深度丨「点击化学与生物正交」诺奖之外，大有可为！

2022-10-17

抗体药物偶联物抗体免疫疗法蛋白降解靶向嵌合体小分子药物

前言2022年诺贝尔化学奖被授予美国化学家卡罗琳·贝尔托西 (Carolyn Bertozzi)、丹麦化学家摩顿·梅尔达尔 (Morten Meldal) 和美国化学家卡尔·巴里·夏普莱斯 (K. Barry Sharpless)，以表彰他们“对点击化学和生物正交化学发展作出的贡献”。作者 | Ting点击化学：以碳-杂原子键 (C-X-C) 连接为基础发生快速、高效地合成有用新分子的化学合成方法。生物正交：利用点击化学的原理在生物体内发生不干扰自身生化反应的化学反应。Barry Sharpless和Morten Meldal将化学带入了功能主义时代，并奠定了点击化学的基础。Carolyn Bertozzi将点击化学带入了一个新的维度，并开始使用它来绘制细胞图。在许多其他应用中，她的生物正交反应现在有助于更具针对性的癌症治疗，如在抗体-药物偶联物 (ADC)、荧光成像以及药物递送等领域。本篇文章详细地总结了点击化学与生物正交的发展过程，介绍了基于点击化学的药物发现、核酸功能化、细胞标记、药物递送在疾病诊断和靶向治疗中的应用、在细胞复合物形成中的应用、ADC合成和PROTAC合成等应用方向。图1：2022年的诺贝尔化学奖得主Bertozzi教授、Meldal教授和Sharpless教授（源自：https://www.nobelprize.org/）01点击化学与生物正交的发展点击化学 (CC) 的概念首先由Sharpless提出，是通过以碳-杂原子键 (C-X-C) 连接为基础发生快速、高效地合成有用新分子的化学合成方法，已被广泛用于药物发现、新型药物递送系统 (DDS)、聚合物化学和材料科学[1]。▲CuAAC反应（铜催化炔烃叠氮化物点击化学）可以被认为是一种理想的点击反应，但Cu(I) 的毒性限制了这种特殊反应在体内应用中的使用。▲Bertozzi及其同事通过仔细设计和修饰炔烃基团，开发了一种无金属变体——应变促进的叠氮化物炔烃环加成 (SPAAC)，这种反应已被用在体外和体内的细胞表面上标记糖蛋白，而且没有明显的细胞毒性。由此也引出了生物正交反应，即利用点击化学的原理在生物体内发生不干扰自身生化反应的化学反应。▲环辛炔 (OCT) 与叠氮化物在生理条件下在没有铜催化的情况下发生反应，使用 OCT 进行 SPAAC 反应的缺点是需要较长的反应时间。修饰的 OCT 的无铜点击化学反应更快、毒性更低，并被广泛认为是一种有用的细胞工程方法。▲Blackman等人成功开发了s-四嗪和反式-环辛烯 (TCO) 衍生物的环加成反应之间的逆电子需求Diels-Alder (iEDDA)反应，产生了比 SPAAC 反应更快的无铜点击化学反应。研究人员开发了iEDDA反应的生物正交化学报告分子，包括降冰片烯、环丙烯、N-酰基氮杂环丁烷或乙烯基硼酸，它们在生理条件下与四嗪 (Tz) 反应条件，并已证明它们可用于用荧光团和功能分子标记细胞。表1：目前使用的点击化学反应的特点[2]02基于点击化学的药物发现▲高通量筛选（HTS）：CC与高通量酶测定技术相结合，例如微阵列，改变了药物发现中的先导发现和先导优化。由于点击反应的效率和水相容性，组装的产物可以直接筛选抑制作用，无需任何纯化。由CC合成的小分子文库已成功用于生成独特的抑制剂和重要酶的活性指导指纹图谱，这可能导致新的酶亚类的鉴定和表征[3]。▲基于片段的药物发现 (FBDD)：由于其高度模块化和高效的反应性质，CC也是开发基于片段的抑制剂的最实用方法之一。在CC的帮助下，可以设计密切相关但片段化前药的药物组合物，以与分子靶标（例如蛋白质或基因）特异性相互作用，从而实现个性化治疗。▲FBDD 中的动态模板辅助策略：CC的高度模块化和高效反应特性使合成化学家能够通过基于片段的酶抑制剂构建不同类别的化合物库。图2：用于开发酶或蛋白质抑制剂和药物开发的点击化学示意图[3]03基于点击化学的核酸功能化▲DNA纳米催化剂的设计：单链DNA由三个结构域组成。一部分是富含胸腺嘧啶的序列，可作为模板形成铜纳米粒子(CuNPs)。第二部分是可以靶向癌细胞的适体，如腺癌细胞表面独特且丰富地表达的粘蛋白1 (MUC1)。第三部分是一个15碱基的链，连接不同长度的富含胸腺嘧啶的区域和不同类型的适体[4]。DNA链不仅作为纳米载体的构建块和CuNPs的模板，而且对靶细胞进行特异性识别，由此产生的纳米催化剂在体外表现出良好的生物相容性、优异的催化转化效率和类型特异性细胞识别。核酸的可编程性通过简单地使用不同的适体，意味着可以实现灵活的靶向，表明这是一种有前景的癌症个性化治疗方法。图3：基于DNA的生物正交催化剂的设计[4]▲叠氮化物炔烃环加成提供的模块化可以作为一种用于生物学和纳米技术应用的核酸组装方法。在体外和细胞中构成了化学合成基因组DNA片段的策略，特别是那些含有修饰和表观遗传碱基的基因组DNA。用这种方法组装的基因在原核和真核系统中都起作用[5]。▲寡核苷酸的点击连接是产生反义寡核苷酸的有效工具。在这种情况下，三唑的存在增加了寡核苷酸对核酸酶降解的稳定性并减少了寡核苷酸的阴离子电荷，可能有助于细胞摄取。▲ASO的化学合成和点击连接已被用于引入碱基修饰和核苷衍生物（即. 锁定核酸，G-clamp），可增强靶标结合和错配敏感性。▲点击化学在CRISPR-Cas基因编辑的高度局部和生物学重要领域中的应用，以快速和高通量地生成sgRNA文库。Smith及其同事通过使用CuAAC化学将5'-hexyne tracrRNA (65-mer)与3'-叠氮化物crRNA成分(34-mer)结合来制备双分子指导RNA系统。布朗和他的同事也用不同长度的三唑键修改了相同的环，通过SPAAC或CuAAC反应将37-mer crRNA和66-mer tracrRNA缀合形成sgRNA构建体。图4 点击化学生成的sgRNA构建体与三唑键类型[5]04基于点击化学的细胞标记由于糖、氨基酸或脂质等生物成分在活细胞中被使用和代谢，因此使用带有化学标签的生物分子可以将化学标签引入活细胞中的蛋白质、聚糖和脂质。使用糖类似物的代谢糖工程对于将SPAAC和iEDDA化学底物引入活细胞特别有用。例如，具有化学标签的单糖和代谢糖工程中的N-叠氮乙酰甘露糖胺 (Ac4ManNAz) 被广泛用于细胞表面的工程改造。代谢糖工程和无铜点击化学的结合允许用各种分子稳定标记细胞，而不会影响细胞的特性。图5：通过无铜点击化学对小鼠脑中唾液聚糖进行体内荧光成像[6]05基于点击化学的药物递送在疾病诊断和靶向治疗中的应用▲叠氮基的肿瘤特异性标记：使用生物正交化学受体和SPAAC反应进行了成功的肿瘤靶向药物递送，DBCO修饰的药物可以通过SPAAC反应靶向表达叠氮化物的肿瘤细胞。使用癌症过表达酶可切割Ac3ManNAz类似物和SPAAC反应的癌细胞特异性叠氮化物标记方法可用于癌细胞特异性成像的药物递送。▲通过点击化学进行肿瘤靶向递送用于癌症治疗：用BCN和DBCO等点击化学化学物质修饰纳米颗粒可提高纳米颗粒与叠氮化物标记的癌细胞之间的亲和力。▲iEDDA反应在肿瘤特异性递送中的应用：iEDDA反应已被研究应用于癌症诊断，在早期时间点获得了较高的肿瘤与背景对比度，基于 iEDDA反应的预靶向方法减少了对非靶组织的辐射剂量。06点击化学在细胞复合物形成中的应用关于 CAR T 细胞疗法和巨噬细胞对肿瘤微环境影响的研究表明，细胞间相互作用正在成为一些最有希望的治疗策略。生物正交小分子可以为人工细胞粘附提供更稳定、稳健、多价和经济的化学键的替代方法。iEDD反应可用于在短时间内成功地进行稳定的细胞-细胞粘附。研究人员将多种细胞首先使用Ac4ManNAz代谢糖工程用叠氮基组进行标记。随后，通过Tz-DBCO或 TCO-DBCO处理将Tz和TCO掺入叠氮基修饰的唾液酸中。在微流体环境中将TCO修饰的Jurkat T细胞添加到TCO修饰的A549细胞层后，确认A549和Jurkat T细胞之间的人工粘附在 10 分钟内完成[6]。图8 点击化学人工细胞粘附[6]07基于点击化学的ADC合成Cu(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成(CuAAC)在抗体药物偶联物(ADC)的合成中具有巨大的潜力[7]。目前研究人员已经设计了高效且具有成本效益的基于CuAAC的ADC共轭方法，并证明可以快速合成ADC，并由此发展出GlycoConnect偶联技术，它能够利用天然糖基化位点实现定点偶联，可将单克隆抗体在短短几天内转化为稳定的conjugated ADC。该技术基于两个过程：首先是酶重塑（修饰和用叠氮标记），然后是基于无铜点击化学的有效载荷的连接。Synaffix公司已凭借包括GlycoConnect在内的下一代 ADC技术平台与多家企业展开合作。图6：下一代 ADC技术平台的开发（源自：https://synaffix.com/）08基于点击化学的PROTAC合成利用点击化学平台使用cereblon和VHL连接酶配体制备PROTAC文库，用溴结构域和末端外结构域4 (BRD4)配体 JQ-1和靶向cereblon (CRBN)和Von Hippel-Lindau (VHL)蛋白的连接酶结合剂，这些分子在连接酶/PROTAC/BRD4蛋白之间形成三元复合物的能力以及它们在两种肺癌细胞系中靶向降解BRD4蛋白的活性[8]。图7：使用点击化学进行PROTAC合成的一般策略总结点击化学和非铜生物正交反应在生物医学研究领域取得了重要进展。点击化学已经在药物发现领域发挥重要作用，点击化学还允许对细胞靶蛋白进行特异性标记，并且可以使用点击化学将细胞粘附在一起，还能够实现高效和有效的分子成像和药物递送，用于诊断和治疗。点击化学也可用于开发分子工具，如DNA纳米催化剂、化学合成基因组DNA、辅助CRISPR-Cas基因编辑、ADC和PROTAC合成等。总体而言，点击化学已成为生物医学领域和有机化学中的一种有价值的工具。主要参考文献 [1] Takayama Y, Kusamori K, Nishikawa M. 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