条条大路通罗马？LNP递送之外：自复制RNA(saRNA)疫苗递送策略新趋势全析

2024-06-19

信使RNA疫苗

导读：递送是mRNA疫苗最具挑战性的难题之一。mRNA分子尺寸较大且具有亲水性，这使得其不能轻易地穿过构成细胞膜的疏水性脂质双分子层，因此，mRNA分子进入细胞是一个非常低效的过程。人们为促进mRNA进入细胞，将mRNA与阳离子脂质或聚合物偶联，这些阳离子脂质或聚合物一方面可以中和 mRNA的大量负电荷，另外一方面又可以为其提供穿过细胞膜所需的疏水性。新冠自复制RNA疫苗ARCT154由CSL和Arcturus Therapeutics联合开发，采用脂质纳米颗粒（LNP）递送至体内。ARCT154已经获得日本厚生劳动省的批准用于18岁及以上成年人的初始接种和加强接种。除了基于脂质的递送平台之外，人们还开发出其他的递送saRNA的策略，包括使用裸核酸、聚合物、基于病毒颗粒 (VRP) 的载体，甚至细菌。菌菌将在下文分享脂质之外的saRNA 疫苗递送策略。 01 裸核酸递送策略-DREP 使用裸核酸具有简化制造流程和降低生产成本的明显优势。尽管一些团体已经能够使用不同的方法（例如电穿孔）传递裸 saRNA ，但由于裸露的RNA非常容易降解，因此使用这些方法实现对人群的有效疫苗接种面临极大的挑战性。因此，对于裸核酸递送来说，DNA 将是更好的选择。然而，由于基因组整合导致转染细胞可能发生恶性转化，因此，需要更多的监管关注。 DNA启动的自扩增RNA复制子（DREP）是一种很有前景的系统，其基于在真核启动子控制下的编码saRNA的质粒。一旦质粒进入靶细胞的细胞核，saRNA 就会从 DNA 转录出来并转运到细胞质。DREP与 saRNA 类似，可诱导转染细胞凋亡，从而消除不太可能发生的染色体整合事件，但具有 DNA 稳定性的优点。有研究人员利用DREP 系统设计了一款编码新冠病毒S蛋白 (DREP-S) 或者S蛋白胞外结构域的新冠候选疫苗，并通过同源和异源初免-加强免疫（间隔4周）在小鼠中进行评估免疫效果。对于异源免疫，通过局部电穿孔的方式皮内注射 10 µg DREP-S，然后使用重组 S 蛋白疫苗加强免疫。两种策略都能引发特异性的nAb 和 T 细胞反应。DREP-S 疫苗在同源或异源方案中均倾向于产生偏向 Th1 的体液反应，而仅使用重组蛋白进行疫苗接种则主要诱导 Th2 反应。有趣的是，使用 DREP 作为初始免疫和重组蛋白作为加强免疫的异源接种可触发最有效的免疫反应。由于DREP疫苗稳定性高、成本低、易于生产和储存，因此更加适合进行大规模生产。在针对不同病原体的临床前免疫研究或治疗性肿瘤疫苗中，该策略已被证明是安全且具有免疫原性的。图片来源：DNA-launched RNA replicon vaccines induce potent anti-SARS-CoV-2 immune responses in mice. 最近一项基于裸核酸疫苗递送的研究中，Amano等人基于VEEV载体设计了一种温控saRNA (c-srRNA)，在Rep nsp2 亚基序列中插入5个氨基酸来优化该载体，使其在在 33 °C 下发生复制。这一特性使其特别适合进行皮下注射，因为皮下（ID）温度在 30–35 °C 之间。皮下注射对于疫苗接种来说是一个非常不错的选择，因为皮下富含抗原呈递细胞 (APC) ，APC 可以摄取 saRNA 并将其编码的抗原，以 MHC-I 和 II -抗原肽复合物的形式呈递给 T 细胞。有趣的是，c-srRNA 可以使用乳酸林格氏溶液有效地进行皮下递送：在小鼠体内注射一剂 5 µg c-srRNA 后，荧光素酶的表达可维持近一个月，而注射一剂核苷酸修饰的 mRNA ，荧光素酶的表达仅可维持一周。为了测试该策略诱导针对 SARS-CoV-2 的细胞和体液免疫的能力，将带有分泌信号肽的 RBD 序列克隆到 c-srRNA 中，并用 5 或 25 µg RBD- c-srRNA对小鼠进行初始/加强勉强，间隔4周。结果发现， RBD- c-srRNA诱导了针对 RBD 的细胞免疫，其特征是 CD8 (+) 和 Th1 CD4 (+) 反应，但无法引发体液反应。RBD 特异性抗体的诱导只能通过使用异源疫苗接种方案，将 c-srRNA 疫苗与重组 RBD 蛋白相结合来实现。因此，尽管皮下注射 c-srRNA疫苗似乎是一种专门的“T细胞诱导疫苗”，但它可以与其他策略结合以增强体液反应。皮内递送自我复制 RNA (srRNA) 是一个有前途的疫苗平台。研究人员基于VEEV 载体设计了一种温控saRNA (c-srRNA)，在Rep nsp2 亚基序列中插入 5 个氨基酸来优化该载体，使其在 33 °C 下发生复制。，并在 37°C（核心体温）或以上失活。皮下注射对于疫苗接种来说是一个非常不错的选择，因为皮下富含抗原呈递细胞 (APC) 。有趣的是，这种温控 srRNA (c-srRNA) 在作为针对 SARS-CoV-2 的皮内疫苗进行测试时，在不含脂质纳米颗粒的情况下裸注射时即可发挥作用。为了测试该策略诱导针对 SARS-CoV-2 的细胞和体液免疫的能力，将带有分泌信号肽的 RBD 序列克隆到 c-srRNA 中，并用 5 或 25 µg RBD- c-srRNA对小鼠进行初始/加强勉强，间隔4周。结果发现， RBD- c-srRNA诱导了针对 RBD 的细胞免疫，其特征是 CD8 (+) 和 Th1 CD4 (+) 反应，但无法引发体液反应。RBD 特异性抗体的诱导只能通过使用异源疫苗接种方案，将 c-srRNA 疫苗与重组 RBD 蛋白相结合来实现。因此，尽管皮下注射 c-srRNA疫苗似乎是一种专门的“T细胞诱导疫苗”，但它可以与其他策略结合以增强体液反应。图片来源：Controllable self-replicating RNA vaccine delivered intradermally elicits predominantly cellular immunity. 02 细菌递送黏膜免疫在控制消化道和呼吸道病原体感染方面起着非常重要的作用。考虑到存在大量肠道相关的淋巴组织，疫苗采用口腔递送路线能够触发强烈的黏膜免疫。尽管 mRNA 疫苗经过三十多年的发展，成功应用于新冠疫苗新冠疫苗的研发，但是，采用口服递送路线还未被成功探索。这主要是由于 mRNA 极度不稳定，肠道环境相当复杂。以沙门氏杆菌为代表的细菌与位于肠道集合淋巴结（Payer patch）内的免疫细胞发生相互作用，能够触发有效的黏膜免疫。而且，肠道细菌能够通过 CD103+DCs 细胞影响肺部组织 SIgA 抗体的分泌。除了黏膜免疫，沙门氏杆菌通过肠道中特化的 M 细胞到达肝脏和脾脏等不同器官，从而触发系统性免疫。沙门氏杆菌最为重要的优势是能够侵染抗原递呈细胞，并且其中进行增殖。散布于肠道黏膜上皮细胞间的特化 M 细胞将口服后的沙门氏杆菌从肠腔表面转移到黏膜下层，随后，沙门氏杆菌侵染抗原递呈细胞（APCs），例如，巨噬细胞，树突细胞等，进而借助淋巴系统和血液系统，将沙门氏杆菌传播到不同器官，例如，肝脏，脾脏。在宿主细胞质中，沙门氏杆菌发生裂解，将编码 SFV(nsp1-4)复制子和抗原的质粒释放出来。质粒进入宿主细胞核中转录出mRNA，随后出核，在细胞质中翻译出由 nsp1-4 组成的依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶复合物 RdRp。RdRp 复合物能够识别亚基因组启动子和侧翼保守序列元件（CSE）,从而扩增编码抗原的 mRNA。APCs 细胞会对抗原进行加工处理并且以 MHC I/MHC II+抗原肽的形式将其呈递给 CD8+和 CD4+ T 细胞，从而触发 T 细胞反应。DCs 细胞能够将抗原直接呈递给 B 细胞或者滤泡 DCs(FDCs)，FDC 能够将抗原贮存更长时间，周期性地将其展示给同源 B 细胞。B 细胞再将其分化成能够分泌特异性抗体的浆细胞和记忆 B 细胞。 2023 年 1 月 16 号，一直致力于沙门氏杆菌递送载体临床转化应用的韩国国立全北大学 John Hwa Lee 团队在 Microbes Infect 发表文章：Salmonella-mediated oral delivery of multiple-target vaccine constructs with conserved and variable regions of SARS-CoV-2 protect against the Delta and Omicron variants in hamster。他们采用 P2A（自切割多肽）间隔的多顺反子，编码新冠病毒可变抗原（RBD/NTD）或者保守抗原（HR/N/RdRP），以沙门氏杆菌作为递送载体，构建口服新冠自复制 RNA 疫苗。在仓鼠模型中，他们证实通过沙门氏杆菌递送的多价可变抗原或者保守抗原均能刺激强烈的细胞和体液免疫，能够抑制新冠病毒感染仓鼠体重降低程度，降低肺部病毒载量，缓解肺部充血和炎症反应。尤其是，在血清、肺部以及肠道中检测到非常明显的 IgA 抗体分泌，证实采用沙门氏杆菌作为递送载体触发明显的黏膜免疫，为以沙门氏杆菌为代表的细菌载体在传染病疫苗中的应用提供了坚实的数据支持。 03 聚合物递送系统-pABOL 早在2020年，Robin J. Shattock教授就在ACS Nano发表文章：Big Is Beautiful: Enhanced saRNA Delivery and Immunogenicity by a Higher Molecular Weight, Bioreducible, Cationic Polyme，他们设计了一种称为“pABOL”的生物可还原的线性阳离子聚合物，用于递送saRNA ，并表明增加其分子量可以增强递送效率。同时证明，与市面上销售的其他聚合物相比，采用肌内和皮内注射pABOL-saRNA均可增强蛋白表达和细胞摄取，并且肌内注射pABOL-saRNA流感疫苗可提供完全的免疫保护。到2021年，伦敦帝国学院的Robin J. Shattock教授在Journal of Controlled Release发表文章：Polymeric and lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying RNA vaccines，他们比较了LNP和pABOL（一种生物可还原聚合物）作为saRNA递送系统引起的蛋白表达和疫苗免疫原性方面的差异，结果发现，采用pABOL递送 saRNA 可引起更高水平的蛋白质表达，但采用LNP 会使得saRNA更具免疫原性。 04 病毒复制子颗粒递送系统-VRP 2022年，有研究人员在 signal transduction and targeted therapy发表文章: An alphavirus replicon particle delivering prefusion-stabilized spike protein provides potent immunoprotection against SARS-CoV-2 Omicron variant，他们开发了一种针对Omicron 突变株BA.1的甲病毒复制子颗粒疫苗 VRP-S-2P，VEEV-S-2P 复制子包含两个开放阅读框 (ORF)，编码来自委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV) 的四种非结构蛋白 ns1-ns4 和 Omicron BA.1的融合前S蛋白。将 VEEV-S-2P 复制子 RNA 与表达 VEEV 结构蛋白的两种辅助 RNA 共转染至 BHK 细胞中，从而产生 VRP-S-2P。通过反式补充病毒结构蛋白，复制子RNA可以被封装到单轮感染性甲病毒复制子颗粒（VRP）中，然后通过 VRP 感染递送到细胞中。该VRP缺乏编码VEEV结构蛋白的基因，因此无法繁殖。甲病毒VRP系统已广泛应用于癌症治疗和疫苗开发，并在众多临床试验中充分证明了其安全性和耐受性。 VRP-S-2P疫苗通过腹膜内 (IP)、IM 和 IN 途径每两周免疫小鼠和仓鼠 3 剂。在所有免疫组中均诱导出针对 BA.1的特异性抗 RBD 的IgG 和 nAb，并具有 Th1 偏向抗体反应，其中 IP 和 IM 途径诱导更高的抗体滴度。在易受该变体感染的小鼠中，通过IP和IM途径免疫后，在肺部未检测到感染性病毒。在仓鼠中，所有免疫动物都实现了针对肺部病理学的保护，并且在IP免疫的动物中完全防止了肺部病毒复制。 2023年，有人在Antiviral Res发表文章：Intranasal delivery of replicating mRNA encoding hACE2-targeting antibody against SARS-CoV-2 Omicron infection in the hamster，他们采用VRP递送基于 VEEV 的 saRNA，编码靶向hACE2 受体的新冠病毒中和抗体3E8 mAb，该复制子带有两个亚基因组 (sg) 启动子，经过改造可表达 3E8 mAb 的轻链和重链。编码 3E8 mAb 的 VEEV-VRP 的肺部靶向递送可以显着保护仓鼠免受 Omicron BA.1 感染。 05 总结自复制RNA疫苗被视作为mRNA疫苗的下一代革新技术平台，能够以极低的剂量实现更长久的免疫保护效果。然而，自复制RNA相比常规mRNA分子量更大，对于递送系统带来巨大的挑战。本系列文章中，菌菌对目前现有的各种自复制RNA递送系统的特点和优势作出了归纳总结，主要将其分为脂质递送系统和非脂质递送系统，脂质递送系统又可分为LNP、NLC、LION以及LPR，而非脂质递送系统包括DREP、细菌递送、pABOL以及VRP。自复制RNA疫苗要想在体内高效翻译出抗原，触发有效的免疫反应，首先必须确保拥有高效和安全的递送工具。脂质纳米颗粒递送系统的有效性已在新冠mRNA疫苗的大规程生产和接种中确切验证，但其他递送系统也仍需开发，以探索saRNA的巨大应用潜力。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。