【JMC】东南大学苟少华教授团队报道新型多靶点HDAC抑制剂

2024-02-06

临床研究

2024年1月23日，东南大学苟少华教授团队在Journal of Medicinal Chemistry在线发表了题为“Multitargeting HDAC Inhibitors Containing a RAS/RAF Protein Interfering Unit”的文章。在这篇文章中，他们以Rigosertib为核心骨架，通过不同的连接体引入锌离子结合基团，获得了一系列能够调节RAS蛋白与下游效应物之间信号转导的多靶向组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。其中，XSJ-10可有效诱导癌细胞凋亡，并通过抑制 RAS-RAF-MEK-ERK信号通路和 HDAC3 的乙酰化水平抑制肿瘤的生长。RAS是一种膜结合的鸟苷三磷酸(GTP)/鸟苷二磷酸(GDP)结合蛋白，在许多细胞调节过程中发挥关键作用，如细胞增殖和分化、细胞内和细胞间运输、细胞骨架调节等。RAS蛋白家族由三种不同的亚型组成，即HRAS、NRAS和KRAS。它们经常发生突变以降低GTP酶或GTP 酶激活蛋白(GAP)的活性，激活下游信号通路的级联反应，导致细胞生长失控。目前已经开发出了许多具有不同作用机制的小分子抑制剂(图1)。所有这些小分子抑制剂在临床前研究中均显示出活性，但当它们作为单一药物使用或仅靶向单一突变或野生型RAS驱动的肿瘤时，其中大多数在临床试验中被证明是无效的。因此，如何有效地开发和利用RAS靶点治疗癌症仍然是一项具有挑战性的任务。图1 靶向 RAS 或抑制由RAS 蛋白介导的信号通路的小分子抑制剂组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一类催化赖氨酸去乙酰化的关键酶，与基因转录、细胞增殖、血管生成、迁移、分化等生物过程密切相关。它们在多种肿瘤中过表达，如胃癌、肝癌、乳腺癌等。到目前为止，已经开发了许多HDAC的抑制剂，其中6种已被批准用于临床应用(图2)。然而，这些获批的HDAC抑制剂作为单一治疗剂时的治疗应用范围很窄。此外，还发现了多种副作用，如血液学毒性、心脏毒性、神经病变、贫血等。因此，迫切需要开发具有不同作用机制和广泛应用的新型HDAC抑制剂。图2 已批准的HDAC抑制剂的分子结构已知的HDAC抑制剂在结构上可分为三部分：（1）一个基于CAP的基团，用于识别HDAC的活性口袋;（2）锌离子结合基团（ZBG），在HDACs催化口袋底部螯合锌离子;（3）连接基于CAP的基团和ZBG。由于HDAC蛋白表面有一个很大的疏水区，当某些官能团或药效基团充当基于CAP的基团时，可以实现多靶点抑制。因此，以RAS抑制剂中的主要药效基团或RAS下游信号通路干扰剂为HDAC抑制剂的CAP基基团，通过引入不同的锌离子结合基团，合成可干扰RAS调控的下游信号通路的双靶点RAS/HDAC抑制剂或HDAC抑制剂，可能是克服现有RAS抑制剂不足，扩大HDAC抑制剂应用范围的有效途径。Rigosertib是一种苄基苯乙烯砜类似物，是一种ATP非竞争性的Polo样激酶(PLK1)抑制剂，也可与RAS效应器(RAF、PI3K和RALGDS)的结构域结合，导致RAS-RAF-MEK-ERK等多种信号通路被阻断。对Rigosertib的构效关系(SAR)分析表明，A环侧链上的2,4,6-三甲氧基和B环侧链上的4-甲氧基是保证其体外较高活性的基础。B环3-位不同取代基的引入只影响目标化合物的物化性质。在此基础上，作者试图通过不同的连接体将ZBG引入Rigosertib前体结构中B环的3-位置，目的是获得一系列新的多靶点HDAC抑制剂(图3)，并研究其抗癌活性和作用机制。图3 Rigosertib的分子结构及目标化合物的设计思路合成与表征作者设计并制备了两种目标化合物，一种是用邻苯二胺作为ZBG，另一种是用异羟肟酸。经过一系列化合物筛选，发现化合物XSJ-10（图4）可抑制RAS/RAF/MEK/ERK信号通路和HDAC3乙酰化水平，效诱导癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。图4 XSJ-10分子结构体外酶抑制活性和抗癌活性作者首先测试了目标化合物对HDAC1和HDAC6的抑制活性，以辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)作为对照。结果如表1所示，其中XSJ-7和XSJ-10对HDAC酶活性有明显的抑制作用，且高于对照组。表1　靶标化合物对HDAC1和HDAC6酶活性的抑制随后作者检测了目标化合物对6种不同细胞系和1种正常细胞L02的细胞毒性。其中SAHA和Rigosertib作为阳性对照。如表2所示，所有的目标化合物对测试的癌细胞都显示出强大的细胞毒性。在两种靶向化合物中，XSJ-7和XSJ-10均表现出较好的抗肿瘤活性。表2　靶标化合物对多种癌细胞系的细胞毒性细胞周期阻滞与凋亡鉴于XSJ-7和XSJ- 10具有优异的细胞毒性和酶抑制活性，作者进一步研究了它们的抗癌机制。如图5A所示，SAHA和Rigosertib主要将PANC-1细胞阻断在G0-G1期。然而，XSJ-7或XSJ-10主要将PANC-1细胞阻断在G2-M期。XSJ-7和XSJ-10在HT-29细胞中也有类似的现象，与SAHA不同(图5B)。值得注意的是，PANC-1和HT-29细胞都对化合物XSJ-7和XSJ-10高度敏感。在PANC-1细胞中，XSJ-7和XSJ-10诱导的凋亡百分比分别达到55.1%和57.4%，分别是SAHA(20.5%)和Rigosertib(41.4%)的2.68和2.79倍(图5C)。在HT-29细胞中，XSJ-7和XSJ-10诱导的凋亡率分别达到46.2和51.5%，仍高于SAHA(21.4%)和Rigosertib(34.8%)(图5D)。作者进一步验证了XSJ-7和XSJ-10诱导PANC-1细胞凋亡的能力，并选择SAHA和Rigosertib作为阳性对照。如图5G和5H所示，与对照组相比，所有化合物均能显著促进促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。它们还能促进凋亡细胞Cyt C、Caspase 9、Caspase 3和PARP的表达水平。XSJ-7和XSJ-10抑制凋亡通路的能力明显强于阳性对照。图5　细胞周期停滞和细胞凋亡测定信号通路抑制的研究阻断RAS和RAF之间的信号级联会促进MAPK信号通路中MEK和ERK蛋白的磷酸化。在PANC-1和HT-29细胞中，两种化合物对RAS、MEK和ERK1/2蛋白的表达没有影响，但对C-RAF (ser338)、P-MEK和P-ERK1/2蛋白的表达有较强的抑制作用，XSJ-10在相同浓度下表现出比XSJ-7更强的抑制能力(图6A−D)。此外，如图6G−J所示，XSJ-7和XSJ-10对PANC-1和HT-29细胞中H3和α-微管蛋白的表达无明显影响，但能有效促进这两种蛋白的乙酰化表达水平。这些结果表明，这两种化合物对细胞中HDAC3具有较强的抑制作用。综上所述，XSJ-7和XSJ-10均保留了Rigosertib对RAS/RAF的抑制作用。图6 代表性目标化合物对MAPK信号级联、H3和α微管蛋白乙酰化的调节作用体内抗肿瘤活性作者构建了HT-29异种移植BALB/c裸鼠模型，探讨XSJ-10抗肿瘤活性。Oxaliplatin是临床上应用较广泛、疗效较好的化疗药物之一，与SAHA一起做为阳性对照。从图7可以看出，这些化合物都能有效抑制肿瘤生长，在相同剂量(7.5 mg/kg)下，XSJ-10的肿瘤生长抑制(TGI)率(64.3%)略高于Oxaliplatin (63.2%)和SAHA(60.3%)。当XSJ-10的剂量增加到15 mg/kg时，其TGI达到75.2%，小鼠体重略有增加，但未表现出明显的全身毒性。且如图7E和7F所示，XSJ- 10对小鼠肿瘤中RAS、MEK、ERK1/2、H3、α-微管蛋白的表达无明显影响，但能有效促进Ac−H3和Ac-α-微管蛋白的表达，抑制c-RAF (Ser338)、p-MEK和p-ERK1/2的表达，且呈剂量依赖性。因此，XSJ-10在HT-29异种移植小鼠模型中具有较强的抗癌活性可能主要是由于其能有效抑制RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，促进H3和微管蛋白的乙酰化水平。图7 XSJ-10在HT-29异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性鉴于XSJ-10在上述HT-29异种移植小鼠模型中具有较低的全身毒性，通过增加给药频率进一步探索XSJ-10的抗肿瘤活性。以Rigosertib和Rigosertib与SAHA的物理混合物为阳性对照。如图8所示，在相同剂量(7.5 mg/kg)和给药频率（1次/天)下，XSJ-10对HT-29肿瘤模型(TGI = 70.1%)的抑制作用明显强于Rigosertib (TGI = 46.0%)，但略弱于Rigosertib与SAHA物理混合(TGI = 77.9%)(图8A、B)。XSJ-10还能以剂量依赖性的方式抑制肿瘤生长，在15 mg/kg的剂量下，最大TGI为86.7%，在体内表现出很强的抗肿瘤活性(图8D,E)。图8 XSJ-10 在HT-29 异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性体外生物活性研究表明，这些目标化合物对多种肿瘤细胞均有较强的抗增殖活性，尤其是化合物XSJ-7和XSJ-10，对不同亚型的HDAC均表现出纳摩尔抑制作用。值得注意的是，XSJ-10在HT-29异种移植小鼠模型中具有中等的PK参数，并且比Oxaliplatin、SAHA和Rigosertib具有更强的抗肿瘤活性。进一步的抗癌机制研究表明，XSJ-10通过抑制RAS/RAF/MEK/ERK信号通路和HDAC3乙酰化水平，能有效诱导癌细胞凋亡，抑制肿瘤生长。综上所述，XSJ-10作为一种新型的多靶点HDAC抑制剂，可以干扰RAS蛋白与下游效应物之间的信号转导，值得作为候选药物进一步研究。链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.3c01941声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓