干货+福利|人用狂犬病疫苗研究新进展

2022-07-18

▌摘要目前的狂犬病疫苗是安全的，能诱导持久的免疫力，疫苗接种后病毒中和抗体滴度持续多年。然而，目前的狂犬病疫苗需要多剂量才能达到高中和滴度，而且成本高昂，这意味着狂犬病死亡率最高的发展中国家很难实施广泛的疫苗接种。新的创新是将狂犬病降低到可接受水平的唯一途径。许多临床前和临床研究正在进行，测试新型疫苗、佐剂和注射方法。对活疫苗和替代疫苗载体使用的研究正在进行中，而开发DNA疫苗、mRNA疫苗的尝试迄今未能与传统疫苗的免疫原性和中和能力相匹配。分子佐剂的开发能够以较少的抗原诱导更快、更强的免疫反应，已经产生了令人振奋的临床前结果，似乎使我们更接近于更好的狂犬病疫苗。总的来说，过去十年进行的一系列研究令人印象深刻，令人鼓舞，但大多数新疫苗尚未在临床试验中进行测试，这种实验性疫苗在全球市场上的可行性仍有待观察。本文从狂犬病毒、狂犬病疫苗简史、当前狂犬病疫苗的优势和局限性、狂犬病疫苗的研究进展国内狂犬病疫苗概述以及在狂犬病毒新型疫苗研发方面取得新进展进行综述。读书活动欢迎您的参与本书综述了狂犬病研究和狂犬病疫苗开发的最新进展。向读者介绍了狂犬病毒的生物学和病理学，致病因子和狂犬病疫苗接种的历史。本书提供区域性狂犬病预防计划，讨论为野生动物和人类接种疫苗的策略。此外，还综述了对狂犬病的先天免疫反应以及抗体反应。所有章节均由狂犬病研究领域著名专家撰写，其中一些专家隶属于WHO狂犬病监测和研究合作中心。本书的读者对象是在病毒学、兽医和生物医学部门工作的研究人员和卫生专业人员。205页《Rabies and Rabies Vaccines》读书会即将开启，请加小编微信号cbp510报名参加！▌背景狂犬病疫苗发明于19世纪末，在20世纪得到改进。目前的疫苗效果非常好，能够提供安全、持久的保护，防止致命疾病。但对于最需要它们的人群来说，它们太昂贵，而且多剂量计划是不切实际的。因此，狂犬病在世界许多地区继续肆虐。在全球范围内，它每年估计造成59000人死亡。通过暴露后疫苗接种和抗体预防了数百万人的死亡，每年在1500万疑似狂犬病暴露中使用这些疫苗和抗体。这些统计数字表明，需要继续努力，找到更好的方法来阻止狂犬病。我国是受狂犬病危害较为严重的国家之一，根据国家疾病预防控制局数据统计，我国狂犬病发病数和死亡人数呈下降趋势，其中我国狂犬病的病死人数由2010年的2014例下降到2020年的188例，其主要原因是我国加强对暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)管理和公众对PEP的认识。这十年间，人感染狂犬病的病例数虽然下降，而感染范围却在国内不断扩大，在过去无狂犬病病例和低发病率的省份，如宁夏回族自治区、青海、甘肃、北京、吉林和西藏等地也相继出现了新增病例，见图1和图2。图1. 中国人类狂犬病时空动态（2010-2019）图2. 2013~2020年全国报告狂犬发病和死亡情况（来源于华泰研究)随着我们对狂犬病病毒（RABV）免疫反应的日益了解，一种改进的人类疫苗可能会进化。研究已经确定了疫苗可能利用的新机制，以加快和加强关键的抗体反应。与此同时，来自其他领域的新型疫苗开发正在逐步进入狂犬病领域，例如新型佐剂、新的给药方法和先进的稳定技术。▌狂犬病毒概述狂犬病毒（RABV）属于弹状病毒科、狂犬病毒属。狂犬病毒基因组中有一个核糖核酸链，其反义链编码5个蛋白分别是核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白、糖蛋白和RNA聚合酶。RABV的结构及转录和复制策略：负义基因组RNA是L-P聚合酶复合物的模板。聚合酶复合物在每个终止信号（STOP）处与模板分离。聚合酶并不总是成功地重新接合，导致从3′到5′的负转录梯度。在复制过程中，负义基因组通过更具过程性的病毒聚合酶转录成正义抗基因组RNA中间体。然后将反基因组转录回负义RNA以完成复制，见图2。图2. RABV转录和复制策略RABV通过宿主感染人的途径：大多数RABV自然感染始于动物咬伤或抓伤使肌肉组织暴露于RABV颗粒。感染通过神经肌肉接头（底部插入）传播到周围神经系统。病毒颗粒通过动力蛋白介导的逆行轴突运输途径（顶部插入）以包膜囊泡的形式传播，从突触后神经元跨突触传播到突触前神经元，直到实现中枢神经系统的广泛感染，见图3。图2. RABV通过宿主感染人的途径▌狂犬病疫苗简史狂犬病病毒疫苗是最古老的抗病毒干预措施之一，仅次于天花和霍乱疫苗。1885年，路易·巴斯德（Louis Pasteur）发明了第一种抗狂犬病病毒的疫苗，尽管他还不知道这种传染源本身，但他准确地追踪到了狂犬病感染兔的大脑和脊髓。一个多世纪以来，与巴斯德类似的神经源性RABV疫苗被广泛使用，甚至在新的疫苗出现时。这些疫苗包括由β-丙内酯（BPL）灭活的兔脊髓、山羊或绵羊脑（Semple）或髓磷脂含量降低的乳鼠脑组织（Fuenzalida）制成的疫苗，它们现在已在很大程度上被淘汰。到了20世纪50年代和60年代，新技术使非神经源性疫苗的生产变得更加均匀，产生不良反应的风险也更低。首先，纯化的鸭胚疫苗（PDEV）成为可能。然后，开发并完善了体外细胞培养，实现了RABV疫苗中最重要的创新：在人类二倍体细胞上生长。今天，细胞培养疫苗占可用疫苗的绝大多数。根据生产方法，有四种通用品种：人类二倍体细胞疫苗（HDCV）、纯化鸡胚细胞疫苗（PCECV）、原代仓鼠肾细胞疫苗（PHKCV），以及最近于20世纪80年代开始生产的纯化Vero细胞狂犬病疫苗（PVRV）。根据国家的不同，可用疫苗不仅因生产方法而异，还因免疫途径和给药时间表而异。世界卫生组织（WHO）定期就狂犬病疫苗的接种提出建议。第一个组织培养病毒来源的疫苗是将病毒在原发性地鼠肾细胞上培养，由该技术生产的疫苗于1968年获加拿大批准后使用。我国是在20世纪80年代用狂犬病病毒北京株生产疫苗；而日本等东南亚国家于20世纪80年代采用FluryHEP株适应原代鸡胚细胞，并广泛使用；荷兰采用原代狗肾细胞进行病毒株的培养，该疫苗在免疫方面也取得了不错的效果。目前公认最佳的狂犬病疫苗是人二倍体细胞疫苗，该疫苗是由美国Wistar研究所首创，是用人肺细胞WI-38株适应和培养病毒。法国某研究所用MRC-5细胞生产狂犬病疫苗，并取得很好的效果。据统计，人二倍体细胞疫苗是接种后不良反应最轻、免疫效果最好的疫苗。▌当前疫苗的优势和局限性狂犬病疫苗有许多优点。❶首先，它们是安全的，几十年来已为数百万人使用。❷其次，如果管理得当，它们是非常有效的。尽管接种了疫苗，但仍有罕见的发病报告可能是由于暴露后预防（PEP）延迟或不完全引起的。❸第三，疫苗引发持久免疫，病毒中和抗体（VNA）滴度在接种后持续数年。尽管取得了成功，狂犬病疫苗仍需改进。它们有两个主要局限性：❶需要多剂量才能在所有受体中实现高中和滴度，❷而且成本高昂。这两种限制对狂犬病死亡率最高的发展中国家的社区都产生了不成比例的影响。❸该疫苗的另一个局限性是缺乏对非RABV溶血酶的覆盖率。尽管存在功能性狂犬病疫苗，但狂犬病在世界大部分地区仍然是一个问题，因此许多疫苗专家认为，新的创新是将狂犬病发病率降低到可接受水平的唯一途径。但最近的一项综合分析发现了人类狂犬病预防和治疗创新的多重障碍，包括社会、科学、商业发展和市场方面的障碍。已经提出了创新的融资战略，例如为低资源国家的发展方案提供资金的发展影响债券，作为支付有效控制狂犬病的长期财政负担的方式。未来的狂犬病疫苗开发必须解决创新的多重障碍，特别是考虑到发展中国家不成比例的死亡负担。▌狂犬病疫苗的研究进展理想的狂犬病疫苗应该是一种安全、廉价、单剂量、长期温度稳定且易于管理的疫苗。要了解我们离这一理想有多近的现实图景，可以看看狂犬病治疗学的临床试验管道，看看在不久的将来可能会批准哪些改进。图3分析了已向临床试验报告的所有有关狂犬病的临床试验。图3. 狂犬病疫苗临床试验（2007-2017，资料来源：ClinicalTrials.gov）由全球制药公司赞助的试验占59项试验的近三分之一，但这些试验仅测试当前疫苗的增量改进，例如将疫苗市场扩大到新的国家或人群，引入新的给药时间表，将狂犬病疫苗与其他疫苗一起给药，或者对免疫功能低下的个体接种狂犬病疫苗。例如，赛诺菲已开发出一种不含人或动物源性成分且不含抗生素的无血清PVRV。该疫苗已完成三期试验，降低了血清可传播成分污染的风险，但没有解决狂犬病疫苗更重要的缺陷。正在测试更具创新性的干预措施，包括新型疫苗、佐剂和注射方法。表1还列出了这些试验，以及一系列已发表的关于改善人类和动物狂犬病疫苗的研究。然而，由于大多数仍处于临床前阶段，这些实验策略充其量将在一段时间内不可用，最坏的情况下可能永远无法推向市场。然而，试验必须继续，因为显然需要新的解决方案来大幅减少狂犬病死亡。表1. 临床前研究的狂犬病疫苗▌国内狂犬病疫苗研究与生产概述我国生产狂犬病疫苗的企业有辽宁成大、广州诺诚、宁波荣安、河南远大等。其中辽宁成大占据狂犬病疫苗市场的批签发量占比达到46%。其次，宁波荣安与大连雅立峰的批签发量占比分别为25%和8%;此外，成都康华三代狂犬病疫苗的批签发量占比为4.7%，见图4。图4. 国内2020年狂犬病疫苗批签发分布情况（来源于医药魔方，华泰研究）我国狂犬病疫苗市场约 55 亿元，受宠物存量提升温和扩容。因狂犬病毒暴露后预防的普及，我国狂犬病发病率呈下降趋势，但随我国宠物保有量的增长(预计从 2019 年的 3 亿只攀升至 2024 年的 4.5 亿只，CAGR 8%)，狂犬病毒暴露人次预计呈温和上升趋势，预测国内狂犬病疫苗市场规模将由 2020 年 55 亿元提升至 2030 年 111 亿元，见图5。图5.中国人用狂犬病疫苗市场规模及预测（2015-2030E）（资料来源：灼识咨询，华泰研究）冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)和冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)是企业目前主要的研发方向。狂犬病疫苗研发竞争趋于激烈，多款 Vero 细胞、4 款人二倍体疫苗处于临床三期。Vero 细胞在研疫苗中，华兰疫苗领先，已完成现场核查、纳入优先审评。冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)方面，广州瑞贝斯和亚泰生物进入I期临床试验，智飞生物的子公司安徽智飞龙科马生物制药有限公司、辽宁成大、卓谊生物和大连雅立峰进入Ⅲ期临床试验。冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)方面，目前来看，人二倍体细胞狂苗的发展潜力较大，符合消费升级趋势，而国内仅有成都康华一家生产。正在研发的企业中，仅有辽宁成大一家，并且已经进入Ⅲ期临床试验，见表2。表2.我国人用狂犬病疫苗研究情况（来源于中检院，华泰研究）▌在狂犬病毒新型疫苗研发方面取得新进展中国科学院武汉病毒研究所/生物安全大科学研究中心张波课题组与华中农业大学赵凌课题组开展合作研究，在狂犬病毒新型疫苗研发方面取得新进展。研究团队用狂犬病毒包膜G蛋白替换VEEV结构蛋白基因，构建的重组VEEV-RABV-G能够产生具有感染性、表达RABV-G蛋白的重组病毒。他们将重组病毒与狂犬减毒疫苗株LBNAR病毒纯化后进行电泳分析，发现VEEV-RABV-G仅含有RABV-G一种结构蛋白；二者感染细胞后释放的病毒颗粒形态不同，VEEV-RABV-G为球形颗粒，而LBNAR则是典型的子弹状形态，直接证明VEEV利用RABV-G包膜糖蛋白包装出了新的重组病毒颗粒，见图6。图6. VEEV-RABV-G重组病毒鉴定(注：a：VEEV-RABV-G重组病毒产生及感染示意图；b：VEEV-RABV-G转染细胞后不同时间点IFA检测；c：VEEV-RABV-G病毒感染细胞后不同时间点IFA检测；d：纯化的VEEV-RABV-G重组病毒和LBNAR病毒SDS-PAGE电泳分析；e：VEEV-RABV-G和LBNAR感染细胞后电镜观察；f：传代后的病毒生长曲线比较；g：传代后的病毒噬斑比较)为了验证VEEV-RABV-G重组病毒是否可作为减毒活疫苗，研究团队比较了相同剂量VEEV-RABV-G、狂犬病毒减毒活疫苗LBNAR和LBNSE颅内注射ICR小鼠后的体重变化和死亡率，发现VEEV-RABV-G感染与DMEM培养基对照组的表现一样，完全不会使小鼠发病和死亡，说明VEEV-RABV-G重组病毒具有很好的安全性。同时，他们发现低剂量病毒免疫小鼠时，VEEV-RABV-G比LBNAR诱导的中和抗体效价更高；而无论高剂量或低剂量免疫，VEEV-RABV-G都能够为小鼠提供更好的免疫保护率,见图7。这些结果表明，VEEV-RABV-G重组病毒具有很好的安全性和免疫原性，低剂量、单次免疫即可为小鼠提供很好的免疫保护作用，可作为狂犬病毒的新型减毒活疫苗。图7. VEEV-RABV-G重组病毒的安全性和免疫保护评价(注：a：VEEV-RABV-G、LBNAR、LBNSE、DMEM对照组颅内感染小鼠后体重变化；b：病毒颅内感染后小鼠存活率；c：高剂量（2×105 PFU）VEEV-RABV-G、LBNAR免疫后小鼠血清中和抗体效价；d：低剂量（2×103 PFU）VEEV-RABV-G、LBNAR免疫后小鼠血清中和抗体效价；e：高剂量免疫后狂犬病毒颅内攻毒后小鼠存活率；f：低剂量免疫后狂犬病毒肌肉注射攻毒后小鼠存活率)以前用于细菌和病毒疫苗的许多不同实验方法已应用于狂犬病，但取得了不同的成功。最有希望的新概念之一是使用信使RNA（mRNA）编码狂犬病病毒的主要抗原，即包膜糖蛋白（RABV-G）。CureVac已将其专有技术平台用于生产mRNA来解决这一问题，从而生产出候选狂犬病疫苗CV7201。在小鼠和猪中进行的临床前研究表明，CV7201可以诱导中和免疫反应，从而防止狂犬病病毒，随后在第1阶段人体研究中测试了不同剂量和给药途径的CV7201。这项临床研究证明，mRNA疫苗是安全的，并且具有可接受的反应性，但免疫反应取决于给药方式，并且他们没有明确支持CV7201作为具有这种特殊配方的预防性疫苗的进一步开发。此外，使用包裹在脂质纳米粒（LNP）中的RABV-G mRNA进行的临床前研究表明，小鼠和非人灵长类动物的反应都有所改善，这些令人鼓舞的结果目前正在人类的临床研究中跟进，见图8。图8.LNP mRNA配方的作用模式示意图临床前研究表明，肌肉内或皮内注射mRNA可以诱导针对编码抗原的体液和细胞免疫反应。然而，在人类志愿者中，虽然鱼精蛋白mRNA具有可接受的反应性，但免疫反应取决于给药技术。对小鼠和食蟹猴的临床前研究表明，一种使用脂质纳米粒包裹mRNA的新型候选疫苗可诱导体液和细胞免疫反应，与鱼精蛋白mRNA相比显著改善。目前正在进行进一步的研究，评估人类志愿者中的LNP mRNA配方，以评估有希望的临床前研究结果如何作为开发新型预防性狂犬病疫苗的基础。▌总结总的来说，过去十年进行的一系列研究令人印象深刻，令人鼓舞。目前狂犬病负担很重的国家，尤其是亚洲国家，出现了大量研究，推动了狂犬病疫苗开发的实验界限。大多数疫苗尚未在临床试验中进行测试，此类实验性疫苗在全球市场的可行性仍有待观察。只有在各个领域都优于现有疫苗的疫苗才有机会被广泛采用。然而，作者相信一些候选人将符合这些标准。测试中的许多创新，例如新型佐剂和DNA疫苗、mRNA疫苗，可以结合起来带来更多益处。当前疫苗开发工作中明显缺乏的一个领域是泛溶血病毒疫苗的开发。溶血酶原病毒可以引起致命的狂犬病，目前的疫苗和RIG只能提供不完全的保护。尽管它们主要在蝙蝠体内循环，但它们真正的危险在于它们有可能将宿主转移到一个新的宿主中，正如RABV在其历史上多次所做的那样。疫情将是毁灭性的，尤其是在没有候选疫苗的情况下。正如过去的控制努力所表明的那样，狂犬病控制的未来将需要协调直接策略（暴露后的人和动物免疫）、间接策略（动物和可能的人的预防性免疫）和其他控制策略，如疾病监测和教育方案。参考文献[1]Fisher CR, Schnell MJ. 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Published 2019 Sep 27. doi:10.3390/vaccines7040132识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。