mRNA递送系统开发：筛选靶向性LNP脂质组分以增强抗肿瘤活性
2024-02-27
疫苗信使RNA免疫疗法
导读：脂质纳米颗粒（LNPs）通过促进抗原呈递细胞的摄取、成熟和活性来增强癌症免疫治疗。尽管已知脂质成分的选择及各成分的相对比例影响体内转染效率和组织特异性递送，但缺乏辅助脂质电荷和LNPs成分相对比率对给药部位不同细胞群转染影响的深入分析。2023年12月，约翰霍普金斯大学医学院&纳米生物技术研究所Hai-Quan Mao作为主要研究者在Nature Biomedical Engineering【IF: 28.1】发表文章：《Screening for lipid nanoparticles that modulate the immune activity of helper T cells towards enhanced antitumour activity》。他们报道了一种LNPs筛选方法，通过优化辅助脂质的类型和脂质成分比率，筛选增强骨髓来源树突状细胞的成熟和体外抗原呈递的LNPs，然后在皮下或肌内递送LNPs后评估黑色素瘤小鼠模型中的免疫激活和肿瘤生长抑制。一、研究背景LNPs已用于递送治疗癌症和预防其他感染的mRNA疫苗，通常由辅助磷脂如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸（DSP）、可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质及靶向选择性器官的脂质组成。冠状病毒大流行期间开发的两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗证明了作为mRNA疫苗递送工具的LNPs的安全性和有效性。抗原呈递细胞（APC）内翻译的抗原直接加工并呈递在MHC-I上，激活CD8+ T细胞和Th1免疫反应；非APCs内翻译的抗原被APCs内化并呈递在MHC-II上，激活CD4+ T辅助细胞，促进B细胞分化，并启动Th2免疫反应。多项研究表明，将Th2反应与Th1介导的细胞免疫相结合有助于清除SARS-CoV-2感染的细胞并增强疫苗效力。但mRNA LNPs的组成、治疗效果和免疫激活谱之间的相关性，特别是Th1和Th2反应之间的平衡以及与NK细胞介导的细胞杀伤的协调性，仍需进一步研究。二、筛选靶向DCs的LNP组分研究人员用DLin-MC3-DMA（可电离脂质）、胆固醇、DMG-PEG2000（聚乙二醇化脂质）及6种辅助磷脂（阳离子脂质DOTAP和DDAB、两性离子脂质DOPE和DSPC以及阴离子脂质14PA和18PG），通过改变以下参数生成含1,080个成员的LNPs文库：（1）DLin-MC3-DMA辅助脂质与摩尔百分比为20%-80%；（2）胆固醇与DMG-PEG2000重量比为10-500；（3）DLin-MC3-DMA与辅助脂质重量比为1-200；（4）mRNA中可电离脂质带电基团与磷酸基团摩尔比（N/P比）为4-12。为选择具有APC强特异性转基因表达的LNPs制剂，首先使用终浓度为1μg/ml的萤火虫荧光素酶（fLuc）mRNA（在pH4、25mM醋酸镁缓冲液中制备）评估LNPs在DC2.4细胞（永生化小鼠树突状细胞系）中的递送效率；后使用流式细胞术筛选出7种高转染效率LNPs制剂，包括C3、C9、C10、D1、D2、D6和F5。具有相对较高转染效率的LNPs制剂为：（1）胆固醇与DMG-PEG2000比值接近500：1；（2）DLin-MC3-DMA与辅助脂质比值接近1：1；（3）DLin-MC3-DMA和辅助脂质的中等摩尔百分比在40%-60%之间；（4）中等N/P比，约为8。进一步地，在BMDCs中使用上述7种LNPs负载终浓度为1μg /ml卵清蛋白mRNA（mOVA，在pH4、25mM醋酸镁缓冲液制备）进行免疫刺激作用测试，72h后，与PBS相比，OVA蛋白和其他制剂（C10，D6和F5）使用于抗原呈递的SIINFEKL在MHC-I上的表达显着升高，C10-30%，D6-21.5%，F5-4.0%），C10，D6和F5相较于阳性对照组，CD86+ SIINFEKL-H-2Kb+和CD40+SIINFEKL-H-2Kb+的表达显著升高，BMDCs上清液中炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的分泌水平也显著升高。研究人员将负载10μg mCre的LNPs注射Ai9小鼠，评估皮下或腹腔注射C10、D6和F5后小鼠体内递送的功效。与腹腔注射相比，皮下注射后在引流淋巴结中检测到更高比例的转染细胞。单剂量mRNA LNPs注射3d后，与PBS处理组相比，C10、D6和F5组中SIINFEKL-H-2Kb+CD11c+分别升高4.0、2.7和3.8倍。综上，C10、D6和F5在体内和体外都显示出有效的抗原呈递和免疫刺激作用。图1 用于转染和诱导DCs中抗原呈递及成熟的mRNA脂质纳米颗粒的体外筛选三、C10、D6、F5独特的免疫学特征C57BL/6小鼠皮下注射3次（第0、7和14d）PBS、10μg游离OVA蛋白、Alhydrogel（与OVA蛋白以1：1的比例混合）或载有10μg mOVA的C10、D6、F5或SM-102，评估了LNPs诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应：C10、D6、F5组中CD3+CD8+IFN-γ+、CD3+CD8+GranzymeB+和CD3+CD8+TNF-α+细胞群增加，而SM-102和Alhydrogel组无显着反应，与SM-102相比，C10、D6或F5组CD3+CD8+TNF-α+增加1.5倍；CD3+CD8+IFN-γ+分别增加1.4、1.6和1.9倍；CD3+CD8+GranzymeB+分别增加3.0、2.1 和4.7倍。第21d，将脾脏匀浆成细胞悬液进行离体抗原再刺激（100μg/ml OVA和2μg/ml SIINFEKL），6h后C10、D6或F5组均诱导了有效的抗原特异性Th1型反应，与SM-102相比，CD3+CD4+IFN-γ+T-bet+数量高出5倍，且促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-6）表达增加。但仅C10组诱导了有效的抗原特异性Th2型反应，其诱导的CD3+CD4+IL-4+GATA-3+Τh2细胞比背景高18倍，而D6和F5组仅分别高出2.1和1.0倍。通过监测体重、血清细胞因子（IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4）验证了C10、F5和D6制剂的生物安全性。图2 3种LNPs制剂对淋巴结细胞转染和免疫激活进行体内评估四、C10、D6、F5的抗肿瘤作用在第0、7和14d用PBS、10μg游离OVA蛋白、Alhydrogel（与OVA蛋白以1：1的比例混合）或载有10μg mOVA的C10、D6、F5或SM-102对C57BL/6小鼠进行皮下注射，第21d在小鼠右后侧皮下注射1×106个B16-OVA细胞，评估C10、D6、F5作为预防性癌症疫苗的疗效及长期保护作用。所有LNPs组都强烈抑制肿瘤生长，延长了生存时间，C10、D6、F5和SM-102的中位生存期分别为40、32、30和32d，而游离OVA蛋白组为15d，Alhydrogel组为20d，同时触发Th1和Th2反应的C10提供长效保护。为了评估C10作为多种肿瘤模型治疗性疫苗的效果。第0d在C57BL/6小鼠右后侧皮下接种3×105个B16-OVA、MC38-OVA、EG7-OVA或B16F10细胞，在第4、11和18d，用含有10μg mOVA或含10μg编码Trp2或Gp100的mRNA的C10对小鼠进行免疫，发现C10在所有组中表现出强烈的肿瘤抑制作用：（1）B16-OVA治疗模型：中位生存期为26d（阴性对照17d），C10与免疫检查点抑制剂（100μg抗CTLA-4 mAb，第6、13、20和27d腹膜内给药）联合给药时，中位生存期延长至33.5d，表现出协同作用。（2）MC38-OVA治疗模型：中位生存期为47d（阴性对照26d），与100μg抗CTLA-4 mAb协同将中位生存期延长至53d。（3）EG7-OVA治疗模型：中位生存期为25d（阴性对照组15d）与抗CTLA-4 mAb协同将中位生存期延长至37d。（4）C10-mTrp2和C10-mGp100的中位生存期分别延长至23和23.5d，但未与抗CTLA-4 mAb表现出协同作用，协同作用的差异可能与抗原免疫原性、抗原加工、T细胞受体亲和力和肿瘤微环境有关。图3 具有抗肿瘤功效的mRNA LNPs（C10、D6、F5）作为预防性疫苗图4 具有抗肿瘤功效的mRNA LNPs作为治疗性疫苗五、与T细胞和NK细胞双重攻击相关的长效保护在第0、7和14d分别用PBS或载有10μg mOVA的C10、F5对C57BL/6小鼠进行免疫，从第18d起每隔4d注射一次细胞耗竭抗体（α-CD3、α-NK1.1、α-CD10），第21d注射1×106个B16-OVA细胞。用C10免疫小鼠肿瘤后22d，多个效应淋巴细胞群富集，其中NK细胞、T细胞、CD8+ T细胞分别富集6.9、11.2、7.4倍，T（CD3+）细胞、NK（NK1.1+）细胞或B（CD20+）细胞的耗竭显著降低了C10 mOVA LNPs赋予的存活率优势。而F5-mOVA LNPs组未发现上述富集效应，且抗肿瘤作用仅在T细胞耗尽时才会丧失。综上，C10在促进强细胞毒性T淋巴细胞反应和Th1抗癌反应以及促进体液和Th2反应方面发挥双重作用。图5 T细胞和NK细胞的协同攻击导致长效保护六、诱导Th1或Th1、Th2联合免疫反应的潜在途径研究人员用编码荧光素酶的mRNA评估三种LNPs的转染效率。不同组成的LNPs转基因表达主要局限于给药部位，在转染的细胞类型、免疫刺激细胞因子方面存在差异：C10组转染的细胞中非免疫细胞与免疫细胞的比值为4.5，分别是D6组和F5组的2.9和3.6倍；注射C10 4h和24h后，注射部位诱导的Th1细胞因子（IFN-γ和TNF-α）与D6或F5水平相似，Th2细胞因子（IL-4）的平均水平分别比PBS组高1.6和4倍，表明C10能够诱导强烈的Th1和Th2反应，这种特性与其在注射部位有效转染树突状细胞和非APC的能力密切相关。为研究非免疫细胞与免疫细胞的转染效率之间的差异，定量体外递送至共培养的C2C12细胞（小鼠成肌细胞系）和BMDCs（1:1）并使用流式细胞术检测mCherry的表达。C10染细胞中C2C12:BMDCs高达33.41，D6高达22.21，而F5仅为3.94。当用含fLuc mRNA的LNPs仅转染C2C12细胞时，转染C10分别比转染D6和F5的细胞高25和289倍；但用含有mCherry mRNA的LNPs转染纯BMDC培养物时，C10、D6和F5的转染效率相似；用含50%Cy5标记的mGFP的LNPs和50%未标记的mGFP转染时，3组都观察到约100%的Cy5+细胞（即细胞摄取），但由于C2C12细胞中C10比D6和F5具有更强的内体逃逸和胞质递送能力，导致仅27.7%和8.9%的C2C12细胞分别转染了D6和F5，转染C10的细胞为98.1%。图6 mRNA LNPs的局部转染、细胞摄取和内体逃逸七、总结重复给药后的安全性为将LNPs的效用扩展到治疗性疫苗和其他基因递送应用提供了强劲的动力。该研究提供一种通过调整LNPs脂质组分来定制抗原特异性免疫激活谱的方法，即可通过改变LNPs制剂的组成实现在各种细胞中优先转染及改变在体内不同细胞中递送的转基因水平，而优先转染策略可能是调节Th1和Th2反应之间抗原特异性免疫刺激平衡的潜在工具。先前癌症疫苗递送系统研究表明，有效的Th1免疫反应对于抗肿瘤功效至关重要，该研究中优化的LNPs递送的mRNA疫苗，通过比较诱导Th1或Th1加Th2免疫反应的两种代表性LNPs制剂，发现Th2反应与Th1反应的结合进一步提高了肿瘤抑制效率，由C10-mRNA LNPs产生的各种细胞群（包括T细胞、NK细胞和B细胞）的协调免疫反应为对抗肿瘤攻击提供了更有效和全面的保护。参考文献[1] Zhu Y, Ma J, Shen R, et al. Screening for lipid nanoparticles that modulate the immune activity of helper T cells towards enhanced antitumour activity. Nat Biomed Eng. 2023 Dec 11. doi: 10.1038/s41551-023-01131-0. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。
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