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摘要:复制缺陷型病毒载体疫苗相较于传统亚单位疫苗具有多个优势，包括强大的抗体反应、对消除病原体感染细胞至关重要的细胞反应，以及在无需佐剂的情况下诱导高度免疫原性和持久的免疫反应。人乳头瘤病毒（HPV）是一种拥有超过200种基因型的微生物，在诱导人类肿瘤方面发挥着关键作用，大多数与HPV相关的恶性肿瘤都表达HPV蛋白。与HPV感染相关的肿瘤，主要是由HPV16感染引起的，包括影响宫颈、肛门、阴道、阴茎、外阴和口咽部的肿瘤。近年来，利用病毒载体开发治疗性HPV疫苗以治疗由HPV感染引起的癌前病变或肿瘤的研究迅速增长，目前有许多研究管线正在进行中。同时，筛选最佳抗原需要更多的基础研究和更优化的方法。在临床前研究方面，我们介绍了用于评估疫苗效果的各种模型，强调了它们各自的优缺点。此外，我们介绍了使用HPV病毒载体的治疗性疫苗的最新研究进展，特别是适应症、初步效果、联合用药等。总的来说，本文总结了当前病毒载体治疗性HPV疫苗在HPV感染、抗原选择、载体、效果评估和临床试验进展方面的研究情况。 介绍 已经检测到数百种人类乳头瘤病毒（HPV），它是一种常见的性传播病毒，感染男性和女性的生殖器区域，包括阴茎、外阴（阴道外区域）、肛门的皮肤，以及阴道、宫颈和直肠的内衬。大多数HPV感染是无症状的，某些高风险HPV类型可导致癌症。在全球范围内，HPV是最突出的致癌传染病之一，与多种恶性肿瘤相关，最常见的是宫颈癌。几乎所有宫颈癌病例都与HPV感染有关，特别是高危HPV类型，尤其是HPV16。HPV还与阴道、阴茎、肛门和口咽癌有关。根据最近的研究，超过五分之一的15岁以上男性感染了一种或多种高危HPV基因型。HPV预防性疫苗显示出卓越的免疫原性，可预防HPV相关癌前病变和肿瘤的发展。全球HPV疫苗接种覆盖率存在显著的区域差异。澳大利亚的HPV疫苗覆盖率在世界上是最高的，而许多中低收入国家覆盖率相对较低。尽管已有96个国家将HPV疫苗纳入国家免疫计划，但由于疫苗推广缓慢、筛查和早期诊断率低以及治疗资源有限，中低收入国家的HPV相关肿瘤负担仍然沉重。2024年5月，世界卫生组织（WHO）发布文件明确指出，HPV治疗性疫苗是消除与HPV感染相关的肿瘤的重要手段。Partha Basu等人对2022年1月31日之前的12项HPV治疗性疫苗的II/III期临床试验进行了荟萃分析，共有734名女性接受了用于CIN2/3的HPV治疗性疫苗。414名患者恢复正常或CIN1，疫苗组的总回归比为0.54（95%置信区间0.39至0.69）；而在五项随机对照试验中，接受安慰剂的166名女性的总回归比为0.27（95%置信区间0.20至0.34）。此外，Aida Petca等人分析了2018年1月至2024年1月的临床试验，发现HPV疫苗在皮肤癌和疣中也有一定的治疗效果。当然，免疫原性和效果存在差异，尽管有希望，但仍有提高效果的空间。 重组病毒载体已被用于传递特定病原体的抗原超过40年，包括腺病毒（ADV）、痘病毒、单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口炎病毒（VSV）、慢病毒载体（LV）、巨细胞病毒（CMV）、麻疹病毒（MV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）。病毒载体被设计为将抗原传递到特定的细胞和组织。病毒载体疫苗可以进一步优化，以增强在抗原传递过程中目标细胞中转基因的表达。病毒载体已在临床前和临床试验中作为针对各种传染病的疫苗，如HIV、疟疾、埃博拉病毒和Covid-19。随着Covid-19在全球的传播，包括病毒载体疫苗在内的多种疫苗平台已经蓬勃发展。基于病毒载体的治疗性HPV疫苗也已开发并进入临床试验阶段，一些产品最近宣布了最新的临床结果。本文提供了对HPV疫苗技术发展态势的深入理解，突出了所使用的载体、它们旨在针对的疾病、为最佳免疫反应选择的抗原、用于评估其效果的指标以及在临床评估中取得的显著进展。 HPV感染及其与各种癌症类型的关联 HPV感染已被确定为大多数宫颈癌病例的主要原因。此外，不同解剖部位的癌症也与HPV有关，尽管程度不同。根据2012年全球癌症数据库和五大洲癌症发病率（CI5-X）数据库，88%的肛门癌、78%的阴道癌、50%的阴茎癌、24.9%的外阴癌和30.8%的口咽癌归因于HPV。到目前为止，共有14种HPV基因型被严格归类为"高风险"，主要是因为它们诱导癌变的潜力显著增加。其中，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59被国际癌症研究机构（IARC）特别指定为1组致癌物，这突出了它们的异常威胁。此外，HPV66和HPV68也属于这一高风险类别，进一步扩大了对这些潜在危险基因型的担忧。在中国2023年进行的一项研究中，发现HPV16、58、52、33和31/18是CIN 2和CIN3队列中流行的主要高风险人类乳头瘤病毒（hrHPV）。同时，研究强调了与单纯HPV16感染相关的CIN1、CIN2和CIN3病例的细分，分别为22.06%和46.24%的CIN1和CIN2，以及显著的55.21%的CIN3。这突出了HPV16的致癌性，使其成为宫颈癌前病变和恶性肿瘤发展中最强大的hrHPV类型。HPV 16还负责大约50-80%的生殖道肛门癌，包括阴道、外阴、阴茎和肛门癌。其他导致这些癌症的常见HPV类型包括HPV 33、31、18等。此外，在口咽癌领域，HPV 16在全球范围内是被识别最多的类型，HPV 33、18、31和35紧随其后。值得一提的是，在全球范围内，HPV-16也是男性中最常见的HR-HPV类型，占5%，其次是HPV 51（3%）、HPV 52（3%）、HPV 59（2%）和HPV 18（2%）。因此，HPV 16仍然是对人类健康威胁最大的类型，当前的HPV治疗性疫苗主要针对HPV16。然而，VGX3100的临床试验，这是一种针对HPV16和HPV18的治疗性疫苗，发现持续性病变可能与其他HPV感染有关，这表明患者在治疗前可能已有混合感染。因此，未来的HPV治疗性疫苗应该旨在覆盖更广泛的HPV类型，不仅仅是HPV16。 HPV结构特征和治疗性HPV疫苗的抗原选择 HPV还会导致生殖道疣和复发性呼吸道乳头状瘤病。HPV具有大约8kb大小的环状双链DNA基因组，早期和晚期区域分别编码早期（E1、E2、E4、E5、E6和E7）和晚期（L1和L2）蛋白。晚期蛋白指的是L1（55 kDa）和L2（64-78 kDa）蛋白。每个病毒衣壳由72个L1五聚体和少量L2蛋白组成。L1是一种分子量约为55 kDa的蛋白，是病毒粒子的主要结构成分，位于衣壳的外层，L1 ORF是HPV最保守的区域。因此，L1的ORF相似度<60%被认为是传统HPV分型的依据。L2位于衣壳的内层，在病毒感染中发挥多种重要作用。L2与L1相互作用，促进衣壳组装和稳定性。此外，L2蛋白参与病毒进入宿主细胞，通过与宿主细胞膜融合相关的机制引入病毒基因组。此外，L1和L2都是预防性HPV疫苗的抗原选择。 早期HPV蛋白包括七种蛋白，E1-E7。E1是HPV基因组中最大且最保守的ORF，编码600-650个氨基酸，并参与病毒复制和转录的调控。E2蛋白增强病毒转录和稳定复制；然而，E2可以强烈抑制E6和E7蛋白的表达，并诱导HPV阳性细胞生长停滞和衰老。然而，研究已证实E2单独可以在没有HPV基因组的情况下诱导细胞p53依赖性凋亡。携带牛乳头瘤病毒E2基因的MVA载体被用于治疗。E4在HPV类型间差异很大，以类似配体的方式发挥作用。研究表明HPV E4有助于E6/E7病毒扩增。E5是一种小的、疏水性的跨膜蛋白，是一种致癌基因。E6和E7是最常用于治疗性疫苗的抗原。E6（150个氨基酸）可以降解p53以促进细胞增殖，调节TOLL样受体-9的表达。E6抑制RIG-I介导的IFN-β、趋化因子和IFN刺激基因的诱导，并介导HPV感染细胞的免疫逃逸。E7（100个氨基酸）可以降解Rb并导致肿瘤细胞增殖。 与其他肿瘤疫苗的要求一致，HPV相关肿瘤疫苗的要求是1.肿瘤细胞高表达或特异性表达抗原蛋白。2.蛋白质可以被自然加工成合适的肽以呈现。3.肽与MHC分子有高亲和力4.肽/MHC复合物与相应的T细胞TCR有亲和力。值得注意的是，人群中HLA（编码MHC蛋白）的多样性影响免疫反应的产生。研究最多的蛋白是E6和E7，已确认它们具有高细胞免疫原性，目前是HPV相关肿瘤疫苗的首选。由于E6和E7可以分别降解p53和Rb，导致肿瘤发生，E6和E7作为抗原通常被突变以消除它们的肿瘤形成能力。此外，E2和E5也被发现在肿瘤中表达并表现出良好的免疫原性，有成为疫苗的潜力。 病毒载体平台的优势 使用病毒载体作为疫苗平台可以在不需要佐剂的情况下诱导先天免疫反应。此外，类似于自然感染过程，目标细胞中的病毒载体（没有任何外部佐剂）能够激发强大的体液和细胞免疫反应。病毒感染后，目标细胞激活与抗病毒途径相关的途径，如cGAS-STING途径、IFN信号通道、TNF信号途径等。所有这些都具有协同抗肿瘤效果。同时，病毒感染可以增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，并诱导和训练巨噬细胞记忆细胞以加强肿瘤细胞监视。病毒载体激活的自然杀伤（NK）细胞也是主要的抗肿瘤细胞。此外，病毒载体携带特定抗原，可以促进人体中抗原的有效表达，促进宿主细胞的抗原呈递，激活树突状细胞（cDCs），产生强烈、持久的细胞免疫以持续清除目标细胞，从而成为治疗性疫苗的主要机制。记忆CD8+T细胞使身体能够长时间预防疾病。尽管治疗性疫苗涉及的体液免疫不是效果评估的主要部分，但越来越多的研究发现B细胞和浆细胞分泌的抗体在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，包括可以激活经典补体途径（补体依赖性细胞毒性，CDC）、杀死目标细胞并激活参与Fc受体抗体依赖性细胞毒性效应（ADCCs）的抗体。 复制缺陷型病毒载体，包括5型腺病毒、26型腺病毒、ChAdOx1、弹状病毒（VSV）、黄病毒（YF117D）、沙粒病毒和改良牛痘病毒安卡拉株（MVA）已被用作治疗HPV相关肿瘤的治疗性疫苗。由于它们的复制缺陷，病毒载体拥有广泛的临床流行病学和临床试验数据，显示出良好的安全性概况。腺病毒（Ads）是一种常用的疫苗载体，由于能够感染非分裂和分裂细胞，对不同细胞具有广泛的嗜性，由于作为附加体存在，插入致癌的低风险。然而，人群中常见的Ad5中和抗体可能会降低这类疫苗的有效性。因此，开发了罕见的血清型，如Ad26，以及非人腺病毒，如ChAdOx1。它们在人群中的血清阳性率低或没有，但与非常罕见的凝血障碍、血栓形成和血小板减少综合症（TTS）相关。MVA源自牛痘病毒，具有高容量的转基因插入能力和对哺乳动物细胞的广泛嗜性，因为感染是通过被动膜融合发生的。VSV基因组简单，可以诱导粘膜免疫；然而，它具有神经毒力的潜力。黄病毒和沙粒病毒是新兴的疫苗载体，已被用作拉沙热和埃博拉病毒疫苗。 HPV治疗性疫苗的临床前评估 与其他主动免疫治疗产品类似，在临床前阶段，治疗性HPV疫苗需要使用适当的模型进行验证，包括诱导适当的免疫反应、细胞和体液免疫以及杀死肿瘤细胞。通常在健康动物中检测免疫反应，C57BL/6和非人灵长类动物（猕猴和恒河猴）是最常用的动物种类（表1）。为了评估疫苗的肿瘤抑制效果，TC-1细胞表达HPV16-E6和-E7以及激活的Ras致癌基因，用于C57BL-6小鼠分析含HPV16 E6/E7抗原的治疗性疫苗对肿瘤微环境（TME）中免疫细胞类型的抗肿瘤效果和变化。此外，设计表达HPV6-E6的MOC1细胞用于评估PRGN-2012在C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效果。还有其他源自C57BL/6小鼠的癌细胞系：C3细胞，通过使小鼠胚胎细胞永生化和转染产生，表达完整的HPV16基因组，以及来自小鼠扁桃体上皮的mEER细胞，在更好地转化至头颈鳞状细胞癌（HNSCC）方面具有优势。然而，C57BL/6小鼠只表达H-2 Kb和H-2 Db MHC类I分子，限制了它们的类I表位库。因此，提出了开发更适用的动物模型以验证疫苗效果的建议。通过肌内（IM）注射慢病毒颗粒表达E7/HPV16转基因的比格犬已被验证为持久感染的潜在模型。与HPV16在系统发育和表型上相似的猕猴乳头瘤病毒3型（MfPV3）也适合猕猴持续生殖器感染。然而，比格犬和猕猴难以携带肿瘤，因此难以评估疫苗的抗肿瘤效果。值得注意的是，SfPV1/兔乳头瘤病毒模型，它诱导长期持续性感染和病变的恶性进展，适合于肿瘤抑制和持续性感染模型。 尽管如此，在评估肿瘤疫苗的效果时，利用动物模型不能忽视物种特异性差异。因此，迫切需要建立更好的替代评估系统，以更好地模拟人类反应。疫苗的免疫原性和肿瘤抑制效果可以在人源化小鼠中展示。然而，肿瘤细胞需要相应的HLA分子转导和抗原表达才能有效治疗。体外诱导的人外周血单个核细胞（PBMC）检测可以检测疫苗反应，样本量大，并进行体外杀伤测试；然而，这不能模拟具有复杂肿瘤细胞组成的疫苗效果测试。类器官可以更好地模拟肿瘤细胞组成和免疫抑制微环境，可以用作肿瘤疫苗抑制的补充。然而，体外测试不能有效评估疫苗剂量和程序。总体而言，建议采用多种并行评估策略进行HPV治疗性疫苗的临床前评估，基于每种评估系统的各自缺陷。 当前使用HPV病毒载体的治疗性疫苗的研究现状 随着肿瘤免疫疗法的出现，如PD-1/PD-L1抑制剂、嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）疗法、T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法等产品，体内特异性肿瘤T细胞的杀伤能力得到了进一步证实。肿瘤疫苗作为有效激活全身肿瘤反应性T细胞的治疗方式，也成为了许多研究者关注的焦点。针对HPV相关肿瘤的治疗性疫苗的开发已经进入了一个新阶段。本文总结了现有的HPV治疗性疫苗（表2）。根据最近的报告，截至2024年3月20日，只有TA-HPV（表达改良HPV-16和-18 E6和E7基因的重组牛痘病毒）和VTP-200（由ChAdOx1-HPV和MVA-HPV组成的初免-加强疫苗）已完成II期临床试验。此外，PRGN-2009处于临床II期，而Vvax-001已进入临床II期。然而，Ad-E6E7和Ad26.HPV18的I期由于抗病毒效力低和入组率低而终止。其他临床试验均未进入II期。 在I期中，TA-HPV在29名Ib期或IIa期宫颈癌患者中显示出免疫原性；8名患者产生了HPV特异性血清学反应，4名患者在单次接种后产生了HPV特异性CTLs。TA-HPV结合TA-CIN（由HPV16-E6/E7/L2组成的重组融合蛋白）显示出显著效果，10名HPV 16阳性的高级别VIN女性中有9名展示了HPV 16特异性增殖性T细胞和/或血清学反应，3名患者除此之外还展示了病变缩小或症状缓解。在27名患有3级阴道内上皮瘤变的患者和2名患有3级阴道内上皮瘤变的患者中，观察到6名患者（17%）的病变大小减少，15名（62%）的症状得到了改善。 HPV病毒载体治疗性疫苗的抗原主要是E6和E7蛋白，无论是单独的还是融合蛋白的形式。某些疫苗结合了HPV18的E6和E7蛋白，以扩大疫苗的潜在受益人群。值得一提的是，研究人员已逐渐开始应用生物信息学方法设计和构建目标蛋白，以实现对更多HPV类型的免疫覆盖：研究人员通过选择六个早期蛋白的保守区域并生成共识序列来代表五种hrHPV基因型，设计了合成基因‘5GHPV3’，并将‘5GHPV3’分别插入ChAdOx1和改良牛痘MVA载体中进行ChAdOx1-HPV和MVA-HPV[89]；PRGN-2012是建立在黑猩猩腺病毒载体平台上的，融合了通过生物信息学方法和蛋白工程选择的HPV蛋白区域，以引发针对HPV感染细胞的免疫反应。 在女性中进行了一项严格的临床试验，评估Ad26和MVA载体疫苗成分的安全性和免疫原性，这些女性患有由HPV16或HPV18引起的宫颈感染（NCT03610581）。值得一提的是，PRGN-2012适用于治疗复发性呼吸道乳头状瘤病、乳头瘤病毒感染和刺激对低风险HPV6/11类型的免疫反应的Papillomaviridae。HPV治疗性疫苗普遍用于治疗癌症和癌前病变。在肿瘤形成过程中，形成了一个免疫抑制微环境，MHC分子的下调、Treg细胞的浸润和免疫检查点蛋白如PD-L1的过度表达。治疗性疫苗能够提高系统性细胞毒性CD8+T细胞的水平，并促进肿瘤组织内CD8+细胞计数的增加。在此基础上，研究已证实，肿瘤疫苗与免疫检查点阻断（ICB）的结合可以大大提高肿瘤反应率并增强抗肿瘤免疫反应。从病毒载体HPV治疗疫苗的临床试验来看，如果选择HPV相关肿瘤作为适应症，研究人员会选择PD1/PD-L1抑制剂作为联合用药，如Atezolizumab、Pembrolizumab和Avelumab。如2020年欧洲医学肿瘤学会（ESMO）会议上所报告，在34名患有各种复发/转移性HPV阳性癌症的患者中，使用TG4001联合Avelumab进行治疗性疫苗接种后，1名患者显示出完全反应（CR），7名患者根据RECIST 1.1标准实现了部分反应。因此，肿瘤治疗性疫苗和免疫检查点抑制剂的结合代表了未来治疗的一个重要方向。 病毒载体也可以产生强大的免疫反应，包括抗肿瘤细胞免疫和中和抗体。因此，一些研究人员选择异源载体加强疫苗接种，以刺激更强的抗HPV免疫反应，类似于初免-加强疫苗ChAdOx1-HPV和MVA-HPV，以及初免-加强疫苗Ad26.HPV16和MVA.HPV16/18。 结论 本文总结了使用重组病毒载体开发治疗性HPV疫苗的进展，包括病毒载体、抗原选择、效果评估和临床试验。目前，HPV相关肿瘤疫苗主要通过诱导免疫反应和抑制肿瘤生长来实现其效果。几种基于病毒载体的治疗性HPV疫苗已进入临床试验，显示出令人满意的安全性和耐受性。此外，它们在治疗效力方面也显示出鼓舞人心的免疫原性和肿瘤抑制效果。基于病毒载体的HPV疫苗在未来的发展中具有光明的前景。 在未来的研究中，治疗性病毒载体HPV疫苗将朝以下方向发展：1. 研究更安全、更有效的病毒载体，这些载体在人群中表现出降低的毒力，同时保持感染更多APC细胞的能力，从而引发更强大的细胞免疫反应。2. 不限于E6或E7的抗原。利用生物信息学，我们旨在设计一种增强型“超级抗原”，它能够扩大对多种HPV类型的覆盖，并与更广泛的HLA分型个体兼容。在开发过程中，必须注意某些事项：1. 选择合适的平台用于体外临床前评估疫苗效力至关重要。2. 随着更多临床试验数据的可用性，HPV疫苗的治疗策略将逐渐完善。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

概要:人乳头瘤病毒（HPV）以其致癌特性而闻名，是宫颈癌的主要原因，并且显著地促进了死亡率。它还在全球头颈癌发病率的上升中扮演了相当重要的角色。这些癌症在全球范围内构成了巨大的健康负担。当前在诊断和治疗策略上的局限性，以及在中低收入国家预防性疫苗覆盖不足，阻碍了向世界卫生组织（WHO）为2030年设定的HPV预防和控制目标的进展。为了应对这些挑战，结构病毒学中的广泛研究已经探索了HPV蛋白的性质，为HPV感染机制提供了关键见解，这对于预防和治疗策略的发展非常重要。本综述重点介绍了对HPV蛋白结构理解的最新进展，并讨论了HPV疫苗开发中的成就和未来机会。 1.引言 1.1.与HPV相关的癌症和HPV生命周期 1975年，人乳头瘤病毒（HPV）首次从足底疣中分离出来。由于HPV的L1蛋白高度可变，截至2024年6月，“国际人乳头瘤病毒参考中心”已识别出231种HPV类型。HPV类型根据其致病性和致癌风险被分类为高风险或低风险。高风险HPV负责所有人类癌症的5%，并与宫颈、肛门生殖器（肛门、外阴、阴道和阴茎）以及头颈癌相关。HPV16和HPV18约占全球宫颈癌病例的70%。在2020年，全球估计有604,000例新病例和342,000例死亡。 HPV是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组大小约为8 kb（图1A），包含7-9个开放阅读框（ORFs），全部位于同一链上。基因组被划分为三个不同的区域：上游调控区（URR），包括复制起点（Ori），以及早期（E）和晚期（L）基因区域。早期和晚期基因区域的激活发生在病毒生命周期的不同阶段。早期区域编码七个非结构蛋白：E1、E2、E1^E4、E5、E6、E7和E8^E2，而晚期区域编码两个衣壳蛋白：L1和L2。 HPV特别针对皮肤或粘膜鳞状上皮。感染通常通过上皮表面的微小伤口发生，基底细胞的横向扩展促进了进入参与伤口愈合的细胞（图1B）。在HPV16的情况下，病毒最初与细胞表面的肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）结合，并与细胞质基质成分相互作用，诱导衣壳构象变化。这种变化暴露了L2 N末端RG-1位点，这些位点可以被Furin/蛋白转化酶（PCs）切割，导致病毒衣壳对HSPG的亲和力降低，最终导致病毒进入。在HPV16感染期间，病毒通过早期内质网体、晚期内质网体/溶酶体、跨高尔基网络、内质网，最终到达细胞核。然而，确切的细节仍然有待讨论。 HPV复制发生在进入后。生命周期可以分为三个不同的阶段：建立、维护和生产扩展。在建立阶段，病毒蛋白E1和E2在放大和调节病毒基因组中发挥重要作用。E4，也称为E1^E4，是一个包含E1前五个氨基酸的剪接转录本。它与E2相互作用并稳定E2，诱导G2/M阻滞，促进E6/E7放大，并维持MAPK激活。E4的丧失导致ERK、JNK和p38 MAPK活性降低。E5蛋白的表达依赖于E4的存在，这两种蛋白协同促进病毒DNA放大。E5的存在对于诱导细胞增殖、使细胞重新进入细胞周期和激活晚期病毒功能至关重要。 图1. HPV生命周期及其基因组组织 (A) HPV基因组的组织。数据来源于 https://pave-niaid-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg。(B) HPV生命周期。该图是根据Moody等人和Aksoy等人的插图改编的。 在维护阶段，主要目标是维持恒定数量的病毒基因组并建立持续感染。E2结合病毒基因组到宿主染色体，并支持在有丝分裂期间将病毒基因组分配到子代细胞。E8^E2，也是一个包含E2的铰链、DNA结合和二聚化结构域的剪接转录本，作为病毒抑制蛋白，限制未分化细胞中的HPV复制。在这个阶段，病毒DNA可能整合到宿主基因组中。这一事件通常破坏E1和E2基因，终止E2驱动的E6和E7的转录抑制，最终导致细胞恶性转化。 随后，HPV从病毒基因组的稳定维护过渡到在分化的上皮细胞中发生的繁殖复制。E6对病毒生命周期中的外泌体基因组维护至关重要，而E7显著影响感染细胞的转录，因为它影响多种转录因子。L1和L2的表达发生在高度分化或终末分化的上皮细胞中，并且总是在E4表达之后。每种HPV类型可能表现出独特的晚期基因表达程序。 2.HPV病毒颗粒的冷冻电镜结构 在HPV分离之前，Finch和Klug使用透射电子显微镜（TEM）分析了具有T = 7对称性的兔乳头瘤病毒的二十面体形态。1991年，Baker等人分析了从人类足底疣中分离出来的HPV1的25 A˚结构。尽管分辨率低，但这一分析有效地证明了HPV具有典型的“完整五聚体”二十面体结构。然而，由于其生命周期依赖于基底细胞分化为角质形成细胞，研究HPV病毒结构仍然具有挑战性。目前，研究中使用两种主要的传染性颗粒：伪病毒颗粒（PsVs）和类病毒颗粒（QsVs）。这两种都由L1和L2病毒衣壳蛋白组成。PsVs包裹各种目标基因，如GFP基因，而QsVs包裹PV基因组。 3.主要衣壳蛋白L1 3.1.L1在HPV进入期间 HPV与肝素硫酸蛋白多糖（HSPGs）之间的相互作用在HPV感染期间起着至关重要的作用。添加HSPG有效地抑制了HPV感染。HSPG是一种在细胞膜和细胞外基质中都存在的糖蛋白，它将高度带负电的寡糖片段结合到病毒表面的多个可访问位点，特别是在五聚体的外围和侧壁。值得注意的是，HPV16和HPV18并不共享完全相同的结合位点。 3.2.L1结构和衣壳组装机制 L1蛋白具有典型的“果冻卷”β三明治结构，每个β片由一个不规则的柔性环区域分隔，包括HI、DE、FG和EF环（图2A）。由于其更长和更灵活的结构，HI环在β桶的表面显著突出。C末端由四个α螺旋组成（在HPV59模型中，第四个α螺旋显示为环区域）。该部分朝向颗粒内部无序定向，并且是最可变区域。 L1蛋白可以自发地在体外组装成五聚体。X. Chen及其团队对五种不同的HPV类型进行了全面分析。L1的环可以有效地锚定到五聚体表面。尽管目前已知的HPV类型，如HPV16、HPV18的五聚体β核心具有类似的结构，但特定环的变化导致HPV的不同免疫原性。 五聚体可以组装成T = 1和T = 7类病毒颗粒（VLPs），它们缺乏病毒基因组，表现出卓越的疫苗安全性，即使没有佐剂也具有强烈的免疫原性。2000年，Bishop等人确定了由十二个五聚体组成的T = 1小VLP（sVLP）的结构。这种组装依赖于两个五聚体的L1的第三螺旋（图2C）。 Cardone等人准备了包含L1和L2的T = 7衣壳，并使用延迟冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析研究了颗粒成熟过程。形成C175和C428之间的二硫键对于组装是必需的。Li等人确定了HPV59五聚体结构，他们还构建了一个由72个五聚体组成的T = 7 HPV59 VLP的伪原子模型（图2A）。六个L1蛋白形成非对称单元；每个非对称单元的一个L1形成一个中心五聚体，这也是5倍轴。中心五聚体由五价衣壳蛋白组成，而周围的五聚体是六价衣壳蛋白，位于6倍轴上（图2A）。同样，C末端臂的C429与EF环的C175之间形成的二硫键（图2A）使环区域返回到核心区域，形成一个悬挂的桥接环区域，连接到基座。此外，在六价衣壳蛋白中，一个五聚体的B链与相邻五聚体的F链之间的相互作用可能稳定了五聚体之间的相互作用。同一研究小组设计了一个衣壳杂交VLP（chVLP），通过组装单个C175A和C428A L1突变体，可以容纳各种类型的L1五聚体。一种9型的chVLP疫苗与Gardasil 9具有可比的中和滴度。 图2. 与L1相关的结构 (A) VLPs组装机制（PDB ID：5JB1,24）。L1具有“果冻卷”β三明治结构和五个高度可变环。五个L1单体形成一个五聚体。这些五聚体通过“悬浮桥”区域相互交云，72个五聚体形成一个T=7的VLP。在放大图中，“悬浮桥”区域显示为透明表面模型。关键氨基酸C175和C429以不同颜色显示。(B) HPV L1五聚体和V5抗体（PDB ID：6BT3, Guan J. 等人）或U4抗体（PDB ID：6BSP, Guan J. 等人）复合物的关键抗体结合位点结构。(C) HPV T=1 VLP的冷冻电镜图（PDB ID：1DZL, Chen X.S. 等人）。sVLP的组装主要由h4介导，放大图显示了细节。(D) 与HSPG结合的L1五聚体复合物结构。左图：HPV16与HSPG的复合物（PDB ID：5W1O, Dasgupta J. 等人），右图：HPV18与HSPG的复合物（PDB ID：5W1X, Dasgupta J. 等人）。 L1肽也用作模型多肽，以检查各种HLA-A等位基因对肽的识别偏好。Zhang等人分析了HLA-A2601与两种类型的L1肽的复合结构。结合其他结构数据，他们的分析揭示了HLA-A2601的T细胞反应表型主要偏爱在P1位置含有酸性氨基酸D和E的肽。 3.3.L1抗原-抗体复合物的结构和抗体中和机制 确定L1与中和单克隆抗体之间的相互作用机制是分析L1免疫原性的有效方法，从而指导新型HPV疫苗的设计。Susan Hafenstein团队使用QsVs分析了两个代表性抗体的结合位点。H16.V5代表了HPV疫苗接种者中大多数中和抗体，具有重要的临床意义。这种抗体的Fab结合导致更有序的表面环，加强了C末端“侵入臂”，并促进了基座处更紧密的连接。H16.V5识别L1的FG和HI环，而BC和DE环也参与了这种相互作用，显示出对六价衣壳的优先结合（图2B）。然而，这并不妨碍HPV附着到细胞表面，表明五聚体相互作用可能负责HPV附着。 H16.U4通过空间位阻中和HPV16。U4抗体的结合位点与肝素结合位点部分重叠，表明U4的作用可能与HPV附着有关（图2B）。33此外，对三种报告的抗体—H16.1A、H16.14J和H263—的表位分析表明，DE环是每个表位的核心组成部分，而EF和BC环的贡献较小。 S. Li小组对与抗体结合的PsVs进行了结构分析。对于HPV6，三个抗体特别针对BC、DE和FG表面环，分别结合到五聚体的中心、顶部中心和顶部边缘。5D3和17D5抗体防止PsV附着，这是主要的中和机制。相比之下，15F7允许PsV附着，但阻碍了细胞进入。对HPV58的类似研究发现了三种中和机制：顶部中心结合（5G9和10B11）、顶部边缘结合（2H3和5H2）和边缘结合（A4B4和DE环区域A12A3）。对于HPV59，型特异性抗体28F10结合到FG环区域。此外，S. Li小组确定了与兔单克隆抗体H16.001复合的HPV16 PsV的高分辨率冷冻电镜结构，为HPV颗粒结构提供了详细理解，这是疫苗诱导抗体研究的宝贵资源。 3.4.交叉型嵌合HPV VLPs 1999年，研究人员提出将各种L1类型或其他蛋白的片段嫁接到L1基质上，以实现疫苗设计的交叉保护。这一策略被扩展到在不同HPV类型基础上种植HPV的中和位点，其中型特异性抗体仍然可以结合到这些种植区域。S. Li团队合成并结构表征了HPV58/33嵌合五聚体和三价嵌合五聚体（HPV58/33/52），揭示了不同类型之间的结构排列是相同的，小环在类型之间的运动是由不同基因型的变化序列引起的（图2E）。结构数据证明了嵌合五聚体呈现环区域的天然状态的能力。此外，HPV33特异性抗体4E5结合到HPV33、HPV58/33和HPV58/33/52的VLPs，表明使用这些设计原则用于下一代疫苗的可行性。这种策略也已应用于其他嵌合体，包括HPV51/69/26，HPV39/68/70，和HPV11/6，这些可以诱导多型中和抗体，以相同的免疫剂量实现更广泛的保护范围。 4.次要衣壳蛋白L2 次要衣壳蛋白L2作为一种核蛋白，对病毒颗粒的组装、稳定性和包装起辅助作用。L2由大约470个氨基酸残基组成，在N和C末端都有核定位信号。它在感染期间病毒基因组（vDNA）的细胞内转移中起着至关重要的作用，这一功能主要与L2的RG-1表位有关。vDNA主要结合到L2的富含甘氨酸的N末端跨膜（TM）域；然而，vDNA的穿透依赖于L2的C末端。 Buck等人最初分析了包含假定L2密度的低分辨率PsVs结构。通过减去只包含L1的颗粒的密度来获得假定的L2密度。生化实验还揭示了衣壳内相邻L2分子的N和C末端之间的近距离，每个衣壳可以容纳多达72个L2分子。Guan等人报告了更详细的L2结构信息，也是通过从PsVs中减去已知的L1密度获得的。假定的L2密度从五聚体的内部基座开始，沿着五聚体外部上升到肩部，并在顶部结束。五聚体中的相应密度明显小于六聚体中的密度。作者还观察到在从PsVs中减去L1密度后假定的L2密度，注意到明显的构象变化，并提出L2可能也参与肝素结合。 2021年，Goetschius等人报告了迄今为止分辨率最高的HPV16 QsVs的3.1Å冷冻电镜结构。通过更准确地重建这个颗粒，得到了假定的L2密度及其氨基酸序列，揭示了与L2相互作用的侧面L1残基具有高度的序列保守性。目前，L2蛋白的变异性使得难以估计其化学计量比，其整体结构大部分是无序的。 在最近发表的一项研究中，提出L2由宿主激酶Cdk1和Plk1顺序磷酸化。这个过程调节病毒DNA转移到人类有丝分裂染色质，Jung等人验证了Plk1的polo-box域（PBD）与L2的PBM之间的直接相互作用，并分析了HPV18和HPV4的L2 PBM肽与PIK1的复合结构，这进一步支持了这一结论。此外，在这項研究中，首次报告了L2结构（图2F）。 5.E1和E2蛋白的结构和功能 5.1.E1和E2蛋白的功能 在HPV复制过程中，E1和E2共同调节其他E蛋白的转录。E2对不同结合位点的亲和力可能会影响基因转录的抑制或激活，使E2能够在HPV生命周期的不同阶段发挥多种功能。E2二聚体诱导DNA弯曲，形成类似圆盘的结构。此外，E2招募DNA解旋酶E1，与其他细胞复制因子合作，启动和延长复制。最近的研究还揭示了E1激活核因子κB（NF-kB）途径的能力，表明E1不仅在逃避免疫反应中起关键作用，还在促进复制、持续性和癌症发展中起关键作用。 5.2.E1的DNA结合域 E1蛋白在不同HPV类型中高度保守，可分为三个不同的功能域：（1）N末端域，包含核定位信号（NLS）和核出口信号（NES）；（2）中间域具有DNA结合域（DBD），负责识别长控制区（LCR）中的复制起点；以及（3）C末端域，具有解旋酶/ATPase活性，并在蛋白寡聚化中起作用。Auster等人报告了HPV18 E1-DBD的晶体结构，揭示了HPV18 E1、BPV-1和低风险HPV 11共享的二聚体位点。HPV18 E1-DBD和BPV-1 E1-DBD显示出类似的折叠，中央有五个链的反平行β片，两侧各有四个松散包装的α螺旋和两个紧密包装的螺旋（图3A）。E1以二聚体形式结合DNA，结合位点主要位于E1单体的第三螺旋上。这种相互作用在DNA磷酸骨架上是非特异性的，一个DNA结合环促进序列特异性识别。在E2的招募下，最初的E1二聚体形成一个四聚体E1复合物，最终组装成两个六聚体E1解旋酶。这些具有ATPase活性的解旋酶促进DNA解旋并启动DNA复制。 图3. E1和E2结构 (A) HPV18 E1的晶体结构（PDB ID：1R9W，Auuster A.S. 和 Joshua T.L.）。(B) HPV18 E2与其DNA识别序列的复合物结构（PDB ID：1JJ4，Kim S.S. 等人）。标记了关键的DNA结合残基。(C) HPV16 E2转录激活域（TAD）的二聚体结构（单体PDB ID：1DTO，Antson A.A. 等人）。对二聚体化位点重要的残基着色为棕色。二聚体由相同的单体形成。为了清晰起见，显示了形成相互作用界面的选定残基在上下分子中，但所有标记的氨基酸都存在于一个单体的二聚体表面上。放大图中显示了参与Brd4-TAD（PDB ID：2NNU，Abbate E.A. 等人）结合的残基。 5.3.E2的DNA结合域及其DNA结合机制 HPV E2属于形成二聚体β桶的病毒蛋白家族，并使用表面α螺旋进行DNA相互作用。E2由三个结构域组成：（1）保守的N末端转录激活域；（2）C末端DNA结合/二聚化域；以及（3）连接两个域的富含脯氨酸的铰链区。不同HPV类型的E2 DBDs已被结构表征，包括HPV31、 HPV16、与目标DNA复合物的HPV18 E2的晶体结构、HPV6 E2-DBD、以及HPV6a E2-DBD与两个DNA复合物。E2蛋白的整体构象在不同类型和物种中相对保守。单体由两个大约相等长度的重复序列组成，一侧形成四个β链，另一侧形成两个螺旋。二聚体通过β链之间的相互作用发生，主要由两对色氨酸残基之间的疏水相互作用稳定。此外，二聚体中心形成一个由八条反平行链组成的疏水核心，而两个二聚体的四个螺旋排列在核心的外侧（图3B）。 Bose等人利用结构引导设计修改了HPV16 E2的DBD域，替换了二聚体界面上的保守残基。结果，工程化了一个更稳定的异二聚体，并确定了其晶体结构。修改后的E2 DBD显示出增强的基因靶向抑制。研究人员最初使用BPV-E2-DBD和DNA的复合结构模型来分析DNA蛋白相互作用。 E2通过其第一螺旋与DNA的主沟相互作用，而β2-3环则与次沟或磷酸骨架结合。未结合DNA的E2在此位点上是多变的，并在DNA结合时发生“无序到有序”的转变。随后的研究阐明了HPV E2与特定DNA序列结合时的复杂结构（图3B）。进一步分析揭示了E2对不同DNA序列的不同亲和力与其识别灵活性相关，E2与DNA结合的顺序取决于其对多个位点的亲和力和协同性。E2与DNA结合导致主沟和次沟的压缩，引起DNA扭曲。不同类型的E2在DNA结合时引起不同的构象变化，β4的变化可能解释了异源E1E2复合物之间相互作用较弱的原因。 5.4.E2的铰链区和转录激活域 HPV E2的铰链区将DNA结合域（DBD）与转录激活域（TAD）连接起来，在结构上非常灵活。Dellarole等人分析了HPV16 E2的部分截短的铰链区，鉴定了α区域中两个额外的残基——A327和A328。这些残基的修饰并没有显著影响其生物活性。HPV E2的TAD在促进六聚体形成中起着关键作用，通过与E1的相互作用，对转录和复制的调控至关重要。已知高危和低危HPV类型的TAD的晶体结构，包括HPV18、HPV16和HPV11及其与小分子抑制剂的复合物。 E2-TAD由两个域组成：N1和N2。由残基1-92组成的N1域具有三个长的α螺旋，形成一个扭曲的反平行β片结构。N2域（残基110-201）主要由反平行β片结构组成，而残基93-109形成一个连续的螺旋结构，位于N1和N2域之间并作为支点（图3C）。Harris等人观察到一个连接N2域和N1的螺旋，并确定Ile73是转录激活的关键残基，不影响复制。相比之下，Glu39的作用相反，这对E1和E2的相互作用很重要。 在晶体和溶液NMR结构中，E2-TAD形成二聚体（图3C）。TAD的二聚体化增强了DNA环的稳定性，并促进了结合在远端的转录因子重新定位到HPV的转录起始位点。值得注意的是，在低浓度下，E2 TAD与E1相互作用以增强E1与DNA的结合。相比之下，更高的浓度可能促进同源二聚体的形成并启动复制。Y. Wang和同事报告称，醌类抑制剂阻止了E1和E2之间的相互作用。E2-抑制剂复合物的结构分析揭示了抑制剂结合位点的各种侧链运动，导致N1和N2域之间形成一个深的疏水口袋。E2-TAD与Brd4 CTD的N端20个氨基酸的复合物结构也已报告（图3C）。作者开发了一种Brd4-tat融合蛋白，促进HPV-16或HPV-31 DNA从有丝分裂染色体中转移出来，这可能是开发潜伏抑制剂的一个有希望的方法。 6.E6蛋白的结构和功能 多项研究已证明高危HPV的E6蛋白是导致肿瘤发展的首要致癌基因。E6结合许多参与细胞增殖途径的蛋白质，最终导致它们的降解。PDZ结构域长约80-90个氨基酸，由两个α螺旋和多达六个β链组成，形成一个称为αB-bB沟的结合槽。这些结构域在细胞黏附和极性控制中起着至关重要的作用，通常识别特定四氨基酸肽序列，即PDZ结合基序（PBM），X-T/S-X-V，这些基序经常出现在蛋白质的羧基末端。高危HPV的E6包含一个保守的六肽（R-R/T/N/Q-E-T-Q/E-V/L）在其C末端（图4C）。E6肽配体位于PDZ的“底物”沟内。E6的两个R残基与PDZ之间的额外相互作用为PDZ结构域结合提供了竞争优势，可能使病毒能够破坏含有PDZ的肿瘤抑制因子的调控。E6介导了多个含有PDZ结构域的蛋白质的降解，如与黏附连接（AJ）相关的SAP97/Dlg，调节囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的细胞内运输和定位的CAL，以及与紧密连接（TJ）相关的MAGI-1、MUPP1和ZO-2。此外，非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPN）3、PTPN13和PTPN4被HPV E6识别，E6与PTPN4之间的相互作用主要通过疏水相互作用和氢键介导。由于PDZ结构域与PBM之间的相互作用的重要性，Gogl等人通过定量片段组学分析了PDZ与PBM之间的亲和力，并确定了PDZ与E6和SNTB1的结构。14-3-3蛋白识别在某些序列基序中丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化的蛋白质伴侣，在细胞凋亡、细胞周期或信号转导等广泛过程中很重要。磷酸化的E6 PBM可以与14-3-3家族蛋白相互作用以发挥其致癌功能（图4C）。E6最出名的是通过E6AP蛋白泛素化诱导p53降解，并将p53封存在细胞质中，从而抑制p53信号通路。这导致p53失去其抑癌功能，促进肿瘤增殖，并抑制感染细胞的凋亡。在高危粘膜HPV（hrm-HPV）引起的上皮肿瘤中，E6与E6AP细胞泛素连接酶的LxxLL基序结合。随后，E6/E6AP异二聚体招募并降解p53，而单独的E6或E6AP都不能招募p53。HPV16 E6、E6AP和p53核心域的三聚体复合物的晶体结构揭示了E6AP的LxxLL基序与E6上的p53形成结合槽（图4A）。E6与P53的结合位点与P53与DNA或其他蛋白的结合位点不同。因此，E6可以结合游离的和复合的P53，而不会与细胞因子竞争。尽管E6AP肽的C末端定位在p53核心附近，但该域与p53没有形成实质性的相互作用。Wang等人使用冷冻电镜确定了E6/E6AP/P53全长蛋白复合物的结构（图4B）。该结构揭示了E6AP相互作用界面的更多详细信息。E6AP通过三个主要结合位点与E6相互作用。该结构还证实了E6AP C末端不参与与p53的相互作用，证实了Martinez-Zapie等人的结论。此外，一个体外选择的肽，特别针对HPV16 E6的LxxLL口袋，可以诱导p53招募到E6，表明其他细胞蛋白，除了E6AP之外，也可能结合到LxxLL口袋，从而增强E6与p53之间的相互作用。为了进一步探索E6AP的机制，Wang等人分析了不同状态下的E6/E6AP复合物的结构。他们观察到E6AP的短α-1螺旋通过构象变化控制其非活性单体和活性二聚体之间的转变。结合E6后，E6AP的短α-1螺旋延伸成更长的螺旋结构。延伸的α-1螺旋对称相交，促进二聚体化并促进泛素转移。此外，HPV16E6和IRF3的复合物结构也已发布，其中IRF3主要通过E6的LxxLL口袋与E6AP相互作用。这个结构尚未发表（图4D）。 图4. 与E6和E7相关的结构 (A) E6/E6AP/P53三元复合物（PDB ID：4XR8，Martinez-Zapien D. 等人）。关键残基的侧链在放大图中显示。(B) 具有全长E6AP的E6/E6AP/P53三元复合物（PDB ID：8GCR，Wang J.C.K. 等人）。主要功能位点显示为表面模型，并用灰色箭头标记。(C) HPV E6 PBM与14-3-3 s和PDZ结构域的相互作用。从左至右：14-3-3 s与HPV16 E6 PBM复合物（PDB ID：6TWZ，Gogl G. 等人），CAL PDZ与HPV16 E6 PBM复合物（PDB ID：4JOP，Amacher J.F. 等人），SAP97 PDZ与HPV18 E6 PBM复合物（PDB ID：2I0L，Zhang Y. 等人）。E6序列显示在底部，保守残基着色为橙色。(D) E6/MBP-IRF3复合物（PDB ID：6SJA，Poirson J. 等人）。(E) HPV45 E7 C末端二聚体结构以两种方向显示（PDB ID：2F8B，Ohlenschlager O. 等人）。 7.E7蛋白的结构和功能 HPV E7蛋白是已知的致癌因子，高危HPV的E7被广泛认为是恶性转化的主要驱动因素。HPV E7在各种生物过程中的作用之前已被广泛回顾。E7是一种由大约100个氨基酸组成的酸性磷蛋白，主要定位在细胞核中。在结构上，E7可分为三个域：CR1、CR2和CR3。CR1和CR2都是无序区域，CR2包含LXCXE基序和一个酪氨酸激酶催化位点。CR3包含两个CXXC基序，它们之间由29个氨基酸隔开。 E7主要作为同源二聚体发挥作用，CR3结构域在二聚体化中起着至关重要的作用。Liu等人和Ohlenschlager等人分别报告了HPV1A E7和HPV45 E7中CR3二聚体的晶体结构。E7同源二聚体采用大致球形的形状。E7亚基形成一个扁平结构，具有b1b2a1b3a2的二级结构（图4E）。b1和b2链形成一个反平行扭曲的β折叠，急剧弯曲连接含有四个α螺旋转角的螺旋a1。Ca主链从a1螺旋处直角转弯，形成一个纤细的β链状结构（b3），并以一个短α螺旋结束。CR3中的锌离子结合位点由四个Cys残基配位：两个Cys是b1和b2之间的U型转弯的一部分，另外两个Cys位于a1-a2环和a2螺旋的末端。E7二聚体化是通过b1-b2-a1表面与相应亚基的b2和b3链之间的β折叠之间的相互作用介导的。E7的CR2结构域是无序的。与E7相关的首个结构在1998年被报道：由HPV16E7 CR2结构域的9个氨基酸残基的肽段和视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（pRB）形成的复合物（图4F）。视网膜母细胞瘤（RB）肿瘤抑制基因对细胞周期的调节至关重要，主要在G1-S转换期间，包括抑制E2F转录因子。E7与pRB的结合位点与CDK2和转录因子TFIIB的结合位点非常接近，表明E7不会直接与E2F竞争pRB以抑制E2Fs。Liu等人提出E7蛋白通过其LXCXE基序和CR3结构域介导pRB从E2F转录因子的解离，其中一个E7 CR3二聚体表面与pRB结合，而另一个对E2Fs结合至关重要的表面破坏了pRB-E2Fs复合物。DREAM复合物是一个高度保守的复合物，包含DP、RB样、E2F和MuvB蛋白。DREAM在G0期与许多人类启动子结合，并且需要抑制E2F靶基因。HPV16 E7蛋白也破坏了由口袋家族蛋白p107形成的DREAM复合物（图4G）。来自HPV16 E7 CR2结构域的9个氨基酸残基的肽段与P107的结合位点与pRB中的相同。这种复合物结构为E7与口袋家族蛋白之间的相互作用提供了进一步的结构和机制见解。E7的C末端结构域独立于pRB诱导肿瘤发展。Yun等人报告了HPV18E7的CR3二聚体与PTPN14的复合物结构，并观察到E7与PTPN14的催化域之间的直接相互作用（图4H）。PTPN14是肿瘤抑制性p53-PTPN14-yes相关蛋白（YAP）轴的一部分。HPV18E7和PTPN14之间的复合物形成是通过HPV18E7的C末端结构域的a1和b1与PTPN14的PTP结构域的b5、b6、b7和a4之间的疏水相互作用介导的。MHC I类“单链三聚体”分子是由MHC重链、β2-微球蛋白和特定肽段组成的单条多肽链，并且在研究中广泛使用。Finton等人描述了HLA单链三聚体设计对不同肽段展示及其稳定性的影响，包括HPV16 E7。他们报告了融合蛋白和与晶体化分子伴侣复合物的结构：重链抗体的可变域（VHHs）。这项研究表明，工程化的MHC I类单链三聚体具有稳定的多肽展示能力，HPV E7作为模型肽的潜力。为了避免冗余，展示了两个结构，一个带有VHH，一个不带VHH（图4I）。 8.HPV的预防和治疗 HPV的预防和治疗需要针对HPV感染和恶性转化阶段的药物。预防性和治疗性疫苗目前是HPV预防和靶向治疗的主要策略。预防性疫苗诱导针对病毒衣壳蛋白L1和L2的抗体。全球有六种HPV预防性疫苗可供商业使用，它们利用VLPs。尽管这些疫苗对有限数量的HPV类型有效，但它们不能保证完全预防与HPV相关的癌症。尽管L2的结构和位置不确定，但其中和表位在皮肤和粘膜病毒类型中显示出高度保守性，为开发广谱疫苗提供了机会。当前临床L2疫苗显示全长L2，RG-1抗体表位（氨基酸17-36）或类似表位。预防性疫苗对已经发展为与HPV相关癌症的个体无效。治疗性HPV疫苗（TxV）旨在通过将HPV早期蛋白传递给抗原呈递细胞（APCs），特别是树突状细胞（DCs），以引发强烈的免疫反应，清除持续的高风险HPV感染或诱导癌前病变的回归。大多数治疗性疫苗目前处于临床I/II阶段，HPV靶向治疗性疫苗的开发仍然是一个重大挑战。从疫苗刺激的T细胞反应的角度来看，包含覆盖T细胞表位的免疫原被认为是最佳的。需要更广泛的抗原靶向策略来治疗HPV阳性癌症和清除持续性癌前感染。除了E6和E7，E1和E2在病毒基因组整合之前的早期感染阶段高度表达。这些早期HPV蛋白的结构揭示了它们的关键功能位点，这对疫苗设计很重要。为了减轻疫苗中包含早期蛋白的安全问题，这些免疫原被修改为失活其致癌功能。例如，Auster等人证明HPV18 E1突变体K237A的DNA结合能力几乎完全被废除，指导相应免疫原的修改。然而，重要的是要认识到E6和E7蛋白显示出较低的序列保守性，导致不同HPV类型的致癌潜力不同。这强调了进一步结构研究的重要性。 9.结束语和未来展望 HPV L1的晚期蛋白对疫苗开发很重要。仍然需要对二级衣壳蛋白L2进行进一步的结构表征。需要对全长早期HPV蛋白E1和E2进行进一步的结构洞察，以更好地了解HPV生命周期的早期阶段。关于E6和E7蛋白，现有的结构信息（表1）不足以完全解释这些癌蛋白的多样化致癌机制。对不同HPV类型的E6和E7癌蛋白进行分析和比较，将更好地理解关键位点和致癌机制。正在进行的研究正在揭示E5蛋白的不同剪接变体的作用以及E1-E4和E2-E8等组合。虽然有效的预防性疫苗是可用的，但迫切需要开发治疗性HPV疫苗。对HPV结构生物学的更深入理解将有助于识别进一步的有前途的表位，以指导未来的疫苗设计。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：疫苗是预防传染病最重要的工具之一。随着时间的推移，针对抗原成分开发了许多不同类型的疫苗。佐剂是提高疫苗实践效果的关键元素，通过多种不同的方式发挥作用，特别是作为载体、储存库和免疫反应的刺激物。多年来，疫苗中包含的佐剂很少，铝盐是最常用的佐剂。然而，最近的研究关注了许多具有有效佐剂特性和提高安全性的新化合物。现代技术如纳米技术和分子生物学已经有力地进入了抗原和佐剂成分的生产过程，从而提高了疫苗的效果。微粒、乳液和免疫刺激物因其在疫苗生产中的巨大潜力而备受关注。尽管有关疫苗佐剂的潜在副作用的研究已经报告，如最近认识到的ASIA综合征，但疫苗的巨大价值仍然不容置疑。事实上，最近的新冠大流行凸显了疫苗的重要性，特别是在管理未来潜在大流行方面。在这个领域，对佐剂的研究可能在生产越来越有效的疫苗中发挥领导作用。 1.引言 疫苗无疑是人类历史上最显著的健康成就之一。在两个多世纪的时间里，疫苗使我们能够实现诸如天花的彻底根除、世界上许多地区脊髓灰质炎的消失，以及多个国家许多传染病的死亡率和发病率的大幅下降等非凡目标。在世界许多地区，疫苗政策是公共卫生的基石，非常重视为人群保证安全有效的疫苗。疫苗的效果不仅取决于抗原成分，还取决于经常用来以更有效方式刺激免疫系统的佐剂。佐剂被定义为添加到疫苗中以改善对抗原的免疫反应的成分。此外，佐剂还有多种好处，如减少每剂疫苗中的抗原量和接种次数，在某些情况下，它们增加了抗原成分的稳定性，延长了其半衰期，间接提高了其免疫原性。现在有多种类型的佐剂可用于疫苗制造（表1）。 佐剂可以根据不同的标准进行分类，如它们的物理化学性质、来源和作用机制。最常遵循的分类系统之一是基于它们的作用机制，将它们分为两个主要类别：递送系统（颗粒状）和免疫增强剂。还有一类佐剂是粘膜佐剂，这是一组与前述佐剂共享一些特征的化合物。在递送系统佐剂中，抗原与作为抗原载体的佐剂相关联。此外，它们能够通过激活先天免疫系统来诱导局部炎症反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。具体来说，抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这导致先天免疫细胞的激活，产生细胞因子和趋化因子。免疫增强剂直接激活相同的途径（图1）。 图1. 佐剂的作用机制。 添加佐剂对于老年人使用的疫苗特别有用，因为这类受试者中发生的免疫衰老生理现象，这是导致自然感染或人工刺激（疫苗接种）后免疫反应减少的原因。在这种情况下，佐剂的存在可以代表一个有效的工具，以克服疫苗使用中的这一限制。此外，佐剂对于亚单位疫苗特别有用，因为它们通常太弱，无法单独刺激强大的免疫反应。然而，并非所有疫苗都需要佐剂。例如，许可的结合脑膜炎球菌疫苗不含有佐剂，因为与蛋白质载体的结合本身能够刺激良好的免疫反应。目前许可的佐剂疫苗列于表2。 正如表中所示，EMA和FDA目前许可用于人类使用的绝大多数疫苗都包含铝盐作为佐剂。这一点很重要，因为这些佐剂是疫苗配方中最古老的，并且增加新佐剂的数量显然是必要的，以提高疫苗的安全性和有效性。由于这些原因，加强具有佐剂特性的新分子和因素的研究，增加体外和体内研究的数量是至关重要的。同时，新产品的批准可能会因监管挑战而延迟和成本高昂，这些挑战涉及佐剂的使用和研究、新细胞基质的使用，或者申请流程变更或转移。这个方面可能代表一个阻碍创新、增加成本和延迟疫苗可用性的障碍，特别是在资源匮乏的国家。 此外，COVID-19大流行凸显了拥有有效疫苗的重要性，以应对新大流行的潜在威胁。事实上，许可的针对COVID-19的RNA疫苗具有与用作编码RNA载体的脂质体组分相关的内在佐剂特性。然而，最新许可的COVID-19疫苗是基于一个经典平台，包含刺突蛋白，并以添加一种名为Matrix-M的新佐剂为佐剂，该佐剂含有皂皮树Molina提取物的A部分和C部分。 在选择疫苗佐剂时，应考虑许多方面，其中安全性无疑是第一。一个好的佐剂必须首先是安全的、耐受性好的、易于生产的；具有良好的制药特性（pH值、渗透压、内毒素水平等）和持久的货架寿命；最后，经济上可行。在不影响佐剂安全性的情况下尊重所有这些特性是困难的。因此，目前使用的疫苗中包含的疫苗佐剂非常少。 尽管疫苗取得了巨大的成就，但近几十年来对这些产品产生了很多担忧。一种反对疫苗的文化，被称为“疫苗犹豫”，已经在全球传播。这在COVID-19大流行期间得到了鼓励，一方面，它强调了疫苗接种作为对抗传染病的重要武器的重要性，但另一方面，它也凸显了一部分人口的犹豫行为。已经报告了这种态度的多种原因，但许多研究表明，对副作用的恐惧和对疫苗成分的不信任是最常报告的。特别是，佐剂是比其它成分更容易引起公众担忧的成分。实际上，当存在时，疫苗的副作用通常是轻微和短暂的，通常表现为注射部位的局部疼痛和红斑、轻微的全身不适和类似流感的症状。这些效果通常在疫苗接种后几小时或几天内消失。很少有过敏性反应或其他严重副作用的报告。 本综述的目的是检验当前使用的疫苗佐剂，并评估有关新佐剂的特性及可能的未来用途的正在进行的研究，突出科学文献中关于潜在关注点和副作用的证据。 2.递送系统 2.1.矿物盐铝盐 铝盐的佐剂特性在20世纪20年代被发现，自1926年以来这些化合物一直被用作疫苗佐剂。最初考虑将添加到生长介质中的铝盐用于诱导破伤风和白喉抗原的沉淀，以帮助它们的纯化。然而，很快就发现这些铝沉淀的抗原比可溶性的抗原具有更强的免疫原性。因此，铝盐是使用时间最长且最常包含在疫苗中的佐剂，约有三分之一的当前许可疫苗含有铝。因此，铝盐在疫苗佐剂中是安全性测试最多的。 人类通过不同来源接触铝，尤其是食物和空气。铝主要通过消化道和呼吸道被人体吸收，随后扩散，然后是三步消除过程，尽管这从未完全完成。吸入的铝少于3%，摄入的铝少于1%在生物体内扩散。然而，通过污染食物的摄取是人体中可发现的95%的铝的来源。世界卫生组织（WHO）规定，通过食物摄取的铝的最大水平应为1毫克/公斤/天（成人60至70毫克/天）。最后，铝可能包含在肠外溶液中，因此可以通过注射传播，通过血液和各种体液隔室在体内扩散。在这种情况下，为了避免铝的积累，其在肠外溶液中的水平应小于25微克/升。 一旦被生物体吸收，铝就在体内组织中扩散。大部分金属随后储存在骨骼、肝脏、肺和神经系统中。在患有慢性肾脏病的人群中，铝不能被消除并随时间积累，特别是在骨骼和神经系统中。在这类患者中，高水平的铝可以沉积在大脑中，导致脑病。铝穿透大脑在一项体内实验中得到了精确量化，该实验在大鼠中注射同位素铝-26（26Al）后进行。在生理条件下，铝对大脑的穿透力从每克脑组织的0.001%到0.005%不等，与其给药途径和化学形式无关。2010年，Goullé等人使用结合了电感耦合等离子体和质谱检测的技术，在20名未接触过金属且未接受过含铝或其他微量矿物质治疗的已故患者的人体组织中量化了铝的水平。以湿重表示的中值结果如下：肺=0.47微克/克，大脑=0.19微克/克，肝脏=0.15微克/克，心脏=0.10微克/克，肌肉=0.08微克/克，肾脏=0.06微克/克。 铝被生物体缓慢排泄，主要通过泌尿系统。一些铝永久沉积在人体中，随着接触水平和年龄的增长而增加。这种永久沉积的铝量在成人中估计为30至50毫克。 在疫苗中，铝以晶体状的氢氧化铝（AlH）或无定形的磷酸铝（AlP）的复合聚合物形式存在，形成聚集的纳米颗粒。AlH呈针状纳米颗粒（直径20纳米），而AlP在透射电子显微镜下呈网状。两种形式通常都溶于柠檬酸，但AlP比AlH更易溶。抗原通过静电相互作用和配体交换吸附在佐剂颗粒表面。铝盐/抗原结合增强了抗原呈递细胞（APCs）的抗原摄取和呈递。此外，铝盐刺激NLRP3炎症体的激活，导致IL-1β和IL-18的产生，随后局部炎症和APCs的招募。 许多疫苗使用吸附在AlH或AlP上的抗原（例如，针对破伤风和白喉、无细胞百日咳、乙型肝炎以及肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗），因为它们免疫原性差，随后需要增强免疫反应以引起有效的疫苗接种。在欧洲，疫苗中的铝量由欧洲药典设定为每剂最大1.25毫克铝。在美国，美国联邦法规将生物制品（包括疫苗）中的铝量设定为0.85毫克/剂。与主要以可溶性柠檬酸盐或氯化物形式存在于食物中的铝相比，用作佐剂的无机铝化合物溶解度差；这是它们佐剂作用的一部分。因此，由于在生理pH值下溶解度差，预期肌肉内或皮下注射疫苗中的铝的吸收率会非常慢。 为了评估肌肉内注射后铝的动力学，已经进行了一些体内研究。Flarend等人进行的一项实验研究基于肌肉内注射标记有26Al的AlH和AlP，铝的总剂量为0.85毫克，显示了28天内AlH的吸收率为17%，AlP的吸收率为51%。26Al的最大血清浓度（Cmax）增加为2微克/升，即正常值（30微克/升）的7%。基于这些结果，可以评估肌肉内注射铝盐疫苗佐剂后预期的铝Cmax增加，将等于0.04微克/升，即平均血液中铝水平5微克/升的0.8%。在这个实验中，还评估了大脑中的铝水平，浓度在10-8至10-7毫克/克之间，即10-5至10-4微克/克，因此<0.0001微克/克；这比人脑中平均浓度0.2微克/克低2000多倍。此外，一些研究评估了人类注射26Al-citrate后的铝排泄。一项相当旧的研究表明，在静脉注射26Al-citrate后，59%的注射剂量在一天内通过尿液排出，随后几天排泄速度较慢（第5天的平均保留率为27%），而一项较新的研究表明，在注射铝剂量8年后，保留率约为2%。 铝的毒性是由于体内液体和组织中金属水平的增加。这种增加尤其是由于消除能力的改变，特别是当肾功能受损时。接受血液透析的肾功能衰竭患者尤其有更高风险的铝水平和可能的神经毒性。肾脏移植能够解决铝过剩问题，可能还有相关的神经毒性。多年来，科学家一直在辩论铝神经毒性作为神经退行性疾病原因的可能角色，即使到目前为止，没有确切的证据显示，这个角色仍然是有争议的。 铝的神经毒性已在体外、离体和体内动物模型以及人类中进行了研究。一些体外研究在细菌上进行，显示没有致突变性。此外，使用对氧化突变原敏感的菌株，对铝的氧化作用模式产生了怀疑。其他体外研究在细胞系上进行，以评估不同形式的铝的可能遗传毒性。一些科学家致力于离体研究，使用来自多个供体的淋巴细胞，动物模型中的胚胎毒性研究，最后是各种体内研究。在所有这些研究中，最常用的技术是彗星试验和微核试验。值得注意的是，结果往往是不一致和矛盾的，可能存在方法上的缺陷。因此，到目前为止，尚不可能肯定地说，用作佐剂的铝盐（在推荐剂量下）可能具有毒性效应，尽管它们能够产生或多或少的强烈氧化应激。 2.2.乳液 这一类重要佐剂的始祖是完全和不完全弗氏佐剂。这两种佐剂都是水包油乳液，能够携带抗原并刺激先天免疫系统。完全弗氏佐剂（CFA）在其结构中包含热杀死的结核菌，这增强了对免疫反应的刺激，目前用于体内实验以在小鼠中诱导强烈的免疫激活和自身免疫（如葡萄膜炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎）。然而，CFA能够引起强烈、持久的局部炎症，可能导致动物显著疼痛，并可能在注射部位出现溃疡。不完全弗氏佐剂（IFA）不含结核菌，20世纪50年代作为人类流感疫苗的佐剂使用；与没有佐剂的相同疫苗相比，它能诱导更强、更持久的抗体反应。IFA的佐剂活性基于其作为油性抗原沉积的特性，从注射部位持续释放抗原。这同时增加了抗原的寿命，并强烈刺激局部先天免疫系统，伴有吞噬作用、白细胞的募集和浸润以及细胞因子的产生。然而，IFA在疫苗配方中的引入及其在人类中的常规使用受到其引起的强烈副作用的阻碍。特别是，由高剂量不可生物降解的油脂以及它们的质量差引起的毒性。2005年世界卫生组织进行的一项调查显示，大约一百万人使用IFA进行免疫接种，其中4万人出现了严重的副作用，如无菌脓肿。 2.2.1.MF59 MF59是一种水包油乳液，由角鲨烯、Span 85和Tween 80在pH 6.5的10 mM柠檬酸钠缓冲液中组成，平均粒径约为165纳米。这是第一个作为佐剂批准用于人类疫苗使用的水包油乳液，于1997年在意大利获批。目前，它包含在佐剂化的三价和四价（TIV和QIV）流感疫苗Fluad（Seqirus）中，最初只用于65岁以上的人群，但后来被批准用于其他流感风险群体，如幼儿和婴儿，在H1N1大流行疫苗期间，还批准用于孕妇和幼儿。已经证明，MF59的存在增加了流感疫苗在2岁以下儿童中的有效性。MF59还在乙肝疫苗中作为佐剂进行了测试，能够触发令人印象深刻的免疫反应，比铝佐剂诱导的反应更好。关于作用机制，MF59具有与铝盐相似的效果。在注射部位的沉积活性相当小，因为研究表明其半衰期为42小时。相反，MF59具有强大的能力，能够诱导细胞和体液免疫反应，包括产生高滴度的功能性抗体。MF59的存在刺激局部先天免疫细胞分泌趋化因子，如C-C基序趋化因子配体4（CCL4）、C-C基序趋化因子配体25（CCL2）、C-C基序趋化因子配体5（CCL5）和C-X-C基序配体8（CXCL8），这些趋化因子反过来驱动白细胞的募集、抗原的摄取和迁移到淋巴结，并触发适应性免疫反应。此外，有研究报告称，MF59能够增加调节白细胞跨内皮迁移的基因簇的表达，并随后招募MHCII+CD11b+细胞到注射部位，引发强烈的免疫反应。MF59安全且耐受性良好，这一点已通过在超过35个国家接种的数百万剂次证明。 2.2.2.AS03 AS03是一种水包油佐剂乳液，由表面活性剂聚山梨醇酯80和两种可生物降解的油脂组成，即角鲨烯和DL-α-生育酚在磷酸盐缓冲液中。这种佐剂已用于流感疫苗，诱导与MF59类似的免疫反应，以及在疟疾疫苗中。欧洲委员会于2009年授权AS03佐剂疫苗Pandemrix上市，而AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗于2013年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性似乎比MF59增强了免疫刺激。事实上，在6至35个月大的儿童中使用AS03佐剂流感疫苗，即使在接种后6个月，也显示出强烈的免疫反应。为了阐明DL-α-生育酚在AS03中的贡献，进行了一些研究，比较了AS03和缺乏DL-α-生育酚的相似乳液的效果。通过测量抗原摄取、免疫细胞募集和分泌的细胞因子水平，得出结论，缺乏DL-α-生育酚导致了较低的免疫反应和较低的抗体滴度。此外，已经显示AS03能够通过激活NF-κB来刺激免疫系统，这在肌肉和淋巴结中诱导细胞因子和趋化因子的分泌，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03可以刺激CD4+ T细胞特异性免疫反应，这可以决定持久的中和抗体产生和更高水平的记忆B细胞。AS03的成分进一步补充了两种强大的免疫刺激剂，QS-21（从皂皮树中提取的皂苷）和3-O-去酰基-40-单磷脂A（MPL），以增强其免疫原性，产生了AS02。 2.3.微粒 2.3.1.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是二十面体或杆状纳米颗粒（直径20-200纳米），由自组装的衣壳蛋白组成；长期以来，它们已被研究并用于疫苗开发。它们是非传染性颗粒，因为它们不包含任何遗传物质。它们是一类新疫苗（称为纳米疫苗）中最重要的代表之一，在疫苗开发中变得越来越重要。VLPs是智能纳米颗粒，因为它们由外部病毒壳层和重复表位组成，这些表位被免疫系统立即识别为非自身，产生强烈的免疫反应。这一特性与自然病毒共享，但并不伴有引起感染的有害能力。除了这些重复的结构基序外，VLPs在大小上与病毒相似（通常在20-800纳米之间），并经历了快速有效的处理，导致快速且持久的免疫反应的产生，即使在没有佐剂的情况下也是如此。VLPs可以根据有无包膜被分类为非包膜VLPs和包膜VLPs（eVLPs）。非包膜VLPs可以进一步分为单个或多个衣壳蛋白VLPs，以及单层、双层和三层VLPs。由乳头瘤病毒L1和L2蛋白形成的多衣壳非包膜VLPs是一个经典的例子，它们能够自组装形成微粒。eVLPs在组装和出芽过程中从宿主细胞获得其脂质膜。它们也分为单层、双层和多层。它们可以通过使用各种细胞系统的不同病毒类型通过不同的技术制造，其中包括大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞和无细胞系统。在细胞系统中制造VLPs采用一种称为“先组装后纯化”的多步骤方法，第一步利用衣壳蛋白在表达细胞载体内直接发生的自发组装能力。下一步包括新形成颗粒的纯化。有时，为了获得纯化的颗粒，在细胞组装后，需要解聚新颗粒，因此需要第二次重新组装它们。另一种制造方法使用无细胞体外组装处理系统，包括传统细胞方法的逆转。特别是，使用体外系统作为平台，在表达和纯化衣壳蛋白后诱导其自发组装，无需解聚新形成的VLPs。 目前，两种重要的佐剂疫苗使用纳米颗粒平台来诱导免疫：乙型肝炎和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。目前使用的乙型肝炎疫苗是一种含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重组DNA疫苗，以VLPs的形式存在，用于预防乙型肝炎感染，并通过使用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA技术生产。每剂含有10微克/0.5毫升的VLPs（儿童剂量）或20微克/毫升（成人剂量），两者都吸附在氢氧化铝水合物上。该疫苗接种给婴儿、儿童和15岁以下的青少年，或在有高风险感染乙型肝炎的群体中，也显示出在乙型肝炎携带者母亲所生的新生儿中有出色的免疫原性（95-99%的有效性）。乙型肝炎疫苗似乎至少能提供10年的免疫力。 HPV疫苗也是基于VLP平台的疫苗。HPV病毒是非包膜的，包含双链DNA（dsDNA）。衣壳具有二十面体对称性，由主要和次要结构蛋白组成，即L1和L2蛋白。目前的九价HPV疫苗可预防九种不同的病毒基因型，这些基因型负责90%的宫颈癌和80-95%的生殖器癌症，建议从9岁开始对男性和女性都进行接种。九价HPV疫苗包含九种不同基因型的HPV（6, 11, 16, 18, 31, 45, 53, 58）的L1蛋白形成的VLPs，并通过重组DNA技术合成。VLPs的优势在于它们是不含病毒基因组的蛋白结构，是非传染性和非致癌性的。目前用于表达L1蛋白的载体是酿酒酵母。VLPs与佐剂（AlP）的结合使用允许出色的免疫反应，因此除了能够保护新生儿免受HPV 6和11的感染外，还能提供90%的宫颈癌保护。 2.3.2.病毒体 病毒体是一种与天然病毒结构非常相似的疫苗平台。在结构上，它们是由重组流感病毒包膜形成的VLPs，包含血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和磷脂（磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱），缺乏病毒遗传物质。1975年首次提出使用病毒体制造流感疫苗。自那以后，关于这种疫苗有效性的科学证据已经出现，同时有两种疫苗用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。Inflexal V是一种适合所有年龄组的佐剂流感疫苗，在健康和免疫功能低下的儿童、成人和老年人中都具有良好的疗效。它能够诱导B细胞反应并产生特异性抗体。病毒体保留了病毒HA的受体结合能力和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，它们在结合后无法在细胞中诱导感染。此外，这种结合能力使它们的免疫原性比亚单位和分裂病毒流感疫苗更高。病毒体作为一个完美的递送系统，能够将抗原转移到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，由于它们的佐剂特性较弱，病毒体在激活APCs和促进交叉呈递方面效率不高。这种固有限制可以通过添加更强的佐剂来消除。例如，最近开发了一种新型基于病毒体的流感疫苗，该疫苗补充了Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni吸附到膜中。体外实验表明，吸附了MPLA的病毒体能够比没有添加佐剂的病毒体更强地激活APCs。此外，用这些MPLA佐剂病毒体对小鼠进行体内免疫接种，结果诱导了特异性CTLs。 流感病毒体的制造包括使用洗涤剂八(乙二醇)-n-十二烷基单醚（C12E8）溶解病毒包膜，随后进行超速离心和去除病毒核衣壳。然后，使用疏水珠从上清液中去除洗涤剂，随后病毒膜脂质和包膜糖蛋白重新组装形成大约100-200纳米的颗粒。已经证明，这个过程能够生产出与野生型病毒融合特性非常相似的流感病毒体。流感病毒体通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后与内体膜融合。不同的大分子可以封装在病毒体腔内，由于膜融合活性，能够到达目标细胞的细胞质。例如，已经证明，封装在病毒体中的DTA（白喉毒素的A亚单位）可以成功地运输到目标细胞的细胞质中，导致蛋白质合成的完全抑制。甚至质粒DNA也可以封装在由阳离子脂质形成的病毒体中。这种病毒体DNA可以用来有效地转染目标细胞。 病毒体递送系统和佐剂的显著优势在于它们能够通过疏水脂质相互作用将抗原吸附到它们的表面和腔室上。此外，与VLPs相比，病毒体在疫苗生产中更受青睐，因为后者由于其基于蛋白的结构而具有更有限的运动。此外，将抗原吸附到病毒体流动的磷脂双层表面刺激与宿主细胞受体的相互作用。FDA已经批准病毒体作为人类使用的纳米载体，因为它们具有非常高的耐受性和安全性。与亚单位疫苗相比，病毒体能够诱导强大的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂非常相似。 迄今为止，除了上述两种基于病毒体的流感和甲型肝炎疫苗外，还有几种基于病毒体的疫苗正在研究中，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。HIV病毒体疫苗在临床第一阶段显示出可接受的结果，可能很快就会上市。尽管疫苗可以通过肌肉内或皮下途径给药，但粘膜途径可能会引发更强的免疫反应，因为HIV传播的主要途径是通过粘膜组织。因此，强烈的粘膜抗体产生是抵御HIV感染的重要防御机制。一种基于HIV的病毒体疫苗是通过吸附一些HIV-1毒力抗原（如gp41和p1肽）并包括佐剂3M-052（一种增加病毒体膜刚性的热稳定佐剂）从流感病毒中制备的。在另一项研究中，一种热稳定的HIV-1病毒体疫苗由带有HA、NA、卵磷脂、脑磷脂和其他磷脂的流感病毒体组成，另外还包括3M-052、Toll样受体（TLR7/8）和糖分子海藻糖。 关于HPV，一些研究关注了基于病毒体的疫苗的效力，这些疫苗包含通过受体介导的内吞作用与宿主细胞膜融合的E6和E7蛋白。研究表明，重组HPV16 E7流感病毒体诱导了强烈的CTL反应，并防止了HPV16+转化癌症的发展。此外，用E7-病毒体免疫接种诱导了针对E7的IgG抗体反应。 3.免疫增强剂 3.1.TLR1/2激动剂 在TLR1/2激动剂中，L-pampo是一种强大的佐剂系统，由Pam3Csk4（Pam3）和多聚肌苷酸：多聚胞苷酸（polyI:C）组成，分别是强大的TLR1/2和TLR3激动剂。在Lee等人的研究中，L-pampo诱导了比氢氧化铝更强的针对HBV的抗体产生，并且还涉及细胞介导的免疫反应，如增加多功能CD4+ T细胞。此外，L-pampo也被研究作为针对SARS-CoV-2的强效佐剂。具体来说，SARS-CoV-2抗原（如受体结合域（RBD）和S1抗原或与L-pampo结合的RBD-Fc）刺激了比广泛使用的佐剂更强的针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应。 此外，细菌脂蛋白是TLR2识别的最强效的配体。已经表明，源自细菌脂蛋白的合成脂肽是B细胞和巨噬细胞的强激活剂，可以用作疫苗佐剂。来自发酵支原体的2 kDa巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2) 通过TLR2-和MyD88依赖的信号传导途径激活免疫细胞。除了MALP-2，Pam2CSK4和Pam3CSK4是公认的TLR2激动剂，它们已被评估为针对利什曼病、疟疾和流感等传染病的治疗剂。 TLR3激动剂 在TLRs发现之前，合成的双链RNA polyriboisosinic:polyribocytidylic acid [poly(I:C)] 被发现具有很强的诱导IFN产生的能力。TLR3，一个检测病毒双链RNA的内质体受体，识别poly(I:C)，因为它在结构上模仿病毒RNA，从而诱导I型IFN和III型IFN的产生，并引发Th1细胞因子反应。由TLR3-poly(I:C)相互作用产生的I型IFN对于传统的树突状细胞(cDCs)有效地激活CD8 T细胞反应尤为重要。此外，poly(I:C)产生的I型IFN刺激T细胞的克隆扩增，增加效应T细胞的比例和抗原特异性B细胞的数量。基于所有这些原因，poly(I:C)已被广泛研究作为潜在的佐剂。然而，poly(I:C)对人类具有毒性。因此，科学家们的关注集中在poly(I:C)的衍生物上，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成TLR3激动剂，如ARNAX、IPH 3102和RGC100。poly(ICLC)是聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，与poly(I:C)类似，能够刺激IFN的产生。然而，它对血清核酸酶表现出更高的抵抗力，同时具有更高的免疫刺激性。poly(ICLC)的一个有趣方面是其能够诱导先天免疫途径中其他几个遗传序列的表达，包括炎症体和补体系统，类似于活病毒疫苗。迄今为止，一些研究已将poly(ICLC)作为针对疟疾、HIV和癌症的疫苗候选物。已经表明，与其他TLR激动剂如LPS和CpG相比，poly(ICLC)能够引发更强的Th1免疫反应，这在疫苗接种中是一个积极方面。poly(IC12U)旨在通过尿嘧啶和鸟苷残基之间的不匹配来降低poly(I:C)的毒性。然而，尽管这种变化降低了毒性，但它产生的I型IFN比poly(I:C)少。与poly(I:C)和poly(ICLC)不同，已经表明poly(IC12U)能够结合TLR3但不结合MDA5。与poly(ICLC)类似，一些研究已将poly(IC12U)作为针对HIV、流感和癌症的疫苗中的佐剂。具有佐剂潜力的新型TLR3激动剂ARNAX是一种特异于TLR3的配体，特别生产出来以降低比poly(I:C)更低的毒性。poly(I:C)的毒性与其激活MAVS途径(激活RIG-I和/或MDA5)的能力有关。因此，Matsumoto等人开发了一种配体，包括GpC磷酸硫代寡脱氧核苷酸和双链RNA，该配体被TLR3识别并内化为内质体。该配体能够在不被MDA5检测的情况下激活TLR3，这是由于RNA链的相对较短长度。在小鼠模型中，该佐剂未能显著增加血清炎症细胞因子水平，但有利于DCs对抗原的交叉呈递，并引发Th1型反应。ARNAX研究的两个最重要领域是癌症免疫治疗和流感疫苗接种。 3.2.TLR4激动剂 作为疫苗佐剂研究的TLR4激动剂是AS01、AS02和AS04，它们都含有MPLA，即内质体TLR4的配体。具体来说，AS01已被用于开发针对疟疾、HIV和结核病的疫苗。AS01是一种结合佐剂系统，由MPLA和QS-21两种不同的免疫刺激性分子组成，它们被封装在脂质体结构中。QS-21是从皂皮树Molina的树皮中提取的天然三萜皂苷。这两种化合物使用脂质体作为载体，通过胆固醇依赖性内吞作用到达细胞。在细胞内，QS-21导致溶酶体不稳定，并促进蛋白激酶SYK的激活。MPLA连接内质体TLR4，诱导TRIF依赖性信号传导途径。单独使用QS-21具有重要且不利的溶血效应，诱导细胞死亡。然而，QS-21的溶血活性和随后的细胞死亡通过封装在脂质体中被消除。AS01激活caspase-1，从而促进NLRP3炎症体激活和APCs释放IL-1β以及IL-18。IL-18的释放导致IFN-γ的快速产生，特别是通过淋巴结中的自然杀伤细胞，从而促进DCs的成熟和Th1型免疫反应的诱导。 3.3.TLR5激动剂 TLR5是识别细菌鞭毛蛋白的受体，由多种免疫细胞表达。与配体的联系导致炎症途径的激活和许多炎症介质的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮。此外，鞭毛蛋白能够引发Th1和Th2反应，与其他只能主要诱导Th1反应的TLR配体不同。此外，鞭毛蛋白通过激活NLRC4炎症体诱导IL-1β的产生和释放。鞭毛蛋白能够在TLR5或NLRC4非依赖模型中发挥佐剂活性，但效率低于野生型。事实上，当小鼠模型中两个受体都不出现时，佐剂能力大大降低，这表明至少需要一个受体来驱动免疫反应；两者的存在提供了最佳的免疫结果。已经表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人中保持其佐剂能力，例如在HIV+患者中。Cui等人回顾了所有使用鞭毛蛋白作为佐剂的研究。最简单的方法是将其与抗原一起给药；这种简单的方法成功地诱导了对抗呼吸和胃肠道感染至关重要的粘膜免疫反应。已经进行了许多研究，特别是关于鞭毛蛋白作为流感疫苗佐剂的作用。在这些研究中，使用了与不同流感抗原结合的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白，其中包括灭活PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV) H5N1，对于每一种抗原，都获得了强大的免疫反应（特别是粘膜IgA产生）。鞭毛蛋白还可以成功地修改以获得嵌合鞭毛蛋白或与活性减弱细菌如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)中的抗原鞭毛蛋白复合物。此外，重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生产已在动物模型中作为佐剂疫苗用于传染病和癌症。迄今为止，至少有三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗处于临床试验阶段：两种针对流感病毒，一种针对鼠疫杆菌。 3.4.TLR7/8激动剂 一些研究表明，TLR7/8激动剂能够强烈诱导Th1免疫反应。配体与TLR7/8结合产生高水平的I型IFN、IL-12、TNF-α和IL-1β。此外，TLR7/8和TLR9激动剂是唯一能够激活并促进cDCs和浆细胞样树突状细胞(pDCs)克隆扩增的激动剂分子，同时动员CD14+CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。最重要的代表性TLR7/8激动剂是一些名为伊马替莫德(R837)和雷西莫德(R848)的合成小分子，它们属于咪唑喹啉类。伊马替莫德目前已获批准并许可用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和角化病，而雷西莫德已研究其抗病毒和抗癌治疗用途。 然而，这些小分子已被证明具有一些固有的局限性。特别是，它们可以从给药部位扩散开来，远离抗原，从而降低效果并引起全身副作用。因此，已经表明将这些分子直接结合到铝佐剂上能够提高疫苗的效力。一些先前的研究将咪唑喹啉类直接结合到HIV-1 Gag蛋白或整个灭活的流感病毒上，增加了Th1反应和抗原特异性T细胞的数量。此外，与合成聚合物支架、脂质-聚合物两亲物、聚乙二醇(PEG)、纳米凝胶、明矾和各种其他合成聚合物的结合显著增加了咪唑喹啉的传递，并改善了树突状细胞的成熟和抗原特异性T细胞。此外，先前使用咪唑喹啉与一种或多种其他TLR激动剂（如MPLA（TLR4）和MPLA + CpG ODN（TLR4和TLR9））混合的研究显示，这种组合增加了先天免疫反应，显著产生抗原特异性中和抗体并改善Th1反应。所有这些创新方面都突出了TLR7/8激动剂作为佐剂候选物的极好潜力。 3.5.TLR9激动剂 TLR9自然识别由未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸代表的细菌DNA基序，通过MyD88依赖途径驱动先天免疫系统的激活。这些分子基序已被用作具有特定修饰的合成佐剂，以防止被核酸酶降解。CpG-ODNs在自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDCs)中引起强烈的化学因子、细胞因子和抗体产生，推动强烈的Th1型免疫反应。迄今为止，已经开发了属于三个类别（A-C）的三种不同类型的CpG-ODN配体，但只有属于类别B的分子已在临床试验中用作佐剂。CpG-B ODN定位于内质体并引起pDCs的成熟。此外，CpG-B ODN可以直接与B细胞相互作用以增强抗体产生。在小鼠模型中已经表明，作为佐剂的CpG-B ODN引起了相当持久的抗体产生，比铝佐剂或无佐剂疫苗更好。最近许可的CpG 1018，一种具有高化学稳定性和佐剂能力的寡核苷酸，能够引发Th1型免疫反应，用作乙肝疫苗Hepli-Sav-B中的佐剂。在Hepli-Sav-B中，CpG 1018提高了疫苗效力，只需要两剂的接种计划，相比之下传统乙肝疫苗需要三剂才能获得最佳保护。迄今为止，CpG 1018正在研究开发多种疫苗，包括针对黑色素瘤和COVID-19的疫苗。另一种CpG ODN，CpG 7909，也在临床评估中，并在HBV和疟疾疫苗接种中显示出令人鼓舞的结果。还开发了其他下一代TLR9激动剂。一个有效的代表是MGN1703，一种包含CG基序的小DNA分子，但其结构与CpG ODN不同。MGN1703由一段反向互补的DNA组成，中间是双链的，两侧是两个单链环，包括三个未甲基化的CG基序，形成一个哑铃形结构，与线性分子的CpG ODN形成对比。MGN1703已作为疫苗中的佐剂进行了测试，发现它能够激活先天和适应性免疫反应，副作用轻微或暂时。 4.佐剂的潜在副作用：ASIA综合征 尽管疫苗的安全性极佳，但近年来，人们对其可能的负面效应产生了新的关注，并在众所周知的上述副作用之外，描述了一种新的疾病实体。该实体是由佐剂引起的自身免疫/炎症综合征(ASIA)，首先由Shoenfeld等人提出。这种综合征包括一些免疫介导的疾病，很可能在遗传易感个体接触佐剂后发生。这种综合征的特征主要是产生自身抗体，并且一旦移除触发因素就会改善。在这种综合征的发作初期，一些外部因素，如感染性病原体或佐剂（例如尘埃、硅胶、铝盐等），作用于由特定HLA抗原介导的易发遗传背景，与自身免疫疾病(ADI)的发展相关。特别是，HLA-DRB1和PTPN22基因的同时存在已被证明是这些患者中最常见的自身免疫背景。根据最近的科学证据，一些病理状况，如结节病、Sjögren综合征(SS)、未分化结缔组织病(UCTD)、硅胶植入物不兼容综合征(SIIS)和免疫相关不良事件(irAEs)是ASIA综合征背景下的典型例子。除了疫苗中常见的佐剂外，许多其他物质如硅胶、石蜡、透明质酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也显示出佐剂特性。 根据Watad等人的说法，有两种类型的标准可以帮助诊断ASIA，分为主要和次要标准。主要标准包括在临床表现之前接触各种外源性刺激（感染、接触佐剂）以及出现典型的临床表现，如肌痛、肌炎、关节痛、关节炎、慢性疲劳、睡眠障碍、脱髓鞘、记忆丧失、发热和口干。次要标准包括自身抗体或针对佐剂的抗体的出现、特定HLA模式的存在（例如，HLA DRB1、HLA DQB1）以及自身免疫疾病的发展，即多发性硬化症或系统性硬化症。 一些先前的研究报告称，含有铝盐的疫苗有能力引发ASIA的发作。一个例子是由四价HPV疫苗（含铝盐）代表的，据报道在接种后几周内增加了易感个体自身免疫的风险，或乙肝疫苗。然而，Linneberg的一项重要研究关于铝盐的潜在副作用表明，接受皮下过敏免疫疗法的人多次接种含有氢氧化铝作为佐剂的过敏原，然后接受的铝量比三剂疫苗中包含的量高出约100倍，死亡率较低，并且比接受常规过敏疗法的对照组发展出更少的自身免疫疾病。科学家们的努力转向研究生物标志物以诊断ASIA或预测其易感性（除了前面已经提到的）。例如，ACE 1和IL-2受体在患有这种综合征的个体中增加了50%，维生素D的缺乏增加了ASIA的发病率（由于缺乏免疫调节效应）。强调易感性在ASIA的发作中似乎非常相关是很重要的，Watad等人通过分析500例ASIA综合征的病例很好地突出了这一点。这项研究表明，更高比例的女性个体、吸烟者以及那些以前有自身免疫疾病或家庭成员受影响的人患有ASIA。多基因自身免疫疾病在这些疾病中最常见，UCTD和Sjögren综合征的患病率最高，分别为38.8%和16.8%。在54.4%的自身抗体检测阳性的患者中，有48.2%是ANA阳性。考虑到自身免疫/炎症状态的发展背后有环境和遗传因素，这是显而易见的。暴露于疫苗接种和症状发作之间的中位时间为一周（2天至5年）；48.2%的人口在至少接触一次疫苗后出现临床症状。然而，除了这些科学证据外，一些研究显示接种佐剂疫苗和ASIA综合征之间没有关系。在这些研究中，已经表明疫苗接种和自身免疫之间的关联可能是由于混杂因素的存在和随机事件的结果，而不是真正的因果关系。疫苗接种或接触外来物质与潜在的自身免疫/炎症和免疫介导事件之间的可能联系不应该是降低疫苗接种覆盖率的“假神话”。 疫苗不良事件确实非常罕见。由于缺乏信息和强有力的数据，ASIA是一个恰当的总括术语，用来汇集与疫苗、硅胶或其他外来物质暴露作为共同根源的事件和表面上无关的反应。重要的是要强调，即使未来的研究显示佐剂和自身免疫之间存在真正的相关性，这也不会减少疫苗免疫实践所发挥的巨大且无可置疑的保护作用，它们提供了许多临床益处；事实上，疫苗已经有助于根除和控制许多可传播疾病，改善了人类生活质量。 5.结论 疫苗接种一直是并将继续是人类对抗传染病最有力的武器之一。多亏了这些有效且安全的预防工具，人类已经能够从世界许多地区根除人类历史上最可怕的敌人。最近COVID-19大流行很好地突出了疫苗接种的重要性，疫苗研究必须取得进一步进展，为未来的大流行做准备。疫苗的效果基于佐剂的基本属性和贡献。关于疫苗接种的未来，必须更加关注这些分子，以生产越来越安全有效的疫苗。这一领域的研究正在进行中，并且有几种产品正在研究中，以实现这一目标，造福人类。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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