRNA-脂质体（基于Genzyme脂质67(GL67)）复合物对小鼠肺内给药后，没有在小鼠的肺部产生显著的荧光素酶表达。相比而言，采用pDNA-GL67脂质体给药却能在小鼠肺部产生可检测到的荧光素酶表达。产生上述差异的原因是mRNA-GL67脂质体在生物体液中的稳定性有限。此外，一系列阳离子脂质体，特别是基于DOTAP的脂质体，都可以作为疫苗佐剂。这些类型的阳离子脂质体作为免疫调节剂，以抗原(或病原体)非依赖性的方式刺激固有免疫反应。阳离子脂质体的免疫刺激作用与胺基头部基团的性质、脂质的流动性或酰基链的饱和程度有关。有人提出，含有季胺头部基团的脂质比含有叔胺头部基团的质具有更强的免疫刺激作用；而且，具有不饱和酰基链或短饱和链的脂质比具有长饱和酰基链的脂质更能刺激促炎介质和细胞因子的释放。因此，必须对作为核酸递送系统的阳离子脂质体的潜在免疫毒性进行仔细评估。2.2. 脂质复合物脂质复合物是基于脂质体的制剂，由阳离子脂质体与RNA的静电相互作用形成，由于脂质体结构转化为紧凑的RNA-脂质复合物，从而形成该脂质复合物独特的分子内部排列(图2)。这些制剂的其核酸封装效率低和耐受性差，已被排除在临床研究之外。此外，由于脂质体带有正电荷、易聚集、不能完全包裹核酸，导致脂质体静脉给药后可能会被迅速地从血液循环中清除和产生增强免疫反应。2.3. 阳离子纳米乳阳离子脂质也可用于制备阳离子纳米乳（CNEs）(图2)。Brito等人开发了一种阳离子水包油纳米乳，其中油相包括DOTAP(作为阳离子脂质)和角鲨烯(作为一种安全有效的佐剂)。将油相加入水相中，用亲水(吐温80)和疏水(三油酸山梨醇)表面活性剂稳定，形成纳米液滴。CNEs用于结合编码呼吸道合胞病毒(RSV)、艾滋病病毒(HIV)和人巨细胞病毒抗原的自扩增mRNA疫苗。对小鼠进行两次肌肉注射相对低剂量的CNEs制备的自扩增RNA疫苗后，可以观察到强烈的免疫反应。此外，对动物进行肌肉注射表达人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的自扩增RNA疫苗后，在兔体内产生了大量的HIV中和抗体，而在恒河猴体内观察到了诱导T细胞反应。2.4. 纳米结构脂质载体纳米结构脂质载体(NLCs)是可用于递送mRNA疫苗的脂质之一(图2)。NLCs被认为是固体脂质纳米颗粒和水包油乳剂的混合制剂。NLCs的核心是固体和液体脂质的混合物。这种半结晶基质使该制剂具有更好的胶体稳定性，这种稳定性取决于其中固体脂质含量。与其他固体脂质纳米颗粒相比，NLCs易于制备和灭菌，毒性较低。在一项研究中，研究人员开发了一种An NLC制剂，并与编码寨卡病毒抗原的自扩增mRNA结合，在小鼠试验中，低至10 ng的单次剂量肌肉注射可以获得100%的寨卡病毒保护率。3.LNPs的组成用于RNA疫苗的LNPs应按照特定的生产程序，由特定脂质成分按精确的比例制备。如图3所示，LNPs通常由阳离子/可电离脂质和辅助型脂质(如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇化脂质)组成。图3. mRNA脂质纳米颗粒示意图3.1 可电离阳离子脂质由于带正电的脂质和带负电的核酸之间存在静电相互作用，使用阳离子脂质可以提高开发传统脂质制剂时核酸的包封效率。然而，这些高电荷脂质制剂通过静脉注射可能会刺激免疫系统，同时也可能会导致其在血液中被快速清除，阳离子脂质耐受性差，使新兴的可电离阳离子脂质得到了应用。可电离阳离子脂质是开发更多增强型LNPs的关键成分。Semple等人首次将可电离阳离子脂质引入核酸递送领域。这些脂质的特点是可以根据环境pH值改变电荷，也就是他们在酸性pH值下带正电荷，而在生理pH值下则变为中性。携带的正电荷可以使脂质封装一个RNA分子并且在融合过程与内涵体膜相互作用，然后将核酸释放到细胞质中。另一方面，这些脂质在生理pH值下呈中性避免了脂质在血液中被快速清除，因而其耐受性和药代动力学特性得到了改善。因此，在进行静脉给药后，脂质制剂除了在病变组织(如肝脏和实体瘤)中聚集增加外，其在血液循环中的半衰期也延长了(约30分钟或更长)。与更容易产生细胞毒性的阳离子脂质相比，可电离脂质具有更好的耐受性。此外，含有阳离子脂质的颗粒更容易聚集和沉积在较细的毛细管床中，导致不良后果。对可电离脂质进行不同的结构修饰，可增强其递送核酸的能力。例如，增加可电离脂质疏水结构域的不饱和程度，其核酸递送能力得到了显著提高。因为增加双键数量可能可以促进纳米颗粒融合基团的形成，从而可能会增强融合过程和内涵体的递送。此外，据报道，酸解离常数(pKa)会显著影响该制剂的递送能力（pKa对应可电离脂质或LNPs变成带正电时的pH值）。因此，纳米颗粒在生理pH值下表面呈中性，而在被细胞吸收到内涵体的酸性环境后带正电是很重要的。通过监控LNP的组成，可以进一步增强LNP递送核酸的能力。例如，当显著提高可电离脂质含量(高达57%)以及降低聚乙二醇(PEG)含量 (从10%降低到1.4%)，可明显提高脂质制剂的核酸递送能力。在开发不同的mRNA配方时，仍使用与50%可电离脂质和1.5% PEG相似的组成。为避免产生脂质相关毒性，在制备LNPs时（特别是需要经常给药的脂质），可使用具有高生物降解特性的可电离脂质，可以通过在疏水脂质尾部嵌入羧酸酯基团实现这种可生物降解特性。在体内，酯酶对这些基团的裂解可能有助于将化合物代谢成更易溶于水的产物，这些产物可在几小时内从血浆和组织中被清除。利用可电离脂质制备用于RNA疫苗的LNPs已在多项研究中得到证实。例如，除了磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-脂质外，还使用可电离的阳离子脂质(Acuitas专有)制备LNPs封装编码寨卡病毒菌株前膜和包膜糖蛋白的mRNA。对小鼠和非人灵长类动物进行皮下注射单剂量mRNA的LNP均能诱导产生保护作用。另一组研究人员开发了一种递送mRNA疫苗的LNP，在携带黑色素瘤的B16F10小鼠中可诱导细胞毒性T细胞反应。使用由可电离阳离子脂、磷脂、胆固醇和PEG-脂质制备的LNPs封装编码肿瘤相关抗原gp100和TRP2的修饰mRNA，用上述LNPs对小鼠进行皮下接种，可诱导强烈的T细胞活化，从而缩小肿瘤大小，延长小鼠的生存时间。研究还表明, 与未添加佐剂的LNP的对照组相比，增加脂多糖(LPS)作为佐剂的优化LNP制剂可增强mRNA疫苗的效力并改善小鼠的存活率。为增强LNPs在体内递送RNA的能力，新开发了被称为“类脂质”的可电离脂质。在Chahal等人的一项研究中，利用树状聚合物类脂和PEG-脂质开发的修饰树状聚合物纳米颗粒封装自扩增mRNA（编码H1N1流感病毒的血凝素(HA)蛋白，埃博拉病毒的糖蛋白(gp)或6种弓形虫特异性抗原(根尖膜抗原1 (AMA1)、致密颗粒蛋白6 (GRA6)、表面抗原1 (SAG1)、表面抗原2A (SAG2A)、弓形虫学蛋白2A (ROP2A)和肾上腺皮质蛋白18 (ROP18))）。用编码埃博拉病毒糖蛋白的mRNA疫苗对小鼠进行两次肌肉注射，在所有已获得埃博拉病毒完全保护的小鼠中都产生了高滴度的gp抗体。同样，在对小鼠进行单次肌肉注射编码H1N1流感病毒血凝素或弓形虫抗原的疫苗后，可以预防所有小鼠感染这些病原体。他们在另一项研究中使用同样的树状聚合物类脂纳米颗粒开发针对寨卡病毒的mRNA疫苗。3.2 辅助型脂质辅助型脂质，如PEG-脂质、胆固醇和磷脂酰胆碱，都具有独特的功能特性，他们通常包含在mRNA-LNP中，以增强纳米颗粒的稳定性；辅助型脂质也可促进细胞对脂质双分子层的摄取和破坏，从而提高核酸递送的效率。3.2.1 PEG-脂质聚乙二醇化脂质(PEG-脂质) 是通常位于LNP表面的重要成分。PEG-脂质由PEG的亲水分子与疏水烷基(或脂)链偶联而成，其中PEG结构域位于LNP表面，而烷基链附在LNP双分子层上。聚乙二醇化脂质附着在LNPs双分子层上，由于其空间位阻效应，可以延长LNPs的循环时间。这一特性降低了LNPs与血浆蛋白（调理素）的结合，减少了网状内皮系统对LNPs的快速清除，从而有助于纳米颗粒在病变部位聚集。此外，聚乙二醇化脂质的空间位阻特性可能会阻止纳米颗粒在制备过程中发生融合或聚集，从而获得粒径较小(50-100 nm)、低分散系数的均匀制剂。LNPs中聚乙二醇化脂质的含量应谨慎控制并保持在最低限度。PEG含量较高通常会增加LNPs在血液循环中的停留时间，但也可能会阻止它们与内涵体膜融合，妨碍核酸在细胞内递送。因此，正如Semple等人报道的，将PEG含量从10%降低到约1.5%(同时可电离脂质增加到57%)可以显著提高结合mRNA的LNPs的效力。此外，通过监控附着在LNPs上的PEG-脂质的大小可以控制PEG-脂质从纳米颗粒扩散的速度，并影响其在血液循环中的停留时间。较大的脂质锚点通常用于形成脂质体，这种脂质体在血液中循环的时间更长，以递送化疗药物。另一方面，较小的脂质锚点用于制备在血液循环中停留时间更短的LNPs，它们可以将siRNA递送到肝细胞。控制LNPs的血液循环时间对防止其产生毒性非常重要。附着PEG-脂质的LNPs更长的循环时间可能会提高封装核酸的LNPs的免疫原性和抗体反应(针对表面聚乙二醇)。强烈的抗体反应可能加快该制剂在血液循环中的清除速度，反复给药可能引发急性超敏反应。我们知道，在使用过聚乙二醇化或含聚乙二醇药物的患者体内会产生抗聚乙二醇抗体。这些抗体在反复静脉给药LNPs后产生，并特异性与LNP上的PEG部分结合，引起对LNP的加速清除和急性超敏反应，从而降低药物疗效。这种现象在需要多次给药以获得长期保护的免疫治疗中很常见。通过对PEG分子的修饰以降低其免疫原性或使用不同的给药途径可能是克服这种抗体反应的解决方案。3.2.2 胆固醇胆固醇与封装mRNA或siRNA的LNPs结合可能有助于提高LNPs的稳定性、结构完整性和膜融合性。一些研究表明，在LNPs中加入胆固醇可以高效递送被包裹的DNA，这可能是由于膜融合性得到增强。这些改善产生的原因是胆固醇在纳米颗粒的核心表现出低溶解度，因此可能以结晶形式聚集在LNPs表面，这可能会破坏脂质双分子层的稳定性并增强内涵体逃逸。此外，最近有研究表明，将胆固醇类似物(如C-24烷基植物甾醇)整合到LNPs上，可显著提高体外mRNA基因转染率。3.2.3 磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱的作用是形成和破坏脂质双分子层(因为脂质双分子层是圆柱形的)，因此可能促进内涵体逃逸。使用饱和、高熔点的磷脂酰胆碱，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，可以产生高度稳定的LNPs。然而，由此产生的LNPs不会促进内涵体逃逸，因此会降低被包裹核酸的递送效率。另一方面，利用不饱和的低熔点磷脂酰胆碱，如二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，可能产生流体化的LNPs，这些LNPs对血清蛋白的调节作用非常敏感。因此，磷脂酰胆碱通常与胆固醇结合形成高度稳定的LNPs，这些LNPs在生理温度下保持结构完整性，并可以促进内涵体释放。4.用于RNA疫苗的LNPs的生产方法以前，制备负载RNA的LNPs最常见的方法是利用含有核酸缓冲液的脂质成分的水合作用，然后，通过聚碳酸酯过滤器挤压使上述方法产生的LNPs均质化，以生产更小尺寸的LNPs。这种方法的核酸包封率较低，而且由于需要高度专业化的设备，难以规模化生产。另外，乙醇稀释法是一种耐用、易于规模化生产和重复性好的方法，该方法具有较高的核酸包封率(>80%)。这种方法是在特定浓度下，将脂质成分溶解在乙醇(一种可溶于水的溶剂)中。然后，在酸性pH条件下，用T型混合器将含有脂质的乙醇溶液与mRNA的水溶液混合。这两种溶液的混合相当于稀释了乙醇，从而降低了脂质的溶解度，然后脂质浓缩成带正电的颗粒，转而与带负电的核酸结合产生纳米颗粒。用中性缓冲液稀释上述纳米颗粒，以去除乙醇并中和pH，从而获得更稳定、更均匀的LNPs。微流控混合装置也被用于高效而快速的单个分散LNPs小规模生产。通过向装置内注入脂质的乙醇溶液，然后使用内置的人字形微混合器结构将其与水溶液混合。微混合器和微流控装置可以使两种溶液快速混合，并促进小尺寸LNPs的形成。此外，使用不同微混合器循环数可能证实溶液的混合可以产生LNPs。有报道称，与T型管混合法相比，使用微流体混合技术(采用人字形微混合器)制备siRNA-LNPs可以获得更高的核酸包封率(约70%)。采用低温透射电镜对这两种混合技术所产生的siRNA-LNPs的形态结构进行观察，结果表明，这两种混合方式所产生的LNPs具有相似的结构，它们都具有高电子密度核心，而不是类似于脂质体中观察到的较低电子密度的水核。作者发现，核心的电子密度取决于制剂中使用的可电离阳离子脂质的电荷数和饱和度。5.影响RNA/LNP疫苗在体内递送和摄取的因素5.1 给药途径不同的给药途径，如肌肉注射(IM)、皮内注射(ID)、皮下注射(SC)、静脉注射(IV)、结内注射(IN)和瘤内注射，均可用于递送mRNA疫苗。是否选择了最适合的给药途径是决定疫苗安全性和有效性的重要因素。此外，给药途径可能决定了在设计最优化LNPs时必须考虑的特定的细胞外屏障。研究发现，在肿瘤免疫治疗方面，为刺激全身免疫反应，从而产生对肿瘤的免疫，采用静脉注射mRNA肿瘤疫苗更合适。此外，有报道称，对小鼠静脉和腹腔注射含有编码萤火虫荧光素酶的修饰mRNA的LNPs，荧光素酶在肝脏中表达最高，但持续时间最短(1-4天)，而采用同样的疫苗进行小鼠皮内和肌肉注射，可使接种部位的蛋白表达时间维持10天。另一方面，梁等的研究表明, 与肌肉注射相比，对恒河猴皮内注射编码流感H10N8全长血凝素(HA)蛋白的核苷修饰mRNA(以LNPs为载体) ，可以产生明显更高的血凝素抑制(HAI)滴度和更强的CD4+ T细胞激活作用。这种更强的免疫原性是由于皮内注射疫苗后，皮肤的树突状细胞更快速地激活并迁移到引流淋巴结和抗原在接种部位保留时间更长。因此，对于mRNA疫苗，皮肤似乎是一种有效的给药途径，因为它提供了直接的局部转染并可刺激树突状细胞产生并迁移到淋巴系统。此外，mRNA-LNPs通过淋巴系统被动引流，可将mRNA直接递送到淋巴结和固有抗原提呈细胞和T细胞内。为了获得对纳米颗粒有效的淋巴递送，另一个重要因素是颗粒的大小。有报道称，200nm以下的纳米颗粒可以进入淋巴管，而较大的颗粒可滞留在接种部位。研究还表明，LNPs的聚乙二醇化可能促进其流入淋巴系统，同时有利于其在注射部位的分布和细胞摄取。此外，将靶向配体附着到LNPs上，可增加其在引流淋巴结内的诱捕作用。因此，对于淋巴系统摄取最终的LNPs来说，制备出未带电、体积相对较小、具有充分聚乙二醇化外表面的最优mRNA-LNPs是至关重要的。Wang等人制备的mRNA纳米颗粒系统具备了这些特性。聚乙二醇化的脂质纳米颗粒系统包括脂质包被的磷酸钙纳米颗粒，内含编码黑色素瘤相关抗原的mRNA。LNPs的功能化是通过附着甘露糖作为靶向配体，使淋巴结中的树突状细胞优先摄取最终的LNPs来完成的。最终的mRNA-LNPs小于50 nm，对小鼠皮下注射4小时后，就能有效地转运到淋巴系统。作者推测，磷酸钙核心促进了内吞溶酶体中LNPs的溶解，允许几乎全部剂量的编码黑色素瘤抗原的mRNA快速释放到淋巴结中固有的巨噬细胞和树突状细胞。该研究团队还发现编码酪氨酸相关蛋白2 (TRP2)的mRNA疫苗在B16F10黑素瘤小鼠模型中产生强烈的细胞毒性T细胞反应，并能显著抑制肿瘤生长。5.2 制剂的胶体稳定性为确保所接种制剂的有效性，mRNA-LNPs的胶体稳定性是需要仔细监控的另一个关键因素。众所周知，mRNA纳米颗粒可以与不同的体液相互作用。这种相互作用可能导致生物分子或内源性蛋白吸附到纳米颗粒表面，从而形成一种双分子或蛋白冠的复合体。纳米粒子-蛋白冠复合物的形成可能会降低mRNA-LNPs的胶体稳定性，导致颗粒聚集和mRNA的提前释放。因此，应在未稀释的生物液中对LNPs进行表征，以确定其稳定性、大小和mRNA包封率。关于这点，荧光相关光谱可以用来确定mRNA的络合程度，而荧光单颗粒跟踪技术可以用来测量LNPs的大小和聚集程度。改变LNPs辅助型脂质的组成也可能有助于提高其在血清中的稳定性。例如，据报道，胆固醇的加入可以降低脂膜的渗透性，增加脂膜的硬度，因此，有助于保持血清中LNPs的完整性。此外，在LNP成分中加入聚乙二醇化脂质可能会起到隐身作用以及通过降低对血浆蛋白的吸附能力提高胶体稳定性，从而避免在血液中聚集。然而，有报道称含有聚乙二醇化脂质的LNPs细胞摄取和转染效率较低。因此，仔细选择聚乙二醇化脂质很重要。我们知道，传统的聚乙二醇脂质（如二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG2000）可以与LNPs紧密相连，并阻止核酸的释放。利用具有短酰基链的特定PEG脂质(如神经酰胺-PEG脂质)可能有利于获得高转染效率，因为它们能够逐渐扩散出LNPs，形成不稳定的LNPs，从而释放其核酸成分。双分子冠状复合物的形成可能会改变LNPs的表面特性，这些改变可用于增强对载荷药物的靶向递送。已有文献证明，用于形成双分子冠状复合物的单个蛋白质的类型和数量取决于纳米颗粒的固有特性和生物活性。LNPs能与血液蛋白(调理蛋白如免疫球蛋白(IgG和IgM)、纤维连接蛋白和一些补体蛋白)相互作用，这种相互作用将促进吞噬细胞对纳米颗粒的识别、摄取，从而将纳米颗粒清除。LNPs的聚乙二醇化可能会降低吞噬细胞对纳米颗粒的识别及快速清除作用。有报道称，加入聚乙二醇化脂质降低了纳米颗粒吸附补体蛋白和免疫球蛋白的倾向，从而使纳米颗粒逃离巨噬细胞系统。然而，在有抗PEG抗体的患者中，注入这些聚乙二醇化纳米颗粒会加速对聚乙二醇化纳米颗粒的清除，并且会引起更强的补体相互作用。5.3 目标组分的合并在mRNA-LNP系统中加入抗体或靶向配体可促进mRNA在靶器官的分布和表达于特定免疫细胞(如树突状细胞)的特异表面受体对mRNA的摄取。通过靶向特定受体，纳米颗粒可能被导向细胞内运输通路，防止mRNA被降解。将mRNA纳米疫苗靶向不同C型凝集素受体(如12-205、CLEC9A和甘露糖受体)的理念可用于诱导这些特异性受体摄取mRNA-LNPs。此外，通过加入靶向组分，可实现对核酸的内吞保护，使其免受降解，并调控死细胞相关抗原的交叉提呈作用。Parhiz等人研究了核苷修饰的mRNA-LNPs与抗血管细胞粘附分子(PECAM-1或血小板内皮细胞粘附分子-1)抗体的结合。结果显示，小鼠全身给药后，与非靶向LNPs相比，靶向LNPs对肺内皮细胞的mRNA递送提高了200倍，蛋白表达提高了25倍。此外，对小鼠静脉注射后，加入了甘露糖基序的纳米颗粒可以增加甘露糖基化组织苷基化脂多糖mRNA对脾脏树突状细胞的转染效率。此外，Kedmi等人提出了一种将脂蛋白嵌入siRNA-LNPs中的模块化靶向平台。设计的纳米颗粒用于多种白细胞，并与选定的靶向抗体的可结晶片段结构域产生非共价相互作用。在只存在于炎症组织的炎症白细胞中观察到了白细胞介素10的靶向表达，从而证实了这些LNPs在治疗炎症性肠病方面的疗效。虽然已经证明加入靶向配体可以提高mRNA-LNP的递送效率和治疗效果，但应指出的是，附着靶向成分也可能会增加LNP系统生产过程的复杂性、成本和调控难度。此外，当脂质纳米颗粒暴露于生物体液中，与介质中的蛋白质相互作用，从而形成蛋白冠状复合物时，一些靶向配体的靶向特异性可能会失效。因此，应考虑一些折中方案，以实现可能的临床效益与靶向mRNA-LNP生产过程的复杂性及生产成本之间的平衡。一些研究提出了纳米颗粒与调理素血液蛋白(即:调理作用)的相互作用可作为被动靶向抗原提呈细胞的方法，或通过疫苗平台中的补体相互作用产生树突状细胞的有效激活。Reddy等人的一项研究表明，皮内注射超小的卵白蛋白纳米颗粒作为疫苗平台，可通过补体相互作用靶向和激活淋巴结中的固有树突状细胞。作者的结论是，对小鼠皮下接种卵白蛋白纳米颗粒，通过靶向淋巴结可能仅仅诱导产生体液免疫和补体激活。全身接种mRNA-LNP后，位点特异性靶向和器官分布的差异与LNPs的生物分子冠状物和表面电荷有关。例如，吸收载脂蛋白E作为靶向配体可使肝脏从可电离(或近中性)LNPs中特异性摄取(si)RNA，而不能从阳离子型LNPs中摄取(si)RNA。另一方面，研究发现，采用阳离子脂质和胆固醇制备的阳离子mRNA脂质复合物主要聚集在肺中转染肺树突细胞，用于递送核苷修饰的mRNA和单磷酸基脂质A (TLR4激动剂)。出乎意料的是，Kranz等人发现，降低mRNA脂质复合物的脂质含量会使纳米颗粒携带负电荷，并使其聚集器官从肺转移至脾脏。靶向阴离子mRNA脂质复合物的临床研究(I期)表明，黑色素瘤患者脾脏中存在核酸聚集。5.4 佐剂的整合通过在疫苗配方中加入某些被称为佐剂的化合物，可以增强对抗原的免疫应答。在疫苗配方中使用佐剂可以更有选择性地刺激免疫通路以获得抗原特异性免疫反应(细胞免疫反应或体液免疫反应)。LNPs由于其含有脂质成分，自身可作为佐剂。有些脂质可诱发炎症，刺激免疫系统。例如，据报道，与使用阴离子或中性脂质制备的LNPs相比，用阳离子脂质（如DOTAP）制备的LNPs递送RNAi，在小鼠治疗中可诱导更强的伴随Th1细胞因子的促炎症反应和toll样受体4 (TLR4)的激活。此外，在小鼠皮肤注射含有用可电离阳离子脂质制备的编码绿色荧光蛋白(GFP) mRNA 的LNPs 24小时后，观察到了促炎症反应。因此，激活表达于抗原提呈细胞(APCs)上toll样受体，已经成为刺激细胞因子的产生从而引发炎症反应的佐剂整合靶点。研究人员已经对作为toll样受体激动剂的不同类型的佐剂进行了评估。例如，与非脂质A配方相比，将细菌单磷酸基脂质A整合到LNPs可制备出更有效的疫苗。据报道，佐剂(如未甲基化的CpG-寡核苷酸)与蛋白疫苗共封装时可增强免疫应答。此外，Wu等开发的小分子免疫增强剂作为TLR激动剂诱导免疫激活作用，可以作为制备LNPs的佐剂。非mRNA佐剂的整合可能并不是必要的。哺乳动物细胞可以通过不同的模式识别受体识别外源mRNA，如先天免疫受体TLR3、TLR7和TLR8。刺激这些受体将导致编码促炎细胞因子、趋化因子和1型干扰素的基因转录上调。这些受体介导的反应有助于启动免疫反应。6.作为RNA疫苗递送系统LNPs的临床前和临床应用LNPs在RNA疫苗递送系统的应用有助于充分发挥疫苗的潜力，因为这种递送系统可以防止封装的核酸大分子被核酸酶降解。作为递送系统，LNPs通过细胞膜被细胞摄取(通过内吞作用)，只有在内涵体逃逸后才将其包裹的mRNA递送到细胞质中。LNPs也可能影响固有免疫反应，也可以为mRNA疫苗提供协同佐剂作用。RNA在预防和治疗方面的各种应用角色促进了RNA疫苗对传染性病原体和癌症的不同应用。许多将LNPs作为自扩增mRNA和传统mRNA的递送系统预防各种传染性疾病的研究表明，LNPs在不同的动物中具有强烈和快速的免疫刺激作用。表1总结了以各种脂质配方中mRNA疫苗防治传染性疾病和癌症的临床前研究。此外，为预防传染性疾病开发的不同mRNA疫苗已进入临床研究，以评估其有效性。表2总结了这些临床试验的现状。由Bahl等人主持，由Moderna Therapeutics赞助的临床研究被认为是第一个使用LNP-mRNA疫苗(编码H10N8流感HA抗原)的人体试验(NCT03076385)。本研究结果显示，对31名受试者间隔3周进行两次肌肉接种 100µg疫苗后，所有受试者均产生了不小于40的流感H10N8 HA抗原特异性抗体滴度，表明该疫苗具有良好的免疫原性。此外，研究表明，接种43天后，87%的接种者血清中产生了≥20的病毒中和抗体滴度。尽管与动物模型试验相比，人体试验产生的抗体滴度较低，但这结果也是令人满意的。Feldman等人也报道了类似的发现。这些研究表明，以LNP为载体，编码H10N8和H7N9病毒的全长血凝素的mRNA疫苗是安全的，对健康成人肌肉接种100µg和25µg剂量的疫苗，能在3周内产生强烈的体液免疫反应。作者还报道，两种疫苗在100µg剂量下与使用或不使用佐剂制备的已获批疫苗具有相似的安全性和反应原性。表2 针对传染病和癌症的临床研究的mRNA疫苗HCMV, human cytomegalovirus; hMPV, human metapneumovirus; HPIV3, human parainfluenza virus type 3; LNP, lipid nanoparticle; PCD, estimated primary completion date; TAAs, tumor-associated antigens.6.1．预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染的RNA/LNP疫苗目前，RNA疫苗已成为预防2019年12月因严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染而出现的冠状病毒(COVID-19)大流行最有效的疫苗技术之一。对编码SARS-CoV-2刺突蛋白或刺突受体结合结构域的LNP-mRNA疫苗已开展了多项临床前研究，以评估疫苗的有效性和免疫原性。例如，与电穿孔pDNA疫苗相比，用LNP封装编码病毒刺突蛋白的的自扩增RNA免疫小鼠可产生明显更高的SARS-CoV-2特异性抗体，并诱导了强烈的细胞免疫反应。这些结果与所使用LNP的性质有关。 另一项临床前研究评估了编码SARS-CoV-2全长刺突蛋白或刺突受体结合域的核苷修饰mRNA在小鼠体内的免疫原性。据观察，这两种疫苗在单次接种后除了可产生强烈的抗体反应外，还能诱导强烈的T和B细胞反应。此外，美国马萨诸塞州剑桥市Moderna Therapeutics公司开发了一种编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA-LNP疫苗(mRNA-1273)，用该疫苗免疫非人灵长类动物可产生高中和活性和显著升高的刺突蛋白特异性抗体。由LNPs制备的mRNA疫苗的临床前研究结果有望为COVID-19提供疫苗解决方案，并使RNA疫苗推进到临床研究阶段。Moderna mRNA-1273可以认为是在确定SARS-CoV- 2基因序列42天后第一种进入I期临床研究的疫苗(识别号NCT04283461)。该疫苗生产公司最近宣布，根据对第一次III期临床研究的中期分析，该疫苗的有效性为94%。不同的机构和制药企业正在利用不同的LNPs作为平台技术，开发针对COVID-19的RNA疫苗。例如，BioNTech (Mainz, Germany)与辉瑞(New York, NY)合作开发的mRNA疫苗(BNT162)由四种不同的mRNA格式组成，以S蛋白和受体结合域的抗原为靶点，并以LNP作为载体。截至2020年11月9日，BioNTech(德国美因茨)和辉瑞(美国纽约)报告称，根据对III期临床研究的首次中期疗效分析(鉴别号: NCT04368728)， BNT162疫苗对COVID-19的有效性超过90%。总之，使用LNPs制备mRNA疫苗可以被认为是一种很有前景的预防SARS-CoV-2的方法。这些脂质制剂可迅速生产，从而加快疫苗的开发。用LNPs制备的针对COVID-19不同的mRNA疫苗在各种临床试验中均显示出良好安全性和免疫原性。动物研究数据显示，LNP-mRNA疫苗能诱导强烈的中和抗体反应并产生对 SARS-CoV-2的高保护率。6.2 预防流感病毒感染的RNA/LNP疫苗mRNA流感疫苗是研究最广泛的mRNA疫苗之一，因为它们易于评估在小动物中的疗效，而且可以测试诱导的T和B细胞反应。有报道称，一旦确定流感病毒血凝素(HA)抗原的基因序列，就可以在短时间内生产出自扩增mRNA疫苗。在此基础上，在确定HA抗原基因序列的8天内，就研制出了中国H7N9流感病毒自扩增mRNA疫苗(基于LNPs)，并证明了其在小鼠体内具有免疫原性。Lindgren等人也开发了一种经修饰的编码大流行H10N8流感毒株的血凝素的非复制mRNA-LNP疫苗。用该疫苗对恒河猴进行肌肉和皮内接种，接种后都可使B细胞反应增强，并在引流淋巴结中形成生发中心(GCs)。此外，还观察到H10特异性T滤泡辅助细胞水平的增加，并与人类季节性流感疫苗接种后产生的高亲和力抗体反应相关，上述结果表明产生了血清转化。有研究人员使用mRNA-LNP诱导对不同病毒毒株保守表位(嵌合及无头血凝素结构)的强烈地免疫反应开发了一种通用流感疫苗。这种通用流感疫苗产生了对血凝素柄区结构域的抗体，对动物抵抗各种不同的流感病毒均表现出了很好的保护作用。Pardi等人使用表达全长流感病毒血凝素的核苷修饰mRNA-LNPs制备了另一种具有广泛保护作用流感疫苗并对其进行了疗效评价。在不同的动物模型(小鼠、家兔和雪貂)中，用上述疫苗进行单次接种，可产生血凝素柄区特异性抗体反应，从而对小鼠的同源、异源和异亚型流感病毒感染提供保护。此外，LNPs被用于递送编码H10N8或H7N9流感毒株血凝素的修饰mRNA疫苗。该疫苗在小鼠、雪貂和食蟹猴身上产生了强劲、快速和持久的免疫反应。6.3 预防狂犬病病毒感染 的RNA/LNP疫苗有人利用LNPs制备了预防狂犬病毒感染的mRNA疫苗。Lutz等人开发了一种编码狂犬病毒糖蛋白(RABV-G)的经序列优化、未修饰的mRNA疫苗。用该疫苗对食蟹猴进行单次接种，产生的病毒中和滴度水平超过了世界卫生组织设定的对应人类保护水平的参考值(0.5 IU/mL)。这些抗体滴度是剂量依赖性的，在第28天对动物进行第二次接种后其水平进一步提高了20倍。作者注意到，在1年的观察期内，接种了疫苗的食蟹猴对狂犬病均有稳定的抵抗作用。6.4．预防寨卡病毒感染的RNA/LNP疫苗不同研究团队报道了mRNA/LNPs疫苗对寨卡病毒的保护作用。Pardi等人研究表明,对小鼠(30µg剂量)或恒河猴(50µg剂量)进行单次皮下接种编码寨卡病毒的前膜和包膜(prM-E)糖蛋白的核苷修饰mRNA/LNPs疫苗，在两种试验动物中均可诱导产生抗寨卡病毒中和抗体，从而引起强烈和持久的保护性免疫反应。Richner等也报道了对小鼠肌肉注射编码寨卡病毒prM-E糖蛋白的修饰mRNA/LNPs疫苗（2个10µg剂量），其结论与Pardi等人研究一致。此外，Richner等人设计了一种mRNA/LNP疫苗，对E蛋白的保守的融合环表位进行了基因突变。研究发现，在细胞培养和小鼠试验中，该突变mRNA疫苗对寨卡病毒感染具有保护作用，减少了登革热病毒感染(与寨卡病毒感染密切相关)的增强抗体的产生。研究人员对上述基因突变疫苗预防由寨卡病毒感染引起的可能在怀孕期间发生的胎儿先天性畸形的效果进行了评估。作者报告说，接种两次该疫苗预防了怀孕小鼠由寨卡病毒引起的母体、胎盘和胎儿感染。此外，可以设计出递送编码不同抗原的多种mRNA的mRNA疫苗，从而在一次免疫后产生对多种病原体或同一传染病病原体的不同抗原的免疫作用。这些编码不同抗原的多价mRNA对于刺激不同的免疫反应或靶向染病病原体多个生命周期中表达的抗原特别有用。例如，John等人的研究描述了封装核苷修饰mRNA的LNPs的制备，该mRNA编码人类巨细胞病毒(CMV)五聚体蛋白复合物的五个不同亚基和糖蛋白B (gB)。对小鼠和非人灵长类动物肌肉接种后，该疫苗能在体内有效递送，并产生了强烈的免疫反应和广谱中和抗体。作者还制备了另一种编码免疫显性巨细胞病毒T细胞抗原pp65的LNP/mRNA疫苗。将这种传统疫苗与五聚体蛋白复合物和糖蛋白B疫苗混合接种，可产生多种抗原或广谱T细胞应答，且不会干扰用多价五聚体蛋白复合物接种小鼠产生的抗体水平。表达人巨细胞病毒五聚体蛋白的mRNA疫苗已进入临床评估阶段，目前正在进行I期临床试验。6.5.肿瘤RNA/LNP疫苗肿瘤疫苗既可作为预防(防止引起癌症的病毒感染)性疫苗，也可作为治疗(治疗现有癌症)性疫苗。2010年，首个治疗性肿瘤疫苗Sipuleucel-T (provenge)被批准用于治疗前列腺癌。不同的研究已经证实了肿瘤疫苗在降低癌症复发率以及提高患者总体生存期方面的临床效果。肿瘤疫苗可以编码如肿瘤相关抗原(TAAs)和肿瘤特异性抗原(TSAs)的多种抗原。TAAs包括在癌细胞中过度表达但也存在于正常细胞中的蛋白质。TSAs仅在肿瘤细胞中表达，它们来源于病毒的原癌蛋白或基因突变或重排产生的蛋白。此外，肿瘤细胞在肿瘤发展和癌变过程中的突变可能导致被称为新抗原的变异蛋白的产生。这些类型的蛋白质可以通过分析单个癌细胞的基因突变进行识别。新抗原的使用可能使个性化的新表位肿瘤疫苗的生产成为可能，这可能有利于增强耐受性和限制正常组织毒性，与传统肿瘤疫苗相比，个性化肿瘤疫苗还能提高抗肿瘤免疫反应。个体化RNA突变体疫苗和个体化多肽疫苗是个体化疫苗在一期临床试验中显示出良好效果的例证。第一款个性化疫苗IVAC MUTANOME (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH)是一个编码多个新表位的RNA疫苗, 在I期临床试验中，研究人员对其靶向突变新抗原治疗黑色素瘤患者的免疫原性,安全性和耐受性效果进行了评估(鉴别号:NCT02035956)，结果观察到了对疫苗抗原强烈的免疫反应。此外，该疫苗对选定的125个新表位中的60%都产生了T细胞应答，且没有药物不良反应，这表明入组患者对疫苗具有良好的耐受性。与其他类型疫苗相比，mRNA肿瘤疫苗的优势之一是可以从肿瘤样本中获得RNA，从而生产患者特异性抗原，然后制备个性化疫苗。此外，toll样受体TLR3、TLR7、TLR8提供的信号可能反映了mRNA作为佐剂增强的免疫应答作用。此外，mRNA疫苗不存在感染风险，而且其具有生产迅速、可规模化生产、廉价的优点。当编码的抗原在细胞质中被翻译成抗原提呈细胞或APCs(树突状细胞或巨噬细胞)的蛋白质时，mRNA疫苗会刺激特异性免疫反应。表达的蛋白质通过主要组织相容性复合体(MHC) I类分子呈递给CD8+ T细胞，刺激细胞反应。通过mRNA编码的抗原与来自溶酶体蛋白的MHC II类转运信号的融合，可能诱导在癌症免疫治疗中至关重要的支持性CD4+ T辅助细胞反应的产生。因此，可以开发出编码肿瘤特异性抗原的mRNA疫苗，产生针对肿瘤细胞的特异性T细胞免疫反应。使用安全且具有生物相容性的纳米颗粒系统，如脂质纳米颗粒和脂质体，制备和优化mRNA的递送，从而进行个性化mRNA肿瘤疫苗的临床试验和体内给药。纳米颗粒系统作为mRNA肿瘤疫苗载体的应用在防止mRNA降解方面具有很多优越性，而且可能通过疫苗与佐剂的共同递送以及配体靶向树突状细胞，增强抗肿瘤反应。此外，纳米颗粒系统为控制疫苗的释放和分布提供的可能。研究人员已经在脂质纳米系统中制备出了编码不同抗原的个性化mRNA肿瘤疫苗，并已进入临床研究(NCT03897881，NCT02316457, NCT03313778, NCT03480152, NCT03323398)。已有报道称LNPs封装个性化mRNA疫苗已成功应用于黑色素瘤患者的治疗。所有患者对疫苗的新表位均表现出T细胞应答。此外，接种疫苗后，两名受试者的黑色素转移酶显著降低，从而提高了患者的存活率。为了诱导强烈细胞毒性CD8+ T细胞应答，Oberli等人开发了LNPs，用于递送编码模型免疫蛋白 (卵白蛋白（OVA）)的mRNA疫苗。作者确定了一种包含可电离脂质(cKK-E12)和添加剂(十二烷基硫酸钠)的最佳配方疫苗。当cKK-E12的摩尔比从35%降低到10%时，该配方疫苗可以增强T细胞反应。使用编码相应抗原的mRNA疫苗对表达OVA的转基因肿瘤或侵袭性B16F10黑素瘤的模型小鼠进行免疫，可产生很强的CD8+ T细胞免疫激活，同时减缓肿瘤生长，缩小肿瘤体积，从而延长疫苗接种小鼠的生存期。通过将不同组分附着在靶向免疫细胞表面特异性受体的LNP表面，进而递送其封装的mRNA，增强LNP的效力。另外，LNPs与佐剂共同给药可能会增强对免疫反应的刺激。例如在荷瘤（B16F10黑色素瘤）小鼠中，将TLR4激动剂(脂多糖;LPS)整合到LNP中，可减缓肿瘤生长并延长小鼠存活时间。同样，Verbeke等人证实，对核苷修饰mRNA与含有TLR4激动剂(单磷酸基脂类A;MPLA)的DOTAP-胆固醇mRNA脂质复合物共同给药，可以诱导固有免疫反应，并能引起体内抗原高水平表达。此外，Lee等人将脂肽三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸(Pam3)（一种TLR1和TLR2激动剂）作为佐剂加入到封装卵白蛋白mRNA的LNPs中，用Pam3-LNP对小鼠进行肌肉接种，可引起肿瘤抗原的高水平表达，并增强细胞免疫反应。LNPs在递送mRNA肿瘤疫苗方面的另一个优点是，可以设计出递送编码细胞因子mRNA的LNPs，以激活免疫反应并杀伤肿瘤细胞，而不会对健康细胞产生毒性或副作用。Lai等人研究了编码白细胞介素-12 (IL-12，一种具有抗癌活性的细胞因子)的mRNA-LNPs对肝癌模型转基因小鼠肿瘤生长的抑制作用。对小鼠进行mRNA-LNPs疫苗全身给药，结果表明，该疫苗不仅不会产生对健康组织的毒性，而且能减缓肝脏肿瘤的生长，并提高治疗小鼠的存活率。Jain等人研究了另一种提高治疗性mRNA特异性的策略。作者研究了使用治疗性mRNA对患病或癌变细胞进行编程，使其合成一种有毒蛋白质的可能性，这种蛋白质将导致这些细胞的自我毁灭，而不会损害正常细胞。为此，将microRNA (miRNA)的靶点整合到修饰mRNA中，编码毒蛋白或凋亡蛋白，如caspase或PUMA (p53上调凋亡调节剂)。miRNA结合位点可以靶向只存在于健康细胞中的miRNA，然后使这些细胞能够识别并降解毒性mRNA。研究发现，小鼠瘤内给药携带这些miRNA-mRNA组合序列的LNPs可以阻止健康细胞中mRNA毒蛋白的表达，但可以选择性地触发肿瘤细胞的凋亡，而不会引起全身毒性。7.结论RNA疫苗被认为是一种有前景的、高效的、廉价的、可规模化生产的疫苗设计平台。与传统疫苗相比，RNA疫苗因其生产过程快速、生产成本低的优点，更适合于传染病大流行期间的免疫接种。LNPs作为mRNA疫苗的递送系统的潜力已在许多临床前研究中证实，而且LNPs除了能使核酸进入靶细胞外，还能有效地防止mRNA胞外降解。然而，将动物试验转化为人类临床研究可能出现的挑战限制了以LNP制备的RNA疫苗进入市场的数量。随着Onpattro®的初步批准和各种mRNA纳米载体的开发，在封装mRNA疫苗和将递送RNA疗法用于其他领域（如基因编辑和治疗性蛋白质的生产），LNPs技术都已被证明是有效的。为了得到最终更高疗效的非肠道接种的LNP，需要对其配方进行一些调整。这些调整应该适用于诱导固有用于免疫治疗特定的感染或疾病。总的来说，本文对LNP作为mRNA疫苗递送系统的研究，将为进一步提高LNP制剂中其它核酸产品的有效性和耐受性奠定基础。原文来源：Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines

单克隆抗体（mAb）具有高特异性并能增强免疫反应的特点，是一种潜在的病毒感染治疗剂和预防剂。而抗体工程可增强效应器功能，延长mAb半衰期。结构生物学的进步，则利于通过识别病毒蛋白中的易损区域选择和优化有效的中和mAb，并设计疫苗。COVID-19的爆发使针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）中和mAb的研发日益火热，目前已有几款mAb获得紧急使用授权（EUA）。mAb的应用不仅有益于COVID-19应对，而且还推动其他传染病的治疗和预防。在这里，我们总结了抗体发现和抗体工程的研究进展，以及抗病毒感染mAb的开发过程，这些病毒包括SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒（RSV）、埃博拉病毒（EBOV）、人类巨细胞病毒（HCMV）和流感病毒。自1970年代Köhler和Milstein开发能够产生单克隆抗体（mAb）的杂交瘤技术以来，mAb已成为治疗癌症和免疫疾病的关键药物，2021年第100种基于抗体的治疗药物已获得美国食品和药物管理局（FDA）批准。然而，尽管利用抗体对抗传染病的历史可以追溯到一个多世纪以前的血清应用，但只有少数mAb药物用于治疗或预防传染病。截至2022年初，已有6种针对病原体的mAb已获得FDA批准（表1），适应症包括预防呼吸道合胞病毒（RSV）感染、预防和治疗炭疽感染、预防艰难梭菌感染复发和治疗埃博拉病毒（EBOV）感染。表1：FDA批准的用于传染病适应症的mAb2020年，COVID-19的迅速传播使研究人员大力开发针对SARS-CoV-2的中和mAb。现阶段，超过20种mAb进入临床开发阶段，其中一些mAb已获得FDA和全球其他机构的EUA（表2）。尽管疫苗一直是应对COVID-19的主力军，但mAb也有一定贡献，特别是针对免疫功能低下或有轻度至中度COVID-19的患者。表2针对COVID-19上市或处于后期临床研究的mAb1抗体特性与抗体工程1抗体结构和功能抗体是病原体感染或接种疫苗后由浆细胞或受刺激的记忆B细胞产生的天然生物分子，为Y形异二聚体，由两条25kDa的轻链和两条至少50kDa的重链组成，重链和轻链之间通过多个二硫键和非共价相互作用连接（图1a）。抗体也可分为抗原结合结构域（Fab）和可结晶片段结构域（Fc）（图1b），两个Fab结合并中和病原体，通过铰链与Fc相连，Fab相对Fc具有较大的构象灵活性，能与抗原产生强烈相互作用。糖基化的Fc结构域与其他蛋白质结合，可以介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性等细胞吞噬作用（图1c）。Fc结构域还可以与新生儿Fc受体（FcRn）相互作用，影响抗体药代动力学。抗体的种类取决于alpha、mu、gamma、epsilon、delta等基因片段是否与其可变区重组。人类以下基因产生不同的抗体亚类：α基因片段产生IgA1和IgA2，γ基因片段产生IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，mu片段产生IgM，epsilon片段产生IgE和delta片段产生IgD。除IgD外，每个亚类都能消除不同类型的病原体，IgG类主要针对血液和细胞外液中的病原体。不同抗体亚型的序列变异决定了它们对FcRn、FcγR和补体蛋白C1q的亲和力和特异性。其中IgG1启动ADCC和CDC（图1c），IgG2和IgG4是较差的CDC激活剂，而IgG3有效激活CDC，大多数临床使用或针对感染性疾病开发的治疗性mAb是IgG1亚型。图1：病毒感染期间单克隆抗体的作用机制2抗体作为抗病毒药物一个多世纪以来，单克隆或多克隆抗体已被用于传染病治疗和预防。抗体可以通过多种机制对抗病毒感染。首先，抗体可以防止包膜病毒的病毒糖蛋白或无包膜病毒的蛋白壳与靶宿主细胞结合，这些病毒蛋白在病毒生命周期中具有两个主要功能：与细胞受体结合，介导病毒和细胞膜融合（在包膜病毒的情况下）或渗透到细胞质中（在无包膜病毒的情况下）。例如，SARS-CoV-2进入宿主细胞是由病毒刺突（S）糖蛋白与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体之间相互作用介导的。ACE2在呼吸系统、胃肠道和内皮细胞上表达（图1b）。病毒刺突与ACE2的相互作用可以被靶向刺突受体结合域（RBD）的抗体阻断，抑制病毒感染。通过与白细胞上的补体蛋白C1q或FcγR结合的抗体也可以对抗病毒感染（图1c），导致病毒和/或受感染宿主细胞直接裂解；抗体还可以促进或诱导吞噬作用，或导致有毒化学物质的释放，如细胞因子或活性氧。极少数情况下，抗体与病毒粒子的次优结合可通过抗体依赖性增强（ADE）过程促进病毒发病，其中FcγR识别病毒-抗体复合物可利于病毒进入宿主免疫细胞。使用动物抗原血清是第一种被动免疫法，但有可能引发人类抗体免疫反应，因此可使用人的血液作为抗体来源，这就是恢复期血浆疗法（CPT）。但个体之间不同的抗体反应限制了其发展，且CPT还存在安全风险，包括过敏反应和感染其他病毒（如HIV、乙型肝炎和丙型肝炎）的低风险。总体而言，CPT作用可能仅限于治疗选择有限的早期阶段。鉴于CPT的局限性，研究人员越来越关注使用中和mAb对传染病进行被动免疫。3开发人类治疗性抗体治疗病毒感染的策略人类mAb治疗病原体的策略可分为靶向已知抗原和靶向未知抗原（图2）。靶向已知抗原的mAb从噬菌体展示文库中筛选，该文库由免疫或感染个体的免疫球蛋白可变基因构建。尽管这些方法已分离出针对多种病原体（例如HIV29、SARS-CoV-2和炭疽毒素）的中和抗体，但筛选出的mAb并不代表天然抗体库。随后开发的第二种靶向方法，是直接分离抗原特异性记忆B细胞，然后识别它们产生的mAb。记忆B细胞可以来自恢复期患者的血浆，或来自携带人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠。图2：抗体的发现方法4抗体工程对mAb进行工程改造以改善其治疗特性被称为是抗体工程，研究表明Fc区域突变会增加或降低ADCC和/或CDC有效性，减少IgG分解代谢可改善mAb体内半衰期。工程改造的Fc区域以延长其半衰期的多种抗病毒mAb已进入临床阶段，最先进的是sotrovimab（也称为VIR-7831和GSK4182136），使用LS修饰Fc区域氨基酸，由Vir Biotechnology和GSK开发，针对SARS-CoV-2病毒，于2021年获批。Vir Biotechnology还将LS修饰用于VIR-3434，该mAb旨在预防10种乙型肝炎病毒基因型对肝细胞的慢性感染，目前处于II期试验（NCT04856085）。其他使用LS修饰的抗病毒mAb，包括用于治疗HIV的VRC01LS、VRC07-523LS和elipovimab（GS-9722）。VRC01LS是一种由美国国立卫生研究院（NIH）开发的广泛中和mAb，其血清半衰期比未改造的长约四倍，且在血清中显示相似中和活性，目前处于I期试验（NCT02256631）中。抗体工程还可用于生成新的抗体形式，例如设计用于识别两种不同表位或抗原的双特异性抗体（bsAb）。因此，单个bsAb可以与两种不同蛋白质或同一蛋白质上的两个不同位点结合。目前科学家已开发了广泛的bsAb抗体，特别是应用于肿瘤学，以及传染病研究。其他可用于抗病毒药物的新型工程抗体形式包括纳米抗体（15kDa），与小鼠和人类抗体结合域（50kDa）相比，仍保留完整抗原特异性。此外，纳米抗体能够合常规抗体通无法触及的表位，如被聚糖掩盖的保守病毒结构域。最后，锚蛋白重复蛋白（DARPins）等抗体模拟物可以提供高亲和力并和多特异性。例如，由Molecular Partners和诺华开发的一种多DARPin（ensovibep）能同时与SARS-CoV-2刺突RBD的三个单元结合，目前正在临床试验中（NCT04828161）。2抗病毒感染的抗体1抗冠状病毒，包括SARS-CoV-2冠状病毒是冠状病毒科有包膜的正义单链RNA病毒，可以感染多种哺乳动物和鸟类，导致呼吸道和/或肠道疾病。人类冠状病毒是引起普通感冒的主要原因，导致人类约30%的轻度呼吸道感染和非典型肺炎。4种不同的冠状病毒通常在人群中传播，包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63和HCoV-229E。在过去的二十年中，出现了3种可能导致人类生命危险疾病的冠状病毒。严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）于2002年在中国出现并传播，在37个国家造成8100人感染和近800人死亡。十年后，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）在阿拉伯半岛出现，并传播到21个国家，感染约2500人，致死率为35%。2019年，在中国发现了一种现在称为SARS-CoV-2的冠状病毒感染，这种冠状病毒可导致发烧、严重的呼吸道疾病、肺炎、腹泻、呼吸困难和多器官衰竭。根据世界卫生组织（WHO）的数据，截至2022年2月，已确认超过4.14亿例病例，导致至少580万人死亡。所有冠状病毒都使用三聚体刺突（S）跨膜糖蛋白进入宿主细胞。S蛋白是一种I型膜I类融合蛋白，其有两个功能亚基，它们在蛋白质融合前构象中保持非共价结合（图3a）。氨基末端S1亚基负责与宿主细胞受体结合，而羧基末端S2亚基负责融合病毒和细胞膜。S1亚基进一步分为N端结构域（NTD）和RBD（图3a）。SARS-CoV-2的基因组序列与SARS-CoV有79.6%的同一性，并且与SARS-CoV相似，依靠S1亚基RBD与宿主细胞（如肺细胞和肠细胞）上的ACE2受体结合。在与宿主细胞结合后，S2亚基构象变化导致病毒融合并进入靶细胞（图3b）。S糖蛋白一直是开发靶向SARS-CoV-2mAb的焦点蛋白，它是针对SARS-CoV和MERS-CoV的有效中和mAb靶标。超过20种靶向S糖蛋白的mAb已进入临床试验，其中一些已获得FDA批准（表2）。然而，迄今为止针对COVID-19治疗的大多数mAb会因为SARS-CoV-2变体（VOC）的迅速出现而治疗受限。诸如Alpha、Beta、Gamma和Delta等VOC在S糖蛋白区域有9-12个突变，这些突变会影响mAb的治疗性。Omicron变体在S糖蛋白中累积超过35个突变，其中15个发生在RBD中，RBD不仅是与宿主受体ACE2结合的位点，也是治疗性mAb的关键靶点。Omicron VOCs（BA.1、BA.1.1和BA.2）的出现使许多mAb失效，包括casirivimab和imdevimab的联合使用、bamlanivimab和etesevimab的联合使用以及sotrovimab（表2）。不过，最近开发的两种mAb，bebtelovimab和P2G3对OmicronVOC依然能保持活性。S蛋白上的NTD结构域也是一个重要靶点（图3a），NTD特异性抗体的结构表征表明mAb靶向NTD突出区域的上侧。41个NTD特异性mAb的表位作图鉴定了6个抗原位点，其中一个被所有已知NTD特异性中和抗体识别，并被称为“NTD超位点”，由残基14-20、140-158和245–264组成，目前NTD特异性抗体起作用的中和机制仍有待确定。确定使用mAb治疗的目标人群和最佳时机至关重要。mAb被认为在具有严重COVID-19高风险的个体中发挥预防作用，如老年人和/或患有多种疾病的个体，以及对疫苗接种反应不佳或免疫功能低下的个体。最后，尽管最初担心抗SARS-CoV-2mAb会引起ADE风险，但目前没有证据表明在临床试验中任何mAb都会发生ADE。图3：针对受体结合域的SARS-CoV-2刺突蛋白和中和抗体2抗人呼吸道合胞病毒RSV是一种有包膜的负链RNA病毒，属于肺病毒科。RSV感染极为常见，通常会导致轻微的呼吸道症状。1990年代末至2000年代初，第一个名为RespiGam的RSV静脉注射免疫球蛋白制剂被用于预防患有支气管肺发育不良和早产幼儿的严重RSV相关下呼吸道疾病。RespiGam于2003年停止使用，取而代之的是帕利珠单抗预防，帕利珠单抗也是第一个用于治疗高危婴儿严重RSV感染的中和mAb，于1998年获批。在三种RSV表面蛋白（F、G和SH）中，F特异性抗体在受感染的人类血清中具有中和活性，因此F糖蛋白一直是RSV单克隆抗体开发的重点。F糖蛋白是负责将病毒膜与细胞膜融合的三聚体I型融合糖蛋白，与许多其他病毒融合糖蛋白类似。帕利珠单抗是一种人源化mAb，可与F糖蛋白的抗原位点II结合（图4a）。Motavizumab是一种亲和力高的帕利珠单抗衍生物，效力高10倍，与帕利珠单抗相比，其RSV住院率相对降低了26%。然而，2010年III期临床试验的结果显示，与帕利珠单抗相比，Motavizumab不良事件增加，导致其开发终止。用于治疗RSV的新型mAb，例如nirsevimab（MEDI8897）和suptavumab（REGN2222），Nirsevimab衍生自一种名为D25的mAb，由AIMM Therapeutics分离，靶向抗原位点Ø，在体外比帕利珠单抗更有效。3抗埃博拉病毒埃博拉病毒是属于丝状病毒科的单链RNA病毒。埃博拉病毒属包含6种不同名称：本迪布焦埃博拉病毒（Bundibugyovirus）、雷斯顿埃博拉病毒（Restonvirus）、苏丹埃博拉病毒（Sudanvirus）、塔伊森林埃博拉病毒（TaïForestvirus）、邦巴里埃博拉病毒（Bombalivirus）和扎伊尔埃博拉病毒（埃博拉病毒，EBOV）。EBOV会导致严重疾病，病死率高达25-90%。EBOV的糖蛋白是三聚体I类融合蛋白，由三个二硫键连接的GP1-GP2异二聚体在病毒表面形成三聚体。GP1亚基与EBOV受体NPC1结合，允许GP2介导的病毒和宿主细胞膜融合（图4b）。GP1带有RBS、聚糖帽和粘蛋白样结构域。GP2包含一个N端肽、内部融合环和跨膜结构域。1995年从埃博拉病毒幸存者中分离出两种mAb（mAb100和mAb114），REGN-EB3（以Inmazeb销售，再生元）是三种针对EBOV糖蛋白的完全人源mAb（REGN3470、REGN3479和REGN3471）的组合。REGN3479（现称为maftivimab）识别GP2融合环并提供中和活性，REGN3471（现称为odesivimab）识别外部聚糖帽并具有细胞靶向功能。REGN3470（现在称为atoltivimab）与GP1头部结合，提供中和活性和细胞靶向活性。图4：与来自各种病原体的糖蛋白结合的中和抗体4抗人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒（HCMV）是一种有包膜的双链DNA病毒，其基因组大小超过235kb，是已知最大的人类疱疹病毒。HCMV是betaherpesvirus家族成员，可以在健康个体中建立终生潜伏期。原发感染一般无症状；然而免疫功能低下宿主中的病毒再激活可能危及生命，并且怀孕期间的垂直病毒传播是先天性出生缺陷的主要原因之一。HCMV利用不同的糖蛋白复合物允许细胞进入多种细胞。两种含gH / gL的复合物可调节病毒嗜性，gH / gL / gO三聚体与PDGFRα结合，是成纤维细胞感染所必需，gH / gL / UL128 / UL130 / UL131A五聚体与神经纤维蛋白2结合，是病毒进入上皮细胞、内皮细胞和骨髓细胞所必需的。（图4c）。几种靶向gH / gL或gB复合物的mAb已被分离出来，并在体外感染模型中显示出适度的功效。为了鉴定最有效的HCMV中和抗体，Lanzavechia小组从自然感染供体的记忆B细胞中分离出一大组mAb，发现五聚体复合体是HCMV中和的主要靶点，其产生的中和抗体的效力比其他HCMV复合体的效力大几个数量级。这一发现揭示了抗原选择对鉴定有效的中和mAb和设计有效疫苗的重要性。在同种异体造血干细胞移植或实体器官移植后，使用HCMV特异性mAb预防HCMV感染和疾病已得到广泛研究。MSL-109是一种靶向HCMV表面糖蛋白gH的mAb，且作为AIDS患者的HCMV诱导性视网膜炎的补充治疗，但由于缺乏疗效，在II/III期停止开发。RG7667是结合gH / gL和五聚体复合物的两种mAb的混合物，可以有效地中和所有测试细胞类型的HCMV感染。然而，在对肾移植受者进行的II期试验评估时，发现缺乏疗效。CSJ148由两种抗HCMV mAb组成，一种抗gB mAb（LJP538）和一种抗五聚体 mAb（LJP539），用于预防造血干细胞移植患者的HCMV，也终止于II期试验。因此，尽管抗HCMV mAb已做出了重大开发努力，但尚未获得FDA批准。临床上唯一可用的基于抗体的疗法仍然是Cytogam，一种用于静脉注射的CMV免疫球蛋白制剂。5抗流感病毒流感是正粘病毒科的一员，有4种类型——甲型、乙型、丙型和丁型流感——它们都有一个分段的负义单链RNA基因组。甲型和乙型流感是造成人类严重感染的原因，而丙型流感仅引起轻微症状，丁型流感不会感染人类。该病毒基因组由编码至少12种蛋白质的8个片段组成：血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、PB2、PB1、PB1-F2、PA、PA-X、NP、M1、M2、NS1和NS2。病毒表面的两种糖蛋白是HA和NA，HA比NA更丰富（每个病毒粒子约500个分子），比例为4:1至5:1。HA头部是发生抗体反应的主要目标，其序列和糖基化位点变化多样。尽管HA的结构总体上是保守的，但其序列和糖基化模式在不同亚型之间不同。由于其高序列可变性，针对免疫优势头部的抗体反应是菌株特异性的，并且仅提供短期免疫。其头部含有RBS，它通过与唾液酸受体结合将病毒附着到宿主细胞上。RBS形成一个浅口袋，由4个部分组成：190螺旋和130、150和220环，除了220环外，RBS本身相对保守，而其余的头部在序列上是高度多样化的。抗体通常针对5个主要抗原位点，即H1的Ca1、Ca2、Cb、Sa和Sb，以及H3的位点A-E，它们位于RBS周围。RBS位点的抗体可以阻断病毒附着或阻止受体介导的内吞作用，因此中和病毒。HA茎部主要在亚型内高度保守，并且在某种程度上跨亚型，以比头部结构域慢得多的速度进化（图4d）。MEDI8852是一种人IgG1 mAb，从一名无并发症的甲型流感感染患者中分离出来，目前处于IIa期。Vir Biotechnology正在开发VIR-2482，这是一种中和甲型流感的mAb，它与HA的保守区域结合并能中和自1918年西班牙流感（H1N1）以来的所有主要毒株。因此，这种类型的抗体可用作通用预防剂，克服当前流感疫苗的局限性。此外，由于VIR-2482已通过改造其Fc区域延长血清半衰期。3对疫苗开发的影响1用于疫苗设计的抗原-抗体相互作用和结构疫苗学疫苗已被证明是传染病最有效的预防策略。然而，依赖三类传统疫苗（减毒活疫苗、灭活疫苗和解离病原体）对HIV、RSV、流感、丙型肝炎病毒、HCMV或EBOV等病毒已不起作用。对于大多数疫苗而言，抗体反应至关重要。因此，鉴定能够有效中和病原体的抗体是加速疫苗开发的关键因素。反向疫苗学2.0，也称为基于抗体的疫苗学，旨在克服传统方法的局限性，通过基于抗原与其同源抗体复合的结构表征设计新型疫苗（图5）。通常通过对感染细胞的粗匀浆进行蛋白质组学分析来鉴定抗原，然后根据免疫原性及其刺激免疫反应的能力进行选择。然而，这种方法非常耗时，并且在鉴定新的蛋白质时不能保证其结构完整性或免疫原性。实验驱动的中和mAb的分离和其靶标鉴定，仍然是鉴定候选疫苗的最佳方法。抗体驱动和基于结构的抗原设计策略在开发新出现的传染病疫苗方面特别有效。图5：反向疫苗学2.02人呼吸道合胞病毒对于RSV，中和抗体主要针对融合（F）蛋白的头部结构域（图4a），为了集中针对F头部抗原位点的免疫反应，Boyington等人设计了仅包含头部区域的截断F免疫原。这些蛋白质在融合前状态下特别脆弱，因此需要稳定其结构，将抗原锁定在融合前构象中，以促进阻止膜融合的中和抗体反应。这种结构信息可用于识别稳定突变，多种基于结构的设计策略已被应用来稳定F蛋白的融合前构象。基于结构的疫苗设计中一个相对年轻的领域是表位支架，它依赖于将病毒表位移植到不相关的载体蛋白上，即所谓的支架蛋白，以将免疫反应集中于保守的、功能性的位点上，这些位点是中和抗体的靶标。这一策略首先应用于设计新的HIV免疫原，由McLellan等人首次实现，他们通过将莫他珠单抗的表位移植到不相关的蛋白质支架上，将F蛋白的抗原位点II设计成免疫原。3埃博拉病毒多个平台的疫苗已显示出对EVD的保护作用，其中两种并非基于反向疫苗学概念的疫苗已获得许可：包括Ervebo（rVSV-ZEBOV）和Zabdeno / Mvabea的联合使用。这两种疫苗都基于病毒载体，最近对接种疫苗的人类B细胞反应的分析表明，疫苗诱导的mAb中的体细胞超突变水平较低。基于蛋白质的亚单位疫苗的合理设计工作正在进行中。其他正在开发的疫苗包括cAd3-EBOZ，一种黑猩猩腺病毒（cAd3）的减毒型，编码EBOV-GP糖蛋白。最后，发现含有EBOV-GPMakona株的重组纳米颗粒疫苗可诱导有效的免疫反应。4人类巨细胞病毒HCMV疫苗的开发始于1970年代初期，实验室工作分离了两种减毒病毒株：AD169和Towne。AD169减毒株很快被放弃，Towne减毒株在实体器官移植受者和健康志愿者中进行了广泛测试。寻找CMV疫苗的关键是鉴定CMV的表面蛋白，称为糖蛋白B或gB（图4c）。当与MF59水包油佐剂联合使用时，该疫苗是安全且部分有效的，但在人体中3次注射后中和抗体水平较弱。亚基gB蛋白还与AS01佐剂结合以刺激TLR4受体，从而在人体中引发更高和更长时间的抗gB抗体水平。gB抗原是III类三聚体融合蛋白并且在融合后构象发挥作用，有人提出融合前构象中的gB可以产生更高的中和反应，但最近的结果表明可能并非如此。CMV表面存在的蛋白质五聚体复合物由糖蛋白H（gH）、糖蛋白L（gL）和基因UL128、130和131A的产物组成，该复合物已被证明能产生比gB更高滴度的中和抗体（图4c），这一发现推动了HCMV疫苗领域的发展。然而，如果需要中和抗体来预防HCMV的感染和传播，则还需要强烈的T细胞反应来抑制血清阳性患者的病毒再激活。即将进行的使用重组蛋白亚基（NCT05089630）或mRNA（NCT05105048）的临床试验将表明五聚体是否可以单独使用，或者是否需要与gB一起使用。5流感病毒开发流感疫苗的主要障碍之一，是病毒附着的高度变化的HA头部的免疫优势。因此，基于结构的设计方法一直专注于HA茎区（图4d）。为了将抗体反应转移到HA茎结构域，对嵌合HA分子进行了改造，该分子由与不同HA头配对的共同HA干组成。小鼠的反复免疫表明可以产生HA干特异性抗体反应，从而产生异源和异源亚型免疫。在雪貂中，这些构建体显示出在流感病毒攻击后减少病毒载量。嵌合HA已在I期临床试验中进行测试，证明其安全性，以及能够诱导广泛、强烈、持久和功能性的免疫反应。也有设计策略通过去除HA头产生分离的HA干抗原，如Yassine等人的无头HA和Impagliazzo等人的mini-HA设计。6冠状病毒获取SARS-CoV-2 S蛋白的结构数据在开发多种COVID-19疫苗（包括非常成功的mRNA疫苗）中发挥重要作用。开发有效疫苗的另一个关键方面，是从HCoV-HKU1和MERS-CoV等其他冠状病毒的S蛋白研究中获得丰富经验。7艾滋病病毒HIV疫苗开发研究极大受益于人类bNAb的分离，使用bNAb指导的HIVEnv三聚体稳定化是许多免疫原的基础。此外，最有希望的策略是使用稳定的三聚体，来激活特定的产生bNAb细胞前体并引导它们产生成熟的bNAb——这种策略称为种系靶向。最近，在接种eOD-GT8免疫原的健康受试者中报告了97%的血清转化，展示了种系靶向策略的强大潜力。4总结与展望SARS-CoV-2的出现强调了传染病的严重性，短时间内几种抗COVID-19疫苗和mAb疗法的发现和开发、制造和监管评估方面取得了前所未有的成功。这些进步是基于过去几十年在免疫学和疫苗学方面取得的巨大科学进步，也是基于对冠状病毒生物学重要知识的了解。利用抗体来治疗COVID-19也受益于技术进步和专业知识完善，但mAb有一定局限性，如SARS-CoV-2 Omicron VOC会导致抗体的病毒靶标发生突变以致病毒逃脱中和。希望本文和其他地方总结的近期临床成功药物和案例研究，对抗感染mAb的研发能有所启示。鉴于目前mAb的一个关键限制仍然是其在组织中的有限分布，将mAb特异性递送至靶标的新型的递送策略，可能会使mAb成为对抗病毒感染的更强大工具。