Voretigene Neparvovec

摘要：基于动物细胞的表达平台能够生产复杂的生物分子，如重组蛋白和病毒载体。尽管大多数生物治疗药物是在动物细胞系中生产的，但在人类细胞系中的生产也在扩展。使用人类细胞系的一个重要优势是，由此产生的生物治疗药物更有可能携带更多“类人”的翻译后修饰。在人类细胞系中，由于其高转染性、快速生长速率以及在无血清悬浮培养中生长的能力，HEK293细胞被广泛利用。在这篇综述中，我们讨论了HEK293细胞及其亚型在生产生物治疗药物中的使用。我们还比较了它们与其他常用宿主细胞系在每类生物治疗药物中的使用情况，并总结了影响宿主细胞系选择的因素。 1. 引言 复杂生物制药产品的生产在很大程度上依赖于哺乳动物细胞系，其中大部分治疗性生物制药是在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的。使用哺乳动物生产细胞可以实现具有复杂翻译后修饰（PTMs）的生物制品的生产。抗体、生长因子和凝血因子等复杂生物制品需要复杂的PTMs来确保产品的稳定性和效力。然而，并非所有生物制药产品都能在CHO中生产。由于CHO无法满足某些PTMs的要求，一些重组蛋白是在HEK293中生产的，而且大多数治疗性病毒载体也是在HEK293中生产的。自2015年以来，已有七种基于HEK的产品获得FDA批准（表1）。 表1 | 2015年以来在HEK293中生产的FDA批准的生物制品 其中，有六种是细胞和基因疗法（Mullard，2016，Mullard，2017；Mullard，2018；Mullard，2019；Mullard，2020；Mullard，2021），在这些疗法中，HEK293细胞系或其衍生物被用于病毒载体的生产。随着越来越多的细胞和基因疗法正在开发中，我们将看到HEK293在病毒载体生产中的使用相应增长。 2. HEK293细胞及其衍生物 HEK293细胞系是通过将人类胚胎肾细胞与剪切的腺病毒5型DNA进行转化而建立的。自那时以来，已经建立了许多亚型和衍生物，其中HEK293、HEK293-T和HEK293-F经常用于生物制药的生产。HEK293-T是HEK293细胞系的衍生物，通过表达温度敏感的SV40 T抗原突变体而建立。T抗原的表达允许携带SV40复制起点的质粒在转染到细胞时复制。HEK293-F细胞是GIBCO®品牌的细胞，从HEK293克隆而来，并适应了无血清介质中的悬浮培养。在重组蛋白生产中常用的其他值得注意的HEK293衍生物包括HEK293-E和HEK293-6E。通过表达Epstein-Barr核抗原1（EBNA-1），建立了HEK293-E，这允许具有oriP的质粒进行染色体外复制。类似地，通过表达缺少Gly-Gly-Ala域的截断EBNA-1，建立了HEK293-6E细胞系。与HEK293-E相比，HEK293-6E显示出改善的瞬时基因表达和细胞生长。 3. 在HEK293中生产重组蛋白 真核表达系统用于生产具有复杂PTMs的复杂重组蛋白，以确保蛋白质的正确功能。使用HEK293宿主细胞消除了由于非人类PTMs存在而引起的潜在免疫原性问题。它的转染容易和相对较高的蛋白质生产力使其成为科学研究中小规模生产重组蛋白的受欢迎选择，并且它适应悬浮无血清培养的能力促进了它在大规模生物治疗药物生产中的使用。 由于转染容易，HEK293广泛用于瞬时基因表达（TGE）。可以通过使用如磷酸钙或聚乙烯亚胺（PEI）等现成的试剂转染HEK293，快速生产重组蛋白。这种转染过程已在搅拌槽生物反应器中得到证明，并且是实验室到临床前使用快速生产重组蛋白的好方法。HEK293E和HEK293-6E在TGE中广泛使用，因为使用具有Epstein-Barr病毒oriP的质粒显著改善了TGE。然而，TGE在重组蛋白生产中的主要缺点是需要大量的转染级质粒DNA。 稳定生产细胞系被优先用于重组蛋白的大规模生产。最新的HEK生产的重组蛋白治疗药物NUWIQ®是在HEK293F细胞中生产的。NUWIQ®是一种重组凝血因子VIII（FVIII）。它通过将B域删除的人类FVIII表达构建物转染HEK293F细胞而生产。选择稳定转染体后，选择表现出最佳生产的克隆用于使用。 可以通过基因扩增技术增加生产细胞系中的蛋白质产量。在HEK293细胞中已经证明了使用谷氨酰胺合成酶（GS）介导的基因扩增和选择系统，这可以提高重组蛋白的产量。通过将重组人促红细胞生成素与谷氨酰胺合成酶在双顺反子载体中结合，经过甲硫氨酸亚砜（GS抑制剂）的顺序增加后，促红细胞生成素的表达显著提高。基因扩增技术的应用可以扩大人类细胞系，如HEK293在治疗性重组蛋白生产中的使用。 3.1. HEK中重组蛋白生产的未来 宿主细胞对生产的生物治疗药物的糖基化谱有重大影响。在NUWIQ®的情况下，与CHO或BHK生产的rFVIII相比，HEK293生产的rFVIII表现出改善的功能和降低的免疫原性，因为它完全硫酸化，并且不含有抗原性的Neu5Gc或α-Gal表位。与CHO细胞相比，HEK293细胞在谷氨酸的γ-羧化和酪氨酸残基的硫酸化方面具有更大的能力。这些PTMs是分别对Drotrecogin alfa和重组因子IX等治疗性糖蛋白所必需的。 尽管由于特定的PTM要求，一些生物治疗药物仍在如HEK293的人类细胞系中生产，但大多数复杂的重组糖蛋白是在CHO中生产的。在生物制药行业中可用的哺乳动物表达平台中，中华仓鼠卵巢（CHO）细胞用于生产约70%的重组生物制品，特别是单克隆抗体。CHO细胞之所以广泛使用，是因为它们高产，能够在无血清、化学定义的细胞培养介质中悬浮培养。此外，CHO生产的重组蛋白携带类人PTMs，这改善了生物活性并由于缺少α-半乳糖表位而降低了免疫原性。 与HEK相比，CHO细胞不能完全复制人类糖结构。这是因为CHO细胞不表达在人类细胞系中表达的酶β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶、α1,3/4岩藻糖转移酶或β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶III。此外，由于它们表达胞苷酸N-乙酰神经氨酸酸水解酶，CHO生产的糖蛋白带有潜在免疫原性的N-羟乙酰神经氨酸。由于具有理想糖基化谱的糖蛋白可以表现出更高的效力、稳定性、半衰期和降低的免疫原性，HEK293作为宿主细胞系的优势在于对生产的生物治疗药物特定糖基化谱的要求。CHO的这种限制可以通过工程改造细胞来克服，使其能够生产具有理想糖基化谱的糖蛋白。所需的和理想的糖基化谱可以通过表达在人类中发现的酶或敲除在人类中不存在的酶来工程改造。随着CHO细胞糖基工程的这些发展，我们预见到HEK293作为治疗性重组蛋白生产的宿主细胞的使用将进一步减少。 4. HEK293中病毒载体生产的前景 HEK293常用于病毒载体的生产。由于存在腺病毒E1A/B基因，它们在病毒载体生产期间提供辅助功能，因此被用于腺病毒和腺相关病毒载体的生产。在逆转录病毒载体生产中，由于细胞系中表达SV40大T抗原，因此使用HEK293T。T抗原的表达允许携带SV40复制起点的质粒在转染到细胞时进行复制。也有报道说，大T抗原的表达改善了慢病毒载体的生产。然而，HEK293T中病毒滴度的提高并不能完全归因于T抗原对质粒复制或转录活性的影响，这表明还有其他间接效应和细胞系的特性，这些特性能够实现高滴度逆转录病毒载体的生产。 早期的病毒载体生产是一个挑战，因为生产是通过在含血清的培养基中短暂转染贴壁HEK293细胞进行的。最近在短暂转染技术、细胞系和培养基开发方面的进步已经证明，可以在化学定义的细胞培养介质中使用无血清悬浮基础转染过程进行病毒载体生产。此外，已经建立了稳定的病毒载体生产细胞系。这些发展一起使得在HEK293细胞中可扩展地生产病毒载体。 4.1. 当前逆转录病毒载体生产技术 逆转录病毒载体是包膜的单链RNA病毒。在这类病毒中，基于小鼠白血病病毒的γ-逆转录病毒（γRV）和基于人类免疫缺陷病毒1型的慢病毒（LV）通常用于基因疗法。这些逆转录病毒根据其基因组组织被广泛分类为“简单”和“复杂”逆转录病毒。简单逆转录病毒包含两组不同的病毒RNA，其中病毒基因组RNA与mRNA不同。在复杂逆转录病毒中，病毒基因组RNA充当mRNA。 由于逆转录病毒载体能够转导广泛的细胞类型，因此是基因转移的最佳工具之一。逆转录病毒转导可以稳定地改变转导细胞，因为逆转录病毒RNA基因组被逆转录病毒逆转录酶转换为DNA后，可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中。由于LV载体表现出比γRV载体较少的有害整合特性，它们在基因疗法中更广泛地使用。γRV和LV都被用于生产嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法。自2017年以来，已有四种FDA批准的CAR-T疗法，包括Yescarta、Kymriah、Breyanzi和Abecma。 对于γRV和LV载体生产，已经开发了不同的包装系统，每一代的开发旨在减少复制能力病毒（RCV）的风险。在γRV生产中，由于病毒基因是非细胞毒性的，已经开发了包装细胞系以促进γRV生产。在第三代γRV包装细胞系中，gag-pro-pol基因和包膜蛋白在不同的表达载体中稳定表达。然后通过转染包装细胞系与单一载体构建体来实现γRV生产，该构建体携带感兴趣的转基因、Ψ包装信号和改良的长末端重复序列（LTR）物种，以进一步最小化RCV形成的风险。 LV基因的细胞毒性使得建立包装或生产细胞系具有挑战性。因此，四质粒短暂转染工作流程在LV载体生产中得到广泛利用。质粒携带：1）Gag-Pro-Pol，编码病毒结构蛋白和酶；2）Rev，表达对病毒基因组核输出至关重要的辅助蛋白；3）Env，编码与细胞受体结合以实现细胞进入的包膜糖蛋白；4）携带感兴趣基因的载体基因组。 逆转录病毒载体通常通过短暂转染贴壁HEK293T细胞生产。然而，从单层烧瓶中扩大生产是耗时的、劳动密集型的，并且需要大面积的工作空间进行细胞培养。为了提高过程的可扩展性，已经开发了几种无血清悬浮基础生产方法。悬浮基础生产方法在体积生产率方面与基于贴壁的生产方法相当（表2和3）。尽管在过程可扩展性方面有所改进，但逆转录病毒载体生产仍然具有挑战性。高质量转染级DNA和试剂的高成本以及批次间变异性和短生产周期导致了生产高滴度和一致性病毒载体的限制。 表2 | 不同γRV生产方法的比较 表3 | 不同LV生产方法的比较 4.1.1. 逆转录病毒载体生产的未来 为了提高γRV和LV生产的可扩展性，已经产生了稳定的生产细胞系。由包装细胞系开发的稳定、适应悬浮的生产商细胞系能够在无血清培养基中生产yRVs，已经开发出来以提高工艺可扩展性。随后，也开发了用于更安全、自灭活（SIN）yRVs的yRVs生产商细胞系。SIN载体最初是通过修改3个病毒LTR的U3序列开发的，这导致在转导细胞中整合时失去病毒增强子和启动子序列。这降低了RCV形成的风险，因为病毒启动子和增强子缺失，从而防止了载体的动员。此外，当与弱内部启动子结合使用以驱动感兴趣基因的表达时，可以降低遗传毒性风险。 由于所需基因的细胞毒性，开发稳定的LV生产细胞系具有挑战性。这可以通过使用细胞毒性较低的病毒蛋白酶突变体或包膜蛋白）或使用可诱导表达系统来克服。Tomás等人开发的LentiPro26稳定慢病毒载体生产细胞系，展示了在长达2个月的时间内稳定、持续的LV生产，同时保持与传统短暂转染基础生产方法相当的体积滴度。Chen等人证明，可以通过转染携带所有所需慢病毒载体组分的单一DNA构建体，快速生成稳定生产细胞系，将LentiPro26系统中生成和鉴定稳定生产克隆所需的时间从6个月缩短到大约4个月。在稳定的γRV和LV生产系统的进一步发展将提高γRV和LV的生产率，以满足这些载体在临床基因疗法应用中不断增长的需求。 4.2. 当前HEK中腺相关病毒生产的技术 腺相关病毒（AAV）是无包膜的单链DNA病毒，已被证明作为基因治疗载体的安全性和有效性。自2012年以来，已有三种批准的rAAV基因疗法，即Glybera、Luxturna和最近批准的Zolgensma。 重组AAV（rAAV）通常通过短暂转染含三个质粒的贴壁HEK293细胞生产，这三个质粒包含：1）腺病毒辅助因子，E4、E2a和VARNA；2）腺相关病毒rep和cap基因；3）由AAV ITR序列包围的货物基因。由于表达腺病毒E1a/b基因，这些基因对AAV生产至关重要，因此最常使用HEK293细胞进行rAAV生产。尽管HeLa细胞系在早期研究中被用于rAAV生产，但由于表达腺病毒病毒辅助基因E1A/B，提高了生产过程中的rAAV滴度，因此通常更倾向于基于HEK293的细胞系。 4.2.1. 基于辅助病毒的rAAV生产/HSV生产系统在HEK293中 rAAV也可以使用辅助病毒生产。野生型AAV需要与腺病毒共感染以进行有效的感染。早期的rAAV生产使用辅助病毒生产系统，通过感染携带AAV rep、cap和货物基因的重组辅助病毒来实现rAAV生产。通常使用两种重组病毒，一种携带rep和cap基因，另一种携带货物基因。这最小化了重组，从而降低了野生型AAV形成的风险。由于需要在纯化过程中将辅助病毒与rAAV分离，并需要证明纯化的缺乏复制能力的病毒，因此不偏爱使用基于辅助病毒的rAAV生产系统。 4.2.2. HEK293中rAAV生产技术的未来 尽管上述治疗的rAAV生产是在基于贴壁的系统中进行的，但最近也开发了基于悬浮的rAAV生产技术。已经在适应悬浮的HEK293细胞系中展示了rAAV生产，产量与现有的基于贴壁的生产系统相当（表4）。随着越来越多的悬浮基础方法被用于临床试验中rAAV治疗的生产，我们预见将从基于贴壁的生产方法转向更可扩展的基于悬浮的生产方法。 表4|不同rAAV生产方法的比较 为了提高rAAV生产的可扩展性，也已经开发了稳定的生产细胞系。CEVEC制药公司开发了ELEVECTA®生产细胞系，其中AAV生产基因在CEVEC的羊膜细胞生产（CAP）细胞中稳定表达，基因表达由可诱导启动子控制。只需诱导即可实现可扩展的rAAV生产，无需使用辅助病毒、转染试剂或质粒。 虽然rAAV通常在基于HEK293的系统中生产，但也开发了显示相当rAAV滴度的杆状病毒基系统。使用杆状病毒表达载体系统进行rAAV生产最初在2002年被描述，其中通过三种重组杆状病毒的共感染实现了rAAV生产，一个Rep-杆状病毒、一个Cap-杆状病毒和一个货物ITR杆状病毒，辅助功能由杆状病毒提供。 OneBac rAAV生产系统旨在通过将生产所需的重组杆状病毒数量从三个减少到一个来提高生产系统的可扩展性。这是通过生成稳定表达AAV rep和cap基因的Sf9细胞系实现的。这导致了一个更具可扩展性的生产系统，并且与基于HEK293的系统相比，滴度有所提高。 尽管所描述的系统展示了Sf9生产的和HEK293生产的rAAVs之间的类似功能，但最近的一项研究识别了两种系统生产的rAAVs之间的差异。在Sf9细胞中生产的rAAV衣壳与在HEK293中生产的衣壳相比，具有不同的翻译后修饰。在HEK293细胞中生产的rAAV基因组表现出增加载体效力的甲基化模式。尽管只测试了AAV1和AAV8血清型，但这表明由于改善的载体效力，更倾向于使用HEK293生产的rAAVs。除非未来评估的血清型显示Sf9生产的rAAVs可能具有改善的载体效力，否则将更倾向于在HEK293中生产rAAV。 4.3.腺病毒载体疫苗和溶瘤腺病毒的生产 腺病毒（AdV）是无包膜的双链DNA病毒。由于它们具有高基因组容量、高转导效率并且是非整合性的，具有高染色体外持久性，因此最初被用作基因治疗载体。然而，由于AdV基因转移后发生致命的全身炎症反应，它们在基因治疗中的适用性受到限制。尽管由于这一不幸事件，AdVs在基因治疗中的使用有所下降，但在期望引起免疫反应的应用中，AdVs的使用有所恢复。诱导强烈免疫反应的能力促进了传染病和癌症免疫疗法疫苗候选物的开发。AdV现在构成了临床试验中大部分病毒载体，其主要应用为疫苗或癌症疗法。 COVID-19大流行推动了腺病毒载体疫苗的快速发展及其最终的紧急使用。在世界卫生组织（截至2021年8月）批准用于紧急使用的三种腺病毒载体疫苗中，Ad5-nCOV和ChAdOX1-nCoV是在HEK293细胞中生产的，而Ad26.COV2-S是在PER.C6细胞中生产的。这些细胞被利用来生产AdV载体，因为需要在生产细胞系中转补病毒载体基因。 第一代AdV载体是通过用表达载体替换E1和/或E3区域生产的。E1基因产物对病毒生产是必要的，在HEK293或PER.C6等生产细胞系中跨补充。E3基因区域的产物对病毒复制并不重要，因此不需要补充。由于其他病毒蛋白的表达，第一代腺病毒载体引发免疫反应。在疫苗的情况下，引发的免疫反应特别有利。 随后的AdV载体涉及去除病毒基因以最小化这些载体在体内使用时引发的免疫反应。在第二代AdV载体中，已经灭活了额外的病毒复制所需基因。病毒生产是在表达E2和/或E4基因产物的细胞系中进行的。最后，在第三类“无病毒腺病毒”中，除了需要用于病毒DNA复制和包装的顺式作用DNA序列外，所有病毒基因都被去除了。对这些AdV生产系统的改进涉及减少序列同源性的修改，从而降低通过随机重组事件产生野生型AdV的风险或修改以最小化病毒传播期间的转基因表达以提高病毒生产。 4.3.1.其他腺相关病毒和腺病毒的生产系统 AdVs和AAVs的生产需要在HEK293细胞中跨补充腺病毒E1基因。然而，由于HEK293细胞是使用剪切的AdV基因组DNA产生的，E1基因携带与野生型AdV高度同源的DNA序列。在HEK293细胞中生产第一代E1缺失的腺病毒载体导致了带有E1序列的RCV的产生，这可能是由同源重组造成的。尽管使用了E1和E3缺失的腺病毒载体，但RCV的形成无法被消除。 为了减少同源性，使用定义的E1基因区域转化细胞系将减少在AdV生产期间通过随机重组事件产生野生型AdV的风险。PER.C6细胞系是通过将人类胚胎视网膜细胞与腺病毒5型E1基因的定义区域转染而建立的，该区域受人类磷酸甘油酸激酶启动子的控制。在PER.C6细胞中生产E1缺失的腺病毒载体没有产生复制能力病毒，允许以成本效益的方式生产AdV载体。 类似于PER.C6细胞，CEVEC的CAP细胞通过含有AdV 5的E1和pIX的载体永生化，目的是在不意外形成RCV的情况下高滴度生产复制缺陷的腺病毒载体。由于减少了意外RCV形成的风险，这些细胞系可能比HEK293更倾向于用于AdV生产。 5.结论 人类细胞系HEK293已成为治疗性病毒载体的主要生产平台。细胞系发展的进步将看到更多的HEK293克隆或衍生物被开发用于在无血清悬浮培养基中生长，用于高滴度病毒载体生产。当前的例子包括Thermo Fisher Scientific提供的商业化LV和AAV载体生产工作流程，其中他们的基于HEK293的病毒生产细胞（VPC）用于LV-MAX™系统和即将推出的VPC 2.0，用于他们的原型AAV-MAX系统中。 病毒载体生产技术的未来倾向于为AAV、LV和yRV生产开发稳定细胞系。这样的工艺使得在生产病毒载体时无需使用转染所需的昂贵试剂。在稳定生产细胞系中，CHO中的工艺发展导致糖蛋白产量提高了10-20倍。HEK293细胞培养基开发和工艺技术的进步可能导致稳定生产系统中病毒载体产量的类似提高。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。