【Nature子刊】靶向KLHDC2的蛋白降解剂设计开发

2024-04-22

蛋白降解靶向嵌合体

靶向蛋白降解技术（target protein degradation, TPD）是药物设计领域的新兴技术。其中靶向蛋白降解嵌合体（proteolysis-targeting chimera, PROTAC）是一种异双功能小分子，由E3连接酶的配体、靶蛋白的配体以及连接链三部分组成，能够诱导靶蛋白和连接酶相互接近，导致靶蛋白的泛素化和降解。尽管目前在人体已经鉴别出600多种E3连接酶，但大多数降解化合物都是基于VHL和CRBN这两个E3连接酶的配体，只有少数E3连接酶的配体被用于小分子降解剂。因此，通过开发能够高效招募其他E3连接酶的小分子配体来探索更多有应用潜力的E3连接酶也是TPD领域的重要发展方向。E3连接酶亚家族CRL2中的三个成员KLHDC2、KLHDC3、KLHDC10能够控制C端为甘氨酸的蛋白质的降解。其中KLHDC2能够高效介导C末端序列为甘氨酸-甘氨酸的蛋白的降解，而且KLHDC2的kelch结构域与其底物肽Selk的高分辨率共晶结构已被解析。这使其成为TPD分子设计的一个潜在选择。Arvinas公司最近从头设计了靶向KLHDC2蛋白的配体分子，并验证了该配体用于PROTAC的可行性。此外，研究还发现KLHDC2会通过自身的C端组装成动态的四聚体，并且底物或小分子的结合可以调控该过程，为该酶的机制提供了新的见解。研究人员基于KLHDC2与其底物Selk的共晶结构，从头设计了小分子配体，并通过对接、模拟和实验的方法进行了多轮优化，最终得到了一类潜力较好的KLHDC2配体。分子设计的过程如上图a，为保证配体的亲和力和特异性，保留了最末端的甘氨酸结构，使用吡啶酮替换掉近端的甘氨酸，吡啶酮会与口袋残基形成阳离子-Pi及氢键相互作用。之后，再引入非平面的萘啶酮以稳固阳离子-Pi作用并形成氢键。在萘啶酮的一侧引入仲丁基或叔丁基插入疏水口袋，来模拟底物肽的脯氨酸结构。最后，在萘啶酮的另一端引入氨基甲酸酯的linker链，指向口袋外，用于连接靶向蛋白的配体。最终得到的配体结构(上图b)，KDRLKZ-1与2的区别主要体现在丁基的结构，KDRLKZ-3的甘氨酸羧基被酰胺化，用作阴性对照。研究人员以VHL-VH298这对E3连接酶-配体分子为对照，通过Alphalisa实验（上图c和d）验证了设计的配体分子能够特异性结合到KLHDC2蛋白。之后通过SPR实验（上图e和f）证明了配体与KLHDC2蛋白间的高亲和力。为了进一步证实配体分子与KLHDC2口袋的结合模式，他们解析了KLHDC2与KDRLKZ-1的共晶结构（上图g-i)，并和蛋白与底物肽的共晶结构对比，发现KDRLKZ-1与底物肽的重叠性较好，结合模式相同，各个分子与口袋残基的相互作用与设计时基本一致。此外，为了观察配体对KLHDC2酶活性的影响，他们还在昆虫细胞中共表达了KLHDC2以及与其结合的scaffold蛋白EloB、EloC，纯化三元复合物并在体外验证了配体分子对KLHDC2介导的泛素化过程的抑制作用。为了验证配体分子能够在体外发挥诱导接近作用。研究人员将胞内蛋白VHL或KLHDC2用HiBit标记后，把细胞裂解液与生物素衍生化的配体分子孵育，进行pulldown实验（上图a和b），证实了配体分子能够与胞内蛋白特异地高效结合。之后，在配体分子上接合BRD4抑制剂JQ1，合成KLHDC2-BRD4 PROTAC，并通过SPR实验（上图c和d）证实该分子能够与两个靶蛋白KLHDC2、BRD4结合，进而将二者拉近，同时发现具有结构较为刚性的且较长的linker的PROTAC分子的亲和力更高。在证实KLHDC2-BRD4 PROTAC分子能够诱导两个靶蛋白靠近后，他们将胞内蛋白BRD4用HiBit标记后，把细胞与PROTAC分子孵育后，通过检测细胞裂解液的荧光强度，来测定PROTAC分子降解BRD4的能力。考虑到含有游离羧基的化合物穿过生物膜的能力较差，他们设计了甲酯的前药形式。结果显示，所设计的PROTAC能时间依赖地降解细胞内的BRD4，且降解的效果与招募CRBN的PROTAC分子ARV-825接近(上图b和c)。甲酯修饰且linker为联苯形式的PROTAC效率最高，能够在4-6 h内将BRD4含量降低约93%（上图d），羧基直接游离的PRTOAC分子的降解活性有所降低；而酰胺形式的化合物只能表现出微弱的活性。接下来，他们为了证实所设计的PROTAC分子对蛋白的降解是靠泛素蛋白酶体系统实现的且依赖于KLHDC2连接酶，先在细胞与PROTAC分子的孵育体系中加入UPS抑制剂MLN4924或MG-132（上图e），发现化合物介导的蛋白降解受到了抑制。之后，通过siRNA将细胞的KLHDC2基因敲除后（上图f和g），也观察到了类似的现象，证实了其降解机制。此外，作者将JQ1分子更换后，设计了靶向雄激素受体的PROTAC,通过测定细胞靶蛋白的水平，证实了降解分子的高活性，且其降解能力依赖于UPS系统及KLHDC2酶（上图h-j）。针对纯化KBC（KLHDC2-CloB-CloC）复合物时出现的反常现象，他们进行了分析，对KLHDC2的结构生物学进行了新的探索。在用分子筛纯化KBC复合物（上图a）时，保留时间对应的分子量明显大于其单体的分子量，同时SDS-PAGE也出现相似的现象（上图b），对应低分子量的条带消失，只出现高分子量的条带，这些现象共同说明KBC复合物在体外是以多聚体的形式存在的。但是在KBC复合物与底物小肽孵育后，在分子筛和电泳图上则会出现对应低分子量的峰或条带，且表现出浓度依赖性。结果表明SelK肽与底物口袋的结合会影响KBC复合物多聚体的形成。他们首先猜想在KBC复合物的形成过程中，底物口袋应该是被KBC自身的某一段序列占据，而底物小肽与该序列竞争地结合KLHDC2的底物口袋。KLHDC2 C端蛋白质序列为NNTSGS，而SelK小肽结合在口袋中的序列为PPPMAGG，他们观察到这两条序列在结构上具有一定的相似性，尤其是与degron识别紧密相关的C端最末尾几个氨基酸（SGS与AGG）。自然地，推测KLHDC2的C端小肽能够结合到其底物口袋内，并通过alphaLISA实验证实了这一猜想（图4c）。相对于底物小肽纳摩尔级的活性，KLHDC2本身C端序列的结合能力在微摩尔级别，证实了底物能够高效地将KLHDC2的C端序列竞争掉（上图d）。SEC实验的结果也证实了这一结论（上图e）。之后研究人员解析了KLHDC2与肽NNTSGS的共晶结构（上图f），与之前解析的KLHDC2与Selk肽的共晶结构相比，两段小肽的重叠度很高，口袋关键互作残基无明显变化，表明两条肽与口袋的结合模式相同，进一步证实了猜想。为了进一步地阐释KBC四聚体的结构，研究人员用冷冻电镜对预先交联过的KBC复合物进行结构解析，发现该复合物中占据多数的组分是KBC四聚体，此外还有少量的二聚体或者三聚体（上图a）。二聚体内的两个KBC复合物分别命名为KLHDC21和KLHDC22，KLHDC21的C端与KLHDC22的底物口袋结合（上图b），KLHDC21的BC box和Cullin box与KLHDC22间存在氢键和疏水相互作用。由于KLHDC21的N端区域分辨率较差，所以并没有分析该部位的相互作用。KBC二聚体呈循环组装的模式，KLHDC22的C端会插入到另一个二聚体KLHDC21的底物结合口袋，以此类推，最终形成四聚体。Kelch结构域也参与蛋白间的相互作用，主要包括KLHDC21的179-183残基和KLHDC22的74-77残基间的互作（上图c）。综上，KBC复合物的KLHDC2的C端与相邻蛋白底物口袋循环组装，形成四聚体，亲和力较高的Selk肽能够竞争掉亲和力较低的KLHDC2 C端序列，使聚合物解体。之后，他们使用此前设计的KDRLKZ小分子进行SEC测试，发现KDRLKZ分子能够发挥与Selk肽类似的竞争作用（上图d），进一步验证了结论。最后，研究人员绘制了KBC复合物的酶活调控模型（上图e）。当没有底物或者小分子配体存在时，KBC依靠KLHDC2的C端序列组装成复合物，此时KBC复合物没有活性；当SelK肽或者小分子配体存在时，由于其与底物口袋的亲和力更强，原先四聚体复合物解体为具有活性的二聚体或者单体，并与CRL2催化亚基结合，以介导靶蛋白的泛素化。因此，KDRLKZ小分子不仅起到将靶蛋白拉近E3连接酶以实现其泛素化，更发挥了KBC复合物的激活剂的功能。参考文献Hickey, C. M., Digianantonio, K. M., Zimmermann, K., and et al. Co-opting the E3 ligase KLHDC2 for targeted protein degradation by small molecules. Nat Struct Mol Biol, 2024, 31, 311-322. doi: 10.1038/s41594-023-01146-w.声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓