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近日（3月25日），丹麦的制药巨头诺和诺德宣布将收购一家专注于心脏病的德国Biotech公司Cardior Pharmaceuticals。诺和诺德表示交易总价值约为11亿美元（10.25亿欧元）。该金额包括预付款以及取决于某些开发和商业里程碑的额外付款。近年来，大药厂对于心血管领域的布局越来越频繁，而诺和诺德也是如此，例如自家的司美格鲁肽跨界应用和IL-6抑制剂ziltivekimab等等。而此次诺和诺德看重的是Cardior的核心管线CDR132L，这是全球首个进入心脏病临床试验的基于非编码RNA的疗法。CDR132L与心衰心衰是世界上导致死亡的主要病症之一。目前使用的心力衰竭的治疗药物选项包括血管紧张素调节剂、β受体阻滞剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、血管紧张素I-受体阻滞剂与脑啡肽酶抑制剂、血管扩张剂、正性肌力剂或SGLT-2抑制剂的组合。尽管几项临床研究已显示，所有这些药剂均可显著降低心力衰竭诱发的死亡率，但5年死亡率仍令人难以接受地高达近50％。因此，非常需要开发新型且更高效的心力衰竭治疗方法。心肌肥大是心衰的重要原因，最初心脏肥大是一种生理上的代偿机制，旨在减小壁应力和增加心输出量。然而，长时间的心脏肥大就会发展为收缩功能障碍、心脏代偿失调和最终导致心力衰竭。这其中就涉及许多关键心肌肥大信号。miRNA正好能在这种不利的心脏重构中起着关键作用，Cardior的研究团队2013年就发现miR-132通过靶标转录因子FOXO3起作用，可以诱导心脏肥大，反之抑制miR-132就有可能治疗心脏肥大引起的心衰。CDR132L就是这一发现临床转化的产物。CDR132L是心肌细胞中miR-132表达的有效抑制剂，是由DNA和LNA构件(building block)组成的混合物，具有核苷间硫代磷酸酯键联。根据专利可知可能结构如下所示：目前CDR132L已在多国布局专利：CDR132L的临床意义目前现有技术的心力衰竭药物疗法主要局限于不太晚期的疾病阶段(纽约心脏协会NYHA设定了I期和II期；NYHA I/II)。然而，现有的治疗药物不能阻止至晚期(NYHA的III期和IV期)的进展，而这些晚期患者往往频繁住院，1年死亡率甚至超过70％。作为最后的手段，植入泵(左心室辅助装置，LVAD)和最终的心脏移植可能是极少数末期心力衰竭患者唯一的救命选择。然而，这两种最后手段价格需求极高：①LVAD的安装和维护费用极高，包括设备本身的成本、手术费、住院费、后期定期维护和更换电池等费用。②心脏移植其费用同样非常高昂，而且还有心脏供体的稀缺问题，价格方面涵盖了手术费、供体心脏获取费用、手术前后长期的免疫抑制药物费用、康复治疗费用以及可能发生的并发症治疗费用。他人的心脏还存在排异问题，还需要长期观察，一旦出现问题后果可能严重。因此，迫切需要降低死亡率和住院率的新型、高效的疾病中止疗法来为患者提供治愈希望。而CDR132L作为下一代心衰药物可以通过钙信号传导和收缩性以及心脏功能的正常化，改变心脏自噬和稳态，适应不良的心脏重构的减弱。而在I期临床中，CDR132L展现出了对多个生物标志物和关键指标的改善：比如，对心脏的射血分数(EF)有积极影响，NT-proBNP作为心脏安全标志物未受到CDR132L治疗的不利影响。，这表明心室舒张功能障碍的患者可以从中受益。又比如，心脏纤维化生物标志物I型前胶原蛋白C端前肽(PICP)和半乳糖凝集素-3(Gal-3)在CDR132L治疗的心衰患者中显示水平降低，表明具有抗纤维化作用。而CDR132L在心脏组织内的半衰期约为3周，安全性良好，未发现严重不良事件。目前CDR132L正处于II期临床，尝试在心肌梗死患者中进行恢复治疗。未来这一疗法可能向与标准治疗联用等方法开发。对于诺和诺德的意义有趣的是，对于诺和诺德来说，司美格鲁肽在心血管方面的益处已经通过监管机构的审批而可能在跨界市场占据巨大的优势。但是……如果不是肥胖的患者，那可能就无法享受这一益处。而恰巧CDR132L的治疗范围，反而选定在并不是那么肥胖的患者中，收购CDR132L意味着覆盖面不会重叠，或者是肥胖的患者瘦身下来后，可以继续服用CDR132L来确保对心脏功能重建的益处。不仅不会和司美格鲁肽冲突，还能恰巧适配。另外考虑到CDR132L的临床大多集中在欧洲，在获得诺和诺德的青睐后，该药品可以迅速在全球开展临床，同时也有已申请专利保护未来市场。总结总的来说，CDR132L具有一定潜力，此次被诺和诺德收购也是对潜力的认可，有可能加入现有联合疗法增强疗效，当然潜在的挑战也有，如CDR132L的持久性，停药后是否会反弹，是否对心脏以外的miR-132也有靶向作用等等，可以期待未来的发展情况。

前言在过去的几十年里，我们对癌症的理解发生了根本性的变化。我们现在认识到，癌症不仅仅是一种疾病，而是一个复杂的生态系统，涉及广泛的非癌细胞及其在肿瘤内的无数相互作用。肿瘤微环境（TME）包括多种免疫细胞类型、癌相关成纤维细胞、内皮细胞、周细胞和各种其他组织-受体细胞类型。这些宿主细胞曾被认为是肿瘤发生的旁观者，但现在已知在癌症的发病机制中发挥关键作用。TME的细胞组成和功能状态可能会因肿瘤发生的器官、癌症细胞的固有特征、肿瘤分期和患者特征而大不相同。了解TME从肿瘤的发生、进展、侵袭到转移性播散和生长的各个阶段的重要性，了解肿瘤细胞内在、细胞外和疾病进展的系统介质之间的复杂相互作用，对于合理开发有效的抗癌治疗至关重要。TME形成的基本原则癌细胞通过招募和重编程非癌宿主细胞以及重塑血管系统和细胞外基质（ECM）来协调支持肿瘤的环境。这个动态过程依赖于癌症细胞和TME的常驻或招募的非癌细胞之间的异型相互作用。有多种机制可以调节这种细胞间对话，包括通过细胞间接触和旁分泌信号传导。接触依赖性通讯由粘附分子介导，包括整合素、钙粘蛋白、选择素和免疫球蛋白超家族成员，也通过间隙连接和膜蛋白通道介导。除了直接的细胞-细胞接触外，通过释放细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶的旁分泌信号传导对TME内的细胞间通讯也至关重要。这些分子是为了应对癌症固有特征和细胞应激而分泌的，它们可以来源于TME中的多种细胞类型，并通过与受体结合或ECM重塑对靶细胞发挥直接和间接作用。ECM通过充当分泌分子的基质和细胞粘附和迁移的底物来促进细胞间通信。蛋白酶对ECM的重塑释放了束缚的分子，从而产生局部高浓度的释放介质。此外，癌症和TME细胞通过包括整合素和CD44在内的受体直接接触周围的ECM，从而形成癌症中复杂的信号网络。TME的组成和功能状态在患者之间可能有很大差异，即使在同一癌症类型中也是如此。患者的特定因素，包括年龄、性别、生活方式、体重指数和微生物组，可以影响TME，肿瘤发生的器官也会影响TME。不同的器官具有独特的组织固有免疫细胞和基质细胞类型，组织类型可以决定这些细胞的功能状态。除了解剖部位依赖的机制外，TME最重要的调节器可能是癌症细胞本身。癌症的细胞内在特征，包括改变的（表观）遗传学、代谢重编程和解除调控的信号，是肿瘤如何形成其微环境的关键决定因素。随着高分辨率分析技术的迅速发展，癌症固有特征和TME之间的更多联系将被揭示，这可能为针对单个肿瘤合理设计TME靶向策略奠定基础。肿瘤起始：组织稳态的破坏恶性细胞必须克服多个节点才能成功形成肿瘤，其中许多取决于破坏周围组织的正常化信号，然后劫持微环境过程来支持发展中的肿瘤。从免疫攻击到免疫逃避的平衡我们的免疫系统对于抵御危及生命的病原体、伤口愈合和根除受损细胞至关重要。为了执行这些功能，免疫系统具有令人难以置信的多样性和适应性，具有严格控制的机制来限制组织损伤和恢复体内平衡。对癌症演变的分析表明，初始低度病变的特征是原始T细胞大量涌入，表明免疫系统在其最早阶段就感应到了转化。然而，随着病变的进展，观察到活化的T细胞和髓系细胞积聚的转变，以及参与免疫抑制的基因上调。活化的CD8+T细胞减少，PD-L1和CTLA4表达增加，调节性T细胞（Tregs）增多，T细胞受体（TCR）克隆类型减少。随着这些病变的进展，向免疫抑制性TME的转变随之而来。在肿瘤发生的早期阶段，始发性肿瘤导致支持肿瘤的炎症环境，几乎所有进展性肿瘤都会诱导不同水平的T细胞、自然杀伤（NK）细胞、，以及CD8+T细胞的DC排斥或触发功能障碍程序。当肿瘤同时刺激髓系细胞，特别是巨噬细胞和中性粒细胞的募集和激活时，这两种细胞共同形成了肿瘤支持性炎症环境。炎症：肿瘤进展的催化剂在发展中的肿瘤中，炎症的特征是破坏适应性先天免疫细胞的串扰。在炎症信号传导延长、缺氧、低pH和代谢产物水平改变的影响下，这种炎症会变为慢性而具有破坏力。随着肿瘤的生长，共同进化的免疫环境发生了深刻的变化，导致细胞毒性CD8+T细胞和NK细胞减少、功能失调的CD8+T淋巴细胞、免疫抑制性CD4+FoxP3+Treg和调节性B细胞逐渐增多，而CD4+T细胞向促炎性Th2表型倾斜，DC表现出成熟和功能缺陷。与此同时，髓系细胞越来越多地被动员到TME，在那里它们使其表型适应局部炎症。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和中性粒细胞（TANs）通常是不同TME中最丰富的髓细胞。驱动这些细胞动员和激活的关键肿瘤衍生介质包括CSF-1、CCL2、VEGF-A、TNF-α和巨噬细胞的信号素3A、G-CSF、GM-CSF、IL-6、CXCL1、CXCL2、IL-1β以及中性粒细胞的IL-8。它们在人类肿瘤中的存在通常与较差的预后和较差的治疗反应相关。CAFs和ECM在TME发展中的多方面作用与免疫细胞一起，CAF是许多肿瘤的主要成分。一些肿瘤，如肝细胞癌，是由异常活化的成纤维细胞引起的，特别是在纤维化或肝硬化的肝脏中。其他类型的癌症也可以诱导纤维化，单细胞技术的最新进展揭示了以前未被重视的CAF的表型和功能多样性。CAFs对TME的动态变化也表现出可塑性。最近的研究表明，CAF由多种亚型组成，这些亚型在肿瘤进展过程中发生变化，并在空间上受到调节。在胰腺癌中，三种不同的CAF亚型共存：肌成纤维细胞（myCAF）、炎症CAF（iCAF）和抗原呈递CAF（apCAF），具有不同功能和转录组可塑性。在其他癌症类型中，也已经发现了类似的CAF亚群。最近的研究表明，CAFs可以通过多种机制帮助肿瘤逃避免疫控制。CAF主要负责TME内ECM的沉积和重塑。CAF通过分泌CXCL12和TGF-β导致ECM沉积产生物理屏障，直接阻止T细胞募集或激活。此外，CAFs还通过分泌包括IL-6、IL-1β、VEGF、CSF-1、CCL2在内的介质动员和编程免疫抑制性髓系细胞，间接干扰抗肿瘤免疫，并通过促进Tregs的积累发挥免疫抑制活性。CAF还直接影响癌症细胞。在人类乳腺癌和肺癌样本中，CD10+GPR77+CAF亚群通过分泌IL-6和IL-8为癌症干细胞提供生存空间，从而促进肿瘤形成和化疗抵抗。血管生成促进癌症进展血管生成，即发展新生血管的过程，对肿瘤的发生至关重要。血管生成是一个复杂的过程，涉及内皮细胞、周细胞、壁细胞、癌症细胞、肿瘤相关免疫细胞和CAFs之间的广泛串扰。肿瘤血管不断暴露于促血管生成的因素，导致血管系统紊乱、渗漏和弯曲。这会影响肿瘤的氧合，改变免疫细胞动力学，并减少药物对肿瘤的渗透。组织缺氧是血管生成的主要诱因。许多对缺氧有反应的分子可以促进血管生成转换，其中血管内皮生长因子（VEGF）及其下游信号通路是主要的驱动因素。此外，肿瘤相关髓系细胞通过促血管生成介质，包括VEGF-A、FGF2、PIGF、TNF和BV8，促进肿瘤血管生成和增加血管通透性。这些细胞还产生蛋白酶，如MMPs和组织蛋白酶，这些蛋白酶分解ECM并释放螯合的促血管生成分子，使其具有生物可利用性。重要的是，血管系统和免疫细胞之间的作用是相互的。越来越多的证据表明，肿瘤诱导的血管生成有助于免疫抑制和免疫逃避。例如，调节免疫细胞归巢和运输的血管粘附分子可以被下调，肿瘤相关的内皮细胞表达较低水平的ICAM-1、VCAM-1、E-选择素和P-选择素。相反，包括IDO、TIM3和PD-L1在内的抑制性免疫检查点分子可以在肿瘤血管上上调。肿瘤进展：癌细胞的侵袭和迁移一旦肿瘤成功地在血管生成、炎症和纤维化之间建立了相互加强的联系，它们就可以进入疾病进展的下一阶段：局部侵袭。侵袭性生长是癌症的主要特征之一，为转移性传播奠定了基础。侵袭是一个复杂的多步骤过程，为了与邻近的癌细胞分离，必须破坏上皮细胞与细胞之间的粘附。细胞间粘附蛋白（E-钙粘蛋白）的缺失是这一过程的核心，通常伴有上皮-间充质（EMT）样的过渡状态。来自TME的因素促进了癌症细胞的表型转换，导致局部侵袭。此外，越来越多的证据表明，CAF通过其重塑和施加物理拉力在ECM中生成轨迹，从而实现癌症细胞的集体侵袭。其他TME细胞也可以促进癌症细胞的侵袭。例如，在小鼠乳腺癌模型中进行的活体显微镜（IVM）研究表明，EGFR+癌症细胞的侵袭和迁移依赖于产生EGF的TAMs的共同迁移。这些发现表明，CAF、免疫细胞和组织驻留细胞共同促进了癌细胞的侵袭行为。转移过程中的下一个限速步骤是将癌症细胞注入血液或淋巴循环。癌症细胞跨内皮层进入循环的机制复杂、依赖于环境，并受癌症细胞固有特征、ECM的特性和血管系统类型、微环境因素以及缺氧程度的影响。通常，TAM与癌细胞灌注相关。血管周边TIE2+ TAM诱导的VEGF-A信号转导导致血管连接的局部丢失，导致血管通透性短暂增加，从而促进癌症细胞的灌注。此外，除巨噬细胞和内皮细胞外，中性粒细胞、周细胞、CAF、脂肪细胞和TME的机械特征，包括ECM结构和间质流体压力，也通过直接或间接机制影响癌症细胞的灌注。肿瘤转移：转移前生态位的形成发展中的肿瘤对宿主的影响并不局限于局部TME。通过旁分泌效应，原发肿瘤触发一连串事件，在远处器官中产生癌症细胞传导微环境，然后发生转移扩散。触发一系列系统性变化导致转移前生态位生成的启动信号包括肿瘤衍生的可溶性介质，最显著的是G-CSF、VEGF-A、PLGF、TGF-β、S100蛋白和TNF，以及携带肿瘤信息的EVs，这些肿瘤信息可以转移到BM细胞和远处器官中的驻留细胞，在那里，它们激活并编程免疫细胞及其祖细胞，以动员到未来的转移部位。其他肿瘤分泌的介质可以直接修饰远处的器官。例如，低氧4T1乳腺癌细胞分泌LOX，通过诱导破骨细胞生成，破坏了正常的骨内稳态，促进了循环肿瘤细胞（CTCs）的归巢和定植。在LLC和B16荷瘤小鼠中，肿瘤衍生的EV携带小RNA，激活肺上皮细胞中的Toll样受体3（TLR3），刺激中性粒细胞趋化介质的释放，通过中性粒细胞募集最终形成肺转移前生态位。这些研究表明，原发性肿瘤破坏了远处器官中不同组织驻留细胞和新动员的BM衍生免疫细胞之间的串扰，因此有助于转移前生态位的形成。原发性肿瘤促进转移生态位的另一个机制是通过肿瘤诱导的全身炎症和免疫抑制，有利于扩散癌细胞的免疫逃逸。在乳腺癌症小鼠模型中，全身动员分泌IL-1β的中性粒细胞可增强肺外膜成纤维细胞分泌前列腺素E3，导致抗肿瘤免疫降低和肺转移增强。CTC在循环中的生存之战一旦肿瘤细胞侵入循环，它们就会在这种外来微环境中立即受到一系列不同的生存挑战。包括由细胞脱离引起的失巢，血液循环中的高剪切力以及免疫介导的攻击，这些共同导致大多数CTC的死亡。尽管如此，对于通过循环存活下来的一小部分CTC来说，它们可以通过各种机制逃避破坏。其中包括CTC聚集，其通过诱导NANOG、SOX2和OCT来促进干性；与特定的免疫细胞如中性粒细胞或血小板的结合；从而逃避包括NK细胞在内的细胞毒性免疫细胞的作用。与这些机制一致，CTC聚集与单个CTC相比，通常与更差的患者预后有关；而循环中中性粒细胞与淋巴细胞的高比率与多种癌症的不良预后相关。器官嗜性和外渗对于通过循环存活的一小部分CTC，其转移过程中的下一个限速步骤是渗出到转移器官。这在一定程度上取决于每种原发性癌症的潜在器官嗜性。转移性可能是高度定型的，例如，乳腺癌症主要扩散到肺、肝、骨和脑，而前列腺癌则表现出向骨扩散的高度倾向。这种器官嗜性受到多种机制的影响，包括趋化因子、代谢物和EV等因素的信号传递，这些因素有助于CTC向特定器官的定向迁移。此外，CTC所走的特定循环路线以及癌症细胞为了进入特定器官而必须跨越的不同血管屏障的范围进一步影响了它们的最终目的地。对于外渗过程本身，肿瘤细胞必须首先停止并附着在内皮管腔上，同时不断受到周围快速流动的血液的高剪切力。肿瘤细胞和内皮细胞表达的细胞粘附分子及其配体、整合素和ECM成分促进了这一步骤，并与血液白细胞滚动、粘附和外渗的分子机制有一些相似之处。血小板和中性粒细胞可能仍与CTC一起传播，可以分别通过选择素、GPCR或通过中性粒细胞外陷阱（NETs）的产生进一步增强肿瘤细胞对脉管系统的粘附。粘附后，CTC接下来穿过EC连接，也可能穿过额外的血管细胞层和ECM，进入新的器官实质，这通常需要细胞粘附分子的活性蛋白水解或降解。癌症细胞不仅依赖于在这一步骤中产生的蛋白酶和降解酶，而且还可以通过产生NET从非癌细胞释放这些酶，包括血小板、单核细胞和中性粒细胞。渗出后，CTC通常留在血管附近，这对决定其命运至关重要。转移部位肿瘤的休眠和生长播散性肿瘤细胞（DTC）在外渗到继发部位后，面临着来自外来组织环境的一系列新挑战，并且绝大多数肿瘤细胞再次被宿主防御机制杀死，包括免疫监测。少数存活下来以培育新器官的DTC通常留在脉管系统附近，来自血管周围生态位（PVN）和组织特异性生态位的分子信号，最初将DTC保持在休眠状态，这可能会保护它们免受免疫系统的识别和杀死。休眠是转移级联反应中最不为人所知的阶段，这些细胞会停止增殖，并可以在静止状态下存活，有时长达数年至数十年。对控制休眠开始的机制、休眠在潜伏期的维持以及休眠后的重新激活的研究，仍然是癌症领域的“黑匣子”。 因此有必要充分了解其潜在机制，尤其是与微环境的关键相互作用，对器官特异性转移的这种精细调节。小结随着近年来在肿瘤微环境范围和理解上的发展，我们逐渐意识到TME的巨大复杂性和相互关联性，以及它在不同器官和患者之间的多样性。尽管存在这些挑战，但在针对TME的治疗策略也在不断扩展，展现出有希望的前景。其中包括通过改变ECM、EVs的干预措施“重编程”TME的治疗、细胞疗法和疫苗以及免疫检查点抑制剂。现在的关键问题是如何以合理和最佳的方式将这些不同的方法结合起来。展望未来，随着单细胞分析技术和人工智能的技术突破，对于TME的研究将在未来几年取得关键进展，以充分实现针对TME的癌症治疗。相信在不久的将来，我们将能够以TME为治疗目标，造福更多的癌症患者。参考文献：1.The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer Cell.2023 Mar 13;41(3):374-403免责声明“药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！

导读：脂质纳米颗粒（LNPs）通过促进抗原呈递细胞的摄取、成熟和活性来增强癌症免疫治疗。尽管已知脂质成分的选择及各成分的相对比例影响体内转染效率和组织特异性递送，但缺乏辅助脂质电荷和LNPs成分相对比率对给药部位不同细胞群转染影响的深入分析。2023年12月，约翰霍普金斯大学医学院&纳米生物技术研究所Hai-Quan Mao作为主要研究者在Nature Biomedical Engineering【IF: 28.1】发表文章：《Screening for lipid nanoparticles that modulate the immune activity of helper T cells towards enhanced antitumour activity》。他们报道了一种LNPs筛选方法，通过优化辅助脂质的类型和脂质成分比率，筛选增强骨髓来源树突状细胞的成熟和体外抗原呈递的LNPs，然后在皮下或肌内递送LNPs后评估黑色素瘤小鼠模型中的免疫激活和肿瘤生长抑制。一、研究背景LNPs已用于递送治疗癌症和预防其他感染的mRNA疫苗，通常由辅助磷脂如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸（DSP）、可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质及靶向选择性器官的脂质组成。冠状病毒大流行期间开发的两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗证明了作为mRNA疫苗递送工具的LNPs的安全性和有效性。抗原呈递细胞（APC）内翻译的抗原直接加工并呈递在MHC-I上，激活CD8+ T细胞和Th1免疫反应；非APCs内翻译的抗原被APCs内化并呈递在MHC-II上，激活CD4+ T辅助细胞，促进B细胞分化，并启动Th2免疫反应。多项研究表明，将Th2反应与Th1介导的细胞免疫相结合有助于清除SARS-CoV-2感染的细胞并增强疫苗效力。但mRNA LNPs的组成、治疗效果和免疫激活谱之间的相关性，特别是Th1和Th2反应之间的平衡以及与NK细胞介导的细胞杀伤的协调性，仍需进一步研究。二、筛选靶向DCs的LNP组分研究人员用DLin-MC3-DMA（可电离脂质）、胆固醇、DMG-PEG2000（聚乙二醇化脂质）及6种辅助磷脂（阳离子脂质DOTAP和DDAB、两性离子脂质DOPE和DSPC以及阴离子脂质14PA和18PG），通过改变以下参数生成含1,080个成员的LNPs文库：（1）DLin-MC3-DMA辅助脂质与摩尔百分比为20%-80%；（2）胆固醇与DMG-PEG2000重量比为10-500；（3）DLin-MC3-DMA与辅助脂质重量比为1-200；（4）mRNA中可电离脂质带电基团与磷酸基团摩尔比（N/P比）为4-12。为选择具有APC强特异性转基因表达的LNPs制剂，首先使用终浓度为1μg/ml的萤火虫荧光素酶（fLuc）mRNA（在pH4、25mM醋酸镁缓冲液中制备）评估LNPs在DC2.4细胞（永生化小鼠树突状细胞系）中的递送效率；后使用流式细胞术筛选出7种高转染效率LNPs制剂，包括C3、C9、C10、D1、D2、D6和F5。具有相对较高转染效率的LNPs制剂为：（1）胆固醇与DMG-PEG2000比值接近500：1；（2）DLin-MC3-DMA与辅助脂质比值接近1：1；（3）DLin-MC3-DMA和辅助脂质的中等摩尔百分比在40%-60%之间；（4）中等N/P比，约为8。进一步地，在BMDCs中使用上述7种LNPs负载终浓度为1μg /ml卵清蛋白mRNA（mOVA，在pH4、25mM醋酸镁缓冲液制备）进行免疫刺激作用测试，72h后，与PBS相比，OVA蛋白和其他制剂（C10，D6和F5）使用于抗原呈递的SIINFEKL在MHC-I上的表达显着升高，C10-30%，D6-21.5%，F5-4.0%），C10，D6和F5相较于阳性对照组，CD86+ SIINFEKL-H-2Kb+和CD40+SIINFEKL-H-2Kb+的表达显著升高，BMDCs上清液中炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的分泌水平也显著升高。研究人员将负载10μg mCre的LNPs注射Ai9小鼠，评估皮下或腹腔注射C10、D6和F5后小鼠体内递送的功效。与腹腔注射相比，皮下注射后在引流淋巴结中检测到更高比例的转染细胞。单剂量mRNA LNPs注射3d后，与PBS处理组相比，C10、D6和F5组中SIINFEKL-H-2Kb+CD11c+分别升高4.0、2.7和3.8倍。综上，C10、D6和F5在体内和体外都显示出有效的抗原呈递和免疫刺激作用。图1 用于转染和诱导DCs中抗原呈递及成熟的mRNA脂质纳米颗粒的体外筛选三、C10、D6、F5独特的免疫学特征C57BL/6小鼠皮下注射3次（第0、7和14d）PBS、10μg游离OVA蛋白、Alhydrogel（与OVA蛋白以1：1的比例混合）或载有10μg mOVA的C10、D6、F5或SM-102，评估了LNPs诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应：C10、D6、F5组中CD3+CD8+IFN-γ+、CD3+CD8+GranzymeB+和CD3+CD8+TNF-α+细胞群增加，而SM-102和Alhydrogel组无显着反应，与SM-102相比，C10、D6或F5组CD3+CD8+TNF-α+增加1.5倍；CD3+CD8+IFN-γ+分别增加1.4、1.6和1.9倍；CD3+CD8+GranzymeB+分别增加3.0、2.1 和4.7倍。第21d，将脾脏匀浆成细胞悬液进行离体抗原再刺激（100μg/ml OVA和2μg/ml SIINFEKL），6h后C10、D6或F5组均诱导了有效的抗原特异性Th1型反应，与SM-102相比，CD3+CD4+IFN-γ+T-bet+数量高出5倍，且促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-6）表达增加。但仅C10组诱导了有效的抗原特异性Th2型反应，其诱导的CD3+CD4+IL-4+GATA-3+Τh2细胞比背景高18倍，而D6和F5组仅分别高出2.1和1.0倍。通过监测体重、血清细胞因子（IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4）验证了C10、F5和D6制剂的生物安全性。图2 3种LNPs制剂对淋巴结细胞转染和免疫激活进行体内评估四、C10、D6、F5的抗肿瘤作用在第0、7和14d用PBS、10μg游离OVA蛋白、Alhydrogel（与OVA蛋白以1：1的比例混合）或载有10μg mOVA的C10、D6、F5或SM-102对C57BL/6小鼠进行皮下注射，第21d在小鼠右后侧皮下注射1×106个B16-OVA细胞，评估C10、D6、F5作为预防性癌症疫苗的疗效及长期保护作用。所有LNPs组都强烈抑制肿瘤生长，延长了生存时间，C10、D6、F5和SM-102的中位生存期分别为40、32、30和32d，而游离OVA蛋白组为15d，Alhydrogel组为20d，同时触发Th1和Th2反应的C10提供长效保护。为了评估C10作为多种肿瘤模型治疗性疫苗的效果。第0d在C57BL/6小鼠右后侧皮下接种3×105个B16-OVA、MC38-OVA、EG7-OVA或B16F10细胞，在第4、11和18d，用含有10μg mOVA或含10μg编码Trp2或Gp100的mRNA的C10对小鼠进行免疫，发现C10在所有组中表现出强烈的肿瘤抑制作用：（1）B16-OVA治疗模型：中位生存期为26d（阴性对照17d），C10与免疫检查点抑制剂（100μg抗CTLA-4 mAb，第6、13、20和27d腹膜内给药）联合给药时，中位生存期延长至33.5d，表现出协同作用。（2）MC38-OVA治疗模型：中位生存期为47d（阴性对照26d），与100μg抗CTLA-4 mAb协同将中位生存期延长至53d。（3）EG7-OVA治疗模型：中位生存期为25d（阴性对照组15d）与抗CTLA-4 mAb协同将中位生存期延长至37d。（4）C10-mTrp2和C10-mGp100的中位生存期分别延长至23和23.5d，但未与抗CTLA-4 mAb表现出协同作用，协同作用的差异可能与抗原免疫原性、抗原加工、T细胞受体亲和力和肿瘤微环境有关。图3 具有抗肿瘤功效的mRNA LNPs（C10、D6、F5）作为预防性疫苗图4 具有抗肿瘤功效的mRNA LNPs作为治疗性疫苗五、与T细胞和NK细胞双重攻击相关的长效保护在第0、7和14d分别用PBS或载有10μg mOVA的C10、F5对C57BL/6小鼠进行免疫，从第18d起每隔4d注射一次细胞耗竭抗体（α-CD3、α-NK1.1、α-CD10），第21d注射1×106个B16-OVA细胞。用C10免疫小鼠肿瘤后22d，多个效应淋巴细胞群富集，其中NK细胞、T细胞、CD8+ T细胞分别富集6.9、11.2、7.4倍，T（CD3+）细胞、NK（NK1.1+）细胞或B（CD20+）细胞的耗竭显著降低了C10 mOVA LNPs赋予的存活率优势。而F5-mOVA LNPs组未发现上述富集效应，且抗肿瘤作用仅在T细胞耗尽时才会丧失。综上，C10在促进强细胞毒性T淋巴细胞反应和Th1抗癌反应以及促进体液和Th2反应方面发挥双重作用。图5 T细胞和NK细胞的协同攻击导致长效保护六、诱导Th1或Th1、Th2联合免疫反应的潜在途径研究人员用编码荧光素酶的mRNA评估三种LNPs的转染效率。不同组成的LNPs转基因表达主要局限于给药部位，在转染的细胞类型、免疫刺激细胞因子方面存在差异：C10组转染的细胞中非免疫细胞与免疫细胞的比值为4.5，分别是D6组和F5组的2.9和3.6倍；注射C10 4h和24h后，注射部位诱导的Th1细胞因子（IFN-γ和TNF-α）与D6或F5水平相似，Th2细胞因子（IL-4）的平均水平分别比PBS组高1.6和4倍，表明C10能够诱导强烈的Th1和Th2反应，这种特性与其在注射部位有效转染树突状细胞和非APC的能力密切相关。为研究非免疫细胞与免疫细胞的转染效率之间的差异，定量体外递送至共培养的C2C12细胞（小鼠成肌细胞系）和BMDCs（1:1）并使用流式细胞术检测mCherry的表达。C10染细胞中C2C12:BMDCs高达33.41，D6高达22.21，而F5仅为3.94。当用含fLuc mRNA的LNPs仅转染C2C12细胞时，转染C10分别比转染D6和F5的细胞高25和289倍；但用含有mCherry mRNA的LNPs转染纯BMDC培养物时，C10、D6和F5的转染效率相似；用含50%Cy5标记的mGFP的LNPs和50%未标记的mGFP转染时，3组都观察到约100%的Cy5+细胞（即细胞摄取），但由于C2C12细胞中C10比D6和F5具有更强的内体逃逸和胞质递送能力，导致仅27.7%和8.9%的C2C12细胞分别转染了D6和F5，转染C10的细胞为98.1%。图6 mRNA LNPs的局部转染、细胞摄取和内体逃逸七、总结重复给药后的安全性为将LNPs的效用扩展到治疗性疫苗和其他基因递送应用提供了强劲的动力。该研究提供一种通过调整LNPs脂质组分来定制抗原特异性免疫激活谱的方法，即可通过改变LNPs制剂的组成实现在各种细胞中优先转染及改变在体内不同细胞中递送的转基因水平，而优先转染策略可能是调节Th1和Th2反应之间抗原特异性免疫刺激平衡的潜在工具。先前癌症疫苗递送系统研究表明，有效的Th1免疫反应对于抗肿瘤功效至关重要，该研究中优化的LNPs递送的mRNA疫苗，通过比较诱导Th1或Th1加Th2免疫反应的两种代表性LNPs制剂，发现Th2反应与Th1反应的结合进一步提高了肿瘤抑制效率，由C10-mRNA LNPs产生的各种细胞群（包括T细胞、NK细胞和B细胞）的协调免疫反应为对抗肿瘤攻击提供了更有效和全面的保护。参考文献[1] Zhu Y, Ma J, Shen R, et al. Screening for lipid nanoparticles that modulate the immune activity of helper T cells towards enhanced antitumour activity. Nat Biomed Eng. 2023 Dec 11. doi: 10.1038/s41551-023-01131-0. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。