突破瓶颈：AAV基因组改造技术助力高效病毒载体生产

2024-06-24

基因疗法上市批准

摘要：腺相关病毒(AAV)是基因治疗中最强大的载体之一。该载体的实验特性显示了其效率和可接受的安全性，这解释了科学家们在研究和治疗广泛疾病中增加使用它的原因。这些研究需要使用功能性、纯净且高滴度的载体颗粒。事实上，当前对AAV结构和基因组的了解有助于提高AAV载体的可扩展生产。在这篇综述中，我们总结了通过修改AAV基因组或细胞内生物过程来优化可扩展AAV生产的最新研究。 1. 引言腺相关病毒（AAV）是一种能够感染人类和其他灵长类动物的小病毒。它们是非包膜病毒，属于依赖性细小病毒属，属于细小病毒科。这种小（20纳米）病毒最初在1965年被Atchison等人在腺病毒（Ad）制剂中作为污染物发现。已知有几种自然AAV血清型，其中AAV2是最被充分研究和最常用的。这些血清型在它们的衣壳结构上有所不同，导致它们在宿主生物体中的趋向性和免疫原性也有所不同。AAV有一个相对简单的基因组，是一种非致病性病毒，这就是为什么AAV载体是基因治疗中很有前景的病毒载体。此外，AAV在整合到宿主基因组中的频率较低，这表明其在临床研究中的安全性。AAV载体的另一个优点是它们能够提供稳定的转基因表达，这种表达在一些体内实验中可以持续超过一年。AAV已经被用于治疗中枢神经系统和视网膜退行性疾病，各种类型的肌营养不良症，以及心脏、肺和肝脏疾病。除了自然AAV血清型外，重组AAV（rAAV）血清型也包括在治疗不同疾病的前临床和临床试验中，例如血友病B。第一种基于AAV的基因治疗药物Glybera是针对脂蛋白脂肪酶（LPL）缺乏症 LPL）缺乏症患者。Glybera于2012年获得欧洲药品管理局（EMA）的批准，但后来在2017年因商业失败退出市场。当前基于AAV的基因治疗市场有两种FDA批准的基于AAV的基因治疗：1）Luxturna（voretigene neparvovec），2017年批准用于治疗Leber先天性黑蒙症，随后在2018年11月获得欧洲委员会的批准，2）Zolgensma，2019年批准用于治疗脊髓性肌肉萎缩症。这些药物的批准对基于AAV的基因治疗领域产生了巨大影响。此外，AAV也被研究作为癌症治疗的基因治疗工具。通过修改AAV衣壳以实现对癌细胞的更高转导效率是使用AAV载体靶向癌细胞的策略之一。另一种策略是使用AAV载体的自杀基因治疗方法。这种方法通过传递转基因到癌细胞来触发细胞死亡过程。AAV载体也用于称为DREADDs（仅由设计药物激活的设计受体）技术的非侵入性化学遗传技术。这项技术在行为神经科学中得到了广泛应用，其中AAV传递的DREADDs在体内调节G蛋白偶联受体（GPCR）活性。这种GPCR调节有助于研究人员理解大脑活动与行为以及神经疾病发病机制之间的联系。AAV-DREADDs已成功用于在小鼠模型中进行酒精消费研究和体外细胞神经网络研究。同样，AAV载体在不同的光遗传学方法中被用于治疗不同的视网膜退行性疾病和青光眼；所有正在进行的视网膜基因治疗临床试验都是基于AAV递送。AAV载体在光遗传学中的另一个应用示例是使用AAV载体进行聋沙鼠和老鼠模型中的听力恢复研究。AAV载体在不同科学领域中的应用强调了优化AAV生产的重要性，以满足研究需求。使用基于AAV的基因治疗的临床和前临床研究的数量不断增加，需要使用成本效益的方法进行AAV生产。为了优化AAV生产，已经进行了许多研究，包括上游和下游阶段。上游优化包括质粒修改，使用不同的细胞系和转染方法。目前，组装AAV颗粒最广泛使用和可用的方法是转染贴附的HEK293细胞培养。然而，即使在高比例的转染中，生产病毒颗粒的难度和效率不足，已成为研究其他组装系统的推动力。目前主要使用的是1）HEK293悬浮培养，2）SF9昆虫细胞与重组杆状病毒（rBV）表达载体，3）稳定的生产HeLa细胞，以及4）使用复制缺陷的单纯疱疹病毒（HSV）的平台。然而，每个平台在安全性、灵活性和多功能性方面都有缺点和限制。例如，尽管悬浮培养很容易扩展，但并非所有细胞在转染期间都接受到最佳数量和比例的质粒，这可能导致全衣壳的比例下降。使用昆虫细胞Sf9和rBV的结果与野生型病毒蛋白的比例不同。此外，在非哺乳动物细胞中组装的AAV的翻译后衣壳修饰和病毒DNA甲基化与在HEK293中组装的AAV不同，可能导致治疗副作用。在生产细胞系的情况下，为每种血清型和转基因创建新的亚克隆既耗时又具有制造挑战。因此，尽管这些系统看起来非常有前景，但需要进行许多优化以克服现有的困难，并创建一个健壮且通用的平台。另一种解决方案可能是通过修改AAV的基因组和结构来改善生产，例如增加产量、纯度和有效性。然而，由于AAV的详细生物过程尚未完全理解，仍然存在限制。在我们的综述中，我们专注于2020年至2023年在AAV基因组修改领域的最新同行评审文章，以提供新的和最新的信息和结果，这些可以用来实现更好的AAV生产产量，提高纯度、安全性和有效性。我们还提到了早期年份的文章，以提供一个完整的概述，说明已经做了什么。 2. 关于AAV的简要背景 AAV颗粒由一个4.7-kb的单链DNA基因组组成，被包装在直径约为260A的病毒衣壳中。这个大约3.8MDa的二十面体衣壳由60个亚基组成，这些亚基由3种不同的病毒蛋白（VPs）组成，它们仅在N-末端有所不同（图1）。图1. AAV基因组由ITRs所夹，编码Cap和Rep AAV基因。 AAV的小包装能力被认为是使用AAV载体进行基因治疗的主要限制之一。AAV基因组由两个反向末端重复序列（ITRs）所夹，每个ITR大约为145bp长（图2）。图2. 野生型ITR结构。 ITRs在AAV复制、转录调控和基因组包装中起着主要作用。AAV基因组包含两个主要的开放阅读框（ORFs），受3个启动子的控制（图1）。第一个ORF位于Cap基因中，通过不同的起始密码子编码三种病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3（分别为87 kDa、72 kDa、62 kDa）。Cap ORF还编码组装激活蛋白（AAP）、膜相关辅助蛋白（MAAP）和X蛋白，这些蛋白参与AAV生命周期，特别是在增加AAV2自主DNA复制（无辅助因子）方面，在分化的角质形成细胞中，这是其天然宿主组织，以及在Ad5感染的293细胞中AAV2 DNA复制。第二个ORF，Rep ORF的转录是在P5和P19起始位点启动的，它通过转录本的替代剪接导致AAV的四种非结构蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）的表达。大型Rep（Rep78和Rep68）已被证明具有位点特异性[5]和链特异性核酸酶活性，DNA-RNA和DNA-DNA解旋酶活性，以及DNA结合功能，所有这些似乎都是病毒复制和位点特异性整合到宿主基因组所必需的。小型Rep（Rep52和Rep40）对基因组包装是必需的。尽管这些Rep蛋白对复制很重要，但它们不足以产生有效的感染。AAV需要与辅助病毒共感染，无论是腺病毒（Ad）还是单纯疱疹病毒（HSV），才能有效感染。AAV感染过程的第一步是与细胞表面受体结合。AAV2、AAV3和AAV6与肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）结合。AAV1、AAV4、AAV5和AAV6的其他细胞表面受体是唾液酸，而AAV9是N-末端的半乳糖，而AAVrh10与末端半乳糖的细胞表面糖链结合。AAV与细胞受体的结合是由与细胞表面的附着蛋白结合开始的，其中KIAA0319L（称为AAVR）是众所周知的。不同类型的附着蛋白和受体与不同的血清型相关，受体结合的这种多样性在血清型之间定义了不同血清型的不同的趋向性。尽管关于所有AAV血清型、细胞受体和蛋白之间相互作用的数据不多，但这些数据可以用来优化特定AAV血清型的生产细胞系。使用对血清型不利的细胞系进行特定血清型的AAV生产过程可能有帮助；通过这种方式，我们可以减少新产生的载体重新转导到生产细胞中，这可能导致更高的病毒滴度。AAV感染的下一步是向细胞核的内吞作用。定义了不同的AAV内吞途径。例如，AAV2感染具有CLIC/GEEC内吞作用的所有特征，这是一种非衣蛋白依赖性内吞途径，而AAV5感染途径主要是通过衣蛋白包被的小泡向高尔基体。AAV内体逃逸可以通过该隔室内部的pH值下降介导，这导致暴露在衣壳蛋白VP1（VP1u）独特的N-末端隐藏的磷脂酶A2（PLA2）结构域。之后，AAV颗粒进入核孔复合体，基因组释放发生在核进入期间或核内，并定位在与常染色质共定位的核周围，那里发生活跃的转录和DNA修复。对于野生型AAV，如果存在辅助病毒，基因组复制就会开始。事实上，这种复制是由AAV编码的Rep蛋白、辅助病毒编码的蛋白、宿主细胞复制蛋白RPA、RFC、PCNA和DNA聚合酶delta介导的；AAV ITRs作为转录的起始点，开始将单链AAV转换为双链AAV。这是AAV转导中的一个限速步骤，这就是为什么使用自互补AAV（scAAV）基因组可以绕过第二链的合成，同时逃避单链DNA降解，这使得scAAV载体能够快速启动转基因表达。然而，由于强大的基因表达，通过scAAV传递的转基因产物比通过单链AAV载体传递的转基因引起更强的免疫反应。脱壳后，单链基因组转化为双链的多聚体环状串联体形式，在有丝分裂后细胞中长期存在。值得注意的是，dsDNA转换后短时间内载体基因组的不稳定导致基因表达的显著丧失。这些步骤中的损失有助于整体效率的载体在每次转导事件中所需的VGP剂量。AAV脱壳和向核仁运输的详细机制仍然值得关注，因为这些步骤可以影响AAV新颗粒的合成和病毒基因组包装的效率。这就是为什么理解这些潜在机制至关重要，特别是在AAV载体生产协议和体内AAV趋向性研究中。 3. AAV基因组和结构的改造，以实现可扩展、优化的AAV生产 3.1. 病毒滴度、转基因表达和包装在临床前和临床阶段测试基于AAV的基因疗法需要大规模生产，与体外实验相比，需要显著更高的载体颗粒滴度。目前，通过使用不同的细胞系、组装系统、转染类型和下游阶段优化，正在增加AAV产量。然而，基于rAAV基因组或结构改造的其他几种方法可以用来获得更纯净、功能更完善的AAV病毒颗粒的更高滴度。以下各节讨论了这些方法的示例。 3.1.1. ITRs结构改造 ITRs序列的变化可以显著影响AAV的复制和包装，从而更有效地生产病毒颗粒或改进载体变体。通过ITR序列改造，发明了自互补AAV（scAAV），这是治疗脊髓性肌肉萎缩症的重要成分，名为Zolgensma。这种结构是通过从其中一个ITR中移除trs获得的（表1），从而防止Rep68/78切割，结果是通过改变的内部ITR链接的复制载体基因组。将复制的基因组传递到细胞核促进自退火，形成双链DNA结构，无需完成第二链。因此，感兴趣的基因的转录，以及编码蛋白的表达，开始得更早，并保持在更高水平。表1：ITR改造及其对AAV生产的影响。灰色字母，ITR结构中删除的核苷酸。红色字母，ITR序列中修改的核苷酸。更改是相对于野生型ITR的。另一种修改ITR序列的方法是移除或突变非必要的ITR结构元素。大多数尝试改变ITR序列都导致了病毒基因组复制和/或包装的破坏。然而，一些ITR序列的删除，甚至只含有一个ITR结构的AAV基因组，并不会影响包装AAV基因组的能力。2017年，Zhou等人继续研究ITR区域删除对rAAV包装和表达的影响。提出BB’和CC’区域可能对rAAV复制和包装并不重要，创建了一个修改后的ITR（ITRΔBC rAAV）（表1）。研究表明，这两个ITR中的这些区域的删除并不影响包装，但将rAAV滴度降低了75%。Rep结合元素（RBE）和可被Rep68/78识别的trs在AA’区域的存在解释了rAAV包装的保存。ITRΔBC rAAV滴度降低的原因可能与缺乏RBE’有关，RBE’也对大Rep蛋白的相互作用至关重要，导致ITRs的解旋和在trs上形成“茎-环”结构。rAAV质粒中缺乏RBE’导致与野生型相比复制率较低，这与ITRΔBC rAAV的病毒基因组DNA复制减少8倍一致。因此，这可能是病毒滴度降低的原因。令人惊讶的是，ITRΔBC rAAV系统的转基因表达高于野生型，无论是体外还是体内。研究表明，在末端以T形发夹构象限制的具有回文末端重复的DNA分子容易受到共济失调毛细血管扩张突变（ATM）介导的基因表达丧失。删除BB’和CC’区域导致用一个简单的U形发夹替换了转录上沉默的T形发夹，不受ATM依赖性沉默的影响。因此，ITRΔBC的U形HP末端保持完整，不受ATM的影响，可能导致rAAV表达增加，这与由于ATM功能丧失导致的rAAV转导增强的报告一致。此外，Mre11（MRN）复合体，在AAV感染期间也识别并与AAV ITRs相互作用，限制了AAV转导。在MRN抑制剂存在的情况下，观察到转导效率的变化，与具有wt ITR的rAAV相比，ITRΔBC rAAV总是较低，表明BB’和CC’区域的删除降低了MRN复合体对AAV表达的抑制作用。基于ITR和启动子结构的相似性，最新的ITR序列改造在2020年由Earley和同事发现，他们发现了多个转录起始位点（TSS），主要集中包含RBE的40 bp区域。ITR序列中TSS的存在，除了高含量的胞嘧啶和鸟嘌呤（64-70%）和高CpG二核苷酸频率（83-95%）外，类似于转录活跃的CpG岛（CGI），这是脊椎动物中最常见的启动子类型。可以假设ITRs作为CGI型启动子，可能在野生型AAV的生命周期中发挥作用。此外，未甲基化的CGIs是免疫刺激物，消除它们可以导致基因治疗的免疫反应减少。在最近的一项研究中，Pan实验室发现，完全没有CpG基序的ITRs（表1）将载体产量降低了约3倍，但有助于与野生型ITRs相同的基因组包装水平。没有CGIs的载体滴度较低可以通过减少载体基因组的复制来解释，这是可以预测的，因为CGIs通常是复制的起点。令人惊讶的是，野生型ITR载体和无CpG ITR载体在体内显示出相似的转基因表达水平和载体基因组的拷贝数。 3.1.2. MAAP改造 2021年，Galibert等人更详细地研究了MAAP2在AAV生产中的生物学。结果表明，MAAP的截断和失活导致Rep和AAP蛋白的表达水平更高。全长MAAP的存在展示了VP蛋白的特定降解产物。至少缺少MAAP蛋白C-末端最后10个氨基酸的缺失减少了衣壳的降解，并增加了衣壳蛋白的表达，而其他截断形式的MAAP完全阻止了AAV2衣壳的降解，这导致某些变体组装的衣壳增加了3.5倍。可以假设MAAP以某种方式影响衣壳降解和VPs的稳定性。也可以假设，由于截断形式或失活的MAAP导致AAP表达增加，这种蛋白直接导致防止VPs的降解并增加它们的稳定性。 3.1.3. AAP的作用 2010年，在AAV2基因组中发现了组装激活蛋白（AAP）。它是Cap基因蛋白之一，来自一个额外的嵌套的替代ORF（ORF2）和在非传统翻译起始位点的翻译启动。这项研究表明，这种23 KDa蛋白在将新合成的VPs共转运到核仁，它所在的位置，并在衣壳组装中发挥积极作用。尽管AAP2的研究表明这种蛋白对衣壳组装至关重要，但这种趋势只是偶尔观察到。对不同AAV血清型的分析表明，AAP的需求根据病毒血清型显著变化。2017年，Grosse等人和Early等人证明，AAP的缺失将病毒颗粒的滴度降低了大约2.5到3000倍，与野生型相比，这些研究揭示了AAV4、AAV5和AAV11在衣壳组装中独立于AAP。2018年的进一步研究表明，血清型对AAP的依赖可以分为三类：（i）AAP独立，（ii）AAPC - 独立，或（iii）AAP依赖（表2）。表2：AAV血清型对AAP的依赖性。绿色框表示AAP独立血清型（AAP的完全缺失导致约1%的WT滴度）。黄色框表示AAPC独立血清型（AAP C末端三分之二的缺失导致超过WT滴度的10%）。红色框表示AAP依赖血清型（AAP的完全缺失导致约1%的WT滴度）。 2017年，Grosse等人证明，在没有AAP的情况下功能性载体颗粒的生产（通过转导后GFP表达细胞的数量确定）可以通过不同血清型的转AAP的共表达来恢复（图3A）。有趣的是，与几种AAP血清型的共表达使AAV3的产量增加了约1.5倍，这表明AAV3组装直接依赖于AAP的保留。此外，AAP4和AAP5更有效地恢复了AAV4和AAV5的生产，可能由于这些血清型的衣壳和AAP序列与其他血清型有显著差异。有趣的是，AAP在AAP表达AAV变体中的过度表达并不增加功能性颗粒的产量，无论是野生型还是嵌合变体。因此，如果人工AAV变体不产生功能性颗粒或产量低，这并不一定与AAP的改变有关。相反，这可能反映了衣壳在组装成不能被AAP克服的病毒粒子方面的固有缺陷。这与另一项实验一致，在该实验中，通过DNA重组创造了八个不同血清型（主要是AAV2、8和9）的嵌合衣壳AAVDJ，进行了重组AAP的共表达（图3B）。结果表明，AAPDJ恢复了这三种没有AAP的AAV的生产，几乎与每种AAP本身相同。此外，它还成功地与其他血清型一起工作，除了AAV4和AAV5。此外，对60种不同的嵌合AAP的后续研究表明，它们至少保留了一些活性来恢复AAP敲除突变体。因此，在嵌合AAV生产期间生成嵌合AAP很可能不是限制因素。图3. 10种缺乏AAP的辅助质粒与10种AAP变体的反式互补。然而，在2018年，Viney和同事研究了AAV嵌合衣壳，其中VP3序列来自AAV6，VP1和VP2来自不同的血清型。他们发现，尽管这些嵌合体平均病毒滴度比野生型AAV6低3个对数，但它们显示出比野生型AAV6更高的转导能力（从1.5到2个对数）。假设这可能是由于AAP序列变化导致的AAP敲除引起的，恢复了野生型AAP6 N-末端的关键氨基酸序列（第13至27个氨基酸）。结果，它导致了病毒滴度的完全恢复，并将转导效率降低到野生型AAV6的水平。此外，AAP基因改变的嵌合体表现出所有三种衣壳蛋白表达减少。尽管不可能否认AAP在稳定衣壳生产中的基本作用，是否额外表达AAP会影响嵌合衣壳的组装和功能需要进一步研究。需要对各种血清型的AAP进行额外研究，以更好地了解AAV组装的生物学，并进一步应用这些知识生产重组病毒颗粒。 3.2. AAV生产动态的改造；满的与空的衣壳 3.2.1. AAV复制和包装的动态了解AAV生产过程中的生物学过程有助于优化生产条件和材料，以获得更好的产量。2021年，Nguyen等人首次提出了基于机制的rAAV生产的动力学模型。他们在HEK293细胞上制作了模型。根据这个模型和文献数据，AAV DNA复制在细胞中大约在转染后12小时开始，比衣壳组装晚得多。复制在24小时达到峰值，并在48小时内达到稳定。相比之下，衣壳形成在转染后的头几个小时开始，并在24小时减少。结果，首先制作的衣壳在没有DNA的情况下离开细胞核，并且由于缺乏可用的衣壳，AAV基因组的包装受到限制。这就是为什么最初点上DNA复制动力学的变化可能影响完整病毒粒子的生产。为了促进DNA复制和衣壳形成，Rep和Cap蛋白可能被分割成两个不同的质粒，以确保Rep基因的早期表达。2016年，Emmerling和同事描述了一个具有分裂和修改的Rep和Cap基因的系统。他们已经证明，与标准质粒相比，这个系统允许滴度增加两倍多。此外，缩短的辅助质粒（10 236 bp而不是15 263 bp）显著增加了载体产量（2.7 × 10^5 VG/cell），这被解释为在短质粒的情况下，转染效率的增加和所需基因的拷贝数每给定量转染DNA的增加。 3.2.2. Rep基因改造 AAV2的Rep基因被广泛用于生产不同AAV血清型的载体，效率各异。使用与所生产血清型相对应的Rep基因代替Rep2可能会增加完整病毒颗粒的数量。使用AAV1、6或8的Rep基因显示出低或缺失的VP表达，以及与Rep2构建相比，剪接Rep蛋白Rep68和Rep40的蛋白表达减少，这可能由于位于Rep基因3'端的Cap基因启动子p40的不同活性，或由于mRNA剪接阶段的某些机制。为了恢复衣壳和Rep蛋白的表达，将AAV2 Rep的3'端（负责锌指结构的部分）引入到AAV1或AAV6中。令人惊讶的是，这种策略在AAV8中不起作用，VPs的表达是通过使用编码DNA结合域的AAV1 Rep的3'端区域恢复的。基于这些结果，Mckenna和同事创建了由AAV1、AAV2、AAV6和AAV8域组成的嵌合Rep基因，具有AAV2 Rep基因的共同3'端。这些嵌合组合增加了几个测试血清型的总衣壳比例2-4倍。因此，使用嵌合Rep基因而不是标准AAV2 Rep生产病毒颗粒可能是减少空病毒比例，从而提高转导效率的有希望的方法。 3.2.3. MAAP的作用作为病毒出细胞因子，MAAP也可能在AAV生产动态中发挥作用。在2021年发表的一项研究中，Elmore和同事进行了一系列实验，证明MAAP8表达的减少导致病毒分泌延迟2天，而总病毒滴度变化最小。MAAP表达对AAV动态的影响影响了从细胞裂解物和培养基（上清液）中收集组装好的AAV载体的时间点。 3.3. 减少AAV生产污染物 3.3.1. P5启动子改造除了Rep基因改造在减少空衣壳比例中的作用外，一些改造还可以帮助去除组装病毒中的非病毒DNA杂质。在2022年，Brimble和同事确定了从Rep-Cap生产质粒的上游AAV P5启动子包装的污染物序列到rAAV载体中。在这项研究中，研究人员证明，与P5启动子相关的DNA污染物可以在体外和体内有效转录和翻译。污染物还可以在小鼠中建立抗原特异性的CD8+ T细胞免疫。因此，这些污染物对AAV载体在基因治疗中的使用效率产生负面影响。包装这些污染物的可能原因是Rep结合位点（RBS）和P5启动子的Rep切割位点的接近，这可能是包装P5附近杂质序列的原因（图4）。尽管在体内P5启动子的活性已在肝细胞中显示，但仍需要研究其他组织中的这种活性。这在新的AAV衣壳工程中尤其重要，因为血清型对器官的转导效率可能如此之高，以至于这些污染物可能造成严重的负面影响。图4. P5启动子结构和修改后的启动子结构。为了解决这个问题，通过在P5的Rep切割位点和RBS之间通过大约5bp或100bp的间隔序列物理分离，获得了一个修改后的启动子。在同一研究中，测试了在大规模AAV生产中分离Rep切割位点和RBS的系统的效率。结果表明，该系统导致了更低的污染物，并且具有相同的病毒滴度，这些载体在小鼠中注射时与使用传统P5质粒生产的载体一样有效。因此，总的来说，这个系统提供了Rep-Cap质粒污染的减少，无论使用的血清型和转基因如何，同时保持病毒滴度。因此，Rep基因改造可以显著提高生产的病毒载体的质量。 3.3.2. ITR改造使用带有一份AD序列的PCR扩增转基因（表1）代替载体质粒也是有效包装rAAV的，这允许更长的转基因（约230个核苷酸），并且还减少了病毒颗粒中的DNA污染物量。这种rAAVs（rAAV-L-AD/DA）的包装效率变得比rAAV-pAD更高，并且污染物的辅助和包装质粒骨架也被发现在不足的水平，这意味着L-AD不与质粒重组形成嵌合产品。rAAV-L-AD在体外提供了约70%的转导效率（10^5 VG/cell），而rAAV-pAD的转导效率可以忽略不计，因为带有非载体基因组和空颗粒的病毒颗粒与完整颗粒竞争受体结合，抑制了其转导效率。 3.3.3. MAAP改造以减少污染物 MAAP对生产质粒包装的影响也被发现。在转染后72小时，观察到野生型AAV2被抗生素抗性基因污染的水平为3.5%。MAAP表达缺失导致污染达到47%，与AAV基因组相比。此外，在没有MAAP的情况下，大部分污染物DNA来自AAV2基因组质粒。MAAP可能负责通过AAV ITR的D序列识别AAV基因组，这并不参与形成Holliday结构。只有在C-末端显示与野生型相似污染水平的稳定截断形式的MAAP。此外，这种变体有助于增加含有AAV基因组的病毒颗粒的水平。因此，MAAP在AAV生物学和病毒颗粒生产中起着重要作用，因此是研究和优化组装过程的有希望的对象。 4. 结论 AAV对器官和组织具有不同的天然趋向性，这使得它们适用于与不同疾病相关的研究。AAV载体是感染包括啮齿动物、家兔、狗、小型猪和非人灵长类动物在内的许多动物模型的极好工具。这些模型使研究人员能够为他们的研究找到最佳动物模型，并帮助测试不同的基因治疗方法、载体效率和安全性、基因治疗试验的寿命、所传递载体和转基因的免疫原性，以及基因治疗程序后可能的副作用。必须指出的是，对于一些AAV血清型，其趋向性在物种之间不同，这使得将治疗从临床前转移到临床试验变得具有挑战性。对使用AAV作为疾病治疗平台的兴趣日益增加，这使得改进载体以实现更高的转导效率、更特定的趋向性、更少的免疫反应和更稳定的转基因表达变得至关重要。正如本综述前文提到的，对AAV基因组进行特定改造可以帮助提高产量，获得更高的滴度和更少的污染物。这些改造还可以提高基因治疗的安全性，因为增加满/空衣壳的比例将减少载体剂量的免疫原性，并使其更集中，从而更具功能性。所有提到的改造在建立了合格的可扩展AAV生产后，可以有效地用于体内研究。在过去十年中，关于AAV基因组的发现数量显著增加。然而，AAV的机制和基本生物学以及基因组改造后对载体生产力和完整性的影响仍需要完全理解。AAV基因组的改造是在AAV生产级联中应用的广泛变化的一部分，从上游到下游阶段。进一步了解最近发现的MAAP和X蛋白、REP和AAP的嵌合结构，以及AAV在颗粒组装期间的生物学过程，将有助于更有效、更快速地优化AAV载体生产，达到寻找不同疾病最有效基因治疗载体的最终目标。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。