mRNA序列设计经典案例：辉瑞/BioNTech BNT162b2序列解析

2024-05-10

信使RNA疫苗

导读：体外转录RNA（IVT RNA）包括mRNA、自复制RNA(saRNA)、反式扩增RNA(taRNA)和环状RNA(circRNA)，近年来在预防和治疗用生物制剂的开发中备受关注。IVT RNA是一种精心设计的序列，以模拟天然RNA转录本发挥翻译蛋白的生物学功能。IVT RNA的开发领域正在从人类拓展至动物，包括畜牧业、水产业和宠物领域。然而RNA结构不稳定，容易发生降解。合理的序列设计是提高mRNA稳定性的一种有效策略，学习商业化产品的开发策略是我们快速上手的有效方法。上篇文章中，菌菌解析了辉瑞/BioNTech开发的BNT162b2：mRNA序列设计案例分享：辉瑞辉瑞/BioNTech BNT162b2序列全解析今天菌菌将以Moderna疫苗mRNA-1273为主题，了解多样化的mRNA疫苗序列设计策略。01 mRNA-1273的编码序列设计mRNA的编码区（CDS），也称为开放阅读框（ORF），在体内翻译产生具有生物活性的目标蛋白，如病原体关键抗原、肿瘤抗原、抗体或其他功能性蛋白，CDS序列的设计和优化至关重要。CDS的设计策略主要为密码子优化，以提升蛋白翻译效率。密码子的优化包括两个水平，分别为复合密码子家族和家族内密码子优化。1.1 复合密码子家族优化对于人体内Arg编码基因来说，使用CGN的频率高于AGR密码子。然而，在病毒基因组内却恰恰相反。为抵御宿主锌指抗病毒蛋白（ZAP，基因名 ZC3HAV1）通过CpG靶点对病毒基因组的降解，病毒基因组中CGN频率较低。例如，NC_045512中的 SARS-2-Spike包含42个Arg残基，其中30个由 AGR 密码子编码，仅12个由 CGN 密码子编码。基于人类基因组和新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）编码序列的密码子偏好差异，Moderna 对mRNA-1273进行了密码子优化，将其中28个AGR密码子替换成了CGN。高表达的人类核糖体基因序列中，81%的亮氨酸由CUN编码。类似地，在mRNA-1273中，大多数（107/108）的亮氨酸由CUN编码，仅保留了一个UUR。而Moderna在Ser密码子的优化方面体现了另一种考量。理论上，AGY和UCN亚家族在编码Ser时水平相当，但相比之下，AGY更容易优化（AGC＞ AGU），因此mRNA-1273 中仅保留了3/99个UCN。1.2 家族内密码子优化进一步的家族内密码子优化方面，原则是将家族内密码子替换为高表达基因优选且被最丰富的tRNA解码的最佳同义密码子。例如，在编码Arg的密码子中，CGG被认为是CGN家族中的最优解，mRNA-1273基于此理论进行了密码子优化，仅保留了1个CGU。同样地，在谷氨酸（Glu）密码子优化方面，mRNA-1273中的GAN家族密码子全部替换成了GAG。这一策略与辉瑞/BioNTech的BNT-162b2明显不同。mRNA-1273的翻译终止信号由3种不同的终止密码子串联组成：UGAUAAUAG。当前主要以CAI（密码子适应指数）作为密码子优化的参数。经密码子优化后，mRNA-1273的CAI约为0.98，相比天然新冠病毒S蛋白编码基因（CAI＜0.7）大幅提高。02 mRNA-1273的非编码区序列设计2.1 mRNA-1273 5’ UTR序列设计5’UTR是核糖体起始翻译的结合位点，在mRNA翻译起始方面发挥重要作用，合理的5’UTR序列有助于实现mRNA的高表达。基于目前的mRNA开发产品，有3种5’UTR设计策略最为常用：第一种在mRNA疫苗的设计中最为常用，通常直接选取受用群体内高表达基因的5’UTR，例如人alpha珠蛋白的 5’UTR、鼠源alpha珠蛋白的 5’UTR或猫源DNAH2基因的5’UTR等。第二种是通过指数富集（SELEX）的方式来实现 5’UTR的系统演化，这种方法耗时且筛选难度较大。Moderna基于SELEX方法全新设计了mRNA-1273的5’UTR序列，且包括公认最优的Kozak序列GCCACCAUG。Moderna mRNA-1273的5’UTR序列5’UTR的另一种来源是使用病原体或其他病毒RNA来源的5’UTR。这一策略目前主要用于自复制RNA(saRNA)的序列设计，如日本PMDA获批的ARCT-154：全球首款自复制RNA(saRNA)传染病疫苗ARCT-154的序列解析不同的5’UTR序列可能适用于不同的mRNA编码序列、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可扫描文末二维码联系菌菌~2.2 mRNA-1273 3’UTR序列设计3’UTR的生物学功能与5’UTR类似，促进编码序列的翻译，其序列设计策略也与5’UTR的设计类似。Moderna疫苗mRNA-1273采用了人源alpha珠蛋白的 3’UTR，长度为110 nt。Moderna mRNA-1273的3’UTR序列2.3 mRNA-1273 poly(A)序列设计根据Moderna公开的专利信息，mRNA-1273的poly(A)尾由100 nt的聚腺苷酸组成。03 总结随着mRNA工艺路线的不断升级，无疑推动了各类体外转录RNA（IVT RNA）疫苗/药物的开发进程，深刻地影响生物医药领域的格局。IVT RNA的开发前景广阔，当前正在从人用药领域拓展至畜牧养殖、水产养殖和宠物领域。合理的序列设计是mRNA开发的首要目的。基于多年的技术沉淀，耀海生物开发了自有的mRNA体外转录质粒载体、建立了天然UTR和改造UTR库、自主研发了mRNA纯化工艺和检测方法，全力推动mRNA制品的研发进程。参考文献[1] Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3;9(7):734. doi: 10.3390/vaccines9070734.[2] Jeong D.-E., McCoy M., Artiles K., Ilbay O., Fire A., Nadeau K., Park H., Betts B., Boyd S., Hoh R., et al. Assemblies of Putative SARS-CoV2 Spike Encoding mRNA Sequences for Vaccines BNT-162b2 and mRNA-1273.[3] Moderna. US 2021/0228707 A1.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。