浅析细胞治疗非病毒载体递送方式的多样性：电转和LNP递送应用

2024-04-17

细胞疗法信使RNA免疫疗法

在体外细胞治疗领域，常见的递送载体可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体系统如逆转录病毒、慢病毒等的成熟应用仍然占据着大部分的细胞治疗应用场景，但近年来大量的临床研究和技术管线信息显示，非病毒载体的临床应用逐渐得到大家的重视。目前，常见的非病毒载体有质粒、转座子、mRNA以及CRISPR/Cas9系统等，这些非病毒载体通常具有以下特点：载体的生产成本相对低、生产规模相对容易放大、批次间质量重复性相对较高。载体的基因载量相对更大从而满足某些特定的基因修饰应用场景。载体的免疫原性相对较低从而可能提升有效性和安全性。另外如mRNA载体在细胞中只瞬时表达而不整合到基因组的特点使其在某些适应症应用场景更合适。当然，无论哪种非病毒载体在体外细胞治疗领域的应用中，都需要通过一种高效的方法将非病毒载体导入到细胞中发挥生物学功能。目前非病毒载体递送的方法大概分为两大类：电穿孔转染递送和脂质体如LNP递送。健新原力针对电转及LNP脂质体递送进行了针对性的工艺开发，并已获得一定的积极数据。本文将对这两部分进一步展开解释并进行案例分享。电穿孔转染递送电转拥有独特的优势，细胞膜可直接被合适的刺激 (如电压脉冲)渗透形成瞬时的电穿孔，这有利于“裸”物质 (如DNA/RNA，蛋白质等) 在短时间内大量的进入细胞从而完成载体递送，因此合适的电穿孔参数是高效递送且不损伤细胞的关键因素。在最近的研究中，电穿孔因兼具高效和安全的优势已被证明是非病毒载体转染中极具前景、应用最为广泛的技术之一。电转递送工艺应用案例➤ mRNA-CAR-T细胞工艺应用案例：mRNA作为CAR的表达载体联合电转递送应用于CAR-T细胞制备。健新原力团队针对电转应用中的常见痛点——电转规模小、细胞活率低、转导效率低的问题，利用mRNA CD19 CAR进行了测试及开发。数据显示，一次电转细胞数量规模能够达到3E9，同时实现电转后24h细胞收获时的细胞活率达到80%以上以及细胞回收率达到90%以上；同时，电转后24h细胞收获时的CD3+CD19CAR+阳性率可达到85%以上，IFN-γ释放达到14,945 pg/ml。图1. 细胞活率和细胞数量图2. CD3+CD19CAR+阳性率和IFN-γ释放➤ T细胞基因编辑技术应用案例 (Cas9蛋白+TRAC sgRNA)：随着基因编辑技术逐步发展，电转染的应用也日趋广泛。下图展示了针对T细胞进行TRAC单基因敲除的案例。图2中A/B图展示的是在电穿孔RNP (Cas9蛋白+sgRNA) 转染体系中针对RNP用量及电转参数进行的体系优化研究。A图显示了对RNP用量的研究。结果显示，除RNP amount 1外, RNP amount 2/3/4条件下随着用量增加，敲除效率无明显变化，均达到95%以上。在细胞活率方面，RNP amount 2条件下敲除效率高于RNP amount 1，而细胞活率无明显影响。在该研究下，RNP amount 2为最优用量选择。B图是针对RNP用量及电转参数的优化。结果显示，在RNP amount 1条件下，电转P2程序的敲除效率略低于P1程序，均未达到95%以上，转染后细胞活率P2程序相对P1程序略高。在RNP amount 2条件下，不同电转参数P1/P2敲除效率无明显差异，均达到95%以上，但转染后细胞活率P2程序相对P1程序略高。在该研究下，RNP amount 2和P2电转程序为较合适的选择。C图展示的是我们在电穿孔Cas9 mRNA + sgRNA转染体系中进行的转染体系优化研究。结果显示的是不同厂家Cas9 mRNA分别在不同Cas9 mRNA用量条件下敲除效率，在该研究中，各组敲除效率无明显差异均达到90%左右，各组细胞活率无明显差异均达到95%以上。ABC图3. T细胞TRAC 基因敲除转染体系优化以下展示了T细胞TRAC/B2M/CD52多基因敲除的案例。图4展示的是经过电穿孔RNP (Cas9蛋白+sgRNA)转染体系优化后的T细胞双敲数据，流式结果显示TRAC/B2M双基因敲效率能够达到85%左右；图5展示的是我们经过转染体系优化后的T细胞三敲数据，流式结果显示TRAC/B2M/CD52三基因敲效率能够达到60%左右。图4. T细胞TRAC/B2M基因敲除图5. T细胞TRAC/B2M/CD52基因敲除脂质体如LNP递送各种合成的和天然衍生的脂质已经被用来形成脂质纳米颗粒(LNPs)，并在新冠疫苗新冠疫苗的研发中取得了显著的成果。近年来随着mRNA和LNP技术的发展，他们逐步突破了在疫苗领域的应用，逐步扩展应用范围，在靶向递送领域也实现了巨大的突破。➤ LNP进行CAR基因递送案例：平台测试了不同种类的LNP进行CD19CAR的T细胞递送，并检测了CD19CAR的转染表达效率。下图6的 A图数据显示，利用LNP3和LNP4转染T细胞具有较高的转染效率，两者转染后24h的CD19CAR+阳性细胞比例均达到95%以上，LNP4转染后72h内的CD19CAR+阳性细胞比例几乎没有降低。B图数据显示，各LNP对T细胞的体外转染后的细胞活率差异不大，转染后细胞活率均高于90%。AB图6. CD3+CD19CAR+细胞比例以及活率同时，健新原力也利用不同的LNP进行了T细胞基因编辑的测试，对比了不同参数条件下的敲除效率和细胞活率，进一步验证了LNP递送方式在基因编辑领域应用的更多可能性。健新原力“源力共赴 · 线下沙龙”第二站将于4月26日在上海再度启程！以“What If...探索不同载体递送技术的碰撞与火花？”为主题，进一步披露更多不同载体技术的内部开发策略及案例数据。相约健新原力线下沙龙，锁定新型药物载体递送系统前沿动态，对话上海，携手行业同仁解锁高效载体递送技术新时代，探索先进疗法药物创新及开发的新篇章。立即扫码报名参加嘉宾信息朱敏博士健新原力高级副总裁兼CDMO运营负责人朱敏博士是生物制药行业备受尊敬的专家，在工艺开发、表征和IND/BLA申报方面拥有超过17年的丰富经验。加入健新原力之前，朱敏博士曾在勃林格殷格翰（弗里蒙特）担任蛋白质科学总监，负责CMC战略和从工艺表征到BLA申报的跨职能协调，以及连续流平台下游设备设计和工艺开发项目。在此之前，朱博士在MedImmune/AstraZeneca（阿斯利康旗下公司）领导多个后期生物管线产品的下游商业化工艺开发、工艺表征和验证。朱博士在复旦大学获学士和硕士学位，南开大学获博士学位，曾是马普所和加大圣克鲁斯分校博士后，并在同行评审期刊上发表了20多篇文章，多次在国际生物制药会议上发表演讲。方子辉博士健新原力RNA卓越中心负责人方子辉博士曾就读于美国匹兹堡大学药学院，并荣获中国留学基金委奖学金，研究领域涉及生物化学、分子生物学和药学，博士期间主要参与lncRNA对肿瘤的调控机制的研究，发现并命名了一个全新的影响乳腺癌病人生存率的lncRNA，该基因收录于NCBI，相关成果第一作者发表在肿瘤顶级期刊Cancer Research（影响因子达13.312）；方子辉博士曾在丽凡达生物和艾美疫苗参与新冠mRNA疫苗的研发和产业化（临床三期），其它主持和参与的项目有mRNA蛋白补充疗法、mRNA肿瘤治疗等，在LNP递送系统的开发、应用和大规模生产中也有丰富的经验，mRNA新冠疫苗新冠疫苗文章发表于知名疫苗期刊Vaccines，并在RNA药物和LNP领域发明了多项专利。方子辉博士目前是浙江健新原力制药有限公司RNA卓越中心负责人，主要负责公司RNA平台的工艺开发和RNA技术创新，除了mRNA传染病疫苗外，在mRNA基因治疗、个性化肿瘤疫苗和mRNA-CART疗法等方面帮助合作伙伴开发了多个新的技术路线，并支持GMP生产和临床申报。姜书谭博士益杰立科免疫与干细胞平台负责人姜书谭，免疫学医学博士，博士阶段在中科院上海生化细胞所从事科研工作。2022年初加入益杰立科，担任免疫与干细胞平台负责人。何吉健新原力细胞事业部PD经理何吉，现任健新原力细胞治疗事业部PD经理，8年以上抗体和细胞治疗药物研发及CMC开发经验，主导和参与多个细胞治疗产品工艺开发和IND申报。目前专注于细胞治疗产品非病毒载体技术平台工艺开发和项目管理工作。张龙贵厚存纳米公司总经理张龙贵，厚存纳米创始人、核心技术发明人，目前担任公司总经理，博士毕业于四川大学&慕尼黑大学，药剂学专业。自2010年开始从事纳米递送技术研究，在材料设计与处方设计方面有多年的思考。社会层面担任德国华人华侨科技工商协会生物医药分会副主任，深圳光明留学生联谊会理事，四川大学研究生产业导师，深圳理工大学曙光书院荣誉辅导师。关于健新原力健新原力是专注于先进治疗药物（ATMP）的CDMO企业，致力于提供高质量端到端的质粒、RNA、LNP、病毒载体、细胞治疗等解决方案。我们的先进车间符合FDA、EMA、NMPA的cGMP标准，并采取严格的政策和措施以保护客户知识产权。管理团队拥有丰富的行业经验，在美国、欧洲和中国已成功领导多个创新药从开发到商业化全流程。健新原力在工艺开发和生产方面拥有专业知识和丰富经验，致力于加速全球创新药的开发和商业化，是您值得信赖的合作伙伴。