融合趋化因子可增强 HPV E6E7mRNA/saRNA疫苗的抗肿瘤疗效

2024-04-23

信使RNA疫苗寡核苷酸

导读：与人乳头瘤病毒（HPV）感染相关的癌症构成了重大的国际健康问题。宫颈癌是全球女性中第二常见的癌症，但也是发展中国家最常见的癌症。此外，全球每年有 115,000 人受到 HPV 相关头颈癌的影响。这些癌症的发生与高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染密切相关。研究表明，HPV-16 是这两种癌症的主要亚型，占宫颈癌病例的 46%–63% 和头颈癌病例的 90%。2024年3月，国内有研究者在 Molecular Cancer【影响因子：37.3】发表文章：《Genetic fusion of CCL11 to antigens enhances antigenicity in nucleic acid vaccines and eradicates tumor mass through optimizing T-cell response》，他们将趋化因子与 HPV16 E6 和 E7 抗原融合，分别制备了 DNA 疫苗、mRNA疫苗和自复制(saRNA)疫苗。结果显示，融合蛋白可诱导最强的细胞免疫反应，并表现出优异的抗肿瘤活性。25 µg CCL11-E6E7 DNA疫苗、10 µg CCL11-E6E7 mRNA疫苗、2 µg CCL11-E6E7 saRNA疫苗均表现出抗肿瘤效果。值得注意的是，saRNA疫苗的抗肿瘤效应更强，CCL11-E6E7 saRNA实现了100%的完全缓解。01背景介绍核酸疫苗可分为 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗，两者均是通过体内表达抗原来触发免疫反应。在宿主细胞中，携带抗原序列的 DNA 或者 mRNA 疫苗翻译生成抗原蛋白。胞内生成的抗原在细胞质中被蛋白酶体分解，以 MHC-I 分子-抗原肽形式激活 T 细胞毒性反应。分泌到胞外的抗原会 APC 吞噬，同时触发 T 辅助细胞或体液免疫。对于预防性或者治疗性核苷酸疫苗来说，抗原免疫原性的优劣是成功触发免疫反应的基础。mRNA 疫苗的免疫机制（图片来源：Knife’s edge: Balancing immunogenicity and reactogenicity in mRNA vaccines）在疫苗设计中，可采用以下策略来优化抗原免疫原性：序列优化：优化编码抗原的核苷酸序列，例如，密码子优化、UTR 序列等，提升 mRNA 稳定性，增强抗原表达。表位优化：疫苗中的表位被设计成能够模拟野生型抗原的关键部分，但同时也包含一些变化，这些变化可以提高免疫系统的反应能力。这样，即使个体之前对某个野生型抗原产生了免疫耐受（即免疫系统对该抗原不再有强烈反应），表位优化也能够“打破”这种耐受，促进免疫系统对抗原的交叉识别和反应。引入 MHC I 分选信号或者溶酶体/内体定位信号：MHC I 分选信号（MITD）或溶酶体/内体定位信号是一种特殊的序列，它可以被添加到疫苗中的抗原上。这些信号指导抗原进入树突状细胞内部的特定区域，如 MHC I 类和 II 类分子处理的位置。当抗原被带有 MITD 的信号引导时，它们更有可能被树突状细胞处理并呈递给 T 细胞。这样，T 细胞就可以识别这些抗原，并启动针对它们的免疫反应。引入破伤风类毒素片段：破伤风类毒素片段作为佐剂，能够促进免疫系统对疫苗中的抗原产生更强烈的反应。这是因为破伤风类毒素片段能够激活辅助性 T 细胞（CD4+ T 细胞），从而增强针对抗原的免疫记忆和长期免疫保护。然而，这种方法也可能导致免疫系统对破伤风类毒素片段本身产生强烈的免疫反应。这是由于抗原呈递的优势层次（antigenic hierarchy）影响了 CD8+ T 细胞的表型，即免疫系统可能更倾向于对破伤风类毒素片段产生反应，而不是疫苗中的其他抗原。这种现象称为“抗原优势”（antigen dominance），它可能会影响疫苗的整体效果，因为它可能会减少对疫苗中其他重要抗原的免疫反应。虽然破伤风类毒素片段的融合可以增强免疫反应，但也可能导致免疫系统过度集中于破伤风类毒素片段，而不是疫苗的主要目标抗原。这需要在疫苗设计中进行仔细的平衡和考量。融合趋化因子及受体：由于核酸疫苗的抗原表达极低，选择性靶向 APC 是提高有效生物分布和免疫原性的关键。APC 表面具有特异性受体，可被受体特异性单克隆抗体（mAb）或天然配体特异性靶向。在递送抗原时，借助趋化因子等天然配体与 APC 表面特异性受体的相互作用，可实现 APC 的激活，其优点是不诱导或微弱诱导趋化因子本身的免疫反应，并具有潜在的佐剂作用。趋化因子及其受体有助于将白细胞输送并募集到炎症部位。事实上，XCL1、CCL3 （MIP1α）、CCL5 （RANTES）、CCL7、CCL20、CCL21、CCL22、CCL25、CCL27、CCL28、CXCL10 和 CXCL13 已被证明在与病毒或肿瘤抗原融合或共同递送时可增强细胞和体液反应。然而，对趋化因子与抗原融合后免疫反应的系统评价尚未见报道。目前尚不清楚趋化因子是否对诱导细胞和体液免疫具有不同的偏好。因此，了解趋化因子融合抗原形成的免疫反应的整体情况将为开发基于趋化因子的针对病毒或肿瘤的预防性或治疗性疫苗提供有用的信息，并促进对不同免疫细胞亚群协调的理解。趋化因子影响抗原诱导的免疫反应02融合抗原DNA疫苗的设计与验证2.1 HPV E6E7抗原基因设计与优化2008 年，有研究者采用编码 E6E7 融合抗原的新型 HPV-16 DNA 疫苗在体内诱导抗肿瘤免疫。这种 E6/E7 融合抗原基因全长 818 bp，被克隆至 pVAX 表达载体。首先，他们根据 GenBank 检索到的 16 个序列比对找到 E6 和 E7 蛋白的共有序列，随后，在 E6E7 融合序列做出以下修改：高效前导序列（IgELS）被融合在起始密码子上游的框架内以促进表达。为了具有更高水平的表达，该融合基因的密码子使用适应智人基因的密码子偏倚。进行 RNA 优化，GC 含量非常高（>80%）或非常低（<30%）的区域，顺式作用基序（例如内部 TATA 盒），chi 位点及核糖体进入位点均被避开。还将p53 结合/降解所需的 E6 蛋白结构域发生突变或删除。E7蛋白与细胞视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白的结合位点发生突变。在E6和E7蛋白之间引入内切蛋白水解切割位点，以实现正确的蛋白质折叠和更好的 CTL加工。pConE6E7融合抗原序列在上述基础，研究者将趋化因子序列添加到 E6E7 的 N 末端，通过灵活的 G5SG5 Linker 连接，该连接子富含亲水性氨基酸，并增加两个结构域之间的空间分离，允许正确折叠以保持趋化因子的最佳生物活性。由于 DNA 疫苗通过肌肉注射给药，主要在注射部位表达，因此保留融合趋化因子的分泌信号肽，以实现 APC 靶向的分泌表达。大多数趋化因子来自小鼠，而对于某些趋化因子，我们在缺乏小鼠信息的情况下使用人类替代物。将融合序列克隆至 pVAX 1 质粒载体中并转染至 HEK 293 T 细胞中以检测蛋白表达。研究者总共合成 46 种趋化因子和 FMS 样酪氨酸激酶 3 配体（Flt-3L）。2.2 融合蛋白的筛选使用50μg E6E7质粒作为对照，用25μg剂量的E6E7-趋化因子融合质粒分别对动物进行免疫，以筛选真正能够增强E6E7免疫原性的趋化因子。将平均 CD8+ 特异性 T 细胞免疫反应的变化大于或等于 E6E7 组两倍的变化设置为筛选阈值，初步鉴定出包括CCL11在内的六种趋化因子具有免疫增强作用。重新评估TC-1 荷瘤小鼠中六种趋化因子的免疫原性和抗肿瘤活性。与E6E7质粒相比，所有筛选的趋化因子均表现出对免疫原性的改善，其中CCL11显示出最高的特异性CD8+T细胞水平。所有趋化因子融合E6E7组的小鼠肿瘤生长均受到抑制或逐渐根除，而单独使用E6E7质粒治疗仅显示短期生长抑制，随后出现复发。CCL11-E6E7治疗的小鼠表现出最低的平均肿瘤生长率和显著的延长生存期，5只小鼠中有4只完全缓解，其治疗效果可以重复。为了验证CCL11融合是否优于简单的共同给药，我们构建了表达CCL11的质粒并同时注射CCL11-E6E7、E6E7和CCL11以与E6E7进行比较。与E6E7治疗获得的水平相比，CCL11-E6E7 以及 CCL11 与 E6E7 的共同给药均显示E7特异性CD8+T细胞显着增加。然而，CCL11-E6E7仍然具有最高的T细胞水平，表明与CCL11的融合有利于诱导特异性 CD8+T细胞。03CCL11-E6E7 mRNA/saRNA疫苗的设计和验证由于mRNA疫苗可以解决DNA疫苗的多种不足，如免疫原性低、基因整合风险、需佐剂、细胞内递送难等。3.1 CCL11-E6E7 mRNA疫苗因此，研究者又基于常规mRNA和自复制RNA（saRNA）技术制备了RNA疫苗，以评估融合趋化因子CCL11能够增强mRNA疫苗或saRNA疫苗的抗原免疫原性。CCL11-E6E7 mRNA 显示出与 E6E7 mRNA 相同的蛋白质表达水平。接下来，将每种类型 10 µg 的 mRNA 注射到 TC-1 荷瘤小鼠的骨骼肌中。特异性 CD8+ T 细胞检测显示，CCL11-E6E7 治疗组小鼠的 CD8+ T 细胞水平约为 E6E7 组的两倍；并且，CCL11-E6E7 治疗组5/6 小鼠获得疾病相关的长期缓解，而 E6E7 组中只有 1/6 小鼠获得完全缓解。生存曲线也显示出 CCL11-E6E7 治疗组存活率得到显著提升。3.2 CCL11-E6E7 saRNA疫苗一般来说，由于更有效的抗原表达，saRNA疫苗可以比mRNA疫苗诱导更强的免疫反应。为了获得更明确的saRNA治疗效果，研究者平均体积大于100立方毫米的的较大荷瘤小鼠并用单剂量2 µg saRNA对其进行治疗。与E6E7 saRNA相比，CCL11-E6E7 saRNA的蛋白质表达略低。然而，CCL11-E6E7 saRNA表现出更强的特异性T细胞免疫反应。并未检测到非常显著的对于存活率的提升，但 CCL11-E6E7 saRNA 治疗组显示出更好的肿瘤治疗功效。L11-E6E7 saRNA 组小鼠7/7 只实现了持久的完全缓解，相比之下，E6E7 saRNA 组小鼠只有 4/7 的小鼠表现的持久完全缓解。这些结果表明趋化因子融合策略适用于 DNA 和 mRNA 疫苗的制备。04总结这项研究前所未有地将所有潜在的趋化因子与HPV16 E6/E7抗原融合表达，并系统分析了能够增强抗原免疫原性的趋化因子，从中鉴定出了几种能够显着增强抗原抗肿瘤活性的趋化因子，其中，CCL11表现出最强的抗肿瘤增强作用。一般来说，在肿瘤动物模型中，大肿瘤很难用治疗性 DNA 疫苗根除。这是由于肿瘤生长速度非常快，而 DNA疫苗诱导的有效免疫反应需要持续十天以上。然而，在这项研究的多次重复实验中，与 CCL11 融合的 E6/E7 DNA 疫苗可以消除大型 HPV16 E6/E7 肿瘤，这是以前的DNA疫苗实现不了的，证实 CCL11 是免疫原性的强大增强剂。同时，研究还验证了融合趋化因子的mRNA肿瘤治疗性和saRNA肿瘤治疗性疫苗，同样表现了去除肿瘤的效果。尤其是saRNA，使用2 µg CCL11-HPV16 E6/E7 saRNA实现了100%的完全缓解。自复制RNA(saRNA)由于其复制特性，在远低于常规mRNA的剂量下可实现相同水平的蛋白表达，可以显著降低其生产成本以及由剂量带来的不良免疫原性，因此是一种理想的预防和治疗性疫苗平台。参考文献 [1] Qi H, Sun Z, Gao T, Yao Y, Wang Y, Li W, Wang X, Wang X, Liu D, Jiang JD. Genetic fusion of CCL11 to antigens enhances antigenicity in nucleic acid vaccines and eradicates tumor mass through optimizing T-cell response. Mol Cancer. 2024 Mar 8;23(1):46. doi: 10.1186/s12943-024-01958-4. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。