HIV-1 Vpu

嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769背景介绍基因疗法是将改变特定细胞功能的遗传物质引入患者体内来治疗遗传性疾病的一种手段。基因治疗的关键步骤是通过基因传递载体将基因有效地传递到靶组织/细胞。目前基因传代载体分为两类：病毒载体和非病毒载体，目前基于病毒载体的基因治疗主要通过逆转录病毒、腺病毒（Ad）或腺相关病毒（AAV）的载体将治疗性基因递送到患者体内来实现（图1）。早期由于缺乏对病毒生物学的充分了解导致基于病毒的基因疗法并未取得很好的疗效。图1. 病毒基因治疗方式图示。2021年2月，Jote T. Bulcha1等人在Signal Transduction and Targeted Therapy期刊上发表了一篇名为“ Viral vector platforms within the gene therapy landscape ”的综述，在该综述中，作者详细描述了三种病毒载体平台，大多数基因治疗载体都基于Ads、AAVs和慢病毒（逆转录病毒），本篇将介绍以上三种病毒的结构和感染途径，帮助大家更好地了解病毒载体在基因治疗中的作用。文章内容通常，病毒载体由以下三个部分构成：（1）包裹遗传有效载荷的蛋白质衣壳和/或包膜，并定义载体的组织或细胞亲和性和抗原识别；（2）目的基因，当在细胞中表达时，可以产生预期的效果；和（3）“调控盒”，即控制转基因作为游离体或染色体整合子的稳定或瞬时细胞表达的增强子/启动子/辅助元件的组合。每个病毒载体平台这三个组件的设计都是不同的，有各自的优势和劣势。1腺病毒载体（Adenovirus vectors）|大容量的瞬时目标基因传递结构和基因组：Ads是一种无包膜病毒，主要引起上呼吸道感染，也可以感染其他器官，如大脑和膀胱。它具有二十面体蛋白衣壳，可容纳26至45kb的线性双链DNA基因组。Ads基因组两侧是长度不同（末端为30–371 bp）的发夹状反向末端重复序列（ITRs）。 ITRs作为自启动结构，可促进引物酶非依赖性 DNA复制。病毒基因组包装需要位于基因组左臂的包装信号。Ads基因组编码约35种蛋白质，这些蛋白质在病毒基因转录的早期和晚期表达。Ads基因组包括五个所谓的“早期”基因组成，即E1A、E1B、E2、E3和E4（图2）。图2. 野生型腺病毒5型（Ad5）基因组和常见的基于Ad5的载体的遗传修饰的示意图。感染途径：迄今为止，已经鉴定出一百多种人类Ad基因型，分为A到G七个亚组，对Ad感染途径的认识主要基于人Ad5 （HAd5）。感染开始于细胞表面定位的柯萨奇病毒- Ad受体（CAR）和病毒衣壳纤维远端结构域之间的相互作用。此外，还发现了许多其他的Ad受体，如CD46、DSG2和唾液酸。病毒与细胞表面受体结合后发生内吞作用，内吞作用是由五邻体上的三肽Arg - Gly - Asp （RGD）基序与宿主细胞表面的αV整合素之间的相互作用所介导的。内吞作用后，衣壳被分解，V和VI蛋白促进内体逃逸。病毒DNA随后通过核膜孔进入细胞核，此外，部分被破坏的病毒粒子的六邻体与动力蛋白马达结合，帮助病毒通过微管网络运输到核孔进入细胞核，病毒DNA主要保持表染色体状态，不整合进宿主细胞基因组中。2腺相关病毒载体（Adeno-associated Virus vectors）|一个有着巨大潜力的病毒载体结构和基因组：AAV于1965 年由鲍勃-艾奇逊（Bob Atchison）作为腺病毒制剂的污染物发现。由于它依赖腺病毒或任何可以发挥辅助功能以完成其生命周期的病毒，因此被归类为依赖性细小病毒。AAV缺乏复制和表达其自身基因组所需的基本基因，这些基本功能可由Ad的 E1、E2a、E4和VA基因提供。AAV基因组本身是单链DNA，包含四个已知的开放阅读框（ORF）。第一个ORF编码四个复制基因（Rep），该复制基因以其分子量命名：Rep40、Rep52、Rep68和Rep78。第二个ORF分别编码三种病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。第三个和第四个是嵌套亚基因组mRNA，命名为组装激活蛋白（AAP），其参与衣壳单体到发生衣壳组装的核仁穿梭过程；以及最近发现的功能尚不完全清楚的膜相关辅助蛋白（MAAP）。基因组全长为4.7kb，基因组两侧是含有145个碱基的 ITR（图3）。ITRs作为复制的自启动结构，并为Rep介导的包装提供信号。AAV衣壳是一个T=1、二十面体、60聚体的衣壳，VP1、VP2和VP3亚基分别以1∶1∶10的比例组成。组装衣壳的最佳特征是形成Rep结合的面五重对称轴，并包含五重孔，其中DNA在Rep介导的ATP酶活性下插入衣壳；以及由包括可变环区V、VII、VIII和IV的三重突起限定的三重对称轴。图3. AAV基因组示意图及PCR筛选位点。感染途径：我们对AAV感染途径的了解仅基于少数血清型。目前普遍的理解是血清型与不同细胞的表面糖蛋白受体和次级受体结合可能具有不同的亲和力。在与细胞表面结合后，网格蛋白介导的内吞作用被触发，AAV颗粒随后在内体囊泡中传递，并通过晚期内体和溶酶体区室传递。由于这些囊泡的低pH环境，衣壳发生构象变化暴露VP1/2结构，VP1独特区域（包含磷脂酶结构域）逃离核内体或溶酶体区室，然后通过VP2上发现的核定位信号穿梭进入细胞核。一旦进入细胞核，AAV基因组就会合成第二链，形成基因转录所需的双链基因组结构。3慢病毒载体（Lentivirus  vectors）|用于基因修饰细胞治疗的强大载体结构和基因组：慢病毒属于逆转录病毒，逆转录病毒是球形、有包膜的单链RNA病毒，直径约100 nm。慢病毒颗粒包裹两个与核衣壳蛋白结合的正义链RNA。该颗粒还含有逆转录酶、整合酶和蛋白酶蛋白。慢病毒HIV-1的全长为9.7 kb，其两侧是5 '和3 ' LTR，主导病毒基因组复制。LTR由特有的U5和U3序列，以及两端共有的R序列组成。顺式作用序列，也被称为psi，位于LTR外。逆转录病毒具有共同的基本核心蛋白基因，如gag、pol和env.gag基因编码保护性衣壳和基质蛋白，env基因携带决定病毒细胞趋向性的跨膜和包膜糖蛋白的信息，pol基因转录逆转录酶和整合酶。慢病毒有额外的基因tat和rev，tat通过与LTR结合来辅助转录的激活和RNA聚合酶II的延伸。rev通过与环境基因区域的基序结合来协调剪接和未剪接的病毒RNA的核输出。另外的辅助基因如：vif、vpr、vpu和nef，可以提高病毒滴度和促进病毒的发病机制（图4）。图4. 第三代hiv -1慢病毒载体设计。感染途径：慢病毒颗粒进入宿主细胞是由固定在外膜上的糖蛋白与特定细胞受体之间相互作用介导的。与细胞表面受体的成功结合会引发一系列事件，导致病毒颗粒脂质双分子层与细胞融合，随后将病毒遗传货物递送到细胞质中。慢病毒DNA以非随机整合的方式整合到宿主基因组中，并优先选择转录活性位点。讨论在这篇综述中，作者讨论了病毒载体的现状，特别是基于Ad、AAV和慢病毒的病毒载体，指出基于病毒载体的未来是光明的，解决许多人类遗传疾病的能力是可以实现的，但目前掌握的方法仍然存在一些缺点，需要进一步探索病毒生物学以及跨学科的方法来克服当前的挑战。参考文献Bulcha J T, Wang Y, Ma H, et al. Viral vector platforms within the gene therapy landscape[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2021, 6（1）: 53.嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!

人类基因治疗通过操纵基因表达，改变活细胞的生物学特性以达到治疗目的。这项技术有希望可以突破常规药物不能完全治愈疾病的缺陷，因此，人类基因治疗是本世纪的研究热点之一。最近，几种基因疗法已被世界各地的监管机构批准用于治疗一些疾病，包括癌症、失明和代谢紊乱等。早在1970年，美国医生Stanfield Rogers就试图通过注射含有精氨酸酶的乳头瘤病毒来治疗精氨酸血症。这是第一次人类基因治疗试验，尽管以失败告终。自此，基因治疗就开启了一段旅程。图1 基因治疗的历史表1 2022年以病毒载体为基础的主要基因治疗产品与需要反复注射的蛋白质、小分子等传统治疗方法相比，对长寿细胞进行基因治疗可以持续产生内源性蛋白质，即在原则上将正确的遗传物质引入患者体内后，基因治疗提供了“一蹴而就”的疗效。此外，本方法将向所有患者提供首次潜在的治疗选择，不存在“不可能的靶向治疗药物”情况。目前，基本的基因治疗方法分为四种：基因补充、基因沉默、基因置换和基因编辑。最初的基因治疗侧重于转基因的传递，即修复或替换有缺陷的基因。后来，随着功能基因组学的快速发展和与基因编辑相关的核酸酶的迭代多样化，基因治疗方法发生了前所未有的革命。CRISPR/Cas9技术的出现使基因编辑变得更加简单有效，从而导致了基因编辑领域的突破。CRISPR/Cas9基因编辑提供的易用性和高效性使T细胞中高效的基因敲除、特定部位敲入和全基因组筛选成为可能。此外，CRISPR还适用于其他几个领域，如天然抗病毒药物、抗感染系统、抗微生物药物、DNA/RNA表观遗传状态的修饰等。长期的基因治疗包括通过一种“传递载体”给药特定的遗传物质（即DNA或RNA），这有助于外来遗传物质进入靶细胞。传递载体有两种类型：病毒载体和非病毒载体。常用的病毒载体有腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ads）或慢病毒（LVs）。腺相关病毒（AAV）载体AAV介导的基因转移作为一种治疗方法具有很大的潜力，目前AAV载体大多针对单基因疾病，属于罕见病的范畴。FDA已经批准了基于两种AAV载体的基因治疗产品：LUXTURNA用于治疗确诊的双等位基因RPE65突变相关性视网膜营养不良患者，ZOLGENSMA用于治疗两岁以下患有脊髓性肌萎缩症（SMA）且存活运动神经元1（SMN1）基因存在双等位基因突变的儿童患者。使用重组AAV血清型来提供细胞毒性治疗也被认为是一种局部抗肿瘤治疗方法。基于AAV载体局部注射的颅内干扰素-β（IFN-β）基因治疗已被报道成功地治疗非侵袭性原位胶质母细胞瘤模型。AAV载体具有几个关键特性，可用于癌症治疗中的基因传递。AAV最初被发现是腺病毒制剂中的一种污染物，具有一个小的（~25 nm）二十面体衣壳，由三种结构蛋白组成，即VP1、VP2和VP3。AAV基因组由一个约4.8kb的单链DNA组成。此外，AAV是复制缺陷的细小病毒，传统上需要与辅助腺病毒或疱疹病毒混合感染才能实现有效感染。且AAV至少有12种自然血清型，每一种都表现出不同的组织趋向，这主要是因为这些血清型与一系列初级细胞表面糖蛋白受体和次级受体/辅助受体的亲和力不同。目前，AAV无辅助病毒系统主要用于临床研究。表2 不同AAV血清型的组织趋向性及代表性临床试验AAV是一种无包膜的病毒，可以通过改造将DNA运送到靶细胞，在此过程中，病毒基因组没有整合到宿主细胞中，而是在宿主细胞核中形成了异构体串联。这些头到尾的环状串联蛋白在未分裂的细胞中保持完整，如神经元和心肌细胞，因此，能够在几个月内表达转基因。AAV载体在细胞分裂中也提供了相对稳定的表达。如果使用极高的多样性感染，或者细胞在腺病毒复制酶存在的情况下感染，整合事件的频率可能会增加。AAV载体通常是体内基因治疗的首选载体，有以下优点：能够转导分裂和静止细胞；强大的体内转导效率；在静止细胞中的长期转基因表达；对特定组织和细胞类型的趋向性；相对较低的免疫原性；非致病性；临床安全性。图2 使用AAV载体治疗遗传病的体内策略示意图然而，有些障碍限制了AVV载体的广泛应用，例如：1)载体嵌入大小：克隆到AAV载体的推荐嵌入大小是有限的。为了应对这一问题，通过同源重组将AAV基因组组合成相同的反向末端重复序列（ITR）。大量的基因表达被分成两个或更多个载体，然后运输到相同的细胞。另一种方法涉及基因片段切割，针对更大的基因片段，截取功能区。2)靶向组织特异性：在非靶标组织中，细胞基因表达可能导致毒性或诱导不必要的免疫反应。在基因治疗中提高靶向组织特异性将有助于提高治疗效果。基于AAV载体的组织靶向的组织特异性由AVV的衣壳蛋白决定，不同的AAV血清型也表现出不同的组织趋向性，选择适当的组织特异性启动子也很重要。3)低效转导：AAV载体可以在转基因水平上进行改造，例如，优化密码子、启动子和顺式元件，这影响着临床使用的所有AAV载体。4)免疫反应：根据已发表的研究，超过90%的人类感染了AAV，而大约50%的人类可能有中和抗体（NAB）。这些抗体可以刺激炎症分子的产生，激活细胞死亡途径，并诱导能够针对含有AAV的细胞进行破坏T细胞的功能。虽然单独使用AAV载体不能引起与使用腺病毒等其他病毒类似的强烈免疫反应，但免疫系统仍然是体内基因转移的障碍。5)不切实际的生产策略和低病毒量：工业界和研究机构应探索如何减少瞬时转染所需的质粒数量，提高转染效率。此外，如何提高细胞培养密度，扩大生产能力，去除空病毒也有待探索。6)成本高：基因治疗研究和开发的高成本导致了极高的终端商业定价。这种高成本，加上缺乏保险支付系统，对无法自己负担如此高费用的患者来说是一个问题。显然，传统的支付机制已不足以满足基因治疗的需要，因此有必要采用新的、高效的支付机制。7)疾病病例狭窄：分析数据表明，针对眼睛、肝脏、肌肉和中枢神经系统以外区域的药物试验比例很低。主要器官，如心脏、肾脏和肺，仍然几乎无法使用基于AAV的基因疗法。尽管存在某些缺点，但AAV载体仍然具有巨大的潜力，可以彻底改变人类疾病的临床管理。腺病毒（Ads）载体Ad是一种大型复杂的非包膜双链DNA病毒，大小为70-90nm，具有可容纳26-45kb的线性双链DNA基因组的二十面体蛋白衣壳。Ad存在100多种血清不同类型，其中49种感染人类，根据其特定类型，这些病毒可以与各种细胞表面蛋白结合，以促进它们进入靶细胞。作为基因治疗工具，已经超过450个基于Ads载体的方案被批准用于临床试验。Ads是广泛的细胞和组织类型中最有效的基因传递系统，这是因为大多数人类细胞表达初级腺病毒受体和次级整合素受体，如柯萨奇和Ad受体（CAR）、CD46和粘粒素-2 （DSG-2），以及聚糖GD1a和聚唾液酸。Ad是第一个进入严格治疗开发阶段的DNA病毒，主要是因为它具有明确的生物学特性、遗传稳定性、大的转基因能力以及易于大规模生产。此外，与化疗相比，Ad的副作用要轻得多。Ads载体最早于20世纪90年代初用于脑细胞转导，以非人类犬腺病毒2型（CAV-2）为基础的载体能够将基因导向脑、脊髓和周围神经系统的神经元。Ads载体可分为两类：复制缺陷病毒和复制能力强的溶瘤病毒（OVs）。到目前为止，已经开发了三代Ad载体。第一代Ads载体是通过将E1A/E1B区域替换为长度可达4.5 kb的转基因磁带来设计的。这些Ads病毒载体可在转导后24小时内诱导高水平的先天炎症反应；在第二代Ads载体中，通过额外删除E2/E4位点进一步增强了转基因能力，但由于产生细胞系的复制能力下降，总体产量仍然很低；第三代Ads载体，除ITRs和病毒包装信号外，其所有病毒序列都被删除。与第一代和第二代Ads载体相比，这些病毒载体的相关体内免疫反应大大降低，尽管它们保持了高转导效率和趋向性。Ad载体是肿瘤基因治疗中最常用的载体，也用于疫苗表达外源抗原。大多数癌症病例在晚期发现时，无法用传统的治疗方式治愈。因此，为了提高肿瘤的穿透性和局部扩增的抗肿瘤作用，开发了溶瘤剂，如有条件复制的Ad（CRAds）。肿瘤细胞中的病毒感染导致复制、溶瘤和随后释放病毒子代。重要的是，这种复制周期允许输入剂量的显著局部放大。另一方面，与其他类型的溶瘤病毒治疗类似，除使肿瘤缩小外，溶瘤腺病毒还可能引起强大的抗病毒和抗肿瘤免疫反应。这些病毒可将冷的免疫抑制肿瘤转化为炎性肿瘤。针对T细胞抑制检查点蛋白的抗体，即细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 （CTLA-4）、程序性细胞死亡1 （PD1）蛋白和PD1配体（PDL1），已被批准用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌（RCC）、肝细胞癌和几种类型的肿瘤。此外，Ads载体可用于治疗性癌症疫苗。这些Ads载体疫苗能够在哺乳动物宿主中诱导先天性和适应性免疫反应。尽管取得了这些成功，但针对Ads载体的先天和预先存在的免疫仍然是这些载体开发和应用中的一个严重挑战。尽管腺病毒具有组织特异性和灵活性，但正如在动物模型中报道的那样，静脉注射这些病毒可能诱导急性肝损伤。与AAV相比，Ad在体内的表达时间较短。慢病毒（LVs）载体LV属于逆转录病毒属的正逆转录病毒科亚科，可分为两大类—灵长类和非灵长类。所有LV的形态和基因组组织在几个方面是相似的：直径约为100 nm的多形性的球形颗粒，含有由两条单链正义RNA分子组成的二倍体基因组。LVs载体通常包括以下所需元件：通过Ψ包装信号的50个长末端重复序列（LTR）、中央多嘌呤束/链终止序列（cPPT/CTS）、Rev响应元件（RRE）和30个LTR，包括poly （A）信号。目前，已经开发了四代LVs载体。第一代LVs载体含有很大一部分HIV基因组，并表现出将遗传物质转移到宿主细胞中的高频率。慢病毒辅助基因vif、vpr、vpu和nef以及LV调控基因tat和rev被纳入第一代LVs载体中。为了获得进一步的安全性，研究出第二代LVs载体，因为它们不需要将遗传物质转移到宿主细胞中。第三代LVs载体被认为是不能复制和自我灭活的载体。在这一代中，对野生型人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的复制至关重要的病毒tat基因已被删除。此外，载体包装功能已被分离为三个独立的质粒，而不是两个质粒，以减少质粒扩增和病毒载体制造过程中重组的风险。这些原因使得第三代LVs载体比第二代LVs载体更安全，因此，第三代LVs载体得以广泛应用。然而，结构体之间的同源重组仍然可能发生，因此，第四代LVs载体的出现。然而，第四代LV载体的滴度受到影响，这限制了其广泛应用。与传统的基因传递系统相比，LVs具有几个潜在的独特优势。与腺病毒或腺相关载体不同，针对慢病毒载体的中和抗体很少产生。LVs载体最重要的优势是能够提供长期稳定的基因表达，这对青少年或儿科患者至关重要；能够感染分裂/非分裂细胞，如神经元和骨细胞，并且由于其相对低免疫原性的特性，LVs载体可以包含9~10 kB大小的构建体。LV载体主要用于体外基因治疗，如B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的基因治疗。B-ALL是一种起源于单细胞的克隆性恶性疾病，是儿童非创伤性死亡的主要原因。CAR-T疗法在治疗B-ALL方面取得了非凡的临床效果。为了在体外培养CAR-T细胞，LVs似乎特别有吸引力，因为其能够稳定地整合较大的DNA嵌入。图3 利用LV载体治疗遗传疾病的体外策略示意图与基于LVs载体的基因治疗相关的主要问题包括在载体生产过程中可能产生具有复制能力的LV，患者基因组中内源性逆转录病毒对载体的动员，可能导致癌症的插入突变，导致跨代效应的种系改变，以及基因治疗患者的新病毒传播。近年来，随着对LVs载体的广泛细致的研究，该平台已广泛应用于研究和临床试验。尽管某些问题仍有待解决，但安全有效的LVs载体仍被认为是人类基因治疗的一种有希望的工具。     其他病毒载体其他未指明的病毒载体包括牛痘、麻疹、单纯疱疹、甲病毒、水疱性口炎、流感、杆状病毒等。牛痘病毒能够在肿瘤细胞中选择性地复制和繁殖，导致溶瘤。此外，其快速的病毒颗粒生成、广泛的宿主范围、大的基因组以及安全的处理使牛痘病毒成为基因治疗的合适载体。麻疹病毒是一种非整合RNA病毒，作为基因治疗的载体，在人类中具有长期的安全记录。单纯疱疹病毒（HSV）作为向神经系统传递特定基因的载体也具有许多优势，包括其体积大，宿主范围广，以及在神经元细胞中建立长期无症状感染的能力。甲病毒载体为基因治疗应用提供了一种有吸引力的方法，提供了快速、简单的重组病毒颗粒生产和广泛的哺乳动物宿主细胞转导。水疱性口炎病毒（VSV）由于其强大的肿瘤细胞杀伤和免疫刺激特性，代表了一个有吸引力的溶瘤病毒治疗平台。然而，这种载体也存在一定的挑战，如系统递送效率低下，可能导致严重的副作用，包括神经毒性。流感病毒是一种带有负意义的呼吸道病原体，是分段RNA基因组。在实验室中构建重组流感病毒是在20世纪80年代首次报道的。不同的基因修饰导致流感病毒的致病性减弱，这增加了流感病毒载体用于癌症基因治疗的安全性。杆状病毒已被广泛应用于昆虫细胞重组蛋白的生产。它也已发展成为安全有效的基因传递载体，具有广泛的进入性和在哺乳动物细胞中的复制缺陷等优点。不同的病毒载体有不同的优势。这些病毒载体的不同特性允许它们在基因治疗领域的各个方面的应用。在过去的几年里，生物制药行业在技术方面取得了非凡的进步，这导致了该行业真正的转变。使用基于病毒载体的基因疗法的新型治疗方法的出现和进展是该领域的重要里程碑。目前，产品正在开发用于广泛的适应症，包括自身免疫、癌症、眼科、神经系统、消化/代谢和感觉疾病。人工修饰失去致病性的病毒载体被广泛用作基因治疗领域的传递系统，其主要优点是其天然的高转导效率和稳定的表达。然而，某些挑战仍然存在，这些挑战因病毒载体而异。基因疗法、体细胞疗法、组织工程药物和先进治疗药物（ATMP）共同代表了四个主要的ATMP产品组。大多数基因疗法的设计目的是在人体内达到永久或持久的效果，这固有地增加了延迟不良事件的风险，例如使用腺病毒载体。有必要继续研究基因治疗的不良反应，特别是长期不良反应。病毒学的进步和对病毒生物学理解的提高将有助于开发适合转译应用的病毒载体变体，同时也会导致更好的疾病治疗结果。文献来源：Viral Vector-Based Gene Therapy识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T，Chimeric abtigen receptor T cell）是指利用基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞中，使T细胞通过与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活，从而达到治疗肿瘤的目的。目前有多种方法用于T细胞修饰及CAR-T细胞产品制备，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体）及非病毒载体转染等，目前已开展的临床试验中以病毒载体转导的方式为主。 ◉ 慢病毒( lentivirus)载体慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（human immunodeficiency virus，HIV-1）为基础发展起来的基因治疗载体，属于逆转录病毒家族，又区别于一般的逆转录病毒载体，比逆转录病毒载体具有更强的感染能力，具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合、持久表达、免疫反应小等优点，是最常用的基因转移载体。而载体作为基因治疗的工具，可能带来插入突变、复制型病毒、外源因子污染等风险，同时其携带的遗传物质是CAR-T细胞的重要组成部分，是使T细胞具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞活性的重要基础，考虑到病毒载体技术的广泛应用，具有复制能力的慢病毒/逆转录病毒检测成为重要问题，FDA及欧盟先后出台相关文件，要求建立灵敏、可靠的RCL/RCR检测方法。图1 慢病毒基因组HIV病毒基因组由两条正义链的RNA组成，约9kb的序列编码了9个蛋白，分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个最大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和envgag：包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因(Gag, group specific antigen)pol：包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase)env：包含组成病毒外壳的基因(envelope)（gag、pol、env是逆转录病毒的三个基本结构基因）复制性慢病毒/复制性逆转录病毒▌ RCL/RCR风险：1.RCL/RCR会同逆转录病毒载体一样，整合在细胞基因组中，从而产生因整合导致的原癌基因激活，抑癌基因破坏或者使促细胞生长的因子高度表达而造成二次肿瘤的风险。2.因其具有复制性，即产生具有复制能力的病毒，增加了因整合而造成的二次肿瘤的风险。▌ RCL/RCR产生的原因：慢病毒载体来源于病原体HIV-1，为了保证产品的安全性，目前基因治疗产品所用的慢病毒载体/逆转录病毒载体均为非复制性。通过将基因组中的辅助蛋白删除，并将结构基因分别通过3-4个质粒系统进行分别包装，形成三质粒系统或者四质粒系统，如图1所示，极大的降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性，这意味着至少需要2-3次完整的重组时间才能产生一个具有复制能力的慢病毒，在此基础上进一步修饰改造，构建自失活的慢病毒载体（SIN），极大的提供包装病毒的安全性，此外使用VSV-G蛋白取代env蛋白增加载体的稳定性及受体细胞范围。RCL/RCR产生的主要原因是转移载体和包装载体同源序列的重组。随着新的载体系统的发展与应用，载体系统中各元件之间发生同源重组的变化导致 RCL/RCR生成机制和结构的变化愈加复杂。而且，重组不仅限于载体系统之间各组分发生的重组，也包括载体成分和细胞基因组之间的重组。图2 HIV-1基因组→三质粒系统→四质粒系统复制性慢病毒/复制性逆转录病毒检测▌ RCL/RCR检测的阶段虽然通过上述病毒制备体系的改进，很大程度上降低了RCL/RCR产生的风险，但是仍不能完全排除，美国FDA要求对于γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体，需要在整个生产过程及不同阶段进行RCL/RCR检测，需要对载体生产用主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、载体上清液及在体外培养超过4天的载体转到细胞进行检测，如图3所示：图3 RCL及RCR检测取样▌ RCL/RCR检测的方法FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增，并在培养终点进行检测。◉ 共培养测定法：图4 RCL测试• 扩增期：将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系( 通常用 C8166) 孵育，细胞传代 5 次以上，培养至少3周。• 指示期：3 周后收集培养上清，接种于C8166 细胞中培养 7d 后检测RCL 标志物。• 检测：A：P24 ELLISA 的方法：适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成 RCL 的检测。B：PERT法：当 RCL 进行扩增后，也可应用PERT 检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景。C：qPCR方法：采用实时定量 PCR 方法( Q-PCR) 测定假型病毒 VSV-G 复制过程中的 VSV-G 基因序列或检测由载体质粒和包装质粒重组产生的psi-gag序列。 qPCR快检法 目前许多 CAR-T企业采用 Q-PCR方法直接测定CAR-T终产品中的 VSV-G 序列或 psi-gag 序列，因考虑到CAR-T细胞种产品一般需要新鲜输注的特殊情况，基于细胞培养法的RCL/RCR检测方法周期较长，建议在细胞产品制备过程中进行全面控制(如对慢病毒载体及生产终末细胞采用基于细胞培养方法测定 RCL/RCR，以确保生产工艺过程中不存在 RCL 的风险) ，细胞终产品阶段可采用qPCR快检测法快速放行。“新品”预告湖州申科自主研发将推出可用于基于细胞培养方法的qPCR检测以及CAR-T终产品qPCR检测的RCL及RCR检测专用试剂盒，分别以慢病毒载体包膜VSV-G基因和逆转录病毒载体包膜GALV基因为目标序列，建立荧光定量PCR检测方法，并对方法进行了性能验证，最低检测限分别可达4copies/reaction和3copies/reaction.新品即将上市如有订购需求请扫描下方二维码留言咨询‍