Voretigene Neparvovec

尽管已经取得了实质性进展，但在rAAV的开发中仍然面临几个挑战，这些挑战从根本上影响着基于rAAV的眼科基因治疗的安全性和有效性（图1）。 图1. 基于rAAV的眼科基因治疗的挑战。首先，预先存在的抗rAAVs的抗体可以阻止玻璃体内注射后的细胞/组织转导。其次，眼部递送的rAAVs可以诱导眼部的先天和适应性免疫反应，导致严重炎症，并显著影响治疗效果和安全性。第三，rAAV，特别是rAAV2分子，通过玻璃体内注射递送的分子无法穿透位于外层视网膜的光感受器和视网膜色素上皮（RPE），这两种细胞在大多数遗传性视网膜疾病中都发生了退化。这一限制主要是由于rAAV2与HSPG之间的结合。HSPG是rAAV2主要结合的受体，它在内限制膜（ILM）和外限制膜（OLM）以及其他障碍物，如视网膜的细胞外基质中富集。  免疫原性和rAAV引起的炎症 >>> 多种因素可能影响rAAV在眼部的转导效率，其中许多与宿主免疫系统密切相关。尽管眼睛被认为是一个免疫豁免的器官，但眼科基因治疗中炎症的发生依然较为常见。这些炎症通常与转导效率降低、细胞活力下降以及免疫毒性增加密切相关。NAb一直是rAAV系统性给药治疗中关注的重点，同样，用于视网膜基因治疗的rAAV也容易受到NAb介导的中和反应的影响，特别是在通过玻璃体内注射给药时。尽管玻璃体内的NAb滴度较血清中低，但仍可能影响治疗效果。对于血-视网膜屏障（BRB）完整的患者，玻璃体中的NAb水平通常很低。然而，在BRB受损的患者中，玻璃体中的NAb水平与血清中的NAb水平呈正相关。 研究发现，通过玻璃体内注射rAAV可引发抗AAV的系统性NAb产生。在血清NAb滴度较高的非人灵长类动物中进行眼部给药时，载体的转基因表达较弱甚至检测不到。有趣的是，无论NHP接受单眼注射还是双眼注射，两只眼睛的玻璃体液中的NAb滴度均趋于相同。由于临床上采集玻璃体液操作复杂且具有挑战性，因此在视网膜基因治疗前，通过评估血清中预先存在的NAb水平及BRB的完整性，可能成为一种替代性、可行的评估手段。 为了减少NAb对AAV的影响，研究人员正在设计新的视网膜靶向衣壳，用以替代传统的野生型AAV血清型（如AAV2和AAV8）。最近的一项小鼠眼部研究显示，注射到玻璃体腔内的抗原会通过视神经鞘的淋巴血管被引流至深颈部淋巴结，这一过程对于视网膜和中枢神经系统中抗原特异性CD8+ T细胞的生成起到了关键作用。研究还发现，通过VEGFC刺激增强淋巴引流会进一步抑制AAV载体在视网膜中的转导效率，而使用sVEGFR3抑制VEGFC信号则可以提升视网膜中AAV载体的重复给药效果。尽管该研究未直接评估玻璃体液中中和抗体的滴度，但结果表明，临时抑制眼部淋巴引流可能有助于减少抗AAV中和抗体的生成，从而提高基因治疗的有效性。这项研究为优化AAV载体的设计和使用提供了新的方向，尤其是在解决中和抗体相关挑战方面具有重要意义。 在临床实践中，与rAAV治疗相关的眼部炎症在接受视网膜下或玻璃体腔注射的患者中较为常见，这种炎症具有一定的剂量依赖性，但在临床前研究和临床试验中表现出显著差异。手术操作、给药方式、rAAV剂量、载体制备方式、启动子序列的选择、转基因的潜在毒性以及术前是否使用免疫抑制剂等多种因素，都会影响炎症的严重程度。玻璃体腔注射直接将AAV颗粒暴露于玻璃体和视网膜的免疫细胞中，因此与视网膜下注射相比，更容易引发免疫激活反应。在非人灵长类动物实验中，玻璃体腔注射AAV导致房水中出现短暂的细胞炎症，同时玻璃体内产生持续性炎症反应，且炎症程度与注射剂量成正比。通过去除空AAV衣壳以降低衣壳剂量，可以有效减轻炎症并提高转导效率。此外，玻璃体腔注射还会引发系统性NAbs的生成，但在注射后3个月内，细胞因子水平和视网膜炎症相对较低。在一项针对15名莱伯遗传性视神经病变（LHON）患者的临床试验中，使用rAAV2-ND4进行玻璃体腔注射后，患者的系统性免疫反应是短暂的，未引发严重炎症。而视网膜下注射由于更高的免疫豁免，通常引起的炎症较少。例如，在针对RPE65基因突变引起的2型莱伯先天性黑朦（LCA2）患者的试验中，术后炎症经过14天的类固醇治疗得到了有效缓解。然而，在针对脉络膜缺损症的rAAV2.REP1视网膜下注射试验中，有一名患者由于载体回流至玻璃体腔而出现了显著的玻璃体炎和视网膜炎，为此，该患者需要接受更长时间的免疫抑制治疗。总体来看，注射途径的选择、剂量的控制以及免疫抑制方案的优化，是减少rAAV治疗相关炎症的重要策略。 长期以来的研究结果表明rAAV的基因载荷，特别是含有未甲基化CpG序列的ITRs，可能会触发先天免疫反应，从而引发炎症。未甲基化CpG序列通过激活Toll样受体9（TLR9），在B细胞的活化和抗体生成中起到关键作用。研究发现，通过CpG寡脱氧核苷酸（ODN）刺激TLR9，会显著增强针对AAV8-SIINFEKL转导小鼠的OT-I（ SIINFEKL特异性）CD8+ T细胞反应。为了减轻这种免疫反应，研究人员开发了一种ITRs中不含CpG序列的AAV载体。尽管这种载体的转导效率与野生型ITRs载体相当，但在生产过程中载体产量明显下降。另一种策略是向载体中引入TLR9抑制序列。例如，将端粒来源的ODN序列TTAGGG插入到5′ ITR与GOI之间，在小鼠眼部实验中， GFP表达水平更高，CD3+和CD8+ T细胞的浸润减少。然而，这种改进策略在非人灵长类动物等大型动物中的效果尚需进一步验证。值得注意的是，目前尚无明确证据表明其它细胞内DNA受体（如AIM2、STING以及与I型干扰素通路相关的受体）参与了对rAAV携带的目的基因的识别。这些研究表明，通过优化CpG相关序列，可能有效降低rAAV引发的免疫反应，为提高其安全性和治疗效果提供了新的方向。  rAAV的载荷容量有限 >>> rAAV的载荷容量约为4.7 kb，这一限制在某些应用中可能成为障碍。例如，在治疗Stargardt病的基因替代策略中，目标基因ABCA4的cDNA长度约为6.8 kb，超出了rAAV的载荷容量。为了解决这一问题，一种可行的解决方案是采用双载体系统，将超大的转基因分为两个独立的rAAV载体。在这种策略中，一个载体包含启动子和转基因的5′部分，另一个载体包含转基因的3′部分和poly(A)尾巴。两个载体还包含一个人类胎盘碱性磷酸酶（AP）基因的重叠片段，这一高重组性片段可以促进两个载体在共同递送后通过重叠区域或ITR发生分子间串联化，从而在mRNA水平上生成全长的目标转基因产物。一项研究开发了一种针对ABCA4的双载体系统，成功将功能性ABCA4转基因递送至ABCA4⁻/⁻小鼠模型中，用以模拟Stargardt病。另一项类似研究也验证了双载体系统能够在ABCA4⁻/⁻小鼠中表达全长的ABCA4转基因。然而，研究发现双载体系统的转基因表达效率并不稳定。在某些研究中，还观察到了全长和小片段ABCA4共存的现象。尽管双载体系统为解决rAAV载荷容量限制提供了一种可能的解决方案，但其效率和一致性仍有待优化和改进。 使用双载体进行基因转导的一个限制在于，两个载体的互补ITR可能形成环状串联，导致仅表达部分转基因，从而生成无功能蛋白。针对这一问题，研究人员探索了一种替代方法，即使用分裂内含肽（一种能够介导蛋白质反式剪接的天然多肽）。该方法通过将如ABCA4或CEP290等大蛋白分割为两个由分裂内含肽包裹的多肽片段，并通过反式剪接在动物模型中成功重建了完整蛋白。这种策略允许大基因序列适配于单个rAAV载体。尽管分裂内含肽介导的蛋白质反式剪接在扩展AAV载体大基因递送能力方面显示出潜力，其在人类中的安全性和有效性仍存在不确定性。尤其是，残留的非哺乳动物来源的内含肽可能引发安全性问题。一项研究发现，使用一种改良的E. coli二氢叶酸还原酶降解标签，可以显著减少反式剪接后内含肽的残留量，并在Stargardt病小鼠模型中验证了其安全性和有效性。这一结果为分裂内含肽技术在未来基因治疗中的应用提供了支持。 最近，美国罗切斯特大学Douglas M. Anderson课题组报告了一种利用核酶激活的mRNA转移连接来实现大基因递送的策略，称为StitchR（Stitch RNA）。该策略通过核酶切割两个独立的mRNA，激活了它们的无痕转移连接，最终在真核细胞中翻译成全长蛋白。在哺乳动物细胞中优化StitchR活性导致蛋白质表达量提高了约900倍，接近从单一载体表达的基因的表达水平。研究结果还显示，StitchR可以用于双AAV基因治疗，通过恢复大分子功能性肌肉蛋白至体内内源性水平来纠正肌营养不良症。点击文末阅读原文，进入派载体，了解更多关于StitchR的内容。 此外，为解决超大转基因的递送难题，研究还探索了高度简化的转基因版本。例如，在CEP290基因的研究中，两项试验分别使用编码miniCEP290基因或功能性CEP290片段的rAAV8进行视网膜下注射，显著改善了LCA小鼠模型中光感受器的存活率、形态和功能，与对照组相比效果显著。这些研究为超大基因递送提供了新的解决思路，也为基因治疗的进一步优化奠定了基础。  靶向特异性 >>> 高效且特异性靶向特定视网膜细胞类型是成功开展眼科基因治疗的关键。许多研究致力于在表达盒中使用细胞特异性启动子，以实现GOI在特定视网膜细胞类型中的精准调控。在一项对比研究中，研究人员评估了五种启动子在视网膜神经节细胞中驱动转基因表达的能力。结果显示，与常用启动子，如CBA、CMV以及短CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白/短β-珠蛋白内含子（sCAG）相比，人类突触素（human synapsin）启动子能够特异地驱动GOI在视网膜神经节细胞中表达。视网膜间视黄醇结合蛋白（IRBP）启动子能够在狗和小鼠的视网膜中特异地驱动GOI在视杆和视锥细胞中表达。然而，该启动子在非人灵长类动物中未能有效地驱动GOI在视锥细胞中表达，表现出物种间的差异性限制。 已有多种RPE特异性启动子被应用于rAAV研究中，包括RPE65、VMD2（或BEST1）和RPGR等。其中，人类RPE65启动子已被用于临床试验，通过视网膜下注射rAAV2/2载体来驱动RPE65基因的表达，以治疗2型莱伯先天性黑朦（LCA2）。然而，在一项试验中，接受注射的三名患者视力未显示显著的临床改善。相比之下，VMD2启动子在多项基于rAAV的动物研究中表现出较强的GOI表达能力，并能够特异地驱动GOI在RPE细胞中表达。这些结果表明，选择适合的启动子对于不同物种和目标细胞的基因治疗效果至关重要，同时也需要针对特定模型优化启动子以提高疗效和临床转化潜力。 最近的一项研究比较了多种光感受器和RPE特异性启动子，以评估它们在视网膜细胞中的安全性，特别是通过视网膜下注射rAAV后的影响。研究结果显示，常用的广谱启动子（如CMV、人UBC启动子和CAG）以及RPE特异性启动子（如VMD2）在形态学、炎症反应和生理功能方面均表现出一定的毒性，而光感受器特异性启动子（如人红视蛋白、人视紫红质、人视紫红质激酶和小鼠视锥视蛋白捕获蛋白）则未表现出明显毒性。AAV载体中启动子相关毒性的可能原因在于，广谱启动子（如CMV、人UBC和CAG）驱动的GOI高水平表达可能通过生成双链RNA或其他免疫刺激序列，激活先天免疫反应。相比之下，光感受器特异性启动子驱动的表达具有更高的特异性和较低的表达水平，因此未引发毒性。这一发现表明，启动子的选择对减少基因治疗中的不良反应至关重要。此外，研究还发现，RPE细胞和小胶质细胞对广谱启动子的敏感性较高，可能导致炎症反应加剧以及视网膜损伤。因此，优化启动子设计以提高特异性和减少免疫刺激，是改善基因治疗安全性的重要策略。  给药方式 >>> 在临床中，rAAV递送至视网膜的常见途径包括视网膜下注射、玻璃体腔注射和脉络膜上注射（图2）。目前，大多数针对光感受器和RPE疾病的基因治疗主要采用视网膜下注射。这种方式尽管能够有效将rAAV递送至视网膜，但其在转导效率和安全性方面仍存在一些局限性。相比之下，玻璃体腔注射能覆盖更大范围的视网膜区域，从而实现更多视网膜细胞的转导，提升基因治疗的效果。然而，目前普遍认为，rAAV2通过玻璃体腔注射对光感受器和RPE细胞的转导效率较低。注射到玻璃体腔中的rAAV2需要克服多重障碍，包括在较大眼球（如非人灵长类动物）的玻璃体液中被稀释（通常0.05–0.10 mL的载体扩散到约2.5 mL的玻璃体液中）、与内界膜上的HSPG强结合、从注射点到光感受器或RPE细胞的长距离扩散、视网膜细胞间的细胞外基质，以及蛋白酶体的降解等问题。因此，近年来的研究逐渐聚焦于开发新型衣壳，以期通过玻璃体腔注射更高效地转导外层视网膜细胞。 图2 rAAV眼科基因治疗的视网膜下、玻璃体内和脉络膜上注射示意图。a. 视网膜下注射是当前大多数基于rAAV的眼科基因治疗临床试验中使用的主要给药方式。通过这一方式递送的rAAV主要感染RPE细胞和光感受器。b. 玻璃体内注射是一个有前景的给药方式，因为它比视网膜下注射更容易递送且侵入性较小。然而，这种给药方式由于视网膜中存在多层屏障，导致rAAV主要感染内层视网膜细胞。c. 基于微注射器的脉络膜上注射可以在诊室环境中进行，有助于将载体递送到位于脉络膜和巩膜之间的脉络膜上腔。一旦注入脉络膜上腔，rAAV会向后和周围扩散。 此外，多项人类和非人灵长类研究表明，玻璃体腔注射rAAV会引发显著的体液免疫反应，这可以通过检测血清中的抗AAV抗体水平来评估。一项研究显示，当在一只眼中进行玻璃体腔注射后，再对另一只眼注射时，会由于NAbs的产生和循环而抑制转基因的表达。这表明玻璃体腔注射可能诱导强烈的体液免疫反应。尽管眼部具有一定的免疫特权，多个临床研究仍发现，玻璃体腔注射rAAV可能引发明显的眼部炎症。一项比较研究发现，与视网膜下注射相比，玻璃体腔注射引起更强的体液免疫反应，但视网膜下注射则在眼前段和后段引起更显著的局部炎症。然而需要注意的是，玻璃体腔注射引起的炎症通常是暂时的，并呈剂量依赖性，可以通过适当治疗（如使用皮质类固醇）加以控制。总体而言，炎症的严重程度和发生率可能因rAAV的剂量、血清型以及患者的个体差异而有所不同。虽然玻璃体腔注射存在引发免疫反应的风险，但只要合理管理，这种风险通常不会显著削弱rAAV治疗的潜在疗效。 除了视网膜下注射和玻璃体腔注射，研究人员还探索了脉络膜上注射这一给药方式。这种方法通常用于治疗涉及脉络膜的疾病，具有非侵入性的特点，可在门诊环境中完成。与视网膜下注射相比，脉络膜上注射能够覆盖更大的注射面积。然而，与直接将载体注射到眼内免疫豁免区域（如玻璃体腔或视网膜下）的方式不同，脉络膜上注射需要载体穿越多个组织层才能到达外层视网膜，这一过程增加了载体与免疫细胞及细胞外基质成分接触的机会，从而提高了免疫反应的风险。目前，仅有两项临床试验采用脉络膜上注射递送基因治疗药物，分别用于评估RGX-314在治疗DR和新生血管性AMD中的效果。这些药物的长期疗效和安全性尚未公布，有待进一步研究和观察。  长期安全性和疗效 >>> rAAV基因治疗的安全性问题一直是所有临床试验的核心关注点。由于此类治疗旨在通过一次性干预实现长期或永久的疗效，其长期效果需要密切关注。多项临床试验表明，基于rAAV的基因治疗在眼部递送后，其对长期视力改善的效果存在较大差异。针对RPE65相关LCA的六项rAAV基因治疗临床试验（共164只眼）的一项元分析结果显示，治疗后一年内，治疗眼的最佳矫正视力显著改善。然而，在治疗后2至3年，视力改善的效果开始表现出差异。尽管如此，这些疗法仍然是治疗此前无法治愈疾病的一项重要突破。以Luxturna为例，FDA的相关文件显示，约一半接受治疗的患者达到了显著视力改善的标准，这标志着LCA治疗领域的重大进展。Luxturna的长期疗效仍在研究中，一些研究指出其疗效可能具有一定的局限性。一项研究发现，尽管在视网膜退行性病变患者和犬模型中，治疗初期确实观察到了视功能的改善，但光感受器的逐渐丧失在治疗后仍然持续。这一现象引发了对Luxturna及类似rAAV基因疗法长期疗效的担忧，也凸显了对患者进行持续监测和随访研究的重要性，以全面评估其长期治疗潜力。 rAAV眼科基因治疗的未来方向 随着基于rAAV的眼科基因治疗不断发展，多个关键领域正在逐步显现，为提升这些疗法的疗效、安全性和适用性带来了新的希望。本节将概述这些未来的发展方向，重点介绍载体设计的创新、基因编辑技术的应用以及当前需要解决的主要挑战。 载体设计的创新 在rAAV衣壳设计方面，目前的研究聚焦于开发具有更高特异性、降低免疫原性并提高转导效率的载体。AAV2.7m8变体的问世标志着一个重要的突破，该变体通过玻璃体腔注射在啮齿动物中实现了优于AAV2的光感受器转导效果。然而，其在NHP中的疗效有限，说明仍需进一步创新。多个研究表明，即使借助AI辅助设计衣壳，并结合NHP的筛选数据，这些衣壳在NHP中通过玻璃体腔注射后，光感受器转导效率仅有小幅提升，显示出其在眼科基因治疗中的潜力仍然有限。这也表明，当前依赖高成本的NHP体内筛选策略可能并非找到在人类中具有强大光感受器转导能力的衣壳变体的最佳方法。 Deverman团队的一项最新研究采用了体外筛选方法，靶向人类转铁蛋白受体，这种受体在人类血脑屏障（BBB）中高度富集并参与跨细胞运输。研究识别出一种AAV9衣壳变体，能够高效穿越BBB并在非人灵长类动物的中枢神经系统细胞中实现转导。通过专注于识别能强效结合人类靶细胞或组织中受体的衣壳变体，该方法成功绕过了跨物种障碍，确保了在人类细胞中的高效转导。这一策略同样适用于眼科基因治疗的衣壳设计，尤其是靶向视锥细胞中表达的保守性受体，以优化玻璃体腔注射的效果。为进一步提升这一过程，可开发新的体外筛选平台，专门用于评估衣壳库的HSPG结合亲和力，并筛选出HSPG结合较少的衣壳。结合这些筛选方法，有望发现同时具备低HSPG结合能力和对光感受器受体高特异性结合能力的衣壳，从而显著提高玻璃体腔注射的光感受器转导效率，推动视网膜基因治疗的变革。 基因编辑技术 rAAV与基因编辑技术（尤其是CRISPR/Cas9）的结合代表了眼科基因治疗的前沿进展，为遗传性视网膜疾病的治疗带来了变革性的潜力。其中一个典型例子是利用rAAV递送CRISPR/Cas9治疗由CEP290基因突变引起的LCA10的临床试验（EDIT-101）。该试验在安全性和疗效方面取得了令人鼓舞的结果，其中64%的参与者在关键次要终点上表现出显著改善。 碱基编辑和先导编辑是新兴的基因组编辑技术，以不同机制实现基因突变的精确修复。碱基编辑利用一种改良的Cas9酶，在无需产生DNA双链断裂的情况下实现特定碱基的转换，而先导编辑通过结合Cas9单链切割酶与逆转录酶，可引入包括小插入和缺失在内的多种遗传改变。这两种技术在高精度修复多种基因突变方面展现了巨大的应用前景，有望进一步推动眼科基因治疗的发展。 由于碱基编辑和先导编辑器的体积超过了AAV的包装容量，其在基于rAAV的眼科基因治疗中的应用受到一定限制。然而，一项研究成功优化了双AAV分裂内含肽先导编辑器，并通过视网膜下注射将其递送至LCA的rd12小鼠模型中，该方法实现了高达16%的RPE65突变的精准校正，恢复了RPE65的表达，显著改善了视网膜和视觉功能，并保护了光感受器，同时未检测到明显的脱靶编辑。这一研究为先导编辑在遗传性视网膜疾病治疗中的潜力提供了成功的概念验证案例。 与DNA编辑相比，RNA编辑具有一些明显的优势，例如能够进行瞬时且可逆的修饰，从而减少基因组中永久性脱靶效应的风险。一项研究表明，使用AAV递送的CRISPR-Cas13bt3（一种新型RNA编辑器）在人体视网膜类器官和人源化小鼠模型中有效沉默了VEGFA。该研究还发现，在hESC来源的RPE细胞中，CRISPR-Cas13bt3显著降低了VEGFA mRNA的表达，并在小鼠的光感受器细胞中实现了对人类VEGFA的特异性敲低。 当前需要克服的主要挑战 为克服rAAV眼科基因治疗的局限性，研究人员正在探索多种创新策略。衣壳工程被用来开发免疫原性较低的AAV变体，以规避NAbs并减少免疫反应，特别是在玻璃体腔注射的情况下。此外，免疫抑制方案的优化和替代给药方式（如脉络膜上注射）的探索，旨在减少炎症反应并改善治疗效果。针对rAAV载荷容量有限的问题，研究人员正在开发双载体系统、StitchR、简化或分割的转基因策略，以提高大基因条件下的GOI表达效率和一致性。载体设计方面的进展，如使用重叠元件和蛋白质反式剪接技术，已经取得了成效。此外，优化更具高精度和细胞类型特异性的启动子等顺式调控元件，有助于提高靶向特异性，并降低视网膜毒性的风险。 针对治疗效果的差异性，更加个性化的患者筛选方法也逐渐受到重视。这些方法考虑到疾病的异质性、患者的年龄以及共病情况等因素，力求为每位患者制定量身定制的临床方案，从而实现一致且有效的治疗结果。AI在预测接受基因治疗患者的风险/收益比方面展现了巨大潜力。通过利用庞大的数据集，机器学习算法能够识别出临床医生或研究人员难以察觉的模式，从而根据患者的个体特征（如基因突变、视网膜退行性变化程度和整体健康状况）做出更为精准的预测。尽管如此，确保长期安全性和疗效仍然是首要任务。相关研究正在开发下一代载体和治疗方法，旨在提供持久的疗效并最大程度地减少潜在风险。 结论和未来发展方向 我们概述了AAV的生物学特性、专为眼部递送设计的衣壳工程、眼科基因治疗的临床试验现状，以及当前面临的挑战和未来发展方向。尽管我们仅涉及了这一广阔领域的一部分内容，但它突出了rAAV在多种眼科疾病中的多样化临床应用。虽然已经取得了一些初步的成功和有前景的进展，但在开发针对遗传性视网膜疾病的基因药物方面仍面临诸多挑战。免疫反应、炎症、与rAAV顺式调控序列相关的视网膜毒性、给药方式、rAAV的包装容量、靶向特异性以及长期疗效等问题，仍然是制约rAAV广泛应用的主要障碍，这些问题正在通过单项和整体的方式进行优化。   目前的研究主要集中在： 探讨治疗的副作用 开发眼部选择性且短期有效的免疫抑制方案 解决已有的或诱导产生的中和抗体问题 优化载体设计 开发具有更高转导效率和特异性的创新衣壳 替代递送方式 这些研究有望克服当前的多项局限性。此外，基于rAAV的眼科基因治疗Ⅲ期临床试验的结果备受期待，可能会进一步增强其应用信心，并为眼科疾病的治疗开辟新的篇章。随着该领域的不断进展，跨学科合作、对长期安全性和疗效的持续监测、对rAAV生物学及疾病机制的深入理解，以及研究人员与监管机构之间的密切合作，将是成功将rAAV眼科基因治疗转化为主流临床实践的关键。 AAV作为眼科基因治疗的主要平台，在临床试验中取得了显著成果，但仍面临诸多挑战，相信通过不断优化载体设计和递送技术，AAV将在眼科基因治疗领域发挥更大的潜力。派真CRO &CTDMO 一站式服务平台，提供从基因合成、载体构建，到病毒包装的整体解决方案，全面支持您基因编辑研究，还可提供从研究至GMP级别的多种AAV血清型载体，助力眼科疾病基因治疗。 参考资料：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.ymthe.2024.10.017 关于派真生物

眼科疾病一直是rAAV基因治疗的前沿领域。截至2023年12月，已有78项临床试验正在进行或已完成，旨在研究rAAV在治疗眼科疾病中的应用（图1）。其中，15%的试验针对新生血管性年龄相关性黄斑变性（neovascular AMD），14%的试验与莱伯先天性黑蒙2型（LCA2）相关。超过60%的试验处于早期阶段（Ⅰ期和Ⅰ/Ⅱ期），主要关注治疗的安全性；此外，15%的试验已进入Ⅲ期阶段，与2019年之前的分析相比，数量有了显著增加。在这些试验中，rAAV2是最常用的血清型，成为基因治疗的主导载体。 图1 基于rAAV的眼科基因治疗临床试验分析。通过检索ClinicalTrials.gov，共筛选出78项基于rAAV的眼科基因治疗相关临床试验（包括正在进行和已完成的）。需要注意的是，该图表特别筛选了同一疾病类别中、处于相同研究阶段的不同研究药物（即，如果某一特定研究药物涉及多个处于同一阶段的试验，则仅统计一次）。因此，这一图表提供的是一个经过筛选的视角，并未涵盖rAAV眼科基因治疗临床试验的全部数据。 遗传性视网膜疾病（IRDs） IRDs是一类具有高度遗传异质性的疾病，可导致视力逐渐丧失，最终发展为失明。目前，尚无针对IRDs的有效治疗手段。然而，基于rAAV的基因治疗为恢复视网膜功能提供了有前景的解决方案，这种方法可以通过递送缺陷基因的功能性拷贝、引入治疗性基因，或直接编辑基因组DNA以纠正突变，从而实现治疗目标。已有多项临床试验正在进行或已完成，为患者带来了希望。  莱伯先天性黑蒙2型（LCA2） >>> LCA2是一种由RPE65基因突变引起的严重遗传性视网膜疾病。基于AAV的基因治疗Ⅰ/Ⅱ期临床研究结果证明了其在治疗LCA2方面的安全性和有效性，为更进一步的临床试验奠定了坚实基础。 在LCA2的AAV基因治疗中，最重要的突破是voretigene neparvovec-rzyl（商品名：Luxturna）的开发，这是一种携带RPE65基因功能拷贝的AAV2载体，也是首个获美国FDA批准用于治疗遗传性疾病的基因疗法。在一项具有里程碑意义的Ⅲ期研究中，共有31名与RPE65相关的IRD患者参与了试验。研究结果显示，voretigene neparvovec显著改善了患者的功能性视力。干预组患者在接受治疗后1年的多亮度移动性测试（MLMT）得分平均提高了1.8个光级，而对照组仅提高了0.2个光级（p=0.0013）。此外，65%的接受治疗的患者在最低光级下达到了最大改善。值得注意的是，该疗法未报告与产品相关的严重不良事件。这些改善效果在后续的3至4年长期随访中得以持续保持，进一步证明了voretigene neparvovec在安全性和疗效上的可靠性。  脉络膜病变（CHM） >>> CHM是一种由CHM基因突变引起的X连锁隐性遗传性疾病，主要病理特征是光感受器、RPE和脉络膜逐渐退化。2011年，首项使用编码Rab伴随蛋白1（REP1）的rAAV2载体进行CHM基因治疗的临床试验启动，此后多项多中心临床试验陆续开展。在首项临床试验中，六名患者接受了眼底注射治疗，结果显示治疗后6个月内，患者平均视力提高了3.8个字母，视网膜敏感性的改善与每平方毫米存活视网膜的给药剂量呈剂量依赖关系。在为期3.5年的随访中，2/6患者的视力改善得以维持，而未治疗眼的视力在基线时表现更好。另一项研究对12名患者的疗效进行了评估，发现患者的最佳矫正视力（BCVA）平均提高了5.5个字母，但有两名患者出现了并发症，分别导致视力下降了15个字母和14个字母。此外，其他三项使用相同载体但更高剂量的临床试验报告了不同的视力改善结果，改善范围从0±7.5个字母到2±4个字母不等，这些变化在治疗后2年内发生。然而，在另一项临床试验中，治疗后2年内未见显著视力改善，但有两名患者报告出现了不良反应，包括结膜下出血和眼内压变化等。尽管各项试验结果差异较大，CHM的基因治疗研究已进入随机、双盲的Ⅲ期试验阶段，即STAR研究，这项研究评估了timrepigene emparvovec（BIIB111/AAV2-REP1）的安全性和疗效，研究对象为成年男性CHM患者，分为高剂量组（1.0×10^¹¹ vg/眼；n=69）、低剂量组（1.0×10^10 vg/眼；n=34）和未治疗对照组（n=66）三组，随访期为12个月。结果显示，试验未能达到主要终点，即BCVA的显著改善。在高剂量组中，65名患者中有3名（5%）改善了至少15个字母，低剂量组34名患者中有1名（3%）达到该标准，而对照组的62名患者中无人达到上述改善。安全性结果与之前的研究一致，但疗效的差异性仍是未来研究的重要关注点。  视网膜色素变性（RP） >>> RP是一类具有遗传异质性的遗传性视网膜病，由80多个不同基因的突变引起，其主要特征是光感受器的逐渐退化，最终导致视力丧失甚至失明。 RPGR基因突变是X连锁视网膜色素变性（XLRP）最常见的原因。XLRP主要影响男性，表现为光感受器和RPE细胞功能受损，导致视力的逐渐下降。近年来，针对RPGR基因的AAV基因治疗取得了显著进展，目前已有多项临床试验正在进行。其中最具代表性的是一项Ⅰ/Ⅱ期研究，使用AAV8载体递送经过密码子优化的RPGR基因（AAV8-RPGR）。初步结果显示，该疗法具有良好的安全性和潜在的疗效，多名参与者的视力和视网膜敏感性均有所改善。重要的是，该疗法具有良好的耐受性，未观察到剂量限制性毒性。此外，XIRIUS基因治疗试验的事后分析以及XOLARIS XLRP自然病史研究显示，一些患者在接受cotoretigene toliparvovec（BIIB112/rAAV8-RPGR）视网膜下注射后，视网膜敏感性和低亮度视力在12个月内表现出持续的改善。然而，Ⅱ/Ⅲ期XIRIUS试验未能达到主要终点，即治疗后12个月内，通过微视野检查（10-2网格）在16个中心点中至少5个点的视力提高7 dB以上。目前，其他临床试验正在积极探索不同的AAV载体，以进一步优化RPGR基因治疗在XLRP中的疗效。一项Ⅰ/Ⅱ期试验（NCT03252847）研究了AAV5-hRKp.RPGR在与RPGR相关的XLRP男性患者中的效果，研究结果表明，该疗法安全且耐受性良好，未观察到剂量限制性事件，大多数不良事件为短暂性且与手术操作相关。在治疗第26周，与对照组相比，治疗组的视网膜敏感性和功能性视力均有改善，第52周也观察到了类似趋势。这些结果支持进一步的Ⅲ期临床试验研究。   由核受体亚家族2组E成员3（NR2E3）基因突变引起的常染色体隐性视网膜色素变性以光感受器退化为主要特征，导致视力逐渐丧失。NR2E3基因在维持视杆细胞和视锥细胞的平衡中发挥关键作用，其突变可能导致夜盲、周边视力下降，最终影响中心视力。针对NR2E3相关RP和视紫红质（RHO）相关RP的基因治疗药物OCU400（AAV5-hNR2E3），在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中共招募了18名受试者。研究结果表明，低剂量和中等剂量治疗具有相对良好的安全性，大多数不良事件在几周内得到缓解。疗效方面，86%的RHO相关RP受试者在视觉功能上表现出稳定或改善，在移动性测试中亮度级别提升了多达3个等级。然而，对于NR2E3突变的受试者，尚未观察到显著改善。这些结果需要进一步研究和验证。 与磷酸二酯酶6B（PDE6B）相关的视网膜色素变性由PDE6B基因突变引起，该基因编码视杆细胞cGMP磷酸二酯酶的β亚单位。PDE6B基因的突变会导致视杆细胞功能障碍和退化，表现为视力的逐渐丧失，早期症状包括夜盲和周边视力下降，最终可能发展为完全失明。基于AAV5载体的基因治疗药物CTx-PDE6b在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中的12个月随访结果显示，该疗法在所有17名患者中均具有良好的耐受性。在病情相对较轻的六名患者中，接受较高剂量治疗的亚组在多个临床终点上表现出显著的视觉功能改善，包括最佳矫正视力、视野范围、微视野检查结果，以及光学相干断层扫描（OCT）显示的视网膜结构改善。这些结果为该疗法的进一步临床开发提供了有力支持。 另一个正在开发基因治疗策略的遗传性视网膜疾病是由MER酪氨酸激酶（MERTK）基因突变引起的疾病。MERTK在RPE的吞噬作用中起关键作用，其功能缺失会导致光感受器退化，最终引发视网膜色素变性。这种常染色体隐性遗传疾病约占视网膜色素变性病例的3%。一项Ⅰ期研究评估了通过眼底注射递送rAAV2-VMD2-hMERTK的安全性，受试者为6名患者，给药剂量分别为150μL和450μL。在长达2年的随访中，结果显示该治疗安全性良好，未观察到与基因载体相关的重大并发症，尽管部分患者出现了轻微的眼部不适。在疗效方面，3名患者在手术后视力有所改善，但其中2名患者在2年时失去了这种改善。这表明该治疗可能具有一定的效果，但临床表现存在不确定性。 视黄醛结合蛋白1（RLBP1）基因的双等位基因突变会导致罕见的常染色体隐性视网膜营养不良，包括视网膜色素变性及其他相关疾病，主要特征为夜盲、暗适应时间延长，以及视力逐渐丧失。目前，报道了约160例病例，主要集中在瑞典和加拿大。由于缺乏自然病史研究，对疾病进展的了解有限，患者预后仍然不理想。目前正在开展针对CPK-850的临床试验。这是一种基于AAV的基因治疗，旨在验证其在人体中的应用效果。研究通过单次眼底注射，评估CPK-850的最大耐受剂量，并探讨其在改善RLBP1相关RP患者视觉功能方面的安全性和潜在疗效。截至目前，该试验暂未公布明确的研究结果。 除了基因替代或基因编辑方法外，光遗传学等独立于遗传突变的治疗策略也被用于研究治疗视网膜色素变性。光遗传学通过将光敏蛋白引入存活的视网膜细胞（如双极细胞或神经节细胞），使这些细胞能够对光刺激产生反应。借助外部光源，这些经过修饰的细胞可以被激活，从而有可能恢复光感受器退化患者的视力。在一项针对RP患者的开创性临床试验中，患者接受了递送光遗传学基因的载体GS030-DP（rAAV2.7m8-CAG-ChrimsonR-tdTomato）治疗，并通过工程化眼镜提供光刺激。结果显示，患者能够感知、定位、计数并触摸各种物体。同时，多通道脑电图记录显示治疗眼在视觉皮层上方检测到与物体相关的活动。近期的研究进展包括一项2b期临床试验的初步结果，试验中使用编码视蛋白的MCO-010（通过rAAV2载体），通过玻璃体内注射递送至RP患者，特异性靶向ON双极细胞。结果令人鼓舞，该干预显著改善了患者的视力，且未报告严重的眼部或全身不良事件。这些研究结果表明，光遗传学策略在治疗RP导致的视力丧失方面具有创新性和潜在的有效性。此外，这种策略还可能适用于其他眼科疾病的治疗，以及不同致盲原因的干预。  Leber遗传性视神经病变（LHON） >>> LHON是一种母系遗传的线粒体疾病，主要导致视力逐渐丧失甚至失明，通常发生在年轻男性中。约90%的LHON病例由三种关键的点突变引起，这些突变位于MT-ND1、MT-ND4和MT-ND6线粒体基因中，导致视网膜神经节细胞凋亡，最终引发严重的视力损害。早期的基因治疗试验中，研究评估了通过玻璃体内注射递送编码密码子优化的MT-ND4基因的rAAV2载体的治疗效果。该载体包含CMV启动子、人类细胞色素c氧化酶10（COX10）基因的顺式作用元件，以及5'端的线粒体定位序列，确保mRNA翻译及蛋白的线粒体共定位。在一项Ⅰ期临床试验中，28名患者接受了单侧玻璃体内scAAV2(Y444,500,730F)-P1ND4v2基因治疗，剂量分别为5×10^9、2.46×10^10和1×10^11 vg/眼，总共三组。视力结果显示差异：部分患者的最佳矫正视力有所改善，但同时观察到显著的视网膜变薄，且稳态视觉诱发电位的振幅未见明显变化。此外，29%的患者发生偶然性葡萄膜炎，主要集中在高剂量组，但未引发长期视力丧失。在一项命名为REVERSE的Ⅲ期临床试验中，37名在过去6至12个月内出现视力丧失的LHON患者接受了lenadogene nolparvovec（rAAV2/2-ND4）的玻璃体内注射治疗。到96周时，25名受试者至少有一只眼睛的最佳矫正视力较基线期有显著的恢复，而29名受试者在两只眼睛的视力均有改善，且未报告严重不良事件。另一项名为RESCUE的Ⅲ期临床试验的结果与此类似，38名患者接受lenadogene nolparvovec注射，96周随访显示，注射眼与未注射眼的视力改善情况相当。此外，一项使用rAAV2/2-ND4的长期研究中，对9名LHON患者的随访结果显示，疾病发作后1至2年的较年轻患者的视力恢复程度更加显著。这些研究结果突出了治疗慢性LHON的挑战，并强调了需要更多对照试验以明确基因治疗的真实效果。目前LHON基因治疗试验结果的差异性，可能部分来源于患者群体、治疗介入的疾病阶段以及试验设计的差异。因此，未来有必要进行更大规模的随机对照试验，以全面评估LHON基因治疗的安全性和有效性。  全色盲 >>> 全色盲，也称为全色觉缺失，是一种常染色体隐性遗传的遗传性视网膜病，主要影响负责高分辨率昼视觉的视锥细胞。高达90%的全色盲患者携带循环核苷酸门控通道亚单位α3（CNGA3）或β3（CNGB3）基因的突变，这些基因分别编码循环核苷酸门控（CNG）通道的关键亚单位，而这些通道对视锥细胞的光转导功能至关重要。 基因替代疗法策略通过rAAV载体递送编码CNGA3或CNGB3的基因，已在多种动物模型中成功进行概念验证，结果显示能够恢复视锥细胞的功能。在评估AAV8.CNGA3基因治疗针对CNGA3相关全色盲的临床试验中，九名患者接受了单次不同剂量的眼底注射，并进行了12个月的随访，结果表明治疗具有良好的安全性，未发生严重不良事件，所有治疗眼均显示视锥细胞功能改善，平均视力提高了2.9个字母，对比敏感度平均增加0.33 log单位，显示出该疗法对治疗此类疾病的潜在益处。 在一项关于CNGA3相关全色盲基因治疗后皮层可塑性的研究中，两名成年患者显示了轻微的改善，包括光敏感度降低和周边视力增强，其中一名患者获得了检测红光的能力。功能性磁共振成像（fMRI）分析显示，治疗眼的感受野大小有所缩小，表明皮层发生了一定程度的适应。然而，未观察到特定颜色相关皮层区域的激活，这可能是由于视锥细胞功能未完全恢复，或是成人皮层处理新输入的视锥细胞信号存在难度。 一种新兴的多模态研究方法表明，基因治疗可以在10至15岁患有CNGA3和CNGB3相关全色盲的儿童中激活休眠的视锥细胞介导通路，恢复视锥细胞的功能。在接受了表达密码子优化人类CNGA3基因的rAAV载体治疗（启动子为PR1.7视锥视蛋白启动子，载体名称为rAAV2tYF-PR1.7-hCNGAco）的四名患者中，有两名患者在治疗后视锥细胞介导的视觉功能和视觉皮层的视网膜拓扑结构显著改善，而未治疗对照组未观察到类似效果。这些证据表明基因治疗可在儿童时期诱导神经可塑性，并部分恢复视锥细胞功能。  莱伯先天性黑蒙10型（LCA10） >>> LCA10是一种常染色体隐性遗传的纤毛病，导致儿童早期出现严重的视力损害或失明。在LCA10患者中，最常见的突变是c.2991+1655A>G，该突变位于中心体蛋白290（CEP290）基因的内含子区域，形成了一个隐秘剪接供体位点。CEP290是一种大型蛋白，位于视锥和视杆细胞的纤毛过渡区，在初级纤毛的形成和稳定中起着至关重要的作用，它调控光感受器内外节之间的蛋白质运输，这对于光转导和光感受器功能非常关键。由于CEP290基因的尺寸较大，传统的基因替代疗法并不适合治疗LCA10，而CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了一种有前景的方法，用于纠正该剪接突变。在一项研究中，利用携带自限制CRISPR/Cas9系统的双rAAV载体成功敲除了小鼠视网膜中CEP290基因的一个内含子片段。 2020年，一项具有里程碑意义的临床试验启动，通过眼底注射递送CRISPR/Cas9系统（EDIT-101），旨在去除LCA10患者视网膜细胞中的CEP290突变。这是一项Ⅰ/Ⅱ期、开放标签、单剂量递增研究，共招募了14名3岁及以上因IVS26变异导致CEP290相关LCA10的患者。主要研究目标是评估治疗的安全性，结果显示未观察到严重不良事件或剂量限制性毒性效应。在12名成人和2名儿童中，有64%的患者在关键的次要指标上取得了显著改善，包括最佳矫正视力、视网膜敏感性和移动性测试得分。此外，6名患者在与视力相关的生活质量上也表现出改善。这些结果为进一步研究CRISPR/Cas9体内基因编辑技术治疗由IVS26变异引起的遗传性视网膜疾病提供了有力支持。  X连锁视网膜劈裂症（XLRS） >>> XLRS是一种发育性遗传性视网膜病，主要表现为视网膜腔隙形成、突触功能障碍和视力下降，并易导致视网膜脱落，最终严重损害视力。该病通常在年轻男性中发病，并随着年龄增长逐渐加重。XLRS由视网膜劈裂蛋白1（RS1）基因突变引起，而RS1基因在视网膜结构的正常发育和维持中发挥着重要的细胞粘附功能。 XLRS的基因治疗旨在将RS1基因的功能拷贝递送至受影响的视网膜细胞。目前已有多项临床试验评估了相关基因治疗的安全性和疗效。在一项Ⅰ/Ⅱa期临床试验中，9名男性XLRS患者接受了玻璃体内递送的AAV8-RS1治疗，剂量分别为1.0×10^9、1.0×10^10或1.0×10^11 vg/眼。研究结果显示，该疗法总体耐受性良好，与剂量相关的炎症可以通过使用皮质类固醇得到有效控制。尽管未检测到针对RS1的抗体，但随着剂量增加，抗AAV8的系统性抗体水平有所升高。在一名患者中，视网膜腔隙曾暂时闭合，这提示需要进一步优化剂量和免疫抑制方案，以提升治疗的安全性和有效性。 一种新的治疗XLRS的方案ATSN-201正在被开发。该疗法采用一种新型AAV.SPR衣壳，用于高效特异性递送RS1基因至视网膜，尤其是靶向通常发生劈裂腔隙的中央视网膜区域。AAV.SPR衣壳能够从眼底注射点向侧方扩散，因此无需直接注射至黄斑这一敏感区域，从而减少视网膜损伤的风险。在正在进行的Ⅰ/Ⅱ期LIGHTHOUSE研究中，ATSN-201显示出良好的安全性，未报告严重不良事件。在首批接受治疗的3名患者中，有2人在给药后8周内显示出视网膜劈裂的显著改善，这种改善持续至24周。这些结果表明，ATSN-201有潜力成为一种安全有效的XLRS治疗方案。  比埃蒂结晶样营养不良（BCD） >>> BCD是一种进行性、罕见的常染色体隐性遗传性视网膜病，其主要特征是在视网膜色素上皮层形成大量闪亮的黄白色结晶沉积物。BCD的发生是由于细胞色素P450家族4亚家族V多肽2（CYP4V2）基因的功能丧失突变，该基因参与脂肪酸和类固醇的ω-羟基化代谢。 在体外和体内模型中，研究者已尝试通过基因替代策略，利用rAAV2递送功能性CYP4V2基因，成功恢复基因功能。一项临床研究评估了NGGT001（一种基于AAV的基因治疗方案）用于治疗BCD的疗效和安全性。结果显示，治疗后9个月内，患者的平均视力提高了12.8 ± 3.7 ETDRS字母，其中46%的患者视力提升超过了15个字母。此外，该疗法耐受性良好，仅观察到与眼底注射相关的轻微、自限性不良事件，未发生眼内炎症。 在另一项使用rAAV2/8-hCYP4V2进行BCD基因治疗的试验中，结果同样令人鼓舞：77.8%的治疗眼在治疗第180天时显示出最佳矫正视力的改善，平均提升9.0 ± 10.8个字母；到第365天，80%的治疗眼进一步改善，平均增加11.0 ± 10.6个字母。研究中共记录了73起治疗过程中出现的不良事件，但大多数为轻度至中度，并未观察到严重的治疗相关不良事件或免疫毒性。值得注意的是，在未治疗的对侧眼也观察到了轻微的BCVA改善。这一现象在此前几项IRD基因治疗临床试验中也有类似报告，可能与以下因素相关：视觉皮层的激活、大脑的可塑性反应，或基因载体扩散至对侧眼的影响。这些发现为BCD基因治疗的进一步研究提供了重要支持。 常见获得性或多因素视网膜疾病 尽管许多临床试验的结果令人鼓舞，但由于每种罕见的单基因遗传性视网膜病患者数量较少，基因治疗的成本显著偏高。相比之下，针对常见的获得性视网膜疾病的基因治疗可能会为更多患者带来积极影响，同时也有望降低治疗成本，从而提高患者的可及性。 01 年龄相关性黄斑变性（AMD） AMD的晚期阶段通常表现为视网膜地理性萎缩（GA）和/或新生血管形成，是发达国家中导致失明的主要原因。对于新生血管性AMD，目前的主要治疗手段是靶向血管内皮生长因子（VEGF），这一关键的血管生成因子在视网膜新生血管形成的发病机制中起重要作用。尽管抗VEGF治疗在减缓许多AMD患者的疾病进展和改善视觉功能方面取得了显著成效，但其需要每月注射，这对患者和医疗系统都带来了较大的治疗负担。此外，部分患者对抗VEGF药物并无显著反应。 基因添加疗法通过rAAV递送相关基因，有望提供持续的内源性生物因子，从而避免重复眼内注射，因此，针对地理性萎缩和新生血管性AMD的rAAV基因治疗正在成为研究热点。 地理性萎缩是一种与AMD相关的晚期且不可逆的黄斑区病变。它是干性AMD的一种表现形式，主要特征是RPE、光感受器细胞以及脉络膜毛细血管的萎缩和丢失，这种病变通常表现为外层视网膜的进行性萎缩，导致患眼视力逐渐下降，直至中心视力不可逆性丧失。GA的病变区域形状不规则，类似地图，因此得名“地理性萎缩”。GT005 是一种一次性基因治疗方案，利用rAAV2递送编码补体因子I（CFI）的基因，旨在通过眼底注射治疗AMD继发的GA。在GT005的Ⅰ/Ⅱ期FOCUS研究中，结果显示该疗法的耐受性良好，并在少数患者中减缓了GA的进展。基于这些初步结果，又启动了两项更大规模的Ⅱ期试验，EXPLORE和HORIZON，以评估GT005在更广泛人群中的疗效，包括携带高风险CFI基因变异的患者。早期数据显示，GT005可能在遗传易感患者中减缓病变进展。然而，尽管结果令人鼓舞，进一步分析认为该疗法未能满足继续开发的效益-风险标准，因此GT005的开发已被终止。 类似地，OCU410 基因治疗使用AAV载体，通过眼底注射递送RAR相关孤儿受体A（RORA）基因，以治疗干性AMD。RORA基因参与脂质代谢和炎症调节。OCU410目前正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验，这是一个开放标签、剂量探索研究。试验设置了低（2.5×10^10 vg/mL）、中（5×10^10 vg/mL）和高（1.5×10^11 vg/mL）三个剂量水平，所有剂量队列均已完成给药。试验的主要目标是评估安全性，次要目标是探索该疗法在减缓GA进展方面的潜在疗效。目前长期研究仍在进行中，目的是监测视力保护和疾病进展的情况。 另一种针对新生血管性AMD的基因添加疗法，利用rAAV2通过玻璃体内或眼底注射递送sFlt-1基因，该基因的表达产物是VEGF的抑制蛋白，由Flt-1（VEGF受体1）的第2结构域与人类免疫球蛋白G1的Fc片段融合而成。在Ⅰ期剂量递增试验中，玻璃体内注射rAAV2-sFlt-1在52周随访中表现出良好的安全性和耐受性，但其sFlt-1的表达水平和治疗效果存在差异，这种差异可能与抗渗透性和抗AAV2血清抗体的存在有关。在Ⅰ期和Ⅱa期随机对照试验的合并分析中，相同载体通过玻璃体内注射给药，在老年患者中显示出良好的耐受性。试验暂未观察到显著的视力改善。 RGX-314是一种利用rAAV8递送编码抗VEGF单克隆抗体片段的基因疗法，通过眼底注射治疗新生血管AMD。在Ⅰ期ASCENT试验的初步评估中，该疗法显示出良好的安全性和耐受性。研究发现，治疗的有效性与剂量相关，部分患者在治疗后长达18个月无需额外的抗VEGF注射。 ADVM-022是一种通过玻璃体内注射，使用工程化的AAV2.7m8载体递送编码aflibercept蛋白cDNA的基因疗法。Aflibercept蛋白是一种阻断VEGF信号通路的可溶性诱饵蛋白。在Ⅰ期OPTIC试验中，92周随访数据显示，超过80%的患者在接受治疗后不再需要额外的抗VEGF注射。该疗法不仅表现出良好的安全性，还在治疗效果和持续性方面展现出显著优势，为新生血管AMD的治疗带来了潜在的变革。 4D-150是一种针对湿性AMD和糖尿病性黄斑水肿（DME）的基因疗法，利用工程化的R100 AAV衣壳，通过玻璃体内注射高效感染整个视网膜，递送表达aflibercept和VEGF-C抑制性RNAi的双重转基因载体，靶向VEGF A、B、C及胎盘生长因子（placental growth factor, PIGF）。在Ⅱ期PRISM试验中，共有51名高治疗负担（在之前的12个月里，平均接受了10次抗VEGF注射）的湿性AMD患者参与研究，接受高剂量（3×10^10 vg/眼）或低剂量（1×10^10 vg/眼）的4D-150治疗或aflibercept注射作为对照。结果显示，4D-150疗法具有良好的安全性，未发生显著眼内炎症，并成功减少了类固醇的使用。在高剂量组中，患者年度抗VEGF注射率减少了89%，其中84%的患者仅需0次或1次补充注射，63%的患者在24周内无需任何额外注射。此外，患者的视力和中心视网膜厚度（CST）均保持稳定。基于这些积极结果，该疗法计划在2025年第一季度启动Ⅲ期试验。 02 糖尿病性视网膜病变（DR） DR是糖尿病患者常见的并发症，也是发达国家主要致盲的原因之一。DR主要包括增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和糖尿病性黄斑水肿（DME）两种类型。其中，PDR的特征是视网膜内异常新生血管的生长，而DME的特点则是黄斑区域的视网膜血管发生渗漏，引发水肿。目前，针对DR的rAAV基因治疗的临床研究主要集中于通过内源性表达治疗性蛋白来干预，其中许多研究的靶点是VEGF。 与新生血管性AMD类似，RGX-314也正在开发用于治疗糖尿病患者。在正在进行的Ⅱ期ALTITUDE试验中，通过脉络膜上注射给药，RGX-314在两个剂量水平的50名患者中显示了良好的安全性，未报告任何与药物相关的严重不良事件。治疗一年后，接受高剂量治疗的患者中有70.8%在糖尿病视网膜病变严重性评分（DRSS）上改善了至少1级，而对照组仅为25%。此外，该疗法将威胁视力事件的风险降低了89%，且没有接受治疗的患者在DRSS评分上恶化2级或以上，而对照组这一比例为37.5%。目前，RGX-314在DME中的应用也在进一步开发中。 此外，ADVM-022也正在DME患者中开展研究，通过玻璃体内注射评估其安全性和疗效（INFINITY试验）。然而，一名接受高剂量（6.0×10^11 vg/眼）治疗的患者出现了低眼压的严重不良事件。在接受高剂量治疗的12名患者中，有5人在治疗后的16至32周内经历了额外的不良事件，包括快速且临床相关的眼内压下降，这些不良事件对类固醇治疗无反应。其中一例严重不良事件发生在高剂量组患者治疗后30周，使得试验申办方暂停试验并进行进一步分析。尽管如此，早期试验（如湿性AMD的OPTIC研究）显示，ADVM-022显著降低了治疗负担，且总体耐受性良好。然而，研究揭示了DME和新生血管性AMD患者之间的显著差异，尤其是在低剂量（2.0×10^11 vg/眼）和高剂量（6.0×10^11 vg/眼）水平下的表现也存在明显不同。这表明，湿性AMD和DME可能具有不同的病理生理机制及相关风险因素。 目前，尽管ADVM-022的剂量限制性毒性的确切原因尚不明确，但推测与DME患者常见的基础疾病有关。DME患者通常伴有严重的血管病变，这可能引发炎症因子增加，导致血管通透性升高和血-眼屏障受损。一项研究发现，编码抗VEGF基因的AAV2.7m8载体在小鼠视网膜中对血管鞘病理具有剂量依赖性影响，这与人类的血管炎表现类似，血管炎症通常伴有免疫细胞浸润。这表明，在接受ADVM-022治疗的患者中观察到的严重不良事件，可能是基础疾病引发的炎症加剧和VEGF功能抑制共同作用的结果，这种双重影响可能随着时间的推移加重疾病相关的炎症反应。 AAV作为眼科基因治疗的主要平台，在临床试验中取得了显著成果，但仍面临诸多挑战，相信通过不断优化载体设计和递送技术，AAV将在眼科基因治疗领域发挥更大的潜力。派真CRO &CTDMO 一站式服务平台，提供从基因合成、载体构建，到病毒包装的整体解决方案，全面支持您基因编辑研究，还可提供从研究至GMP级别的多种AAV血清型载体，助力眼科疾病基因治疗。 参考资料：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.ymthe.2024.10.017 关于派真生物