基于病毒载体的基因治疗

2023-11-16

基因疗法临床研究

人类基因治疗通过操纵基因表达，改变活细胞的生物学特性以达到治疗目的。这项技术有希望可以突破常规药物不能完全治愈疾病的缺陷，因此，人类基因治疗是本世纪的研究热点之一。最近，几种基因疗法已被世界各地的监管机构批准用于治疗一些疾病，包括癌症、失明和代谢紊乱等。早在1970年，美国医生Stanfield Rogers就试图通过注射含有精氨酸酶的乳头瘤病毒来治疗精氨酸血症。这是第一次人类基因治疗试验，尽管以失败告终。自此，基因治疗就开启了一段旅程。图1 基因治疗的历史表1 2022年以病毒载体为基础的主要基因治疗产品与需要反复注射的蛋白质、小分子等传统治疗方法相比，对长寿细胞进行基因治疗可以持续产生内源性蛋白质，即在原则上将正确的遗传物质引入患者体内后，基因治疗提供了“一蹴而就”的疗效。此外，本方法将向所有患者提供首次潜在的治疗选择，不存在“不可能的靶向治疗药物”情况。目前，基本的基因治疗方法分为四种：基因补充、基因沉默、基因置换和基因编辑。最初的基因治疗侧重于转基因的传递，即修复或替换有缺陷的基因。后来，随着功能基因组学的快速发展和与基因编辑相关的核酸酶的迭代多样化，基因治疗方法发生了前所未有的革命。CRISPR/Cas9技术的出现使基因编辑变得更加简单有效，从而导致了基因编辑领域的突破。CRISPR/Cas9基因编辑提供的易用性和高效性使T细胞中高效的基因敲除、特定部位敲入和全基因组筛选成为可能。此外，CRISPR还适用于其他几个领域，如天然抗病毒药物、抗感染系统、抗微生物药物、DNA/RNA表观遗传状态的修饰等。长期的基因治疗包括通过一种“传递载体”给药特定的遗传物质（即DNA或RNA），这有助于外来遗传物质进入靶细胞。传递载体有两种类型：病毒载体和非病毒载体。常用的病毒载体有腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ads）或慢病毒（LVs）。腺相关病毒（AAV）载体AAV介导的基因转移作为一种治疗方法具有很大的潜力，目前AAV载体大多针对单基因疾病，属于罕见病的范畴。FDA已经批准了基于两种AAV载体的基因治疗产品：LUXTURNA用于治疗确诊的双等位基因RPE65突变相关性视网膜营养不良 RPE65突变相关性视网膜营养不良患者，ZOLGENSMA用于治疗两岁以下患有脊髓性肌萎缩症（SMA）且存活运动神经元1（SMN1）基因存在双等位基因突变的儿童患者。使用重组AAV血清型来提供细胞毒性治疗也被认为是一种局部抗肿瘤治疗方法。基于AAV载体局部注射的颅内干扰素-β（IFN-β）基因治疗已被报道成功地治疗非侵袭性原位胶质母细胞瘤模型。AAV载体具有几个关键特性，可用于癌症治疗中的基因传递。AAV最初被发现是腺病毒制剂中的一种污染物，具有一个小的（~25 nm）二十面体衣壳，由三种结构蛋白组成，即VP1、VP2和VP3。AAV基因组由一个约4.8kb的单链DNA组成。此外，AAV是复制缺陷的细小病毒，传统上需要与辅助腺病毒或疱疹病毒混合感染才能实现有效感染。且AAV至少有12种自然血清型，每一种都表现出不同的组织趋向，这主要是因为这些血清型与一系列初级细胞表面糖蛋白受体和次级受体/辅助受体的亲和力不同。目前，AAV无辅助病毒系统主要用于临床研究。表2 不同AAV血清型的组织趋向性及代表性临床试验AAV是一种无包膜的病毒，可以通过改造将DNA运送到靶细胞，在此过程中，病毒基因组没有整合到宿主细胞中，而是在宿主细胞核中形成了异构体串联。这些头到尾的环状串联蛋白在未分裂的细胞中保持完整，如神经元和心肌细胞，因此，能够在几个月内表达转基因。AAV载体在细胞分裂中也提供了相对稳定的表达。如果使用极高的多样性感染，或者细胞在腺病毒复制酶存在的情况下感染，整合事件的频率可能会增加。AAV载体通常是体内基因治疗的首选载体，有以下优点：能够转导分裂和静止细胞；强大的体内转导效率；在静止细胞中的长期转基因表达；对特定组织和细胞类型的趋向性；相对较低的免疫原性；非致病性；临床安全性。图2 使用AAV载体治疗遗传病的体内策略示意图然而，有些障碍限制了AVV载体的广泛应用，例如：1)载体嵌入大小：克隆到AAV载体的推荐嵌入大小是有限的。为了应对这一问题，通过同源重组将AAV基因组组合成相同的反向末端重复序列（ITR）。大量的基因表达被分成两个或更多个载体，然后运输到相同的细胞。另一种方法涉及基因片段切割，针对更大的基因片段，截取功能区。2)靶向组织特异性：在非靶标组织中，细胞基因表达可能导致毒性或诱导不必要的免疫反应。在基因治疗中提高靶向组织特异性将有助于提高治疗效果。基于AAV载体的组织靶向的组织特异性由AVV的衣壳蛋白决定，不同的AAV血清型也表现出不同的组织趋向性，选择适当的组织特异性启动子也很重要。3)低效转导：AAV载体可以在转基因水平上进行改造，例如，优化密码子、启动子和顺式元件，这影响着临床使用的所有AAV载体。4)免疫反应：根据已发表的研究，超过90%的人类感染了AAV，而大约50%的人类可能有中和抗体（NAB）。这些抗体可以刺激炎症分子的产生，激活细胞死亡途径，并诱导能够针对含有AAV的细胞进行破坏T细胞的功能。虽然单独使用AAV载体不能引起与使用腺病毒等其他病毒类似的强烈免疫反应，但免疫系统仍然是体内基因转移的障碍。5)不切实际的生产策略和低病毒量：工业界和研究机构应探索如何减少瞬时转染所需的质粒数量，提高转染效率。此外，如何提高细胞培养密度，扩大生产能力，去除空病毒也有待探索。6)成本高：基因治疗研究和开发的高成本导致了极高的终端商业定价。这种高成本，加上缺乏保险支付系统，对无法自己负担如此高费用的患者来说是一个问题。显然，传统的支付机制已不足以满足基因治疗的需要，因此有必要采用新的、高效的支付机制。7)疾病病例狭窄：分析数据表明，针对眼睛、肝脏、肌肉和中枢神经系统以外区域的药物试验比例很低。主要器官，如心脏、肾脏和肺，仍然几乎无法使用基于AAV的基因疗法。尽管存在某些缺点，但AAV载体仍然具有巨大的潜力，可以彻底改变人类疾病的临床管理。腺病毒（Ads）载体Ad是一种大型复杂的非包膜双链DNA病毒，大小为70-90nm，具有可容纳26-45kb的线性双链DNA基因组的二十面体蛋白衣壳。Ad存在100多种血清不同类型，其中49种感染人类，根据其特定类型，这些病毒可以与各种细胞表面蛋白结合，以促进它们进入靶细胞。作为基因治疗工具，已经超过450个基于Ads载体的方案被批准用于临床试验。Ads是广泛的细胞和组织类型中最有效的基因传递系统，这是因为大多数人类细胞表达初级腺病毒受体和次级整合素受体，如柯萨奇和Ad受体（CAR）、CD46和粘粒素-2 （DSG-2），以及聚糖GD1a和聚唾液酸。Ad是第一个进入严格治疗开发阶段的DNA病毒，主要是因为它具有明确的生物学特性、遗传稳定性、大的转基因能力以及易于大规模生产。此外，与化疗相比，Ad的副作用要轻得多。Ads载体最早于20世纪90年代初用于脑细胞转导，以非人类犬腺病毒2型（CAV-2）为基础的载体能够将基因导向脑、脊髓和周围神经系统的神经元。Ads载体可分为两类：复制缺陷病毒和复制能力强的溶瘤病毒（OVs）。到目前为止，已经开发了三代Ad载体。第一代Ads载体是通过将E1A/E1B区域替换为长度可达4.5 kb的转基因磁带来设计的。这些Ads病毒载体可在转导后24小时内诱导高水平的先天炎症反应；在第二代Ads载体中，通过额外删除E2/E4位点进一步增强了转基因能力，但由于产生细胞系的复制能力下降，总体产量仍然很低；第三代Ads载体，除ITRs和病毒包装信号外，其所有病毒序列都被删除。与第一代和第二代Ads载体相比，这些病毒载体的相关体内免疫反应大大降低，尽管它们保持了高转导效率和趋向性。Ad载体是肿瘤基因治疗中最常用的载体，也用于疫苗表达外源抗原。大多数癌症病例在晚期发现时，无法用传统的治疗方式治愈。因此，为了提高肿瘤的穿透性和局部扩增的抗肿瘤作用，开发了溶瘤剂，如有条件复制的Ad（CRAds）。肿瘤细胞中的病毒感染导致复制、溶瘤和随后释放病毒子代。重要的是，这种复制周期允许输入剂量的显著局部放大。另一方面，与其他类型的溶瘤病毒治疗类似，除使肿瘤缩小外，溶瘤腺病毒还可能引起强大的抗病毒和抗肿瘤免疫反应。这些病毒可将冷的免疫抑制肿瘤转化为炎性肿瘤。针对T细胞抑制检查点蛋白的抗体，即细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 （CTLA-4）、程序性细胞死亡1 （PD1）蛋白和PD1配体（PDL1），已被批准用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌（RCC）、肝细胞癌和几种类型的肿瘤。此外，Ads载体可用于治疗性癌症疫苗。这些Ads载体疫苗能够在哺乳动物宿主中诱导先天性和适应性免疫反应。尽管取得了这些成功，但针对Ads载体的先天和预先存在的免疫仍然是这些载体开发和应用中的一个严重挑战。尽管腺病毒具有组织特异性和灵活性，但正如在动物模型中报道的那样，静脉注射这些病毒可能诱导急性肝损伤。与AAV相比，Ad在体内的表达时间较短。慢病毒（LVs）载体LV属于逆转录病毒属的正逆转录病毒科亚科，可分为两大类—灵长类和非灵长类。所有LV的形态和基因组组织在几个方面是相似的：直径约为100 nm的多形性的球形颗粒，含有由两条单链正义RNA分子组成的二倍体基因组。LVs载体通常包括以下所需元件：通过Ψ包装信号的50个长末端重复序列（LTR）、中央多嘌呤束/链终止序列（cPPT/CTS）、Rev响应元件（RRE）和30个LTR，包括poly （A）信号。目前，已经开发了四代LVs载体。第一代LVs载体含有很大一部分HIV基因组，并表现出将遗传物质转移到宿主细胞中的高频率。慢病毒辅助基因vif、vpr、vpu和nef以及LV调控基因tat和rev被纳入第一代LVs载体中。为了获得进一步的安全性，研究出第二代LVs载体，因为它们不需要将遗传物质转移到宿主细胞中。第三代LVs载体被认为是不能复制和自我灭活的载体。在这一代中，对野生型人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的复制至关重要的病毒tat基因已被删除。此外，载体包装功能已被分离为三个独立的质粒，而不是两个质粒，以减少质粒扩增和病毒载体制造过程中重组的风险。这些原因使得第三代LVs载体比第二代LVs载体更安全，因此，第三代LVs载体得以广泛应用。然而，结构体之间的同源重组仍然可能发生，因此，第四代LVs载体的出现。然而，第四代LV载体的滴度受到影响，这限制了其广泛应用。与传统的基因传递系统相比，LVs具有几个潜在的独特优势。与腺病毒或腺相关载体不同，针对慢病毒载体的中和抗体很少产生。LVs载体最重要的优势是能够提供长期稳定的基因表达，这对青少年或儿科患者至关重要；能够感染分裂/非分裂细胞，如神经元和骨细胞，并且由于其相对低免疫原性的特性，LVs载体可以包含9~10 kB大小的构建体。LV载体主要用于体外基因治疗，如B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的基因治疗。B-ALL是一种起源于单细胞的克隆性恶性疾病，是儿童非创伤性死亡的主要原因。CAR-T疗法在治疗B-ALL方面取得了非凡的临床效果。为了在体外培养CAR-T细胞，LVs似乎特别有吸引力，因为其能够稳定地整合较大的DNA嵌入。图3 利用LV载体治疗遗传疾病的体外策略示意图与基于LVs载体的基因治疗相关的主要问题包括在载体生产过程中可能产生具有复制能力的LV，患者基因组中内源性逆转录病毒对载体的动员，可能导致癌症的插入突变，导致跨代效应的种系改变，以及基因治疗患者的新病毒传播。近年来，随着对LVs载体的广泛细致的研究，该平台已广泛应用于研究和临床试验。尽管某些问题仍有待解决，但安全有效的LVs载体仍被认为是人类基因治疗的一种有希望的工具。其他病毒载体其他未指明的病毒载体包括牛痘、麻疹、单纯疱疹、甲病毒、水疱性口炎、流感、杆状病毒等。牛痘病毒能够在肿瘤细胞中选择性地复制和繁殖，导致溶瘤。此外，其快速的病毒颗粒生成、广泛的宿主范围、大的基因组以及安全的处理使牛痘病毒成为基因治疗的合适载体。麻疹病毒是一种非整合RNA病毒，作为基因治疗的载体，在人类中具有长期的安全记录。单纯疱疹病毒（HSV）作为向神经系统传递特定基因的载体也具有许多优势，包括其体积大，宿主范围广，以及在神经元细胞中建立长期无症状感染的能力。甲病毒载体为基因治疗应用提供了一种有吸引力的方法，提供了快速、简单的重组病毒颗粒生产和广泛的哺乳动物宿主细胞转导。水疱性口炎病毒（VSV）由于其强大的肿瘤细胞杀伤和免疫刺激特性，代表了一个有吸引力的溶瘤病毒治疗平台。然而，这种载体也存在一定的挑战，如系统递送效率低下，可能导致严重的副作用，包括神经毒性。流感病毒是一种带有负意义的呼吸道病原体，是分段RNA基因组。在实验室中构建重组流感病毒是在20世纪80年代首次报道的。不同的基因修饰导致流感病毒的致病性减弱，这增加了流感病毒载体用于癌症基因治疗的安全性。杆状病毒已被广泛应用于昆虫细胞重组蛋白的生产。它也已发展成为安全有效的基因传递载体，具有广泛的进入性和在哺乳动物细胞中的复制缺陷等优点。不同的病毒载体有不同的优势。这些病毒载体的不同特性允许它们在基因治疗领域的各个方面的应用。在过去的几年里，生物制药行业在技术方面取得了非凡的进步，这导致了该行业真正的转变。使用基于病毒载体的基因疗法的新型治疗方法的出现和进展是该领域的重要里程碑。目前，产品正在开发用于广泛的适应症，包括自身免疫、癌症、眼科、神经系统、消化/代谢和感觉疾病。人工修饰失去致病性的病毒载体被广泛用作基因治疗领域的传递系统，其主要优点是其天然的高转导效率和稳定的表达。然而，某些挑战仍然存在，这些挑战因病毒载体而异。基因疗法、体细胞疗法、组织工程药物和先进治疗药物（ATMP）共同代表了四个主要的ATMP产品组。大多数基因疗法的设计目的是在人体内达到永久或持久的效果，这固有地增加了延迟不良事件的风险，例如使用腺病毒载体。有必要继续研究基因治疗的不良反应，特别是长期不良反应。病毒学的进步和对病毒生物学理解的提高将有助于开发适合转译应用的病毒载体变体，同时也会导致更好的疾病治疗结果。文献来源：Viral Vector-Based Gene Therapy识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。