全方位了解RSV疫苗关键工艺流程

2023-08-31

疫苗临床研究

呼吸道合胞病毒（respiratory syncyial virus，RSV）是一种反式单链RNA病毒，共编码11种蛋白，其中病毒表面的G粘附蛋白（Attachment Protein）和F融合蛋白（Fusion Protein）在RSV感染过程中发挥重要作用，G糖蛋白主要负责将病毒吸附到宿主细胞表面启动感染过程，F糖蛋白则介导病毒入侵和将周围的细胞进行融合形成合胞体，分为融合前（pre-F）和融合后（post F）构象，二者是产生中和抗体最重要的抗原位点，也是诱导机体产生免疫原性和抗病毒的最主要靶点。感染呼吸道合胞病毒会导致黏液分泌增加及发炎，导致气道变窄，是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。图1. 呼吸道合胞病毒RSV结构图RSV疫苗研发源自20世纪60年代，福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）的失败严重打击了RSV疫苗的研发热情，增加了RSV疫苗研发的商业风险，使RSV疫苗研发举步维艰。2023年5月3日，葛兰素史克宣布其重组RSV疫苗（RSVPreF3）获得FDA批准，商品名为Arexvy，用于预防60岁及以上老年人RSV感染，为全球首款RSV疫苗。同年5月31日，辉瑞宣布FDA已批准其无佐剂二价RSV疫苗（RSVpreF，PF-06928316）Abrysvo上市，用于预防60岁及以上人群出现由RSV引起的下呼吸道疾病；同年8月21日，该款疫苗被FDA批准作为第一款用于保护新生儿的RSV疫苗，通过给怀孕32-36周的孕妇进行主动免疫，保护从出生至6月龄婴儿免于RSV感染。有数据显示，目前全球在研的RSV疫苗超60款。其中，国外布局RSV疫苗的企业除了上述提到的GSK、辉瑞外，还有Moderna、Novavax、赛诺菲、第一三共等。至于国内，入局RSV疫苗的企业包括艾棣维欣、嘉晨西海、沃森生物/蓝鹊生物、石药集团、艾美疫苗/丽凡达生物等。表1：中国布局RSV疫苗的企业从技术路线来看，目前RSV疫苗的研发主要集中在四大类疫苗，包括减毒活疫苗、病毒载体疫苗、重组亚单位（颗粒）疫苗和核酸疫苗，不同类型的RSV疫苗对应的工艺流程有较大差别，本文分别总结了四种类型的RSV疫苗的工艺方案。01减毒活疫苗减毒RSV疫苗的生产工艺可以采用Vero细胞贴壁培养的方式进行病毒的扩增，Vero细胞的培养采用含10%血清的DEME培养基，感染结束后继续培养6天。收获的含病毒料液经过核酸酶处理，采用PreFlow UB预过滤器进行过滤澄清，然后经复合模式填料Capto Core 700纯化，以去除宿主蛋白及宿主核酸，此层析步骤的上样量可达10 CV （柱体积），相对于传统分子筛的常规上样量（0.01~0.05 CV）具有显著优势。Capto Core 700的流穿液采用500 KDa的中空纤维膜柱进行浓缩和换液，最后采用EKV无菌滤器进行除菌过滤。此工艺整体的回收率为50~60%，层析步骤的收率达到100%，宿主蛋白和宿主核酸的去除率达到99%以上，最终原液中每10 ng Vero宿主核酸病毒含量可达1.1 × 108PFU ，图2为减毒RSV疫苗生产工艺。图2. 减毒RSV疫苗工艺方案02重组蛋白RSV疫苗重组蛋白RSV疫苗的表达体系可以选择CHO细胞或昆虫细胞，以CHO细胞为例，细胞培养过程采用fed batch模式，细胞培养密度达10-14×106 cells/ml，表达滴度达1~3 g/L，此工艺步骤培养基可以选择ActiProTM基础培养基及Cell Boost™ 7a/7b补料培养基。培养结束后，采用两级的深层过滤以去除细胞碎片等杂质，深层滤器可以采用Stax™ Disposable Depth Filter PDP8/PDE2类型的深层滤器，然后经过0.2 µm过滤器过滤以降低微生物负荷。澄清后的料液经过吐温80孵育进行病毒灭活，病毒灭活后的料液由亲和填料Capto DeVirs进行捕获，RSV Pre F蛋白可以与Capto DeVirs结合，大量的宿主蛋白流穿，经过高盐洗脱，蛋白得到提纯并起到浓缩的作用。第二步层析为离子交换层析，采用Capto Q ImpRes高分辨阴离子交换填料，结合洗脱模式用于去除宿主蛋白、宿主核酸，同时也是病毒清除的步骤。第三步为复合模式层析，使用的Capto Adhere填料兼具阴离子交换、氢键和疏水作用，采用结合洗脱模式，该步骤主要用于去除高、低分子量的产品相关杂质和宿主蛋白，另外，具有有效的病毒清除效果，对于MuLV可以降低4.81个Log，对于MVM可以降低3.15个Log。Capto Adhere洗脱液经过纳滤膜过滤以进行病毒去除，可以选用20 nm的 Pegasus™ SV4 系列滤器。然后再经过50 kDa的超滤膜包进行浓缩及缓冲液的置换，最后采用0.2 µm Supor EKV除菌滤器进行除菌过滤。图3为CHO细胞重组RSV疫苗生产工艺。图3. 重组RSV疫苗工艺方案03mRNA RSV疫苗mRNA类疫苗工艺包括了质粒模板的制备、mRNA的合成与纯化、LNP的制备及无菌灌装等步骤。质粒的制备工艺可以选择Cytiva的经典三步法工艺或改进两步法工艺（图4）。mRNA的合成工艺可以选择Wave或XDR一次性生物反应器进行酶促反应，优化的参数包括DNA模板、NTPs及RNase抑制剂浓度、离子浓度、酶活性、孵育pH、时间及温度等。mRNA纯化工艺一般采用Oligo dT亲和层析进行捕获，去除酶类、NTPs及模板DNA等工艺相关杂质，采用高分辨率的疏水或离子填料进行精细纯化，去除片段或dsRNA等产品相关杂质。图4. 质粒工艺流程图捕获层析除了用亲和层析，还可以选用复合模式层析填料Capto Core 700/400，葛兰素史克采用Capto Core 700用于自复制mRNA的纯化，相对于其他的工艺方案有更高的回收率及更低的杂质含量。此后，杜克人类疫苗研究所及伊利诺伊大学分别采用Capto Core 700作为mRNA捕获层析的平台工艺。相比于Oligo dT亲和层析，采用Capto Core 700复合模式层析具有如下优点：1.载量高，填料使用量少，层析柱规格小；2.层析缓冲液种类少，层析缓冲液总量少；3.层析为流穿模式，工艺时间短；4.层析填料成本更低； mRNA形式的RSV疫苗依然可以采用Capto Core 700作为捕获阶段的填料，在可操作性及成本上都具有显著优势。精细纯化可以选择高分辨的疏水填料，如Capto Phenyl ImpRes或Capto Butyl ImpRes，或高分辨离子交换填料，如Capto Q ImpRes或Source 30 Q（图5）。图5. mRNA RSV疫苗工艺流程图04病毒载体RSV疫苗目前，用于RSV疫苗的病毒载体类型主要有腺病毒载体和痘病毒载体。已批准上市的腺病毒载体新冠疫苗已有较为成熟的生产工艺，以腺病毒载体疫苗为例，病毒生产工艺采用HEK293细胞培养和病毒的感染，细胞培养采用无血清悬浮培养基CDM4HEK293，感染结束后可以用表面活性剂对细胞进行裂解、核酸酶进行宿主核酸的降解，裂解液经深层滤器进行澄清。澄清后料液经300 kDa的中空纤维膜柱进行浓缩及换液，而后经过Capto Q ImpRes初步纯化及Capto Core 700精细纯化，层析后料液通过300 kDa中空纤维进行超滤浓缩和换液，0.2 µm Supor EKV除菌滤器进行除菌过滤得到最终的疫苗原液。工艺流程如下图6所示。图6. 腺病毒RSV疫苗工艺流程图总结：以上概述了四种类型的RSV疫苗的工艺方案，Cytiva可提供各个工艺步骤所需的耗材及设备，耗材包括培养基、填料、超滤膜包、预过滤器、除菌滤器、除病毒滤器及中空纤维膜柱，设备包括不同规模的Wave波浪式生物反应器、XDR一次性生物反应器、层析设备、超滤设备及完整性测试仪。图7为Cytiva在新型疫苗领域可以提供的产品，涵盖上游、下游及制剂等不同工艺流程，覆盖从实验室开发、中试放大到商业化生产的不同工艺规模。图7. Cytiva在新型疫苗领域提供的产品更多重组新型疫苗工艺解决方案，欢迎扫码获取PPT参考文献：1.Sophia T. Mundle. et al. Core bead chromatography for preparation of highly pure, infectious respiratory syncytial virus in the negative purification mode. Vaccine. 20162.WO2020026147A1. Antigen purification method.3.WO2014140211A1. RNA purification method.4.Durham. Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics_ mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials. Translation Research, 2021.5.Scalable process for adenovirus production. Cytiva, Application Note KA877080618AN.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。点击“阅读原文”，即刻前往Cytiva官网了解更多疫苗产品及解决方案。↓↓↓