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芥子纳须弥：借空间之广博，赢时间之从容，成生命之精巧 清华大学免疫所刘万里与合作者在《Immunity》发表论文揭示IgG抗体稳态调控新机制及其在红斑狼疮发病和治疗中的潜在价值     2024年10月29日，清华大学生命学院、CLS生命中心、免疫学研究所、膜生物学全国重点实验室、教育部蛋白质科学重点实验室的刘万里与合作者在国际免疫学顶级期刊《Immunity》发表研究论文《Progressive polyadenylation and m6A modification of Ighg1 mRNA maintain IgG1 antibody homeostasis in antibody-secreting cells》，揭示IgG抗体稳态调控的新机制，并探索其在自身免疫疾病的发病和治疗中的潜在价值。     两千五百年前，古希腊的修昔底德（Thucydides）曾经这样描述公元前430年雅典城的一场瘟疫：“染病而垂死的病人，只能被那些已经染病但侥幸康复的人照顾。这些康复者虽然每天照料染病者，但对此并不担心，因为他们了解瘟疫的特征和进程。的确，他们很清楚，在这次瘟疫中，幸存者将不会被瘟疫第二次感染，至少不会因此丧命”。     两千五百年后，现代免疫学研究才逐渐的解析了其中的基本生物医学原理：病原体感染机体后，初始型B细胞（Mature naïve B cell）产生抗体抵御病原体；康复者获得记忆性B细胞，此类B细胞承载IgG抗体记忆，遇到相同病原体时快速免疫活化并产生IgG型的病原体特异性抗体，从而有效抵御病原体的致命攻击。凭借这一生物医学基本原理，人类已经清除天花病毒，接近根除脊髓灰质炎病毒，并有效控制了如麻疹、流脑、白喉等恶性传染病。尽管取得了巨大进展，人类对IgG抗体的稳态维持机制仍然缺乏深入了解。这一科学问题在临床免疫学研究的自身免疫紊乱等方面疾病尤为重要，例如系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE），SLE患者通常表现为异常的免疫应答，其体内的自身反应性B细胞打破免疫耐受，分化为浆细胞而产生过多的IgG型自身抗原特异性抗体，导致对自身细胞、组织、器官的攻击，最终造成临床表现各异的机体损伤。因此，理解IgG抗体的稳态调控机制，尤其是如何避免自身反应性抗体的产生，兼具基础免疫和临床免疫意义。     B细胞通过细胞质膜的B细胞抗原受体（BCRs）识别抗原并启动信号传导。表达IgM-BCR和IgD-BCR的初始型B细胞负责初次抗体反应，而表达IgG-BCR的记忆性B细胞主要在抗原再次暴露时产生高滴度高亲和力的IgG型的记忆性抗体反应。IgM，IgD和IgG等不同亚型的膜结合免疫球蛋白尾部（mIg-Tail）氨基酸序列不同，并影响其下游信号转导功能。例如mIgM-Tail和mIgD-Tail只有三个氨基酸，KVK，负责胞内锚定其穿膜区；而所有mIgG亚型具有进化上保守的28个氨基酸尾部，包含增强信号传导的免疫球蛋白尾部酪氨酸（ITT）基序。小鼠模型和临床队列研究揭示mIgG-Tail在记忆性B细胞的免疫活化和IgG抗体应答中起重要作用，也与自身免疫病、癌症和传染病等多种临床疾病密切有关（例如，刘万里团队前期工作：DOI: 10.1126/science.aap9310；DOI: 10.1038/s41590-024-01944-4；DOI: 10.1172/JCI153454；DOI: 10.1038/ncomms9552；德国Jürgen Wienands团队：DOI: 10.1038/ni.1764；DOI: 10.1038/ncomms6456）。上述研究主要是在蛋白氨基酸序列层面对mIgG的研究，且主要针对的是膜结合免疫球蛋白开展（也被称为，膜联型抗体）。     在B细胞中，膜结合（Membrane-bound, mem）和分泌型（Secretory, sec）免疫球蛋白（也被称为膜联型抗体和分泌型抗体，后者即为血液中的可溶性抗体）重链（Immunoglobulin heavy chains, IgH）起源于同样的种系基因座。在抗体分泌B细胞（Antibody-secreting cells, ASCs）中，sec IgH-mRNA转录本占主导地位，且从mem IgH到sec IgH mRNA的转换依赖于mRNA的可变多聚腺苷酸化加工。形成鲜明对比的是，在细胞质膜表达表面BCR的初始型和记忆性B细胞中，mem IgH-mRNA转录本占主导地位。ASCs中增加的IgH转录使得剪切和加尾机制能够利用近端的分泌型特异性poly(A)位点。然而，目前尚不清楚mem IgH向sec IgH转换过程中具体的调控机制。     基于上述科学问题，论文团队联合攻关，发现IgG1重链转录本（IgG1 heavy chain transcripts，Ighg1）mRNA的逐渐加尾和m6A修饰在ASCs中对IgG1抗体的稳态维持至关重要。作为m6A-reader的YTHDF1的缺失会减弱ASC中Ighg1 mRNA的半衰期，从而减少IgG1+ ASCs中的IgG1蛋白丰度，最终导致免疫后IgG在血清中含量的下降。更重要的是，研究团队还发现了一个此前未被研究的剪接中间体（Intermediate Ighg1），揭示其为受到m6A修饰的主要的Ighg1亚型。m6A修饰和YTHDF1的核定位均是维持ASCs中高Ighg1转录本丰度的关键因素，Ighg1与YTHDF1共同形成类似核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）颗粒的结构。该结构的形成和维持对IgG1抗体稳态有至关重要的作用。上述数据揭示浆细胞妙用乾坤，采取以方寸赢朝夕的哲学，来稳妥处理潜在的高度同质化的Ighg1 mRNA所造成的细胞内质网应激（ER stress）的严峻问题（图1）。 图1 ASCs通过整合Ighg1 mRNA加工修饰维持IgG抗体转录本稳态     为了继续探索上述分子细胞免疫学基础机制的临床价值，研究团队还将注意力转向了自身免疫疾病，特别其中最顽固最难缠最有代表性的SLE疾病。发现YTHDF1在SLE患者的ASCs中表现出过表达特征（图1）。通过单细胞测序分析，揭示一个具有高YTHDF1表达的ASCs亚群（ASC-C4）在SLE患者中显著增加，而在接受免疫抑制治疗后，这一亚群减少并回归到健康志愿者的相关水平。这一发现暗示YTHDF1可能在SLE等自身免疫疾病的发病过程中发挥重要作用，为了进一步的验证YTHDF1在自身免疫疾病中的潜在治疗价值，论文团队使用小鼠SLE模型进行了实验，发现阻断YTHDF1与m6A的相互作用能够有效缓解SLE症状，减少自身抗体的产生。这一结果表明YTHDF1-m6A通路可能成为自体免疫疾病治疗的新靶点。     综上所述，此项研究不仅揭示了YTHDF1在自身免疫反应的潜在病理作用，还为理解SLE的复杂免疫机制提供了新的科学依据。YTHDF1过表达可能是SLE患者体内对持续免疫刺激的过度应答，这种情况可能导致其负责分泌抗体的ASCs持续产生自身抗体，从而加剧免疫系统对自身组织的攻击。因此，YTHDF1的调控对于控制SLE的病情进展具有重要意义。通过抑制YTHDF1与m6A的相互作用，能够显著减少自身抗体的产生，表明这一靶点在控制异常免疫反应方面的潜力。     清华大学生命学院2018级博士生王昱为论文第一作者，博士后张少存为共同第一作者。清华大学生命学院、CLS生命中心、免疫学研究所、膜生物学全国重点实验室、教育部蛋白质科学重点实验室的刘万里教授是论文的首要通讯作者（Lead Corresponding Author），清华大学医学院徐萌研究员和生命学院博士后张少存是本文的共同通讯作者（Co-corresponding Author）。本研究的完成需要大力整合基础免疫学、临床免疫学、RNA生物学、分子成像学、分子细胞生物学、计算生物学和风湿病学等交叉学科的各自优势资源和思维。其中，清华大学生命学院的王昱和张少存为共同第一作者，王昱负责分子细胞以及生物信息学，张少存博士负责免疫学工作及文章整理工作；研究过程得到来自清华大学医学院祁海教授，合肥综合性国家科学中心大健康研究院童佩研究员，中科院生物物理所侯百东研究员，武汉大学周宇教授，西湖大学谢琦研究员，北京大学邹鹏研究员和北京大学人民医院风湿免疫科栗占国教授和孙晓麟研究员的大力支持。论文研究也得到了光飞纳科技有限公司齐冬和尹强工程师、江苏瑞明生物科技有限公司/单细胞检测多模式检测和武汉奥科生物技术有限公司的大力支持。项目联合研究团队得到国家自然科学基金委杰青项目、重大研究计划、专项项目、重点项目，国家科技部重点研发计划，北京自然科学基金重点项目、CLS生命中心、CLS博士后基金、清华大学免疫学研究所和深圳SMART基金的大力资助。 原文链接： https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/immunity/abstract/S1074-7613(24)00484-9 招聘信息 博士后和研究助理招聘广告（长期有效）： 刘万里团队致力于抗原受体介导的免疫识别、免疫活化、抗体应答及相关疾病的研究，在国内外主流的生物医学期刊共计发表SCIE收录的研究论文百余篇（Science、Cell、Science Immunology、Nature Immunology、Immunity×2、PNAS、J Clin Invest、J Exp Med ×3、Ann Rheum Dis、Cell Research×2、Protein Cell×2、Cell Discovery、Nature Communications×4、Science Advances、PLoS Biology、Science Signaling、J Cell Biol、J Allergy Clin Immunol、Leukemia×2、J Immunol×4、eLife×4等）；发表的论文共计被引用接近6800次（根据2024年10月谷歌学术统计）。曾获中国青年科技奖、药明康德生命化学杰出成就奖、谈家桢生命科学奖、树兰医学奖、英国科学会牛顿高级学者奖等奖项。相关科研项目曾获中国十大医学科技新闻、教育部自然科学奖、中华医学科技奖、北京市医学科技奖、湖北省自然科学奖等相关奖项。刘万里获国家杰青、教育部长江学者特聘教授、科技部科技创新领军人才、国家高层次青年人才等支持。研究得到国家基金委重点项目×2（项目负责人）、NFSC-NIH三年期项目（项目负责人）、优青项目（项目负责人）、专项项目（课题负责人）；科技部重点研发计划（项目首席）、863（青年科学家项目）和973（课题负责人）；北京市基金委重点项目（课题负责人）；梅琳达盖茨基金会项目（项目负责人）等支持。招聘博士后（免疫学博士为佳）、研究助理（本科生为佳）和技术员（中学毕业即可），仅限致力于学术研究者来申请（Email: liulab@tsinghua.edu.cn）。 月引潮生：YTHDF1与Ighg1的奇妙舞曲     以此项研究的分子细胞免疫学结论为背景，研究团队还绘制了一张中国风的图片描述这一基础机制。在抗体分泌细胞（ASC）的天际间，YTHDF1蛋白如同敦煌壁画飞天，与Ighg1转录本翩翩起舞，犹如丝带在清风中轻扬，宛若天际的一抹云霞。它们共同构成RNP颗粒，如皓月般静谧，点缀在细胞核的苍穹之中。在ASC中，这些璀璨的颗粒如何奏响一曲优雅的乐章，引导Ighg1转录本从巍峨的细胞核山峦中徐徐而下，进入广阔无垠的细胞质湖泊。当这些转录本缓缓降临，它们迎来了ASCs特有的风景，在细胞质的水面上，内质网宛若散落的岛屿。在这奇妙的境地中，这些转录本经历了一场梦幻般的蜕变，化作数万只“Y”型抗体，犹如湖面上绽放的浪花，耀眼夺目。这一优雅的机制展示了ASCs，犹如自然界的抗体工厂，所拥有的精巧蛋白质加工能力。细胞核内，RNP颗粒紧密压缩，仿佛将宇宙中的星光凝聚一处。它们逐步向细胞质释放的节奏，如同月华引发的潮汐，调和细胞内的平衡与和谐，减轻内质网因快速合成抗体蛋白的核心任务而产生的细胞应激。这体现浆细胞妙用乾坤，采取以空间赢时间的哲学，来妥善解决实施重要任务过程中所需要承受的巨大压力，这一普世问题。 相关领域的国内外专家点评（按姓氏笔画排序） 点评 | 田志刚（中国工程院院士，中国科学技术大学教授）     免疫系统中抗体分泌细胞（ASCs）的稳态调控在抗体应答和自身免疫疾病中扮演关键角色。2024年10月29日，清华大学生命学院、免疫学研究所、膜生物学全国重点实验室、教育部蛋白质科学重点实验室的刘万里教授及其团队在《Immunity》期刊上发表了题为《Progressive polyadenylation and m6A modification of Ighg1 mRNA maintain IgG1 antibody homeostasis in antibody-secreting cells》的研究论文。该研究聚焦于ASCs，揭示了IgG1编码mRNA的m6A修饰与抗体转录后调控的关键联系，并发现YTHDF1在IgG1抗体稳态维持中的重要作用，为其在系统性红斑狼疮（SLE）中的治疗潜力提供了新的视角。     研究团队在SLE患者样本中发现了高表达YTHDF1的ASCs亚群，并确认该亚群在疾病的发病和进展中发挥了关键作用。临床样本分析显示，在SLE患者中，YTHDF1的高表达与疾病严重程度密切相关。进一步的单细胞分析揭示，高表达YTHDF1的ASCs亚群在SLE患者接受免疫抑制剂等治疗后显著减少，表明其在SLE病理进程中具有潜在的治疗价值。通过小鼠SLE模型的实验，研究团队进一步验证了阻断YTHDF1与m6A相互作用的效果，发现其能有效缓解SLE症状，减少自身抗体的产生，显示出YTHDF1-m6A通路作为治疗靶点的巨大潜力。     研究揭示YTHDF1-m6A通路在ASCs中特定亚群的功能及其在IgG1抗体生成中的调控作用，为理解ASCs在SLE中的致病机制提供了新的视角。YTHDF1的过表达可能是免疫系统对SLE持续性刺激的代偿性反应，但这种反应在病理进程中或将加剧疾病。因此，靶向高表达YTHDF1的ASCs不仅为探索自身免疫疾病的分子机制提供了新方向，也为开发以ASCs为靶点的治疗策略奠定了重要基础。     这项研究整合基础免疫学、临床免疫学、RNA生物学、分子成像学、分子细胞生物学、计算生物学和风湿病学等交叉学科的各自优势资源和思维，通过对ASCs中特定亚群的深入探索，为包括SLE在内的自身免疫疾病的精准治疗提供了新方向，并为新型免疫调节药物的设计提供了坚实的理论支持。 点评 | 吴玉章（中国工程院院士，中国人民解放军陆军军医大学教授）     B细胞通过表面的抗原受体（BCRs）识别抗原，并在接触抗原后激活，最终分化为抗体分泌细胞（ASCs），产生特异性抗体。初始型B细胞主要介导初次免疫反应，而记忆B细胞则通过类别转换后的IgG-BCR在再次抗原暴露时快速应答并维持高滴度抗体反应。深入研究IgG-BCR的分子特征及ASCs中IgG抗体的稳态维持机制，对理解B细胞的免疫应答有重要意义，尤其在疫苗研发和优化免疫应答策略方面有潜在应用价值。     2024年10月29日，清华大学生命学院、免疫学研究所的刘万里教授与合作者在《Immunity》期刊发表题为《Progressive polyadenylation and m6A modification of Ighg1 mRNA maintain IgG1 antibody homeostasis in antibody-secreting cells》的研究论文。此工作围绕YTHDF1作为m6A修饰在B细胞终末分化亚群ASCs中的主要识别蛋白，揭示其对IgG抗体稳态维持具有重要调控作用。论文揭示YTHDF1通过识别m6A修饰，调控IgG抗体编码mRNA（Ighg1）的胞内稳态，并提出此分子机制是维持ASCs中的IgG抗体高效产生的关键。该研究提出YTHDF1与m6A修饰后的IgG编码mRNA在核糖核蛋白颗粒中的相互作用，为抗体的转录后调控机制提供了新思路，这项工作也揭示YTHDF1在抗体应答稳态维持中扮演了一个重要的分子调控角色，为深入理解抗体产生的分子机制提供了重要线索。     该研究进一步揭示了YTHDF1介导的IgG1抗体稳态维持机制，特别是其对m6A修饰的调控作用，强调了转录后调控在抗体生成中的重要性。ASCs中YTHDF1对mRNA稳定性的调控作用，为疫苗研发中的抗体持久性提供了理论支持。通过精准调控ASCs中抗体的生成，有望增强疫苗诱导的长效抗体应答，从而提高疫苗的保护力和免疫记忆效力。这项发现使研究人员对通过调控转录后水平来优化抗体应答有了新的理解，为疫苗免疫反应的增强提供了潜在的策略。     此外，该研究对自身免疫疾病的治疗价值也进行了探索。YTHDF1在SLE患者中的高表达，为自身免疫疾病的治疗提供了潜在靶点。在SLE等疾病中，异常的免疫应答常加重病情。研究发现YTHDF1的过度表达与自身抗体的产生密切相关，提示靶向YTHDF1-m6A通路的干预策略可能减少自身抗体的生成，从而缓解疾病症状。这一干预策略不仅为自身免疫疾病治疗提供了新的可能性，也为疫苗接种后如何避免不必要的自身免疫反应提供了参考。     总结而言，该研究在抗体稳态调控和自身免疫疾病的发病机制方面迈出了关键一步，不仅深化了我们对B细胞免疫功能的理解，也为疫苗免疫反应的优化和自身免疫疾病治疗提供了宝贵的理论支持。未来的研究如能进一步揭示YTHDF1及其通路在免疫应答中的更广泛作用，将为抗体工程、疫苗研发和免疫疾病治疗带来更多突破性进展。 点评 | 何川（沃尔夫奖得主，芝加哥大学John T. Wilson讲席教授）     自然界中RNA上存在超过150种化学修饰，其中N6-甲基腺苷（m6A）作为一种重要的表观遗传修饰，其在基因表达调控中的地位逐渐受到重视。RNA的m6A修饰在多种生物学过程中发挥关键作用，包括mRNA的加工、核输出、稳定性和翻译效率，这些过程对基因的时间和空间表达调控至关重要。     2024年10月29日，清华大学生命学院、CLS生命中心、免疫学研究所刘万里教授及其合作者揭示了IgG重链编码mRNA的稳态维持与m6A修饰的紧密关系，阐明了RNA化学修饰在适应性免疫调控中的重要作用。研究发现，YTHDF1通过识别和稳定m6A修饰的Ighg1 mRNA，有效促进了IgG1抗体的持续分泌。这一发现进一步扩展了我们对表观遗传调控在适应性免疫中的作用的理解。     研究亮点之一在于揭示了YTHDF1在抗体分泌细胞（ASCs）中作为关键调控因子的功能，通过形成稳定的核糖核蛋白复合体，有效维持了IgG1抗体的稳态。这揭示了一个有趣的YTHDF1新的功能，也进一步证明YTHDF蛋白之间有不同的功能。不仅深化了我们对表观遗传修饰在抗体产生中的作用的认识，还表明RNA修饰和RNA结合蛋白的相互作用在维持抗体的高效表达中至关重要。     研究还发现YTHDF1在系统性红斑狼疮（SLE）中的过表达与疾病进展相关。阻断YTHDF1与m6A的相互作用可减轻SLE症状，降低自身抗体的产生，表明YTHDF1-m6A通路可能是自体免疫疾病的一个治疗靶点。     这项研究具有多层次的科学意义。首先，它明确了YTHDF1在IgG1抗体稳态维持中的核心作用，展现了表观遗传调控对适应性免疫的影响。其次，研究还表明通过表观遗传干预来缓解自身免疫疾病的新策略，这为突破传统免疫抑制疗法的局限性提供可能。     从表观遗传的角度来看，本研究展示了RNA修饰如何作为表观遗传信息的载体，在细胞命运和功能调控中发挥作用。m6A修饰及其识别蛋白在RNA水平上执行类似的调控功能，揭示了YTHDF1在核内的一个新功能。这些发现为深入理解表观遗传调控如何连接环境信号与基因表达提供了重要的新视角，同时也为表观遗传在自体免疫病理机制中的应用提供了理论依据。

引言 微胶质细胞（Microglia）是唯一来源于髓系的神经胶质细胞，它们起源于胚胎发育早期的卵黄囊，能够通过血液进入大脑，影响着大脑的健康和病理状态。近年来研究发现微胶质细胞通过产生和分泌补体蛋白C1q，对大脑的免疫反应、突触修剪、神经保护和修复等至关重要【1】。而C1q作为经典补体途径的启动者介导了发育和疾病相关的突触修剪，导致下游的补体蛋白C3的裂解和沉积，随后被表达补体蛋白受体3（CR3）的细胞识别并清除【2】。此外，C1q不仅在补体级联反应中起作用，还通过与神经元的互作，影响了大脑的发育和免疫稳态。 有趣的是，在正常衰老过程中，C1q积聚在大脑实质、突触和一部分GABA能中间神经元中。缺乏C1q的成年小鼠（C1qKO）的海马区可塑性增强，并且与同龄野生型（WT）小鼠相比，认知和记忆衰退情况缓解，这些效应不是通过补体途径（特别是C3）或成年突触消除的变化介导的【3】。因此，C1q可能在大脑中具有与经典补体途径无关但与衰老有关的新功能。此外，在衰老的灵长类和啮齿动物皮层中，C1q存在于突触末端、轴突和树突中，这暗示了C1q与衰老相关的功能可能是通过影响神经元内部互作而实现的。解析C1q在衰老过程中神经元和微胶质细胞互作等方面的作用，意义重大。 近日，哈佛大学波士顿儿童医院Beth Stevens实验室在Cell杂志发表了题为Microglial-derived C1q integrates into neuronal ribonucleoprotein complexes and impacts protein homeostasis in the aging brain的研究文章，作者通过非偏好性蛋白质组学方法对不同发育阶段脑组织中分离的突触体进行了C1q的互作分析，揭示了C1q与核糖体蛋白和RNA结合蛋白（RBPs）的衰老依赖性相互作用，并进一步揭示了这些相互作用调控了成年大脑神经元的蛋白质翻译和稳态，并潜在影响了小鼠的学习和记忆等大脑功能。 为了揭示衰老依赖性C1q与不同蛋白质的相互作用，作者从不同年龄段（年轻、中年、老年）的C57BL/6J小鼠大脑皮层组织中分离了粗突触小体，并使用针对C1q的高度特异性单克隆抗体进行了C1q免疫沉淀（C1qIP）和定量蛋白质组学分析。结果表明随着年龄的变化，C1q的互作模式发生了显著变化，并伴随发育过程从胞外蛋白转变为胞内蛋白。更为重要的是，作者发现C1q与不同年龄段小鼠大脑中的神经元核糖体蛋白（RNP）和RNA结合蛋白（RBPs）存在相互作用。 之前研究通过单细胞测序和细胞特异性C1q基因敲除发现大脑中的C1q蛋白水平在衰老过程中显著上升，且脑相关巨噬细胞是神经元C1q的来源【4】。而作者通过改进神经元免疫染色方法，发现与原位微胶质细胞相比，成年动物中更多的C1q蛋白与神经元共定位，并涵盖了多个脑区，包括海马和运动皮层。C1q编码基因条件性敲除证实微胶质细胞和脑相关巨噬细胞是神经元C1q的来源。进一步利用新构建的神经元核糖体特异性荧光标记小鼠，作者发现C1q在成年小鼠的神经元内部部分与RNP复合物原位共定位。 RNP复合物蛋白的明显特征是具有本征无序区（IDR），而C1q氨基酸序列的胶原样结构域内有一个高度可预测的IDR。将纯化的C1q蛋白与总RNA混合后，会形成液-液相分离（LLPS）的浓缩体，液滴形成依赖于C1q（非其他补体蛋白）和RNA的浓度，且胶原样结构域和IDR对于RNA依赖的C1q LLPS至关重要。这一机制显示C1q通过RNA介导的相互作用影响神经元的蛋白质稳态，说明C1q能与细胞内RNA形成功能性复合物。随后，作者在小鼠大脑组织切片中同样发现C1q与RNA存在共定位，且RNA 是 C1q 与体内神经元 RNP 复合物互作所必需的。 为了直接测试外源性胞外C1q蛋白是否能够在体内被神经元内化并与大脑中的RNP复合物融合，作者将纯化的小鼠C1q蛋白注射到神经元GFP-trap C1qKO小鼠的侧脑室中，并对分离的组织进行了C1q的免疫标记，证明了外源性C1q蛋白可以通过内吞依赖性方式在体内与神经元RNase敏感性RNP复合物融合。 为了更好地可视化神经元对C1q的摄取过程，作者制备了荧光标记的C1q蛋白（C1q-594），并进一步证明C1q的胶原样结构域在介导依赖内吞的活体神经元摄取中的重要性，还显示RNA在介导C1q的细胞内互作中的重要性。 RNP复合物存在于多个细胞区室内，并在一系列的生物学过程中均发挥了重要作用，包括RNA运输、蛋白质稳态以及局部翻译等。鉴于C1q富集在这些结构中，作者接下来检测了C1q是否在衰老过程中改变了神经元的蛋白质翻译。结果表明成年野生型小鼠大脑组织中与七聚体复合物相关的蛋白质显著富集，而C1q敲除小鼠大脑组织中则富集了线粒体蛋白质，可见C1q的全局性敲除导致大脑内神经元的翻译和蛋白质稳态发生了明显变化。神经元中突触运输和RNP复合物的调节在介导塑性驱动的学习和记忆机制中至关重要，作者因此探究了C1q在小鼠学习和记忆中调节功能，发现微胶质和大脑巨噬细胞中C1q的条件性敲除虽然不影响恐惧记忆的获取或检索，但C1q条件性敲除后小鼠恐惧记忆的消退功能受损，表明C1q对于正常认知功能和记忆维持至关重要，特别是在成年和衰老期。 模式图（Credit: Cell） 综上，作者通过非偏好性蛋白质组学技术、液-液相分离实验并结合基因敲除小鼠的行为学研究，发现C1q不仅在调控突触消除中发挥作用，大脑免疫细胞来源的C1q以年龄相关的方式整合到神经元RNP复合物中与RNA互作，并调控了成年大脑神经元的蛋白质翻译和稳态，并潜在影响了小鼠的学习和记忆。这一系列实验结果共同证明了C1q在衰老大脑中的新功能，并突显了微胶质细胞和补体蛋白在神经元功能和认知健康中的重要性。 参考文献 1. M.I. Fonseca, et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J. Neuroinflammation, 14 (2017), 48. 2. B. Dejanovic, et al. Complement C1q-dependent excitatory and inhibitory synapse elimination by astrocytes and microglia in Alzheimer’s disease mouse models. Nat. Aging, 2 (2022), pp. 837-850. 3. D. Datta, et al. Classical complement cascade initiating C1q protein within neurons in the aged rhesus macaque dorsolateral prefrontal cortex. J. Neuroinflammation, 17 (2020), 8. 4. T.R. Hammond, et al. Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes. Immunity, 50 (2019), pp. 253-271. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2024.05.058 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

在体外细胞治疗领域，常见的递送载体可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体系统如逆转录病毒、慢病毒等的成熟应用仍然占据着大部分的细胞治疗应用场景，但近年来大量的临床研究和技术管线信息显示，非病毒载体的临床应用逐渐得到大家的重视。目前，常见的非病毒载体有质粒、转座子、mRNA以及CRISPR/Cas9系统等，这些非病毒载体通常具有以下特点：载体的生产成本相对低、生产规模相对容易放大、批次间质量重复性相对较高。载体的基因载量相对更大从而满足某些特定的基因修饰应用场景。载体的免疫原性相对较低从而可能提升有效性和安全性。另外如mRNA载体在细胞中只瞬时表达而不整合到基因组的特点使其在某些适应症应用场景更合适。当然，无论哪种非病毒载体在体外细胞治疗领域的应用中，都需要通过一种高效的方法将非病毒载体导入到细胞中发挥生物学功能。目前非病毒载体递送的方法大概分为两大类：电穿孔转染递送和脂质体如LNP递送。健新原力针对电转及LNP脂质体递送进行了针对性的工艺开发，并已获得一定的积极数据。本文将对这两部分进一步展开解释并进行案例分享。电穿孔转染递送电转拥有独特的优势，细胞膜可直接被合适的刺激 (如电压脉冲)渗透形成瞬时的电穿孔，这有利于“裸”物质 (如DNA/RNA，蛋白质等) 在短时间内大量的进入细胞从而完成载体递送，因此合适的电穿孔参数是高效递送且不损伤细胞的关键因素。在最近的研究中，电穿孔因兼具高效和安全的优势已被证明是非病毒载体转染中极具前景、应用最为广泛的技术之一。电转递送工艺应用案例➤  mRNA-CAR-T细胞工艺应用案例：mRNA作为CAR的表达载体联合电转递送应用于CAR-T细胞制备。健新原力团队针对电转应用中的常见痛点——电转规模小、细胞活率低、转导效率低的问题，利用mRNA CD19 CAR进行了测试及开发。数据显示，一次电转细胞数量规模能够达到3E9，同时实现电转后24h细胞收获时的细胞活率达到80%以上以及细胞回收率达到90%以上；同时，电转后24h细胞收获时的CD3+CD19CAR+阳性率可达到85%以上，IFN-γ释放达到14,945 pg/ml。图1. 细胞活率和细胞数量图2. CD3+CD19CAR+阳性率和IFN-γ释放➤  T细胞基因编辑技术应用案例 (Cas9蛋白+TRAC sgRNA)：随着基因编辑技术逐步发展，电转染的应用也日趋广泛。下图展示了针对T细胞进行TRAC单基因敲除的案例。图2中A/B图展示的是在电穿孔RNP (Cas9蛋白+sgRNA) 转染体系中针对RNP用量及电转参数进行的体系优化研究。A图显示了对RNP用量的研究。结果显示，除RNP amount 1外, RNP amount 2/3/4条件下随着用量增加，敲除效率无明显变化，均达到95%以上。在细胞活率方面，RNP amount 2条件下敲除效率高于RNP amount 1，而细胞活率无明显影响。在该研究下，RNP amount 2为最优用量选择。B图是针对RNP用量及电转参数的优化。结果显示，在RNP amount 1条件下，电转P2程序的敲除效率略低于P1程序，均未达到95%以上，转染后细胞活率P2程序相对P1程序略高。在RNP amount 2条件下，不同电转参数P1/P2敲除效率无明显差异，均达到95%以上，但转染后细胞活率P2程序相对P1程序略高。在该研究下，RNP amount 2和P2电转程序为较合适的选择。C图展示的是我们在电穿孔Cas9 mRNA + sgRNA转染体系中进行的转染体系优化研究。结果显示的是不同厂家Cas9 mRNA分别在不同Cas9 mRNA用量条件下敲除效率，在该研究中，各组敲除效率无明显差异均达到90%左右，各组细胞活率无明显差异均达到95%以上。ABC图3. T细胞TRAC 基因敲除转染体系优化以下展示了T细胞TRAC/B2M/CD52多基因敲除的案例。图4展示的是经过电穿孔RNP (Cas9蛋白+sgRNA)转染体系优化后的T细胞双敲数据，流式结果显示TRAC/B2M双基因敲效率能够达到85%左右；图5展示的是我们经过转染体系优化后的T细胞三敲数据，流式结果显示TRAC/B2M/CD52三基因敲效率能够达到60%左右。图4. T细胞TRAC/B2M基因敲除图5. T细胞TRAC/B2M/CD52基因敲除脂质体如LNP递送各种合成的和天然衍生的脂质已经被用来形成脂质纳米颗粒(LNPs)，并在新冠疫苗的研发中取得了显著的成果。近年来随着mRNA和LNP技术的发展，他们逐步突破了在疫苗领域的应用，逐步扩展应用范围，在靶向递送领域也实现了巨大的突破。➤  LNP进行CAR基因递送案例：平台测试了不同种类的LNP进行CD19CAR的T细胞递送，并检测了CD19CAR的转染表达效率。下图6的 A图数据显示，利用LNP3和LNP4转染T细胞具有较高的转染效率，两者转染后24h的CD19CAR+阳性细胞比例均达到95%以上，LNP4转染后72h内的CD19CAR+阳性细胞比例几乎没有降低。B图数据显示，各LNP对T细胞的体外转染后的细胞活率差异不大，转染后细胞活率均高于90%。AB图6. CD3+CD19CAR+细胞比例以及活率同时，健新原力也利用不同的LNP进行了T细胞基因编辑的测试，对比了不同参数条件下的敲除效率和细胞活率，进一步验证了LNP递送方式在基因编辑领域应用的更多可能性。健新原力“源力共赴 · 线下沙龙”第二站将于4月26日在上海再度启程！以“What If...探索不同载体递送技术的碰撞与火花？”为主题，进一步披露更多不同载体技术的内部开发策略及案例数据。相约健新原力线下沙龙，锁定新型药物载体递送系统前沿动态，对话上海，携手行业同仁解锁高效载体递送技术新时代，探索先进疗法药物创新及开发的新篇章。立即扫码 报名参加嘉宾信息朱敏 博士健新原力 高级副总裁兼CDMO运营负责人朱敏博士是生物制药行业备受尊敬的专家，在工艺开发、表征和IND/BLA申报方面拥有超过17年的丰富经验。加入健新原力之前，朱敏博士曾在勃林格殷格翰（弗里蒙特）担任蛋白质科学总监，负责CMC战略和从工艺表征到BLA申报的跨职能协调，以及连续流平台下游设备设计和工艺开发项目。在此之前，朱博士在MedImmune/AstraZeneca（阿斯利康旗下公司）领导多个后期生物管线产品的下游商业化工艺开发、工艺表征和验证。朱博士在复旦大学获学士和硕士学位，南开大学获博士学位，曾是马普所和加大圣克鲁斯分校博士后，并在同行评审期刊上发表了20多篇文章，多次在国际生物制药会议上发表演讲。方子辉 博士 健新原力RNA卓越中心负责人方子辉博士曾就读于美国匹兹堡大学药学院，并荣获中国留学基金委奖学金，研究领域涉及生物化学、分子生物学和药学，博士期间主要参与lncRNA对肿瘤的调控机制的研究，发现并命名了一个全新的影响乳腺癌病人生存率的lncRNA，该基因收录于NCBI，相关成果第一作者发表在肿瘤顶级期刊Cancer Research（影响因子达13.312）；方子辉博士曾在丽凡达生物和艾美疫苗参与新冠mRNA疫苗的研发和产业化（临床三期），其它主持和参与的项目有mRNA蛋白补充疗法、mRNA肿瘤治疗等，在LNP递送系统的开发、应用和大规模生产中也有丰富的经验，mRNA新冠疫苗文章发表于知名疫苗期刊Vaccines，并在RNA药物和LNP领域发明了多项专利。方子辉博士目前是浙江健新原力制药有限公司RNA卓越中心负责人，主要负责公司RNA平台的工艺开发和RNA技术创新，除了mRNA传染病疫苗外，在mRNA基因治疗、个性化肿瘤疫苗和mRNA-CART疗法等方面帮助合作伙伴开发了多个新的技术路线，并支持GMP生产和临床申报。姜书谭 博士益杰立科免疫与干细胞平台负责人姜书谭，免疫学医学博士，博士阶段在中科院上海生化细胞所从事科研工作。2022年初加入益杰立科，担任免疫与干细胞平台负责人。何吉健新原力细胞事业部PD经理何吉，现任健新原力细胞治疗事业部PD经理，8年以上抗体和细胞治疗药物研发及CMC开发经验，主导和参与多个细胞治疗产品工艺开发和IND申报。目前专注于细胞治疗产品非病毒载体技术平台工艺开发和项目管理工作。张龙贵厚存纳米公司总经理张龙贵，厚存纳米创始人、核心技术发明人，目前担任公司总经理，博士毕业于四川大学&慕尼黑大学，药剂学专业。自2010年开始从事纳米递送技术研究，在材料设计与处方设计方面有多年的思考。社会层面担任德国华人华侨科技工商协会生物医药分会副主任，深圳光明留学生联谊会理事，四川大学研究生产业导师，深圳理工大学曙光书院荣誉辅导师。关于健新原力健新原力是专注于先进治疗药物（ATMP）的CDMO企业，致力于提供高质量端到端的质粒、RNA、LNP、病毒载体、细胞治疗等解决方案。我们的先进车间符合FDA、EMA、NMPA的cGMP标准，并采取严格的政策和措施以保护客户知识产权。管理团队拥有丰富的行业经验，在美国、欧洲和中国已成功领导多个创新药从开发到商业化全流程。健新原力在工艺开发和生产方面拥有专业知识和丰富经验，致力于加速全球创新药的开发和商业化，是您值得信赖的合作伙伴。