KLHDC2

研究背景PROTAC是一种异双功能小分子，由E3连接酶的配体、靶蛋白结合配体和连接两者的连接体组成，促进靶蛋白和连接酶的相互作用，导致靶蛋白的泛素化及降解。虽然存在一些E3连接酶的小分子配体，但大多数降解化合物都是基于VHL和CRBN的配体，这些配体是Cullin-RING连接酶家族(CRLs)中特定E3连接酶的底物识别亚基。迄今为止，大约600个人类E3连接酶中只有少数被应用于TPD。增加TPD中使用的E3的数量将需要识别额外的E3连接的配体。探索除VHL和CRBN外的E3连接酶及其配体可以为TPD应用提供更多的化学选择。CRL包含人类E3连接酶的一个子集，包含约250种与Cullin支架偶联的底物连接蛋白组合，并且底物连接蛋白具有不同的结构和功能。CRL的一个子集在其羧基端消除具有特定氨基酸序列的蛋白质。其中，三种CRL2底物连接蛋白- KLHDC2, KLHDC3和KLHDC 10 -已被证明可以控制以甘氨酸残基结尾的蛋白质的降解。在一项研究中，测量了数千种带有不同C末端附属物的绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白质的稳定性，以甘氨酸结尾的C末端在驱动UPS介导的降解方面是最强的。可转移的降解促进序列称为降解子，具有临界C端残基的序列称为C端降解子。在识别甘氨酸末端C端降解的三个CRL中，对CRL2KLHDC2的研究最为详细。CRL2KLHDC2的最佳底物位于二甘氨酸基序中，在某些情况下，二甘氨酸基序是由蛋白质的内部蛋白水解裂解产生的在二甘氨酸末端底物肽存在的情况下，KLHDC2底物结合kelch结构域(KLHDC2KD)的高分辨率晶体结构已经被确定，提供了C端降解识别的原子水平细节。因此，CRL2KLHDC2是一种E3连接酶，可以驱动其底物蛋白的快速降解，并且具有良好的底物识别袋，使其成为TPD的一个有吸引力的潜在选择。   KLHDC2靶向小分子的发现利用计算机辅助药物设计(CADD)，著名的靶向蛋白降解药物研发公司Arvinas研究团队从KLHDC2KD与其同源C端底物SelK结合的可用晶体结构开始，SelK由其C端甘氨酸残基锚定(PDB：6DO3)。SelK肽的末端甘氨酸(Gly91)被保留，因为它与底物口袋结合最深，并与Ser269、Arg241和Arg236形成四个氢键(H键，黄色虚线)，而Gly90则被吡啶酮环取代(图1a，步骤1)。吡啶酮环从顶面和底面与Arg236和Lys147形成π-阳离子键，并模仿Gly90的羰基与Trp191形成氢键(图1a，步骤1)。添加了一个萘环后，该环与Lys147形成氢键，以加强π-阳离子与吡啶酮环的相互作用(图1A，步骤2)。大基团的萘甲酮环在两个环系之间实施了非平面构象，分别将KDRLKZ-1和KDRLKZ-2的仲丁基或异丁基引导到由Tyr50、Leu342、Leu343、Trp321和Trp370组成的疏水口袋中(图1a，步骤3)，同时将连接物氨基甲酸酯放置在Arg236附近形成临时氢键，并将连接子从口袋中引导到泛素的区域(图1a，步骤4)。作者依靠从头设计和化合物合成的循环来进一步优化这些新的小分子，并使用表面等离子体共振(SPR)的直接结合实验的连续迭代循环来生成数据，为配体优化提供信息。通过AlphaLISA置换试验测定化合物取代SelK多肽的能力。这最终导致了一系列小分子配体的发现，这些小分子配体有效地与KLHDC2KD结合(图1a-i)。为了评估新发现的KLHDC2小分子配体的特异性(图1b)，作者使用AlphaLISA检测了靶向VHL的小分子VH298和KLHDC2配体是否会相互影响，结果表明KLHDC2配体能够特异性结合（图1c，d）。SPR也测试了KDRLKZ-1与KLHDC2KD的直接结合，显示出1:1的结合模式(图1e)。SPR结果显示KDRLKZ-1与KLHDC2KD的结合Kd为0.36 μM，热移实验显示KDRLKZ-1与KLHDC2KD的结合Kd为+6.8℃, AlphaLISA和时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)实验显示KDRLKZ-1取代SelK肽的半最大抑制浓度(IC50)分别为0.21 μM和0.31μM。用酰胺取代KDRLKZ-1的羧基会导致结合减少，这与C端肽与KLHDC2的结合模式一致。羧基被酰胺取代的化合物将被称为“E3 dead”化合物(如KDRLKZ-3，如图1b所示)，它们不再与KLHDC2结合。   KDRLKZ-1在KLHDC2KD底物结合口袋中的结合位置通过共晶结构得到证实(图1g-i)。如图所示，KDRLKZ-1填充KLHDC2底物结合袋，并进行类似于天然底物的相互作用，其C端与SelK的C端几乎重合(图1h)。正如作者最初对KDRLKZ-1的从头CADD模型预测的那样，羧酸与KLHDC2形成4个氢键或盐桥作用;吡啶酮与Trp191形成氢键，并与Arg236和Lys147分别从上、下两个面发生π-阳离子相互作用;萘啶酮环在空间上强制形成非平面构象，引导羰基与Lys147形成氢键，并将正丁基置于疏水口袋中;连接链氨基甲酸酯位于Arg236附近并指向口袋外(图1i)。为了进一步表征KLHDC2配体，作者纯化了全长KLHDC2 E3连接酶及其同源接头蛋白EloB和EloC(该复合物以下简称KBC)，并使用天然底物(用菁5荧光团标记的USP1肽)进行了泛素化实验。作者确定了USP1泛素化依赖于KLHDC2，并发现过量的底物以及小分子配体KDRLKZ-1可以与USP1竞争KLHDC2的泛素化。这些实验证明纯化的KBC具有活性，并且可以与KLHDC2靶向的小分子结合。   图1KLHDC2配体结合能力研究为了测试新的KLHDC2配体在被合成为双功能分子时与KLHDC2结合的能力，作者通过与琼脂糖珠上固定配体的相互作用促进KLHDC2的下拉，使用HiBiT信号进行量化。开发了类似的测定VHL与其配体相互作用的方法。对于VHL和KLHDC2，携带靶向各自连接酶的特定探针的微球的HiBiT信号明显高于单独与生物素偶联的微球(图2a)。此外，生物素标记的KLHDC2-配体探针可以与细胞提取物中的内源性KLHDC2结合(图2B)，这种相互作用可以被多余的配体竞争性地抑制。  以JQ1作为靶蛋白结合配体，作者用KLHDC2配体的活性和E3-死亡版本(图2C)生成了一系列KLHDC2-BRD4 PROTAC分子(图2c-e)，并通过SPR测试了它们形成三元络合物的能力(图2d，e)。在我们的三元络合物SPR实验中，我们在SPR芯片上固定了BRD4上的His标记的溴域，并在没有或存在GST标记的KLHDC2KD的情况下展示了KLHDC2-BRD4 PROTAC分子。一个PROTAC分子K2-B4-3显示出很强的三元络合物形成(图2D)。三元复合体的形成效率取决于KLHDC2的招募，因为E3-Dead版本K2-B4-3D不形成三元复合体。图2基于KLHDC2的PROTAC在细胞中的降解能力在设计了可以诱导BRD4BD2和KLHDC2KD形成三元复合物的PROTACs之后，作者接下来测试了这些PROTACs是否可以驱动细胞中BRD4的有效降解。BRD4水平由添加到内源性BRD4中的氨基末端HiBiT标签表征。KLHDC2-BRD4 PROTAC分子由两种连接类型和三种KLHDC2配体生成 (图3a)，并将羧基改为甲酯基团作为前药，甲酯在进入细胞后会被细胞酯酶加工后转化为羧酸，并且酯基团比羧酸基团有更好的细胞渗透性。酰胺基PROTAC分子被设计为E3-dead阴性对照。    含有甲酯KLHDC2配体的KLHDC2-BRD4 PROTAC分子能够快速有效地降解HiBiT-BRD4，在4-6小时内降低93%(图3b,c)。带有酸基团的PROTAC也能降解HiBiT-BRD4，但不如含酯分子(6小时降解动力学如图3d所示)。根据SPR数据(图2)，非PEG连接子对BRD4的降解效率更高。正如预期的那样，具有酰胺基团的PROTAC分子在HiBiT-BRD4检测中几乎没有活性(图3d)。为了证实观察到的BRD4降解依赖于UPS，作者观察了使用蛋白酶体抑制剂MG-132和类泛素化抑制剂MLN4924后HiBiT-BRD4水平。结果表明，这两种UPS抑制剂都可以抑制在K2-B4-5e存在时观察到的荧光减少(图3e)。为了测试KLHDC2 - BRD4 PROTAC分子的活性是否依赖于KLHDC2，作者使用干扰RNA (siRNA)敲除KLHDC2，发现这完全阻断了K2-B4-5e诱导的HiBiT-BRD4降解(图3f)。作为对照，敲除不相关E3连接酶DCAF16对KLHDC2介导的BRD4降解没有影响(图3f)。在该研究中，作者发现KLHDC2-BRD4 PROTAC分子对细胞系中BRD2和BRD3也有降解效果(图3g)，这个结果与其他使用JQ1作为靶蛋白配体、基于CRBN或VHL的PROTAC表现一致。与BRD4的情况一样，K2-B4-5e对BRD2的降解在敲除KLHDC2后完全阻断(图3g)，但敲除DCAF16没有影响。为了扩大基于KLHDC2的PROTAC降解底物的范围，作者合成了基于KLHDC2，靶向雄激素受体(AR)的PROTAC分子，如K2-AR-1(图3h)。与BET家族蛋白类似，AR的降解也依赖于UPS和KLHDC2 (图3i，j)。图3KLHDC2-EloB-EloC E3连接酶复合体是一种动态的低聚体在纯化全长KBC E3连接酶(KLHDC2与EloB和EloC的复合体)的过程中，作者观察到KBC从尺寸排除色谱柱中洗脱出来的尺寸大于其预期的分子量。KBC络合物的分析尺寸排除层析显示了一个主要峰，其洗脱曲线与分子量约为200kDa的络合物一致(图4a，灰色痕迹，图4b，顶部凝胶)。尽管在一些底物连接蛋白的重组制剂中发现了底物的共纯化，但SDS-PAGE和LC-MS分析表明KBC复合体没有受到污染的迹象。基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析表明，样品中存在一到四个KBC络合物的混合物。值得注意的是，KBC与其底物SelK肽孵育后，洗脱图谱发生了变化。在分析尺寸排除色谱实验中观察到的这种变化是浓度依赖的，SelK导致KBC的洗脱向右移动。KBC-SELK肽复合体的右移洗脱图谱与预期的分子量匹配，与一个KBC复合体一致(图4a，蓝色痕迹，图4b，底部凝胶)。在MALDI实验中，作者也观察到KBC-SelK肽复合体的质量图谱发生了变化。   对于以上现象，作者提出了一个假设，即KBC复合体是一种动态的低聚物，受到底物结合到其KLHDC2KD口袋中的影响。由于KLHDC2是一种E3连接酶，它识别C-末端的GlyGly-End肽作为底物，作者想知道它自己的C-末端(终止于GlySer)是否参与了这种动态复合体的形成。在AlphaLISA置换试验中，来自KLHDC2 C-末端的短肽可以取代底物SELK(图4c)，尽管亲和力较低(图4d)。与它们较弱的结合亲和力一致，将这些肽与KBC孵育会导致KBC寡聚体的部分解离(图4e)。接下来，作者试图了解KLHDC2KD与其反式C-端肽形成的复合体的结构。KLHDC2 C端肽与KLHDC2KD络合物的共晶结构表明，其结合模式与其天然底物SelK的结合模式相同(图4f)。如图所示，Trp270为了适应Ser406的额外原子而略有移动，但与Arg236的关键相互作用被保留了下来。综上所述，根据作者对KBC复合体动力学的生化特征研究，KLHDC2以高阶低聚状态存在，这种状态可以通过占据其底物结合口袋来调节，比如通过它自己的C-末端。   图4Cryo-EM显示KLHDC2-EloB-EloC复合物是一个四聚体为了更详细地定义低聚KBC物种的性质，作者对化学交联的KBC复合物进行了单粒子冷冻电镜（single-particle cryo-EM）分析。KBC复合物的单粒子分析和cryoSPARC的初始模型生成显示了异质性KBC复合物，但大多数颗粒是KBC四聚体。四聚体复合物的三维(3D)变异分析在cryoSPARC中产生了四个密度不同的EloBC亚基类别。对密度最完整的一小部分粒子的进一步细化表明，KBC 分子的对称排列是二聚体的二聚。   因此，作者将C2对称性应用于非均匀细化（non-uniform refinement），以获得最终分辨率为3.8Å的全长KBC复合体的3D重建(图5a)。对称复合体的一半由两个KBC亚复合体组成；作者将一个原型染成紫色并将其命名为KLHDC21，将另一个染成橙色并将其命名为KLHDC22。在每个亚复合体中，KLHDC2是饱和的，而相应的EloB和EloC结合配对以较浅的颜色着色(图5a)。KLHDC2、EloB和EloC的kelch结构域在图中被明确地建模，并且在连续kelch结构域的界面处存在额外的密度，在那里它们与EloB和EloC相互作用。非对称KBC单元的叠加表明，KLHDC2与EloB和EloC的BC-box结合是由KLHDC2的Leu364、Ser366和Val372介导的。虽然BC boxes重叠，但KLHDC2的C-末端的其余部分没有重叠。C-末端的剩余部分对应于KLHDC2预测的Cullin box。如图7b所示，在四聚体中，只有紫色的KLHDC21 Cullin盒被正确定位以与CUL2相互作用，而KLHDC22 Cullin盒则没有。通过分析尺寸排除色谱，我们发现CUL2可以与KBC形成配合物(扩展数据图7c)。我们的模型进一步表明，连续KLHDC2分子之间的相互作用是由KLHDC21的N和C末端介导的。首先，KLHDC21的残基400-406与KLHDC22的底物结合位点结合介导了一组相互作用(图5b)。这些相互作用与上述晶体结构中观察到的与C端肽的相互作用非常相似。其次，BC boxes和Cullin boxes中KLHDC21的C端残基也与KLHDC22相互作用(图5b，插图)。KLHDC21的Lys376在KLHDC22的主链上与Asn184形成氢键;KLHDC21的Glu377与KLHDC22的His345形成氢键;KLHDC21的Phe375与KLHDC22的Leu58形成疏水相互作用。另外，作者观察到KLHDC21的N端残基向KLHDC22延伸，尽管在这个分辨率下很难解释具体的相互作用。作者没有看到KLHDC21和KLHDC22的kelch结构域之间有任何特定的相互作用。沿着KBC原蛋白的daisy chain，KLHDC22和KLHDC21'之间的许多相互作用是明显的。KLHDC22的C端被重新排列，以“打开”BC和Cullin盒子，它们围绕EloC2套圈，使KLHDC21'和EloC2接近(图5c)。KLHDC22的残基363-397组成了这个套索，作者已经在图中粗略地建模了(图5c，插图)，但该分辨率不足以最终描述该区域的大多数相互作用。   然而，很明显，在这个套索的最后，KLHDC22的400-406残基结合到KLHDC21'的底物结合口袋中。KLHDC22和KLHDC21'的kelch结构域之间也存在显著的相互作用。其中一个片段由KLHDC21'的Glu179、Thr180和Trp183以及KLHDC22的74-77个残基介导。第二个片段由KLHDC21'的His346和Arg347以及KLHDC22的Asp127介导(图5c，插图)。作者的低温电镜模型和生化数据表明，KLHDC2四聚体通过低亲和力相互作用结合在一起，这种低亲和力相互作用是由KLHDC2蛋白的C端与邻近底物结合袋结合介导的。高亲和力底物被认为取代了KLHDC2 C末端，从而将低聚物分解成较小的二聚体和单体。与它们作为高亲和力KLHDC2配体的属性一致，作者合成的KLHDC2靶向小分子系列也能够调节KBC四聚体动力学，正如通过分析尺寸排除色谱法测量的它们解离KBC四聚体的能力所示(图5d)。通过SPR动力学测量，具有较长半衰期的KLHDC2配体倾向于诱导更明显的四聚体解离(图5d)。总的来说，作者的数据与KBC通过其自身的C端结合在一起的模型是一致的，底物和小分子(配体或PROTACs)必须能够单独与KLHDC2底物结合口袋来破坏四聚体并诱导形成二聚体或单体，最终诱导生成与CRL2复合物结合的活性形式(图5e)。   图5总结    本研究发现了靶向KLHDC2的高亲和力小分子，这些小分子可用于TPD，不仅展示了KLHDC2如何被小分子所靶向，还描述了KLHDC2的动态组装，并证实了其四聚体的形式。此外，本研究描述的非共价小分子和PROTAC降解剂代表了第一个靶向C-末端的E3连接酶底物结合口袋并将其劫持为TPD的例子。最后，引入了小分子工具，这些工具将使未来能够对C-末端降解连接酶的生物学和机制进行研究。          作者：章建涛校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月23日        原文连接：Nat Struct Mol Biol. 2024，31(2):311-322. doi: 10.1038/s41594-023-01146-w. https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41594-023-01146-w#Abs1    声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

IDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛：聚焦Protac、分子胶、CNS、小分子GLP-1、改良型新药研发过程。合作展位事宜请联系：李欣欣 158 0045 2389Arvinas公司报道的新E3酶KLHDC2配体的发现及用于PROTAC。去年4月他们在会上做了presentation，但没有披露结构；后来又发了文章，今年初正式见刊。KLHDC2识别底物蛋白的C-terminal双甘氨酸特征序列 (degron)，这种特征序列可以在一定条件下由蛋白内切酶解产生。总之他们认为KLHDC2是一种有潜力用来做PROTAC的新E3 ligase。但据报道当时并没有已知的KLHDC2小分子配体，但有一些KLHDC2结合底物蛋白C末端多肽的共晶结构。因此他们尝试由CADD执行structure-based de novo design，如下图所示。结果是成功的，但也不是一蹴而就，如上图所示，初始的hit也很弱，之后经过计算+实验的迭代，在比较快的时间内优化到nM水平。下面是文章内容，有更进一步的细节。下面示意图与文字说明，描述他们如何从KLHDC2结合底物蛋白C末端多肽的共晶结构6DO3出发，基于CADD从头设计这类小分子的过程。当然，如前所述，实际过程可能没有示意图这样直截了当，需要计算+实验的合作及迭代。比较优化的分子结构如下图所示，这其中活性最好的是第2个分子，目前披露晶体结构的是第1个分子 (8SGE)，第3个分子是他们故意设计的inactive配体 (E3 dead)。分子中的羧基是copy了底物蛋白C-terminal的羧基，这个羧基与KLHDC2形成了多重静电相互作用，比较难以替换。其它的设计细节详见上面截自文章的文字说明。下图是文章release的共晶 (8SGE) 与设计之初参照的主要结构 (6DO3) 的叠合，绿色为小分子KDRLKZ-1，橘色为底物蛋白SelK的C末端肽。仅显示二者共有的氢键相互作用 (包括盐桥)。下图示意小分子KDRLKZ-1主要interaction。下图示意小分子含氧烷基链是一处可行的exit vector for PROTAC design。文章中以上文找到的KLHDC2配体做了PROTAC，如下图。其中有把酸酯化的，是前药思路，DC50及Dmax都比原型酸的要好一些。Amide的 (E3 dead) 活性很差。最后，另一家蛋白降解公司Kymera在专利中也报道了自己的KLHDC2配体，主要结构如下图所示。二者具有相同的关键基团，羧基，吡啶酮，以及连在吡啶酮上的酰胺。箭头指示各自主要的exit vector。Kymera也有依据他们自己KLHDC2配体做PROTAC，这里就不探讨了，感兴趣可以查询相关专利 (如WO/2023/192578A1)。图片来自领英Ziemowit Pokladek，但原文似乎已被删掉部分之前写过的structure-based de novo design其它案例In silico driven诺华YAP-TEAD PPI抑制剂的发现又一个应用计算方法peptide-to-SM的例子一个Structure-Based De Novo Design案例拜耳报道de novo hit到临床分子asundexian诺华KRAS分子JDQ443的发现Co-opting the E3 ligase KLHDC2 for targeted protein degradation by small molecules, Nat Struct Mol Biol, 2024 Jan 4https://www.arvinas.com/wp-content/uploads/2023/04/small-molecule-protac%C2%AEhijacking-and-structural-characterization-of-an-e3-ligase-klhdc2-for-targeted-protein-degradation.pdfENDIDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛：聚焦Protac、分子胶、CNS、小分子GLP-1、改良型新药研发。合作展位事宜请联系：李欣欣 158 0045 2389戳这里，阅读原文立即领取免费参会入场券

近日，Kymera Therapeutics宣布，公司在研药物KT-474（SAR444656）的1期临床试验取得积极结果：该药物对缓解化脓性汗腺炎(HS)和特应性皮炎(AD)患者的疾病负担和症状产生了积极的作用，且在中度至重度疾病患者中观察到了全身抗炎作用。据悉，KT-474是一种IRAK4降解剂，而IRAK4是细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶IRAK家族的成员之一。当白介素-1受体（IL-1R）或者Toll样受体（TLR）与配体结合后，IRAK-4能够介导信号传导，激活下游炎症因子的表达。其在全身炎症反应中作用重大，能够作为治疗各种炎症相关性疾病的一个有效潜在靶点。图1 IRAK4与TLR信号传导图片来源：参考文献1除了在自体免疫与炎症性疾病的潜在治疗用途，大量体外、动物甚至人体临床试验证实，IRAK4抑制还可用于治疗实体瘤、血液肿瘤、骨髓增生异常综合征、糖尿病性肾病与神经损伤等多种疾病的治疗，从而使靶向该激酶的先导化合物的开发成为当前的热点之一，目前已有多个IRAK4抑制剂/降解剂已经进入临床试验阶段。本文在分析总结了试验阶段中的IRAK4抑制剂/降解剂的基础上，还对相关临床试验承办人最新的专利布局进行简单分析，以供读者了解这一领域的研发方向与关键公司的研发策略。01专利检索与分析纳入分析的专利符合以下标准：①PCT专利②IRAK4抑制剂/降解剂的化合物专利③公开年为2019年及以后④最新公开的三件专利由于大部分专利的标题化合物具有高度的可变性，本文在列举了活性较佳的标题化合物性化合物（O.E），还列举了较大（L.E）与较小（S.E）的标题化合物，以提高所列化合物的结构代表性。02结果01 阿斯利康临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局WO2022122876该专利合成并公开了约120个2-环己基-4-烷氨基-2H-吲唑-5-羧酰胺类化合物的IRAK4抑制相关活性，各化合物中的羧酰胺的氨基均为5-6稠合芳香双环取代。其中的代表化合物如下表所示。WO2023152349该专利公开了约30个2-环己基-4-烷氨基-2H-吲唑-5-羧酰胺类化合物的IRAK4抑制活性，其羧酰胺的氨基为氧代吡啶取代，其中代表化合物如下表所示。该专利的部分标题化合物对cKit激酶亦有良好的抑制活性。02 Bayer临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局该专利公开了约250个1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺类化合物的IRAK4抑制活性，其中代表化合物如下表所示。03 Aurigene & Curis临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局2019年至今，未公示Aurigene或Curis申请的任何IRAK4相关化合物PCT专利04 吉利德临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局WO2020036830该专利公开了约70个7-(4-氨基吡啶-2-基)吡咯并[1,2-b]哒嗪-3-腈类化合物IRAK4抑制活性，各化合物结构中吡啶环的5-位多为不同形式的三唑基取代。其中的代表化合物如下表所示。WO2020036979该专利公开了约80个7-(4-氨基吡啶-2-基)吡咯并[1,2-b]哒嗪-3-腈类化合物的IRAK4抑制活性，与WO-830专利的主要区别在于，该专利标题化合物吡啶环的5-位多为(R)-(2-氟-3-羟基-3-甲基丁基)氨基甲酰基取代，该侧链亦存在于多个其他申请人的IRAK4抑制剂专利的标题化合物中。该专利的代表化合物如下表所示。WO2020036986该专利公开了以下表中的化合物为代表的约350个5-(1,3,4-噻二唑-2-基)吡啶-4-胺类IRAK4抑制剂的相关活性，其中吡啶环的2-位取代的二环稠合体系的多个环原子可在C与N之间切换。与前两件专利相比的主要区别在于，吡啶-5-位为噻二唑取代。05 Kymera Therapeutics,Inc临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局Kymera Therapeutics,Inc是一家专注于PROTAC技术开发的公司，2019年以后公开的相关专利亦均以IRAK4降解剂为发明主题。WO2022236339该专利仅公开了一个氘代IRAK4降解剂的相关活性，其结构如下式所示。该降解剂在OCI-LY10细胞活力试验中测得的表观DC50在100~500nM之间。各代表化合物的结构式从左到右依次为IRAK4结合部分、连接子与泛素E3连接酶结合部分。此外，WO2023137439还以上式IRAK4降解剂非氘代物的组合物作为发明主题，提示该IRAK4降解剂进行了深入的研究。WO2023147594该专利公开了700余个如下表中的化合物所代表的IRAK4降解剂。WO2023192586该专利公开了以下表中化合物为代表的约100个IRAK4降解剂的相关活性，各代表化合物的结构式从左到右依次为IRAK4结合部分、连接子与KLHDC2结合部分。06 Rigel Pharmaceuticals临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局WO2021041898该专利虽然对100余种通式如下式所示的IRAK4抑制剂提出了权利要求，但未公开具体化合物的IRAK4抑制活性。WO2023183377该专利仅公开了4个嘧啶-2-基吡咯类IRAK4抑制剂的相关活性，其中活性数据最多的标题化合物与对照化合物的结构如下表所示。WO2023192479该专利公开了约40个稠合芳香三环类IRAK4抑制剂的相关活性，各化合物的三环体系均通过氧甲基与吡咯烷酮环相连。代表化合物结构式如下表所示。上表中各代表化合物与辉瑞公司中止临床试验的Zimlovisertib(PF-06650833结构如下式所示)具有高度的结构相似性。07 上海美悦生物科技临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局WO2020135513该专利公开了约40个N-(2H-吲唑-5-基)吡啶-2-羧酰胺类IRAK4抑制剂的相关活性，所述的吡啶环还可以苯环稠合成喹啉环。代表化合物如下表所示。WO2021057785该专利亦以N-(2H-吲唑-5-基)吡啶-2-羧酰胺类IRAK4抑制剂为其发明主题，与WO-513专利的主要差别在于，该专利标题化合物结构中的吡啶氧化成N-氧化物。选自约25个有活性数据的化合物中的代表化合物如下表所示。此外，WO2022194252与CN115252609分别以结构如下式所示的IRAK4抑制剂的晶型与组合物作为主要的发明主题，提示该IRAK4抑制剂进行了深入的研究。08 正大天晴临床试验阶段的在研药物最新化合物专利布局虽然2019年以来未公开正大天晴申请的任何IRAK4相关的化合物PCT专利，但WO2021147968以结构如下所示的IRAK4抑制剂的盐及盐的晶型作为发明主题，提示正大天晴很可能对该IRAK4抑制剂进行了深入研究。03小结虽然多篇论文显示，IRAK4是当前先导化合物开发的热门靶点之一，但暂无化合物成功上市，且在研先导化合物大部分处于临床前与早期临床试验阶段。另外，辉瑞公司与Evommune分别放弃了已经进入临床试验阶段的Zimlovisertib与EVO-101，提示这一领域新药开发面临较大的挑战。本文的专利分析显示，大部分IRAK4抑制剂/降解剂的临床试验承办方在近年都有一定数量的化合物专利布局，说明其一直在努力寻找更优化的先导化合物。各专利的标题化合物类型以小分子抑制剂居多，基于PROTAC技术的抑制剂开发是这一领域的重点方向之一。参考文献1:Yadav H,Shirumalla RK.Emerging trends in IRAK-4 kinase research.Mol Biol Rep.2023 Sep;50(9):7825-7837.doi:10.1007/s11033-023-08438-w.Epub 2023 Jul 25.PMID:37490192.2:Bai YR,Yang WG,Hou XH,Shen DD,Zhang SN,Li Y,Qiao YY,Wang SQ,Yuan S,Liu HM.The recent advance of Interleukin-1 receptor associated kinase 4 inhibitors for the treatment of inflammation and related diseases.Eur J Med Chem.2023 Oct 5;258:115606.doi:10.1016/j.ejmech.2023.115606.Epub 2023 Jun 28.PMID:37402343.声明：本内容为作者独立观点，不代表药智网立场。如需转载，请务必注明文章作者和来源。对本文有异议或投诉，请联系maxuelian@yaozh.com。责任编辑 | 氢键转载开白 | 马老师 18996384680（同微信）商务合作 | 王存星 19922864877（同微信） 阅读原文，是昨天最受欢迎的文章哦