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中国国家自然科学基金委员会（以下简称“自然科学基金委”）和比尔及梅琳达·盖茨基金会（以下简称“盖茨基金会”）今日宣布六项研究方案入选双方发起的联合资助项目，旨在推动新型RNA疫苗和疫苗控释递送技术的研发，提升疫苗在中低收入国家的可及性和覆盖率，从而挽救更多生命。 该联合资助项目自今年4月公开宣布以来，双方共同受理39份有效申请。经过中外专家组的评审，自然科学基金委和盖茨基金会最终共同选出六项研究方案，均由中国高校或研究机构携手其国际合作伙伴提交。每个入选方案将获得自然科学基金委最高150万元人民币和盖茨基金会最高20万美元的资助。 入选研究方案的详情如下： 将人工智能技术（AI）与环状RNA技术相结合，研发更高效的新型疟疾疫苗。该项目致力于利用AI技术，开发新一代多时期、多靶点的环状RNA疟疾疫苗，以期兼备疟疾预防与治疗功能，同时具备保护性高、持久性好和可及性强的特点，为疟疾的临床预防与治疗提供全新解决方案。 研发程序式微针疫苗输送系统，实现一次接种即可按照预定接种间隔释放疫苗剂量。本项目旨在优化当前的疫苗输送系统，用于解决中低收入国家需要多次接种加强针，但由于冷链储存系统不足而导致的疫苗利用率低的问题，从而提高疫苗接种率，帮助构建社群免疫。 基于CpG-LNPs融合体系，设计高效且安全的呼吸道合胞病毒（RSV）mRNA疫苗。本项目旨在将CpG-LNPs融合体系的核心机制应用于新一代mRNA疫苗的设计，以阐明该体系能否推动疫苗显著激活细胞免疫和Th1型免疫反应，从而提升RSV mRNA疫苗的有效性和安全性。 构建并验证新型分区装载技术的实验性研究，探索可溶性微针阵列贴片（DMAP）用于联合疫苗的研发，降低不同疫苗之间的相互干扰。本项目旨在开发一种新技术，以实现多种疫苗在单一贴片中安全、有效的联合递送。 开发热稳定型mRNA载体及递送技术。本项目旨在引入一种新型mRNA递送载体系统，以解决mRNA疫苗稳定性差和递送效率低的问题。 以注射型凝胶和3D打印凝胶植入件技术为基础，开发创新疫苗控释技术。本项目旨在开发一系列新型疫苗控释技术，用于针对免疫反应差的病原体的疫苗研发，并助力在欠发达地区推广单剂疫苗接种方案。 要在全球范围内提升可挽救生命的疫苗的可及性，创新至关重要。RNA疫苗凭借其超快的研发速度，以及在新冠疫情期间展现出的安全性和有效性，已经凸显出其在应对艾滋病、结核病和疟疾等其他致命疾病方面的巨大潜力。同时，诸如微针贴片、控释技术等新型疫苗递送技术，已被证明能够有效应对物流和免疫原性方面存在的挑战，从而提升疫苗的可及性和覆盖率。 免疫接种是盖茨基金会的核心工作之一，所支持的项目涵盖了从疫苗研发到交付的多个环节。通过与国家自然科学基金委员会开展的这一联合项目，盖茨基金会希望能促进疫苗创新领域取得丰硕成果，以减轻中低收入国家的传染病负担。自然科学基金委也在其官方网站公布了本次联合资助项目的入选结果（请复制网址至浏览器打开 https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/tab621/info93751.htm）。关于项目的更多详情，请点击此处。 关于中国国家自然科学基金委员会 中国国家自然科学基金委员会是依法管理国家自然科学基金的机构，由科学技术部管理，相对独立运行。自然科学基金委将国际合作作为优先事项，致力于通过国际合作推动科研进步，为中国科学家营造良好环境，在全球科学界发挥更大作用。 关于比尔及梅琳达∙盖茨基金会 秉承所有生命价值平等的信念，比尔及梅琳达∙盖茨基金会致力于帮助人们过上健康而富有成效的生活。在发展中国家，基金会主要致力于提高人民的健康水平，使他们有机会摆脱饥饿和极端贫困。在美国，基金会致力于确保所有人——特别是拥有资源最少的人——有机会在学习和生活中取得成功。

引言 遗传信息的传递和表达是一切生命活动的物质基础。在真核生物中，RNA聚合酶II转录产生多种类型的RNA，尽管这些RNA在基本结构上高度相似，它们的命运却截然不同：有些RNA被顺利转运出核，而另一些则在细胞核中迅速被识别并降解。RNA能够正确地被分选到出核或降解通路，是确保遗传信息精确表达的关键环节。研究表明，出核与降解机器通过竞争结合新生RNA来完成RNA分选。目前，领域内普遍认为出核通路在RNA分选中占主导地位，只有那些未能与出核机器结合的RNA，才会被降解机器结合并清除。然而，这种出核主导的RNA分选机制可能无法有效保证异常RNA的快速清除，从而对细胞功能产生潜在影响。 2024年10月25日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心程红课题组与武汉大学周宇教授合作，在Molecular Cell期刊在线发表了题为 Dual modes of ZFC3H1 confers selectivity in nuclear RNA sorting 的研究论文，提出并证明了“降解-预设”的RNA 分选新模型，改变了现有的“出核-预设”的RNA分选观点。 外切体是细胞中最主要的RNA降解机器之一，几乎参与了每个RNA分子的命运调控。外切体功能的发挥依赖于接头因子，帮助其选择性降解不同类型的底物RNA。PAXT复合体（PolyA eXosome Targeting connection）是外切体的一个重要接头因子，由MTR4和锌指蛋白ZFC3H1组成核心二聚体，并动态结合polyA结合蛋白PABPN1、锌指蛋白ZC3H3和RNA结合蛋白RBM26/27等。早期研究提出， PAXT主要结合在具有3′ polyA尾的成熟RNA上，通过MTR4招募外切体来降解这些底物。由于PAXT底物RNA与功能mRNA结构完全相同，其介导的RNA分选过程尤为具有挑战性。 在本研究中，意外发现ZFC3H1在转录早期便结合在pre-RNA（RNA前体）的5′端外显子和内含子上。有趣的是， ZFC3H1在此阶段处于自我封闭的模式，阻断了MTR4与外切体的结合，因此并不启动RNA降解。这种“占位”机制可以有效地防止出核因子过早结合而引起的RNA出核紊乱。通过多组学分析，该研究全面解析了PAXT降解底物RNA的特征，包括较少的外显子，较短的长度和较长的polyA尾等。这些特征如何促使ZFC3H1从“占位”模式转换为“降解”模式呢？当RNA包含多个内含子时，剪接过程中出核因子会被招募，并向5′端传递，取代ZFC3H1；而对于少外显子的短RNA，其较长的polyA尾可有助于招募更多PAXT组分（如ZC3H3和RBM26/27），解除ZFC3H1的封闭状态，暴露MTR4，从而启动降解。 综上所述，本研究揭示了新生RNA的命运最初被预设为降解，但伴随转录和加工过程的推进，其命运可被重塑，RNA的特征决定了其最终被分选为出核或降解通路。基于这一发现，研究人员提出了以降解为中心的RNA分选机制，既确保了异常RNA的快速降解，又保证了功能性RNA的高效出核。这一工作揭示了细胞核RNA分选的基本规律，深化了对遗传信息精准传递的理解。 模式图（Credit: Molecular Cell） 参考文献 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.molcel.2024.09.032 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要：追求有效的登革热疫苗已经取得了两个获批疫苗和另一个完成了第三阶段临床试验的成果。然而，每个疫苗都存在不足，这表明用于开发这些疫苗的登革热免疫知识是不完整的。疫苗试验的发现可能会完善我们对登革热免疫的理解，因为这些数据是通过实验得出的，并且是安慰剂对照的。这些试验的结果表明，仅靠中和抗体滴度不足以说明对症状性感染的保护，这暗示了细胞免疫在保护中的作用。这些发现对今后登革热疫苗的开发和应用现有疫苗以实现最大的公共卫生效益具有相关性。 1.引言 登革热是一种急性病毒性疾病，普遍存在于热带地区。据估计，每年约有1亿人受到感染。这种疾病是由四种不同的登革热病毒（DENV-1至DENV-4）中的任何一种引起的，这些病毒主要但并非仅由埃及伊蚊（Aedes aegypti）传播。这种蚊子高度适应城市环境，人类人口密度通常很高。这种与人类的密切接触和对人类血液的专一性使其成为DENV的高效传播媒介。随着A. aegypti的地理分布从热带扩展到亚热带，预计未来几十年全球登革热的负担将加剧。这种负担可能被低估了，因为除了急性疾病外，部分登革热患者还会出现长期后遗症，如疲劳、记忆力减退和注意力受损。因此，减少全球登革热的负担是一个紧迫的公共卫生优先事项。 迄今为止，A. aegypti种群的抑制是预防登革热的唯一方法。这种方法在泛美伊蚊根除计划以及古巴和新加坡的国家病媒控制计划中取得了显著的成功。然而，维持这些成功已被证明是具有挑战性的，不仅仅是因为涉及的高成本。在新加坡，长期减少DENV传播导致了一个群体免疫力低的人口，现在更容易受到流行病的影响，尽管病媒种群密度持续较低。因此，通过疫苗接种提高和维持群体水平的免疫力必须是任何成功的登革热预防计划的基石。 开发登革热疫苗的努力始于A. Sabin的基础工作。开发安全有效的疫苗的一个主要挑战是登革热病理学的复杂性。一次DENV感染后发展起来的持久适应性免疫反应是针对该DENV的；对其余三种异质DENV的保护是短暂的。此外，一次DENV感染后发展的抗体可以增强第二次异质DENV感染，增加严重登革热的风险。这种抗体依赖性增强（ADE）的DENV感染的生物学将在后面的章节中进一步阐述。为了充分保护所有四种DENV并防止ADE的风险，疫苗开发工作集中在选择能够引起对所有四种DENV类型平衡中和抗体反应的疫苗候选物上。 自Sabin的工作以来的半个多世纪后，我们现在有两种获批的活减毒四价登革热疫苗；第三种疫苗已完成第三阶段临床试验。 尽管登革热现在技术上是一种可通过疫苗预防的疾病，但仍有空间开发更多疫苗，这些疫苗在提供更好的适应性免疫反应的同时，引起的副作用更少。然而，这篇综述并不专注于已经使用或可以用于开发登革热疫苗候选物的不同疫苗平台。它也不打算为登革热流行国家的公共卫生机构提供当前疫苗的头对头比较。这篇综述的目的是通过对已完成的第三阶段临床试验的疫苗效力结果，从疫苗效力结果中提炼出对登革热免疫的更细致的理解；完善我们对登革热免疫学的知识，可以进一步巩固下一代登革热疫苗开发的基础。 2.登革热疫苗 已完成第三阶段临床试验的登革热疫苗的发展历史和不同构建已经在其他地方进行了回顾。总之，第一种获批的登革热疫苗CYD-TDV是一种基于黄热病病毒17D（YF17D）骨架的嵌合疫苗，其中YF17D的前膜（PrM）和包膜（E）基因已被DENVs的基因所取代（图1）。然而，由于在没有先前DENV感染的情况下接种疫苗会增加严重登革热的风险，可能由于ADE，其使用仅限于那些有先前DENV感染的人。第二种疫苗TAK003，使用减毒DENV-2骨架，其PrM和E基因被野生型DENV-1、DENV-3和DENV-4的基因所取代（图1）。这种疫苗最近获得了欧盟的批准，用于4岁及以上人群，即使在没有先前DENV感染的人中也可以使用。第三种疫苗TV003最近完成了第三阶段临床试验，并取得了有希望的结果。这种四价疫苗是通过在DENV-4和DENV-1的3'非翻译区删除30个核苷酸（rDEN4∆30和rDEN1∆30），以及从DENV-3删除30和31个核苷酸（rDEN4∆30/31）构建的。DENV-2组分是通过将DENV-2 PrM和E基因拼接到rDEN4∆30骨架中构建的（图1）。 由于上述疫苗是活的，尽管是减毒的，并且是四价的，疫苗接种应该理想地导致四种同时的DENV感染，从而推动所有四种DENV的E蛋白的B细胞反应（图1）；将PrM基因拼接到嵌合构建中是确保适当的E蛋白折叠和病毒粒子成熟所必需的。随着病毒血症感染，更有可能发展出高结合亲和力和类型特异性的中和抗体。疫苗病毒血症的持续时间是与相关黄热病疫苗的中和抗体滴度的直接相关性，可以说是世界上最强大的疫苗。因此，由于CYD-TDV疫苗接种主要产生嵌合YF17D-DENV-4病毒血症，CYD-TDV疫苗接种主要产生DENV-4特异性中和抗体；对DENV-1至DENV-3的中和主要是由于交叉中和抗体。同样，TAK003疫苗接种仅产生可检测的DENV-2病毒血症，导致相应的DENV-2特异性中和抗体的富集。 图1. 登革热病毒(DENV)的主要免疫原性蛋白和三种活减毒四价登革热疫苗的分子结构。 登革热病毒(DENV)是一种单股正链RNA病毒，包括三种结构蛋白[衣壳(C)、前膜(PrM)和包膜(E)]和七种非结构蛋白(NS1至NS5)。针对DENV的抗体反应主要针对PrM、E和NS1蛋白。DENV特异性CD4+ T细胞反应主要针对C蛋白，其次是E、NS3、NS2A/B和NS5，而CD8+ T细胞反应主要针对NS3，其次是C、NS5和NS4A/B。 CYD-TDV是基于减毒黄热病(YFV)骨架，其PrM和E基因被替换为四种DENV血清型各自的基因。 TAK003使用减毒DENV-2骨架，其PrM和E基因被野生型DENV-1、DENV-3和DENV-4株的基因所取代。 TV003是通过在DENV-4和DENV-1的3'非翻译区删除30个核苷酸(rDEN4∆30和rDEN1∆30)以及从DENV-3删除30和31个核苷酸(rDEN4∆30/31)构建的。DENV-2组分是通过将DENV-2 PrM和E基因拼接到rDEN4∆30骨架中构建的。 这张图展示了DENV病毒的主要免疫原性蛋白和三种不同疫苗的分子设计。了解这些疫苗的构造有助于我们理解它们如何诱发免疫反应，以及为何它们可能在效力和安全性方面存在差异。 TV003疫苗接种可以产生所有四种DENV组分的病毒血症。相应地，TV003疫苗接种后产生了针对四种DENV的特异性中和抗体。然而，在进入第三阶段临床试验的TV003配方中，也称为Butantan DV，每个参与者最多只能检测到四种DENV组分中的两种病毒血症。值得注意的是，MSD（美国默克公司）的TV003专有配方V181的第一阶段临床试验，在大多数接种疫苗的个体中产生了四价病毒血症。将V181的未来疫苗效力研究结果与Butantan DV观察到的结果进行比较，可能会进一步揭示疫苗病毒血症如何塑造登革热免疫。尽管如此，这篇综述将关注从Butantan DV配方的TV003中可以得出的登革热免疫学课程，因为它已完成了第三阶段临床试验。 非中和抗体可以触发保护性Fc效应功能，如补体激活和抗体依赖性细胞毒性（抗体依赖性吞噬作用将在后面的章节中更详细地介绍）。针对非结构蛋白1（NS1）的抗体，其在登革热病理学中的作用将在后面的章节中更详细地讨论，也从疫苗接种中产生；然而，这些抗体将针对用作疫苗遗传骨架的病毒（图1）。同样，尽管在E蛋白中发现了CD4+ T细胞表位，但大多数T细胞表位，特别是CD8+ T细胞表位，位于衣壳（C）和NS蛋白中（图1）。因此，大多数疫苗诱导的细胞免疫反应将针对用作遗传骨架的病毒的NS蛋白，因此可能不会在所有四种DENV中平衡。 对症状性DENV感染的疫苗效力在四种DENV类型之间有所不同。此外，所有三种疫苗在有先前DENV感染（基线时血清阳性）的人群中显示出比那些没有感染过至少一种DENV（基线时血清阴性）的人更高的效力。CYD-TDV、TAK003和TV003临床试验的效力终点总结在表1中。关于保护的持久性和加强剂量的需求仍然存在问题。免疫减弱在多大程度上会影响登革热病理学，以及DENV的类型，仍然不确定。 3.理解登革热免疫的挑战 对登革热免疫的了解不得不依赖于流行病学观察的描述性数据。这些数据的质量取决于用于检测和分型登革热病例的研究或监测方法的灵敏度。鉴于临床表现的广泛范围，可能受到诸如DENV株、种族和年龄等因素的修改，再加上在感染期间在一致的时间点获得人类样本的困难，因此数据中存在相当大的异质性也就不足为奇了。这种异质性阻碍了识别登革热保护的免疫相关性。 除了从流行病学研究中得出明确的免疫保护相关性的困难外，对登革热免疫的理解也受到缺乏一个能够密切再现人类DENV感染和疾病病理学的动物模型的限制。产生疾病的小鼠模型大多是免疫缺陷的，特别是通过敲除干扰素（IFN）信号通路中的基因，这是人类对DENV感染免疫反应的关键部分。因此，不能直接将小鼠研究的结论外推到人类登革热。非人灵长类动物（NHPs）可以被DENV感染，尽管大多数在可检测的病毒血症情况下并不发展成类似登革热的疾病。因此，将动物中的登革热免疫研究近似于人类免疫是不确定的。 获得实验性和适当控制的数据的方法之一是应用控制人类感染模型（CHIM）。Sabin的登革热疫苗开发工作依赖于在人类志愿者中进行的这种实验性感染研究。尽管现在以类似的方式进行这种挑战性研究在道德上是不合理的，但值得注意的是，Sabin使用了未传代的野生型DENVs，并没有在任何感染的志愿者中观察到严重的登革热。人类感染研究的最新方法使用了部分减毒的DENVs，以获得更大的安全边际。这种挑战性感染的临床表型范围从无热病毒疹（55）到轻微的类似登革热的自限性急性疾病。然而，使用部分或自然减毒的DENV株可能会低估保护野生型DENVs引起的症状性感染所需的免疫力程度。例如，TV003疫苗接种在未暴露于DENV感染的个体中，在用部分减毒的DENV-2（rDEN2Δ30 Tonga/74）株挑战时，对病毒血症结果提供了100%的保护。然而，rDEN2Δ30 Tonga/74感染仅产生最大病毒血症2.9 log10斑块形成单位（PFU）/ml。另一种引起自限性发热疾病的人类感染模型使用了部分减毒的DENV-1株，其峰值病毒血症范围为4.1至4.8 log10 PFU/ml；这些个体中相应的病毒RNA血症为5.9至7.9 log10 RNA拷贝/ml。相比之下，登革热患者的RNA血症通常在诊断时为6至9 log10病毒RNA拷贝/ml。尽管实验性和自然获得的DENV感染结果之间的接种剂量和感染途径（皮下注射与通过蚊子叮咬的皮内接种）不同，但更大的病毒负担可能需要更强大的适应性免疫反应，以防止疫苗接种后出现症状性结果。在基线时血清阴性的个体中，TV003在预防症状性感染的效力点估计，尽管是在接种后2年而不是在接种后6个月的挑战感染时测量的，为57.9%。总体而言，我们认为CHIM是一种极其有用的方式来筛选不太可能实现理想程度效力的疫苗候选物，以避免进一步昂贵的临床开发，但它还没有达到我们可以准确外推真正疫苗效力的阶段。 临床试验提供了假设驱动的、安慰剂对照的实验数据，这些数据来自大样本量；这四项登革热疫苗的第三阶段试验每项都招募了超过15,000名参与者。它们在登革热流行地区进行，野生型DENVs通过自然的伊蚊-人类周期传播。这些试验还普遍使用主动病例检测来确定疫苗效力；所有发热病例都使用最敏感的诊断工具，即逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测DENV感染。因此，第三阶段试验结果和长期随访观察是完善我们对登革热免疫知识的良机。 4.体液免疫 在20世纪40年代和50年代，登革热血清学被开发并用于测试恢复期血清样本，以寻找DENV感染的证据。从血清学检测和恢复期血清研究中获得的经验表明，病毒中和试验，如斑块减少中和试验（PRNT）和焦点减少中和试验，提供了最大的特异性，以确定初次DENV感染的历史。鉴于大多数二次登革热病例是由与初次感染不同的DENV异型引起的，以及在NHPs中的实验研究，人们认为中和抗体对于登革热免疫是绝对必要的。 4.1.中和抗体和PRNT 首先使用在玻璃处方瓶中生长的细胞单层开发了一种用于DENV中和抗体的斑块减少试验。这种“宏观”试验使用0.4 ml的血清与固定接种量的DENV反应，起始血清稀释度为1:10。这种方法最终被“微观”PRNT所取代，后者需要更少的血清体积和在12孔或24孔组织培养板中生长的细胞单层。由于“宏观”试验被用作“微观”PRNT开发的参考点，大多数人继续使用相同的起始稀释度1:10。因此，在起始稀释度1:10时，病毒接种量的50%或更多被中和（PRNT50）被广泛解释为恢复期血清中的阳性发现。 鉴于DENV感染产生对引起感染的DENV的持久免疫力的假设，恢复期登革热患者中和同型DENV的PRNT50滴度为10或更高通常被假定为免疫的指标。然而，最近的研究表明，对于四种DENVs没有单一的保护性中和抗体阈值。一项队列研究表明，与配对的感染前血清相比，恢复期血清中中和抗体滴度下降不到四倍的个体容易再次感染同株DENV；因此，单独可检测的中和抗体滴度不足以防止同型再次感染。此外，似乎保护免受症状性感染所需的中和抗体阈值在所有四种DENVs中并不一致。CYD-TDV第三阶段临床试验的血清学数据分析后表明，与其他三种DENVs相比，需要更高的中和抗体滴度来保护免受症状性DENV-2感染（表2）；即使比较仅限于DENV-1至DENV-3，其中抗体大多不是针对这三种DENVs的特异性，抗体滴度的差异仍然惊人。同样，一项基于登革热群集的调查发现，与病例有密切接触的人由于病例受到DENV-1和DENV-4感染的保护，当他们的PRNT滴度分别为11和16时，有类似的高概率暴露于传染性蚊子叮咬；相比之下，保护免受DENV-2感染需要PRNT滴度为323。这些发现共同表明，不仅没有单一的中和抗体滴度阈值来保护所有四种DENVs，而且与其它DENVs相比，保护免受DENV-2感染需要更高的中和抗体滴度。 4.2.DENV中和的化学计量 四种DENV病毒颗粒共享一个共同的结构：内核壳被病毒E和膜（M）蛋白包围，这些蛋白显示在来源于内质网的脂质膜上。冷冻电子显微镜图像显示，外层脂质膜上装饰着180个E蛋白和180个M蛋白，并排列成60个不对称的二十面体单元。当足够的E蛋白与抗体结合时，DENV会被中和，而化学计量取决于抗体如何以及在哪里结合E蛋白。 DENV中和的化学计量可能会受到病毒成熟程度的影响。由于DENV从其复制位点通过转高尔基网络进行细胞排出，M蛋白的pr肽的不完全蛋白水解可能会影响病毒的成熟程度。在培养中，未成熟的病毒颗粒更可能被产生，而在人类感染中则可能低估中和DENV所需的抗体量。然而，目前没有证据表明DENV-2产生的成熟病毒颗粒比其他DENV更多，因此不太可能解释保护所需的更高中和抗体阈值之间的差异。 DENV中和的化学计量要求理论上会偏向于结合由两个或更多E蛋白组成的四聚体表位的抗体；中和每个病毒颗粒所需的抗体会更少。许多从恢复期个体中分离出的DENV特异性单克隆抗体结合了这样的四聚体表位。由于对同型DENV再次感染的保护被认为是持久的，因此这种特异性四聚体表位结合的中和抗体的存在可以逻辑上推断出特异性免疫。 来自第三阶段临床试验的效力结果对这一逻辑提供了混合支持。尽管来自CYD-TDV和TAK003疫苗接种的特异性抗体的存在与各自的特异性疫苗效力相一致，但TV003试验的初步报告则建议更细致的解释。在CYD-TDV和TAK003中，接种后产生的主要特异性抗体分别是针对DENV-4和DENV-2。相应地，这两种不同疫苗提供的最高保护分别是针对DENV-4和DENV-2的症状性感染。相比之下，TV003疫苗接种发现对所有四种DENV产生了可比的特异性抗体滴度，尤其是针对DENV-1和DENV-2。尽管如此，在没有先前DENV感染的个体中，Butantan DV（与TV003类似）对症状性DENV-2的效力低于对DENV-1感染的效力（57.9%对85.5%）。在撰写本综述时，尚不清楚这一差异是否具有统计学意义，因为这些点估计的95%置信区间尚未报告。因此，尽管每种DENV特异性中和抗体提供了一定程度的保护，但保护每种DENV所需的滴度是不同的。 4.3.特异性DENV中和的差异阈值可能反映抗体依赖性感染的倾向 DENV感染髓源性细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。除了通过相应受体介导的内吞作用进入外，抗体装饰的DENV还可能通过激活Fcγ受体（FcγRs）被这些抗原呈递细胞摄取。由于DENVs共享相当大比例的结构抗原，感染一种DENV类型会诱导与其他DENV血清型交叉反应的抗体。因此，亚中和浓度的交叉反应抗体可能通过提供DENV一种替代的激活FcγR介导的进入途径来促进感染。通过激活FcγRs的进入似乎也是一种比相应受体介导的内吞作用更有效的病毒进入途径。这种进入途径与在二次感染中增加严重疾病的风险相关，该二次感染是由与引起初次感染的DENV异型引起的。同样，母体中和抗体浓度的减少到增强感染的浓度也与严重登革热风险的增加相关。这一过程被称为DENV感染的ADE。 在人体中，预防DENV-2感染所需的更高抗体浓度可能反映了四种DENV之间ADE风险的差异。尽管ADE被广泛认为是严重二次登革热的致病机制，但这一过程比人们所理解的要复杂得多。来自尼加拉瓜的一项队列研究观察到，只有在基线感染前抗体滴度处于限制范围内时，严重登革热的最大风险才会出现。泰国的另一项研究使用不同的血清学检测也得出了相同的结论。实验上，活减毒黄热病毒（DENV所属的黄病毒属的原型病毒）感染仅在具有由日本脑炎疫苗接种产生的特定范围的交叉反应抗体滴度的人群中增强。 适合ADE的抗体滴度的限制范围可能是由于对适当大小的病毒-抗体免疫复合物的需求，以便最佳共同结合适当的免疫受体。高抗体浓度会聚集DENV形成大的免疫复合物，这些复合物共同结合了较少的但具有抑制作用的FcγRIIB。FcγRIIB含有一个细胞质免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM），其信号传导阻止病毒进入，从而抑制ADE（图2A）。激活FcγRs，如FcγRIIA，含有一个细胞质免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），促进DENV-抗体复合物的摄取。它还迅速诱导抗病毒功能的干扰素刺激基因（ISGs）的表达，并限制病毒复制（图2B）。 图2. 抗体依赖性增强（ADE）需要抗体与DENV的最佳比例以适当地结合细胞受体。 A) 较高的抗体：DENV比例导致DENV聚集并共同结合抑制性Fcγ受体IIb（FcγRIIB），该受体通过其免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）细胞质尾部发出信号，以抑制免疫复合物的摄取。 B) 在中等抗体：DENV比例下，免疫复合物的大小足以共同结合激活FcγR，此处描绘为FcγRIIA，它具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）细胞质尾部。在这种情况下，DENV感染仍然受到抑制，要么是通过抗体结合足够数量的表位以防止DENV与内体膜融合，从而将RNA释放到细胞质中（左），要么是通过ITAM介导的信号传导上调干扰素刺激基因（ISGs），在髓源性细胞中诱导抗病毒状态（右）。 C) 在亚中和抗体：DENV比例下，DENV与白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）之间的额外相互作用，该受体具有ITIM信号传导细胞质尾部，抑制ISG的诱导，从而促进一个更有利于增强DENV感染的细胞质环境。 这张图说明了ADE过程中抗体与DENV相互作用的复杂性。不同比例的抗体与病毒结合可能导致截然不同的结果，从抑制感染到促进感染。这种理解对于开发能够有效预防DENV感染和ADE的疫苗至关重要。 为了使ADE发生，DENV必须在不触发ISG表达的情况下，通过激活FcγR介导的摄取。它通过结合白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）实现这一点，该受体发出信号以抑制宿主髓源性细胞中ISGs的上调（图2C）。抗体-DENV复合物在进入髓样细胞时的相互作用使病毒能够逃避宿主抗病毒反应，这是仅通过非ADE进入途径无法实现的。鉴于这些相互作用的需求，四种DENV可能具有不同的固有ADE倾向。 长期以来，人们一直怀疑四种DENV以不同的方式利用FcγR介导的进入途径。在DENV-2流行的时期进行的研究发现，在母体抗体减弱时，婴儿患严重登革热的风险增加。相比之下，当主要流行病毒为DENV-3时进行的研究没有显示出类似的风险增加。在泰国Khampaeng Phet进行的研究发现DENV-1和DENV-3是症状性初次登革热的主要原因。相比之下，通过母体抗体增强，婴儿中DENV-2感染的症状性感染率增加，二次感染中DENV-2感染也是如此；症状性二次感染与初次感染的比例在DENV-4中也更高，尽管在这个队列中症状性DENV-4感染的总体比例最小。对1994年至2006年在曼谷报告的登革热病例进行的纵向分析也发现了类似的趋势：DENV-1和DENV-3更常与初次登革热相关，而二次感染的DENV-2更常与登革热出血热相关。DENV-2也更常与登革热休克综合征相关。最后，对越南6年报告的登革热病例进行的建模也发现DENV-2是二次感染中症状性登革热的最大风险因素。 来自最近一项研究，该研究涉及超过5600例登革热病例，发现高血浆病毒血症、二次感染和DENV-2感染是与严重登革热风险增加相关的因素。此外，在疾病早期发热阶段通常检测到的病毒血症范围内（血浆6至9 log10病毒RNA拷贝/ml），血浆渗漏（图3A）和严重登革热（图3B）的风险在二次感染DENV-2的患者中最高。总的来说，这些发现表明DENV-2对感染的保护免疫学要求最高。 图3. 二次DENV-2感染与血管渗漏和严重登革热风险最高相关。 A) 显示了经历二次DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4感染的登革热患者的血浆渗漏概率。 B) 显示了经历二次DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4感染的患者的严重登革热概率。每个图表中虚线之间的区域代表了在疾病发热阶段通常在登革热患者中检测到的病毒血症量。 这些图表说明了在二次感染时，DENV-2感染与血浆渗漏和严重登革热风险之间的关联性。虚线区域表示在登革热患者发热期间通常检测到的病毒血症水平，这强调了在这一阶段控制病毒血症的重要性，以减少严重并发症的风险。 4.4.抗NS1抗体 尽管主要针对DENV的PrM和E蛋白的中和抗体在疫苗效力中起着重要作用，但一些人提出有效的登革热疫苗也应该引发针对NS1的抗体。NS1是DENV在急性感染期间唯一从细胞分泌的蛋白，在DENV病理学的实验模型中被认为是内皮功能障碍和血管渗漏的直接原因，也是从免疫细胞释放促炎细胞因子的驱动因素。相应地，抗登革热NS1抗体似乎在小鼠感染模型中发挥保护作用。接种NS1疫苗的小鼠受到致命病毒挑战的保护，最近，两种针对黄病毒NS1的单克隆抗体被证明可以减少病毒血症、内皮功能障碍和血管渗漏，从而提高DENV感染小鼠的存活率。重要的是，与E蛋白的交叉反应或亚中和抗体不同，抗NS1抗体不能诱导ADE。 尽管一些研究发现NS1抗原血症与严重疾病之间存在关联，但其他研究显示了相互矛盾的结果。二次感染DENV-2的患者比初次感染的患者更可能有不可检测的NS1浓度，尽管同一研究也发现高NS1浓度与血小板减少的低谷相关。尽管NS1的致病作用和抗NS1抗体的保护功能尚未在临床上得到证明，但登革热疫苗引发抗NS1抗体可能对潜在调节突破性症状性感染的疾病严重程度有一些益处。 5.细胞免疫 迄今为止，登革热疫苗的开发主要集中在诱导高滴度和平衡的中和抗体，以预防DENV引起的症状性疾病。然而，中和抗体只是适应性免疫反应的一个组成部分。由CD4+和CD8+ T细胞驱动的细胞免疫在病毒控制和预防疾病方面也起着重要作用。辅助CD4+ T细胞通过分泌如IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子，支持免疫系统的其他部分，如B细胞和巨噬细胞，而细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死病毒感染的细胞。因此，中和抗体和细胞免疫反应在控制感染和减轻疾病严重程度方面发挥互补作用。 T细胞在DENV感染中的角色一直存在争议，既有病理学作用也有保护作用。以前认为，初次DENV感染期间诱导的抗原特异性T细胞会在二次异型感染期间导致低亲和力、交叉反应记忆T细胞的扩增，由于清除病毒的能力较低和分泌炎症细胞因子，导致免疫病理学增加，这一现象被称为原始抗原罪。在泰国儿童登革热住院治疗的研究中发现，二次感染中DENV特异性T细胞对感染血清型的亲和力较低，对可能负责先前感染的其他血清型有更强的亲和力。这些T细胞研究是在患有严重登革热的儿童的感染急性阶段进行的。因此，这种“原始抗原罪”解释可能只代表一部分二次登革热患者。与疾病急性期不同，在从登革热中恢复的人中进行的研究发现了强烈的交叉反应T细胞反应。现在越来越认为T细胞在登革热中可能发挥保护作用，DENV特异性T细胞反应与保护效力相关。在与减少严重疾病易感性相关的人类白细胞抗原（HLA）等位基因的个体中，发现了更强大和多功能的抗原特异性CD8+ T细胞反应。同样，DENV感染诱导细胞溶解性DENV特异性CD4+ T细胞，与保护性HLA DR等位基因相关。在泰国学龄儿童的巢式病例对照研究中，具有更高频率的分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的DENV特异性T细胞的儿童更有可能发展为无症状而不是症状性DENV感染。这些观察结果表明T细胞在登革热中具有保护作用。 CD8+ T细胞对DENV的反应主要针对NS3蛋白，其次是C、NS5和NS4A/B，而CD4+反应主要针对C，其次是E、NS3、NS2A/B和NS5。这些DENV反应性T细胞的细胞免疫可能在中和抗体滴度不足以灭菌感染时迅速清除感染方面尤为重要。T细胞的功能作用在异体肾移植受者中得到了证明，他们接受了T细胞抑制治疗以预防移植排斥。由于T细胞计数低，这些患者的DENV感染过程延长，最终只有在T细胞计数恢复到接近正常值下限时才清除感染。 5.1.登革热疫苗接种引发的T细胞反应 CYD-TDV使用黄热病（YF17D）骨架，因此缺乏包含大部分CD8+ T细胞表位的DENV NS蛋白（图1）。尽管YF17D疫苗接种诱导的T细胞对DENV有一定程度的交叉反应，但这些反应往往有限且幅度小得多。例如，尽管基线时对登革热不了解的个体接种CYD-TDV后对YF17D NS3产生了强烈的CD8+ T细胞反应，但对DENV NS3的交叉反应性CD8+反应却很弱。这种缺乏强烈的DENV特异性T细胞反应可能是CYD-TDV对DENV-1和DENV-2效力不佳的原因之一。 TAK003则使用减毒DENV-2病毒PDK53作为DENV-1、DENV-3和DENV-4构建的骨架。在对TAK003接种的登革热不了解和接触过登革热的青少年中，针对DENV-2 NS1的IFN-γ分泌CD4+和CD8+ T细胞的频率最高，对DENV-1、DENV-3和DENV-4 NS蛋白也观察到可检测的，尽管较低的交叉反应性反应。在黄病毒不了解的成年人中也报告了类似的发现。TAK003诱导的T细胞反应反映了其效力概况，对DENV-2的临床效力最高，与其他三种血清型相比：DENV-2为97.7%，DENV-1为73.7%，DENV-3为62.6%；由于病例不足，DENV-4的效力结果不确定。 TV003诱导了一种广泛且多功能的CD8+ T细胞反应，反映了自然二次DENV感染的情况；超过90%的反应针对保守的DENV序列，表明TV003诱导的T细胞反应应该能够识别所有四种血清型。这种四价疫苗接种后的T细胞反应与单价疫苗接种后的反应形成对比；保守序列在DENV1∆30中只占46%，在DEN2/4∆30中占16%，在DEN3∆30/31中占54%，在DEN4∆30中占7%。此外，单价疫苗诱导的T细胞既针对结构蛋白也针对NS蛋白，尽管四种DENVs的CD8+ T细胞免疫优势模式存在差异。例如，51%的CD8+ T细胞反应在DENV-3感染后针对结构蛋白，而在DENV-2感染后只有19%针对结构蛋白。这些差异可能是由于不同DENVs感染期间抗原处理和呈现的差异所致。因此，尽管几乎所有由四价疫苗诱导的CD8+ T细胞反应都被观察到针对NS蛋白（主要是NS3和NS5），类似于二次感染后的反应，但目前尚不清楚仅针对保守表位的T细胞是否在不同血清型中同样具有保护作用。 5.2.常规测量细胞免疫 现在很清楚，有效的登革热疫苗应能够诱导DENV特异性细胞免疫，但目前尚不清楚这一最小阈值需要是多少。细胞免疫很少作为DENV疫苗开发的保护相关因素进行评估，疫苗开发商和监管机构几乎完全依赖于抗体滴度来识别疫苗候选物。一个促成因素是缺乏标准化的T细胞检测，这些检测既简单易行又易于解释。DENV特异性T细胞只占体内所有T细胞的一小部分，通常需要复杂的功能性检测才能被检测到。目前使用的检测方法，如IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）和基于流式细胞术的检测，劳动强度大，耗时长，需要高度专业化的技术专长和设备。此外，这些检测通常在需要大量血液的外周血单核细胞上进行；这使它们不适合大规模部署，特别是在儿童人群中。幸运的是，现在有了更用户友好的T细胞检测方法。例如，最近开发的一种快速细胞因子释放检测只需要少量的全血（<1 ml），在评估严重急性呼吸综合征冠状病毒2特异性T细胞反应方面显示出良好的敏感性和特异性。这种标准化检测的使用可以扩展到DENV疫苗开发，并能够定义结合抗体和T细胞测量的保护相关因素。 6.登革热疫苗的未来 从第三阶段临床试验中可以学到的教训是，登革热疫苗需要引发全面的适应性免疫反应。中和抗体可以提供保护，但可能需要在没有先前DENV感染的人群中达到过高的滴度。此外，尽管中和抗体可以预防感染，但维持这种抗体的持续滴度可能需要反复接触DENVs。引发针对NS1蛋白的体液反应，以及针对C和NS蛋白的CD8+ T细胞反应，可能会产生预防登革热和严重登革热所需的多层次免疫反应。缺乏这种多层次反应可能解释了在没有先前DENV感染的CYD-TDV疫苗接种者中观察到的住院和严重登革热风险增加。相比之下，至少部分是由于这种多层次的DENV导向反应，尽管在没有先前DENV感染的TAK003疫苗接种者中缺乏对症状性DENV-3感染的效力，但避免了登革热住院人数的增加。TAK003的第四阶段临床研究应该能够进一步阐明这些适应性免疫反应在预防登革热和严重登革热中的作用，特别是在没有先前DENV感染的情况下由DENV-3引起的登革热。 理想的登革热疫苗应该能够预防症状性感染和DENV传播。这样的疫苗需要强有力地引发中和抗体和T细胞的反应，鉴于它们在免疫中的互补作用。然而，即使登革热疫苗不能在所有四种血清型中实现高滴度的中和抗体，能够诱导广泛和持久的T细胞反应的疫苗仍然可能在预防登革热住院和严重疾病方面非常有效。从我们对2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗的经验中可以得出类似的教训；尽管目前的COVID-19 mRNA疫苗由于抗体逃逸突变而无法持续保护免受Omicron变体的感染，但通过保留病毒特异性T细胞反应，仍然维持了对严重疾病的保护。此外，疫苗接种在群体水平上也带来好处：在世界卫生组织建议进行预接种以确保只对有先前DENV感染的人进行疫苗接种之前进行的CYD-TDV疫苗接种的建模表明，如果这种疫苗定价有竞争力，对于高登革热流行国家，这种疫苗具有成本效益。因此，TAK003和TV003疫苗接种的改善总体结果可能会为流行国家带来更大的成本效益。因此，一种疫苗即使不能完全保护免受症状性感染或传播，但能预防住院和严重登革热，可能不是完美的，但仍然是群体水平登革热控制的有用解决方案。 最后，我们建议，在一种能够完全保护免受所有四种DENV疾病侵害的单剂量疫苗可用之前，异源初免-加强策略可以利用每种疫苗的优势，同时克服它们的局限性。临床观察表明，在两次感染后，第三次和第四次DENV感染大多是无症状的。因此，例如，先用TAK003进行一次剂量的初免，然后用CYD-TDV进行加强，可以模拟连续感染，因为疫苗病毒血症研究表明这些疫苗的感染类型不同；TAK003显示可测量的DENV-2疫苗病毒血症，而疫苗病毒血症主要从CYD-TDV的DENV-4其次是DENV-3组分中检测到。也可以设想与TV003的类似组合。因此，异源初免-加强策略可以消除多年疫苗开发的需求，使登革热不再仅仅是理论上的，而是真正可以通过疫苗预防的疾病。