Cell | 颜宁/高帅/宋晨合作阐明多种药物和毒素作用于L型钙通道Cav1.2的分子机制

2023-11-16

临床3期临床结果

2023年11月15日，颜宁教授和武汉大学高帅教授以及北京大学宋晨研究员在Cell杂志上联合发表标题为“Structural basis for human Cav1.2 inhibition by multiple drugs and the neurotoxin calciseptine”的文章。本文解析了Cav1.2与匹维溴铵（pinaverium bromide，PIN）等多种药物，以及天然毒素CalciSeptine（CaS）的高分辨复合结构。PIN是一种临床上用于缓解肠易激综合征症状的抗痉挛药物。CaS则来源于黑曼巴蛇的毒液，包含60个氨基酸，是首个被鉴定出来的特异性针对LTCC的毒素。本文阐明了PIN和CaS的作用机制，同时也揭示了Cav1.2在失活过程中存在多种构象，是该研究领域的又一重要进展。图1 CaS坐落在孔道结构域的肩膀上由于全长的Cav1.2不具备生理功能，作者选用了第21个外显子缺失的isoform 4（iso 4）来进行研究。此外作者发现将iso 4的前90个氨基酸截短之后能显著提高蛋白质的表达水平和改善蛋白性质，并且不影响通道的生理功能，因此作者接下来用这个截短体作为研究对象。首先作者解析了Cav1.2（Cav1.2Apo），以及Cav1.2与抗心律失常药物胺碘酮（amiodarone，AMIO）和抗病毒药物索非布韦（sofosbuvir，SOF）复合体（Cav1.2AS）的高分辨率结构。作者发现两者高度相似，令人意外的是在这两个结构中VSDII都呈向下的构象，这与Cav1.1和Cav1.3的结构中VSDII向上这一现象存在明显区别。接下来作者解析了Cav1.2与CaS的复合结构（Cav1.2CaS），CaS坐落在PD的肩膀上，与III、IV重复的P2螺旋和细胞外环（extracellular loops, ECLs）相互作用，这个结合界面和特异性的结合位点通过电生理实验进行了验证。Cav1.2CaS的构象与Cav1.2Apo高度相似。值得注意的是，CaS的抑制机制明显不同于许多其他多肽阻滞剂：CaS远离Ca2+流入的通道、不与任何VSD直接接触、不改变蛋白的整体构象，这意味着CaS是通过稳定失活态来阻碍通道活性的。图2 PIN使Cav1.2的构象发生变化在Cav1.2与PIN的复合结构（Cav1.2PIN）中观察到了两团密度：一团密度穿过胞内激活门（intracellular gate），与GDN吻合；另一团密度在胞内激活门附近，楔入由III、IV重复的S6和S4-S5限制环形成的角，与PIN吻合。随后作者分别将与这两团密度相互作用的关键氨基酸位点进行了突变，发现只有第二团密度相关的突变会影响与PIN的结合能力，证明了在结构中观察到的以上结果。值得注意的是，结合PIN之后Cav1.2的构象发生了明显的变化：VSDII向上，I-III重复朝向远离中央孔区的方向移动从而使得结构变得更加松弛。例如胞内激活门变宽之后能插入一个GDN小分子，SF和PD变得更加疏松。作者进一步探讨Cav1.2PIN的疏松构象是否属于钙通道的开放态。为了回答这个问题，作者进行了分子动力学模拟，然而实验结果表明Cav1.2PIN不通透钙离子，意味着钙通道仍然处于关闭状态。考虑到所有的VSD结构域都向上，作者认为Cav1.2PIN属于另一种失活构象。最后，作者把CaS和PIN与Cav1.2共同孵育后制备样品并解析电镜结构，最终只能得到Cav1.2分别与PIN或CaS结合的复合物，意味着这两者与Cav1.2的结合不兼容。图3：L型钙通道存在多种失活态构象综上，本文阐明了抗痉挛药物匹维溴铵等多种药物和天然毒素CalciSeptine的作用机制，发现LTCC存在多种失活态构象，加深了对钙通道失活过程的理解。结合先前对钙通道系统的结构生物学研究，为未来以计算机预测为基础的药物设计等研究奠定了重要基础。原普林斯顿大学教授、现清华大学讲席教授、北京生物结构前沿研究中心研究员、深圳医学科学院院长颜宁，武汉大学药学院高帅教授，北京大学定量生物学中心宋晨研究员为本文的共同通讯作者。武汉大学药学院高帅、姚霞教授（二人之前为颜宁教授在普林斯顿大学的博士后），清华大学生命学院博士后陈姣凤为本文的共同第一作者。西湖大学博士后黄高兴宇，普林斯顿大学博士后范潇、黄健，北京大学博士生薛凌峰，清华大学生命学院博士生吴童、助理研究员李张强和靳雪芹，圣约翰大学博士生王研、王知非、于勇教授，清华大学化学系刘磊教授，深圳医学科学院潘孝敬研究员对本研究提供了重要帮助。文章致谢了普林斯顿大学冷冻电镜平台、计算平台，中国蛋白质科学研究中心清华大学分院，西湖大学超级计算机中心，北京大学生命科学中心计算平台为本文提供支持。颜宁在普林斯顿大学任教时一直获得Shirley M. Tilghman讲席教授启动经费（2017-2022年）的支持。本研究还受到北京市科委“北京新星”的项目资助。原文链接：https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell/fulltext/S0092-8674(23)01106-6本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！