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导读：脂质纳米颗粒（LNPs）通过促进抗原呈递细胞的摄取、成熟和活性来增强癌症免疫治疗。尽管已知脂质成分的选择及各成分的相对比例影响体内转染效率和组织特异性递送，但缺乏辅助脂质电荷和LNPs成分相对比率对给药部位不同细胞群转染影响的深入分析。2023年12月，约翰霍普金斯大学医学院&纳米生物技术研究所Hai-Quan Mao作为主要研究者在Nature Biomedical Engineering【IF: 28.1】发表文章：《Screening for lipid nanoparticles that modulate the immune activity of helper T cells towards enhanced antitumour activity》。他们报道了一种LNPs筛选方法，通过优化辅助脂质的类型和脂质成分比率，筛选增强骨髓来源树突状细胞的成熟和体外抗原呈递的LNPs，然后在皮下或肌内递送LNPs后评估黑色素瘤小鼠模型中的免疫激活和肿瘤生长抑制。一、研究背景LNPs已用于递送治疗癌症和预防其他感染的mRNA疫苗，通常由辅助磷脂如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸（DSP）、可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质及靶向选择性器官的脂质组成。冠状病毒大流行期间开发的两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗证明了作为mRNA疫苗递送工具的LNPs的安全性和有效性。抗原呈递细胞（APC）内翻译的抗原直接加工并呈递在MHC-I上，激活CD8+ T细胞和Th1免疫反应；非APCs内翻译的抗原被APCs内化并呈递在MHC-II上，激活CD4+ T辅助细胞，促进B细胞分化，并启动Th2免疫反应。多项研究表明，将Th2反应与Th1介导的细胞免疫相结合有助于清除SARS-CoV-2感染的细胞并增强疫苗效力。但mRNA LNPs的组成、治疗效果和免疫激活谱之间的相关性，特别是Th1和Th2反应之间的平衡以及与NK细胞介导的细胞杀伤的协调性，仍需进一步研究。二、筛选靶向DCs的LNP组分研究人员用DLin-MC3-DMA（可电离脂质）、胆固醇、DMG-PEG2000（聚乙二醇化脂质）及6种辅助磷脂（阳离子脂质DOTAP和DDAB、两性离子脂质DOPE和DSPC以及阴离子脂质14PA和18PG），通过改变以下参数生成含1,080个成员的LNPs文库：（1）DLin-MC3-DMA辅助脂质与摩尔百分比为20%-80%；（2）胆固醇与DMG-PEG2000重量比为10-500；（3）DLin-MC3-DMA与辅助脂质重量比为1-200；（4）mRNA中可电离脂质带电基团与磷酸基团摩尔比（N/P比）为4-12。为选择具有APC强特异性转基因表达的LNPs制剂，首先使用终浓度为1μg/ml的萤火虫荧光素酶（fLuc）mRNA（在pH4、25mM醋酸镁缓冲液中制备）评估LNPs在DC2.4细胞（永生化小鼠树突状细胞系）中的递送效率；后使用流式细胞术筛选出7种高转染效率LNPs制剂，包括C3、C9、C10、D1、D2、D6和F5。具有相对较高转染效率的LNPs制剂为：（1）胆固醇与DMG-PEG2000比值接近500：1；（2）DLin-MC3-DMA与辅助脂质比值接近1：1；（3）DLin-MC3-DMA和辅助脂质的中等摩尔百分比在40%-60%之间；（4）中等N/P比，约为8。进一步地，在BMDCs中使用上述7种LNPs负载终浓度为1μg /ml卵清蛋白mRNA（mOVA，在pH4、25mM醋酸镁缓冲液制备）进行免疫刺激作用测试，72h后，与PBS相比，OVA蛋白和其他制剂（C10，D6和F5）使用于抗原呈递的SIINFEKL在MHC-I上的表达显着升高，C10-30%，D6-21.5%，F5-4.0%），C10，D6和F5相较于阳性对照组，CD86+ SIINFEKL-H-2Kb+和CD40+SIINFEKL-H-2Kb+的表达显著升高，BMDCs上清液中炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的分泌水平也显著升高。研究人员将负载10μg mCre的LNPs注射Ai9小鼠，评估皮下或腹腔注射C10、D6和F5后小鼠体内递送的功效。与腹腔注射相比，皮下注射后在引流淋巴结中检测到更高比例的转染细胞。单剂量mRNA LNPs注射3d后，与PBS处理组相比，C10、D6和F5组中SIINFEKL-H-2Kb+CD11c+分别升高4.0、2.7和3.8倍。综上，C10、D6和F5在体内和体外都显示出有效的抗原呈递和免疫刺激作用。图1 用于转染和诱导DCs中抗原呈递及成熟的mRNA脂质纳米颗粒的体外筛选三、C10、D6、F5独特的免疫学特征C57BL/6小鼠皮下注射3次（第0、7和14d）PBS、10μg游离OVA蛋白、Alhydrogel（与OVA蛋白以1：1的比例混合）或载有10μg mOVA的C10、D6、F5或SM-102，评估了LNPs诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应：C10、D6、F5组中CD3+CD8+IFN-γ+、CD3+CD8+GranzymeB+和CD3+CD8+TNF-α+细胞群增加，而SM-102和Alhydrogel组无显着反应，与SM-102相比，C10、D6或F5组CD3+CD8+TNF-α+增加1.5倍；CD3+CD8+IFN-γ+分别增加1.4、1.6和1.9倍；CD3+CD8+GranzymeB+分别增加3.0、2.1 和4.7倍。第21d，将脾脏匀浆成细胞悬液进行离体抗原再刺激（100μg/ml OVA和2μg/ml SIINFEKL），6h后C10、D6或F5组均诱导了有效的抗原特异性Th1型反应，与SM-102相比，CD3+CD4+IFN-γ+T-bet+数量高出5倍，且促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-6）表达增加。但仅C10组诱导了有效的抗原特异性Th2型反应，其诱导的CD3+CD4+IL-4+GATA-3+Τh2细胞比背景高18倍，而D6和F5组仅分别高出2.1和1.0倍。通过监测体重、血清细胞因子（IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4）验证了C10、F5和D6制剂的生物安全性。图2 3种LNPs制剂对淋巴结细胞转染和免疫激活进行体内评估四、C10、D6、F5的抗肿瘤作用在第0、7和14d用PBS、10μg游离OVA蛋白、Alhydrogel（与OVA蛋白以1：1的比例混合）或载有10μg mOVA的C10、D6、F5或SM-102对C57BL/6小鼠进行皮下注射，第21d在小鼠右后侧皮下注射1×106个B16-OVA细胞，评估C10、D6、F5作为预防性癌症疫苗的疗效及长期保护作用。所有LNPs组都强烈抑制肿瘤生长，延长了生存时间，C10、D6、F5和SM-102的中位生存期分别为40、32、30和32d，而游离OVA蛋白组为15d，Alhydrogel组为20d，同时触发Th1和Th2反应的C10提供长效保护。为了评估C10作为多种肿瘤模型治疗性疫苗的效果。第0d在C57BL/6小鼠右后侧皮下接种3×105个B16-OVA、MC38-OVA、EG7-OVA或B16F10细胞，在第4、11和18d，用含有10μg mOVA或含10μg编码Trp2或Gp100的mRNA的C10对小鼠进行免疫，发现C10在所有组中表现出强烈的肿瘤抑制作用：（1）B16-OVA治疗模型：中位生存期为26d（阴性对照17d），C10与免疫检查点抑制剂（100μg抗CTLA-4 mAb，第6、13、20和27d腹膜内给药）联合给药时，中位生存期延长至33.5d，表现出协同作用。（2）MC38-OVA治疗模型：中位生存期为47d（阴性对照26d），与100μg抗CTLA-4 mAb协同将中位生存期延长至53d。（3）EG7-OVA治疗模型：中位生存期为25d（阴性对照组15d）与抗CTLA-4 mAb协同将中位生存期延长至37d。（4）C10-mTrp2和C10-mGp100的中位生存期分别延长至23和23.5d，但未与抗CTLA-4 mAb表现出协同作用，协同作用的差异可能与抗原免疫原性、抗原加工、T细胞受体亲和力和肿瘤微环境有关。图3 具有抗肿瘤功效的mRNA LNPs（C10、D6、F5）作为预防性疫苗图4 具有抗肿瘤功效的mRNA LNPs作为治疗性疫苗五、与T细胞和NK细胞双重攻击相关的长效保护在第0、7和14d分别用PBS或载有10μg mOVA的C10、F5对C57BL/6小鼠进行免疫，从第18d起每隔4d注射一次细胞耗竭抗体（α-CD3、α-NK1.1、α-CD10），第21d注射1×106个B16-OVA细胞。用C10免疫小鼠肿瘤后22d，多个效应淋巴细胞群富集，其中NK细胞、T细胞、CD8+ T细胞分别富集6.9、11.2、7.4倍，T（CD3+）细胞、NK（NK1.1+）细胞或B（CD20+）细胞的耗竭显著降低了C10 mOVA LNPs赋予的存活率优势。而F5-mOVA LNPs组未发现上述富集效应，且抗肿瘤作用仅在T细胞耗尽时才会丧失。综上，C10在促进强细胞毒性T淋巴细胞反应和Th1抗癌反应以及促进体液和Th2反应方面发挥双重作用。图5 T细胞和NK细胞的协同攻击导致长效保护六、诱导Th1或Th1、Th2联合免疫反应的潜在途径研究人员用编码荧光素酶的mRNA评估三种LNPs的转染效率。不同组成的LNPs转基因表达主要局限于给药部位，在转染的细胞类型、免疫刺激细胞因子方面存在差异：C10组转染的细胞中非免疫细胞与免疫细胞的比值为4.5，分别是D6组和F5组的2.9和3.6倍；注射C10 4h和24h后，注射部位诱导的Th1细胞因子（IFN-γ和TNF-α）与D6或F5水平相似，Th2细胞因子（IL-4）的平均水平分别比PBS组高1.6和4倍，表明C10能够诱导强烈的Th1和Th2反应，这种特性与其在注射部位有效转染树突状细胞和非APC的能力密切相关。为研究非免疫细胞与免疫细胞的转染效率之间的差异，定量体外递送至共培养的C2C12细胞（小鼠成肌细胞系）和BMDCs（1:1）并使用流式细胞术检测mCherry的表达。C10染细胞中C2C12:BMDCs高达33.41，D6高达22.21，而F5仅为3.94。当用含fLuc mRNA的LNPs仅转染C2C12细胞时，转染C10分别比转染D6和F5的细胞高25和289倍；但用含有mCherry mRNA的LNPs转染纯BMDC培养物时，C10、D6和F5的转染效率相似；用含50%Cy5标记的mGFP的LNPs和50%未标记的mGFP转染时，3组都观察到约100%的Cy5+细胞（即细胞摄取），但由于C2C12细胞中C10比D6和F5具有更强的内体逃逸和胞质递送能力，导致仅27.7%和8.9%的C2C12细胞分别转染了D6和F5，转染C10的细胞为98.1%。图6 mRNA LNPs的局部转染、细胞摄取和内体逃逸七、总结重复给药后的安全性为将LNPs的效用扩展到治疗性疫苗和其他基因递送应用提供了强劲的动力。该研究提供一种通过调整LNPs脂质组分来定制抗原特异性免疫激活谱的方法，即可通过改变LNPs制剂的组成实现在各种细胞中优先转染及改变在体内不同细胞中递送的转基因水平，而优先转染策略可能是调节Th1和Th2反应之间抗原特异性免疫刺激平衡的潜在工具。先前癌症疫苗递送系统研究表明，有效的Th1免疫反应对于抗肿瘤功效至关重要，该研究中优化的LNPs递送的mRNA疫苗，通过比较诱导Th1或Th1加Th2免疫反应的两种代表性LNPs制剂，发现Th2反应与Th1反应的结合进一步提高了肿瘤抑制效率，由C10-mRNA LNPs产生的各种细胞群（包括T细胞、NK细胞和B细胞）的协调免疫反应为对抗肿瘤攻击提供了更有效和全面的保护。参考文献[1] Zhu Y, Ma J, Shen R, et al. Screening for lipid nanoparticles that modulate the immune activity of helper T cells towards enhanced antitumour activity. Nat Biomed Eng. 2023 Dec 11. doi: 10.1038/s41551-023-01131-0. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程阿尔茨海默病(AD)的病理特征之一是由磷酸化的Tau片段组成神经原纤维缠结（NFT）形成。天冬酰胺内肽酶（AEP）是一种关键的Tau蛋白切割酶，可产生易于聚集的Tau蛋白片段。抑制AEP以降低毒性Tau片段形成水平可能是一种很有前途的治疗策略。这篇文章报道了第一种具有不可逆结合模式的选择性、口服生物可利用性和脑渗透抑制剂，从可逆分子开始概述了该系列的发展，并在体外和体内证明了AEP抑制与Tau N368片段减少之间的联系。阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症形式，2020年全球有5500多万人受到影响。阿尔茨海默病大脑的两个主要组织病理学病变是淀粉样斑块，包括聚集的Aβ肽和神经原纤维缠结（NFTs）。缠结的主要成分是Tau蛋白，通常是一种与微管相关并稳定微管的高可溶性蛋白质。在AD和其他Tau病变中，Tau蛋白经历结构变化导致其聚集。总之，Tau聚集在Tau病变中起着重要的作用。特别地，AD患者认知能力与Tau聚集负荷呈负相关。此外，AD患者的多模态成像显示Tau聚集沉积与区域性脑萎缩和功能障碍相关。因此，减轻Tau聚集的策略是一种很有前途的方法来调节AD。Tau含有几个（3-4）串联重复序列，存在31或32个残基，每个都有一个特征的PGGG基序。重复区是分子的关键部分，使原纤维组装成核。结构研究表明，位于中心的重复区域通常被N端和C端区域覆盖，从而排除了溶液中Tau-Tau相互作用。翻译后修饰，如磷酸化和蛋白水解，诱导Tau蛋白的构象变化，暴露重复区域，促进聚集。溶酶体半胱氨酸蛋白酶天冬酰胺内肽酶（AEP）已被证明可以在重复区域的两侧切割Tau蛋白，从而暴露重复区域并促进聚集。AEP水平和活性在AD中上调，导致产生更多的Tau N368片段。AD患者脑脊液中Tau N368/total-Tau比值显著降低，且与18F-GTP1 Tau PET信号呈强负相关。这一观察结果与Tau N368片段容易聚集的假设相一致。除了切割Tau外，AEP还通过促进Tau磷酸化影响Tau聚集，因为AEP间接抑制蛋白磷酸酶2A（调节Tau去磷酸化的关键酶），AEP可能在促进Tau聚集之外参与AD的发病机制。AEP切割片段Tau N368最近被证明可以通过与BACE1转录因子STAT1结合来增加BACE1的表达和Aβ的产生。这意味着AEP抑制可能通过直接减少Tau N368片段或间接抑制BACE1途径对AD患者提供治疗益处。除Tau蛋白外，AEP被报道具有广泛的底物范围包括与神经退行性疾病相关的其他蛋白，如α-synuclein15和TDP-43。AEP在人体组织中普遍产生，与大脑相比，肾脏和淋巴器官中的AEP水平相对较高。AEP KO小鼠表现出肾近端小管上皮细胞（PTEC）增生和增生的进行性肾脏病理，并表现为免疫系统过度刺激的噬血细胞综合征。因此，该项目的第一个目标是通过使用目标化合物进行药理学抑制并降低潜在的外周毒理学影响的风险。第二个目标是使用脑渗透目标化合物证明AEP在阿尔茨海默氏症或其他Tau病变中的参与机制。先前寻找AEP抑制剂的努力是由Bogyo（化合物1）和Williams（化合物2和3）组推动的。此外，Ye组报道化合物4和5可能通过一种变构抑制机制在体内表现出促进认知的作用。图1.已报道的AEP抑制剂不幸的是，这些抑制剂由于高极性和部分低代谢稳定性以及高蛋白质结合而导致渗透性差。它们不适合测试疾病假说或降低体内外周毒性。在体内可以获得AEP-配体复合物的X射线晶体结构，揭示了催化位点的分子识别（图2）。其与天冬酰胺和天冬氨酸（低pH）残基C端蛋白质底物的特异性切割一致，S1口袋相对较小且极性很强。与Arg-44（2.8和3.0Å）和Asp-231（2.6Å）的侧链形成氢键。肽型氯甲基酮抑制剂AcYVAD-CMK通过与Ser-216和Ala-218附加的主氢键进入子口袋S2−S4。此外，还检测到与Cys-189的共价键（图2）。图2.AEP与Ac-YVAD-CMK共晶（PDB代码: 4aw9）。图中标注了结合口袋S1~S4，以及关键蛋白-配体氢键（红线）和与Cys-189的共价键（蓝线）。化合物设计与SAR研究受益于氰基与Cys-189共价结合，丙酰胺取代基与P1 Asn残基相似，二级酰胺NH和三级酰胺C=O分别与Ser-216和α-218的主链相互作用（图3），选择以通式6的腈（表1）为起点，并重点优化了指向S3和S4袋的R1-R3取代基。最初的SAR研究（表1）表明，芳基乙酰胺具有最好的效价，通过在α位置安装环丙基或环丁基等取代基，可以进一步提高5-20倍（比较化合物6e和6f与6a）。这可以用模型中通过S3口袋中的范德华相互作用来合理化解释。此外，芳基环对位的亲脂取代基对效价和渗透性都有有益的影响。图3.覆盖晶体结构（PDB ID：4aw9）的支架6（黄色）模型表1.P3和P4残基的初始优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10−6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。在亲脂性、高通透性和低清除率之间取得平衡对于获得具有良好体内药代动力学（PK）特征的化合物至关重要。在此基础上，将化合物6o确定为第一个进一步分析的化合物（见下表4）。化合物6o在小鼠中表现出良好的PK谱，生物利用度为41%，脑穿透Kp,uu为0.22。接下来，测定化合物的细胞效力。不幸的是，酶促试验的荧光底物Z-AAN-Rh110不能渗透细胞。其他例如通过Western blot观察内源性底物或使用化学探针，如LE28或AP-1是可行的，但不适合高通量。于是，Roche公司设计了一种细胞渗透的荧光底物，结合亲和力和选择性，提供化合物6o的左手边（即1-(4-(三氟甲氧基)苯基)环丙羧酸(7)的酰胺）连接荧光氨基甲基香豆素（AMC）（图4）。图4. 用于细胞试验的荧光可渗透底物有了底物8，使用过表达HEK293细胞的AEP建立了细胞实验。用这种方法分析化合物，发现腈在细胞水平具有很好的酶促抑制作用，其效力变化约为200倍（表2）。表2.选定腈的细胞潜能a至少2次测定的几何平均值±SEMRoche设想了一种更持久、潜在不可逆的抑制剂，以确保AEP的完全阻断。弹头是多种多样的，不同的不可逆反应基团附着在相应的肼支架上（表3）。化合物孵育0.5h后的酶抑制活性总体上与亲电中心的反应活性相关，氯乙酰胺12被认为是最有效的，但存在一些稳定性问题。自氟乙酰胺11，反应性逐渐降低。表3.含不可逆结合基（弹头，WH）的6o衍生物的效价及表征a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10-6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。氟乙酰胺11在二级功能分析中具有良好的效力，具有良好的选择性和药物代谢和药代动力学（DMPK)谱，并在体内进一步表征（表4）。表4.化合物6o和11的生化、物理化学和DMPK性质a至少2次测定的几何平均值±SEM。b从抑制试验开始测定。c小鼠肝细胞孵育后清除率。dP-gp抑制剂作用下P-gp过表达的小鼠LLC-PK1细胞的顶端外排比和表观通透性。e血浆蛋白结合、未结合部分。fClean是指在10μM条件下，所有检测结果的结合率<50%，或者酶检测结果的选择性>1000倍。g用自动膜片钳yy y测量。C57BL/6小鼠单次给药1mg/kg iv和10mg/kg po灌胃（11）和3mg/kg iv和30mg/kg po灌胃（6o）后的PK参数。药代动力学评估化合物11在给药后表现出中等的生物利用度和良好的半衰期，但由于细胞渗透性低，故化合物11的脑渗透性较差。此外，尽管p -糖蛋白（P-gp；MDR1）转运蛋白含量较低（表4），根据以往经验，Roche公司认为这可能是由主动外排的显著贡献所引起的。P-gp测定法对低被动渗透率化合物的定量达到极限。然而，由于其高效、选择性和不可逆的结合模式，它仍是一种合适的目标化合物，可以解决体内潜在的靶外周毒性，这在KO动物中观察到。为了评估外周AEP抑制剂的体内安全性，给CD1小鼠口服化合物11，每天2次，剂量水平分别为40和60mg/kg/天，持续8周。在这项研究中，没有观察到生活中的发现和复合相关死亡率。在两种剂量的组织病理学分析中均无不良发现。NOAEL考虑为20mg/kg/BID。脱靶特征是睾丸中生殖细胞的中度耗损和变性，少量至中度的腔细胞碎片，以及少量至显著的附睾精子细胞减少。不能排除与11治疗有关。毒性动力学分析显示，第56天最大（Cp,max,free）和平均（Cp,avg,free）游离血浆暴露分别至少为464/436nM（男性，m/女性，f）和123/204nM（m/f）。因此，在HEK细胞中，游离暴露与细胞效力的比值至少为2.7/2.6（m/f）（Cp,max,free）和0.7/0.7 （Cp,avg,free）。在第1天测定799/838nM的Cp、max、free水平（4.6/5.0倍）和224/204nM的Cp、avg、free水平（1.3/1.2倍）。考虑到不可逆的结合方式，外周AEP抑制剂在安全性研究中通过。由于脑脊液-血浆Kp,uu较低，AEP在脑内仅部分受到抑制。接下来，Roche公司将注意力转向了炔10，以提高脑外显率和代谢稳定性。炔以前被描述为不可逆的弹头，并与半胱氨酸形成硫烯醇醚，与结合口袋近距离结合。37-39它们比氟乙酰胺亲脂性更强，因此被认为更适合于实现脑渗透。此外，化合物6o的代谢物鉴定研究表明脯氨酸部分是代谢热点。因此，接下来探索了化合物10中的多种脯氨酸替代品，并研究了它们对效力和代谢稳定性的影响（表5）。表5.脯氨酸核心片段的优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10-6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。首先，(4R)-甲基取代脯氨酸（16）优于其(4S)配置的非对映体（17），无论是细胞效力还是微粒体稳定性，这一趋势也适用于氟取代类似物(18)。环合的环丙基环提高了细胞效力，但微粒体稳定性较差（化合物19、20和21）。苯基环接吡咯烷对这两个参数都有良好的影响（化合物22）。总体而言，也考虑到进一步的表征，例如对肝细胞的稳定性和P-gp转运体外排比和通透性，化合物18显示出最平衡的特征（表5和8）。接下来，通过炔取代基的变化来研究炔的电位活化的影响（表6）。可以看出取代基不仅是耐受的，而且确实导致了显著的效价增加。表6.杂芳基取代对炔的活化作用a至少2次测定的几何平均值±SEM。b小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。cd6（μg）DMSO相对于经颅磁刺激。d与补充NADPH和还原性GSH的人肝微粒体复合孵育后，发现谷胱甘肽（GSH）加合物（Flag）或未发现（No Flag），采用MS/MS分析测定。e可逆结合模式。如图5所示，似乎有两个主要因素影响不同炔取代的pIC50值。首先，与炔基亲电中心的13C位移有相关性，这是衡量弹头亲电性的一个指标。其次，与具有相似反应活性但没有这种结构特征的类似物相比，在邻位上具有氮孤对的杂芳基取代始终显示更高的pIC50值。例如，化合物34（R=Ph）和29（R=o-pyr）在Cel处具有相似的化学位移，但效价相差10倍（表6）。图5.在d6-DMSO中，相对于TMS，酶对碳原子细胞13C位移的效力散点图，单位为ppm。带有邻氮原子的杂芳基片段（蓝色）比没有这个特征的片段（红色）具有更高的效价。谷胱甘肽加合物形成用圆圈表示，而不是加合物形成（菱形）。配体复合物X射线晶体结构研究为了进一步阐明这一有趣的发现，他们测定了化合物36与AEP配体复合物的X射线晶体结构。尽管在底物结合位点附近存在晶体接触，但这些接触在不对称单元中的四个AEP分子之间是不同的，并且存在一致的抑制剂结合模式。此外，围绕炔段的AEP相互作用非常相似。如图6所示，其中显示了内部炔碳原子与Cys-189的共价键，导致sp→sp2杂化变化。噁唑环与相邻的乙烯π系接近共面（扭转角~16°），其氮原子与一个水分子形成弱氢键（d=3.5Å），该氢键通过与Glu-190和Ser-215侧链的相互作用保持在原位。推测该炔抑制剂与相邻杂环中的邻氮的亲和力增加是由于额外的氢键相互作用，并进一步稳定了蛋白质结合的水分子。此外，这种杂环与相邻双键共轭作用的增强可能进一步贡献结合能。图6. AEP与化合物36共晶（PDB ID：7fqk）。氢键用红线表示，与Cys189的共价键用蓝线表示。水晶触点已从图中省略。不幸的是，大多数这些化合物在微粒体稳定性试验中的表现很差，可能是由于三键亲电中心的高反应性（表6）。这种反应性可以通过谷胱甘肽（GSH）加合物形成试验中的广泛标记来证实。无法推导出13C位移、芳香片段R中邻位氮的存在与GSH加合物形成之间的相关性（图5）。随后基于炔基弹头，进一步优化了与S3和S4口袋的相互作用（表7），发现五元杂环在S4中是耐受的，并且邻位的硫原子或氯取代基可以提高配体效率LE41（化合物38和40）。此外，虽然对位上的环烷基甲氧基取代基对效价有有利影响（化合物42和43），但与简单的三氟甲氧基（化合物10，LE 0.36）相比，配体效率没有提高，而且代谢稳定性降低。表7. P3和P4残基的进一步优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。c配体功效，见（41）。一般可以通过将炔作为亲电共价反应基团来获得两位数纳摩尔范围内的细胞电位。不可逆的结合模式有助于在细胞环境中胜过内源性底物并增加了炔的渗透性。通过抑制动力学起始实验（图7）和共晶结构研究了丁腈和炔作为战斗部的结合模式。两个示例性化合物，腈6q和炔43与Cys189形成共价键。随着腈6q浓度的增加，酶的进程曲线呈线性，这表明了一种快速、可逆的结合模式（图7B）。相比之下，炔43存在时的进展曲线显示出平台曲率（图7C），表明不可逆的结合模式。抑制开始的速率常数kobs与炔43浓度呈线性关系（图7D），这与不可逆失活的一步机制一致。利用斜率确定的Kinact/KI为10,361/s/M，是衡量化合物43失活效率的总体指标。优化后的化合物具有良好的生物化学和细胞效力，具有良好的体外DMPK谱。这些化合物的选择在体外和小鼠体内进行了更详细的表征（表8）。据知，这是第一类既可口服又可脑渗透的AEP不可逆抑制剂。其中，化合物18的生物利用度为83%，脑外显率约为30%。这些化合物在体外能够抑制Tau N368片段的形成，如表8所示。那么该片段的形成在体内是否也同样受到抑制？事实上，在表达含有P301L突变Tau蛋白2N4R亚型的Tau转基因小鼠中，经过5天的处理，化合物18表现出显著抑制脑内AEP活性（图8A），并在所有测试的外周器官中完全抑制。同时，观察到Tau N368片段的形成减少（图8B），证实了体外测量的结果。对总Tau蛋白的影响不显著（图8C）。原因是Tau与Tau N368片段的大量过剩。另一个偏差可能是由于只有一个裂解位点被监测，并且只有未磷酸化的物种被基于质谱的分析检测到。表8.候选化合物的体外和体内表征a至少2次测定的几何平均值±SEM。b从抑制试验开始测定。c测定SH细胞中Tau N368片段还原的有效浓度。dP-gp抑制剂存在时P-gp过表达的小鼠转染的LLC-PK1细胞的外排比和表观通透性。e血浆蛋白结合，未结合部分。FGSH加合物与补充NADPH和还原性GSH的人肝微粒体复合孵育后发现（Flag）或未发现（No Flag），采用MS/MS分析测定。gClean表示在10μM的所有测试中，与酶分析中的AEP相比，在所有测试中<50%的结合或>1000倍的选择性。hIC50（Casp 3）>100μM, IC50（Cat S）>100μM。IC57BL/6小鼠单次iv给药1mg/kg和20mg/kg po给药后的PK参数。图8. AEP抑制剂18、20mg/kg BID给药5 d后对TauP301L转基因小鼠AEP的抑制作用。（A）最后一次处理后4小时脑组织样本相对于载药对照组的AEP活性。（B）Tau N368片段浓度。（C）未裂解Tau水平，均与总蛋白和载体平均水平归一化Tau N368片段数量减少导致Tau聚集减少并最终改善认知的基本假设仍有待长期实验证明。这次实验的结果将在之后报告。结论研究首次鉴定出具有细胞活性、可口服、脑渗透性不可逆结合的AEP抑制剂，并在体内证实了靶向性。酶学和X射线共晶分析证实了未开发炔类的不可逆作用模式。在此过程中，已经开发了一种细胞渗透荧光，AEP选择性底物，并降低了潜在靶诱导肾毒性的风险。不可逆抑制剂被证明具有持续的细胞效应，并且在未来的研究中可作为选择性的，体内适用的候选化合物。最后，AEP的正位抑制与大脑中Tau N368片段的减少之间的联系得到了证实。文章来源J. Med. Chem. 2023, 66, 17026−17043请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就阿尔兹海默症靶点Tau举例如下：首页输入Tau，即得。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于Tau相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于Tau相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。其中绿色高亮展示了潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

郑希元, 刘国伟. 《医药新技术与专利法》[M]. 北京: 知识产权出版社, 2022, 167-169.在专利侵权诉讼中，侵权成立的举证责任一般在于原告。但是《专利法》（2020年修正）第66条第1款规定：“专利侵权纠纷涉及新产品制造方法的发明专利的，制造同样产品的单位或者个人应当提供其产品制造方法不同于专利方法的证明。”也就是说当新产品制造方法的发明专利涉嫌侵权时，举证责任倒置。但是，根据该规定，在此类专利侵权纠纷案件中，由被诉侵权人承担证明其产品制造方法不同于专利方法的举证责任，需满足一定的前提条件：①权利人能够证明依照专利方法制造的产品属于新产品；②被诉侵权人制造的产品与依照专利方法制造的产品属于同样的产品。只要专利权人完成了新产品的初步证明义务，再能证明被诉侵权人制造了同样产品，法院就可以认为专利权人尽到了举证责任，举证责任才发生转移，如果被告不能证明生产该新产品的制造方法与专利方法不同，则构成侵权。以下将介绍在“新产品制造方法”中的“产品”范围的认定，何为“新”产品，以及通过案例的方式阐述“证明被诉侵权人制造的产品与新产品一样或等同”的重要性，以期为我国原研药企业如何进行“新产品制造方法”的专利维权以及仿制药企业如何进行有针对性的抗辩提供参考与借鉴。1.依照专利方法制造的产品的范围《专利法》第11条第1款规定：“发明和实用新型专利权被授予后，除本法另有规定的以外，任何单位或者个人未经专利权人许可，都不得实施其专利，即不得为生产经营目的制造、使用、许诺销售、销售、进口其专利产品，或者使用其专利方法以及使用、许诺销售、销售、进口依照该专利方法直接获得的产品。”根据上述规定，在涉及新产品制造方法专利的侵权纠纷案件中，方法专利权的保护范围只包含依照专利方法直接获得的原始产品，不包括对原始产品作进一步处理后获得的后续产品。在张某田诉石家庄制药集团欧意药业有限公司（以下简称“欧意公司”）、石家庄制药集团华盛制药有限公司（以下简称“华盛公司”）等侵犯发明专利权纠纷案[1]中，根据涉案专利的权利要求1，虽然其发明名称是“一种从混合物中分离出氨氯地平的（R）-（+）-和（S）-（-）-异构体的方法”，但从权利要求1记载的内容[2]来看，依照涉案专利方法直接获得的产品是“结合一个DMSO-d6的（S）-（-）-氨氯地平的D-酒石酸盐”，或“结合一个DMSO-d6的（R）-（+）-氨氯地平的L-酒石酸盐”，其中前者即为制造左旋氨氯地平的中间产物，而非左旋氨氯地平本身；而后者即为制造右旋氨氯地平的中间产物，亦非右旋氨氯地平本身。华盛公司、欧意公司生产的马来酸左旋氨氯地平、马来酸左旋氨氯地平片以及左旋氨氯地平，均属于对上述产品作进一步处理后获得的后续产品，不属于依照涉案专利方法直接获得的产品。因此，最高人民法院认定，涉案专利权的保护范围不能延及左旋氨氯地平、马来酸左旋氨氯地平及其片剂。此外，《专利法》第11条第1款“依照该专利方法直接获得的产品”中的“直接获得”是指完成专利方法的最后一个步骤所获得的产品，因此，该“产品”的范围还可包括使用专利检测方法进行检测的产品。药品检验是药品生产过程中必不可少的环节，没有检验就无法知晓是否获得了合格的药品，即只有通过涉案专利方法检测的药品才可以进入市场。在胡某泉、朱某蓉与山东省惠诺药业有限公司（以下简称“惠诺药业”）侵害发明专利权纠纷案[3]中，山东省高级人民法院认为，涉案专利为“肝素钠封管注射液”的质量检测方法，已被申请为“肝素钠封管注射液”药品的质量检测国家标准。药品事关社会公众的健康利益，《药品管理法》（2015年修正）第12条规定：“药品生产企业必须对其生产的药品进行质量检验；不符合国家药品标准或者不按照省、自治区、直辖市人民政府药品监督管理部门制定的中药饮片炮制规范炮制的，不得出厂。”因此，药品检验是药品生产过程中必不可少的重要环节，不进行质量检测就无法获得能够出厂销售的合格药品。惠诺药业生产销售的“肝素钠封管注射液”即是使用涉案专利方法进行质量检验合格的药品，虽然《专利法》（2008年）第11条关于“依照该专利方法直接获得的产品”规定中并未明确使用专利检测方法进行检测的产品是否受该条规制，但惠诺药业生产的涉案“肝素钠封管注射液”药品若不使用涉案国家药品标准进行质量检测就无法出厂，也无法进入市场销售，进而实现销售获利。鉴于此，如不制止惠诺药业使用涉案专利方法进行检测的“肝素钠封管注射液”药品的销售，将导致惠诺药业使用涉案专利方法的侵权后果不受法律规制，惠诺药业仍可通过销售已经使用涉案专利方法检测的“肝素钠封管注射液”药品获得侵权利益，这不符合专利法保护专利权人的合法权益，以及打击侵权行为的立法本意。根据上述所确定的“产品”的范围，在涉及多步骤的制造（制备）方法的权利要求撰写上，需要注意的是，除了将具有新颖性和创造性的步骤单独作为独立权利要求进行保护之外，还可以在该具有新创性的步骤之外添加其他步骤形成新的独立权利要求进行保护，从而扩大了可实际要求保护的“产品”的种类。[1] 该案为最高人民法院公报案例，参见最高人民法院（2009）民提字第84号民事判决书。[2] 涉案专利授权公告的权利要求1为：“1.一种从混合物中分离出氨氯地平的（R）-（+）-和（S）-（-）-异构体的方法。其特征在于：包含下述反应，即在手性助剂六氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）或含DMSO-d6的有机溶剂中，异构体的混合物同拆分手性试剂D-或L-酒石酸反应，结合一个DMSO-d6的（S）-（-）-氨氯地平的D-酒石酸盐，或结合一个DMSO-d6的（R）-（+）-氨氯地平的L-酒石酸盐而分别沉淀，其中氨氯地平与酒石酸的摩尔比约等于0.25。”[3] 该案为2018年中国法院50件典型知识产权案例之一，参见山东省高级人民法院（2018）鲁民终870号民事判决书。目录（下翻查看完整目录）第1章 医药新技术与新政策 1.1医药技术发展新趋势1.1.1抗体药物偶联物1.1.2双(多)特异性抗体1.1.3NTRK融合基因靶向药1.1.4膜内外蛋白降解技术1.1.5AI制药与基因疗法 1.2中国医药行业发展演变1.2.1药品注册政策与上市分析1.2.2医保谈判与集中带量采购1.2.3授权合作与尽职调查 1.3中国医药专利制度演变 第2章 医药专利类型与授权、确权和侵权 2.1化合物2.1.1新颖性判断规则变化2.1.2创造性判断思路与比较分析2.1.3无效宣告请求阶段的修改与举证 2.2盐2.2.1中国典型案例分析2.2.2美国典型案例分析2.2.3中美案例比较研究 2.3晶型2.3.1国内外新颖性评判标准2.3.2鉴别方法与新颖性评判案例2.3.3美国创造性评判标准与实践2.3.4中国创造性评判标准与实践2.3.5中美创造性评判差异及启示 2.4前药、代谢物和中间体2.4.1前药侵权性质认定2.4.2专利间接侵权法律制度2.4.3前药与代谢物专利侵权案例2.4.4代谢物专利布局案例2.4.5中间体专利侵权案例2.4.6启示与不同的声音 2.5医药用途2.5.1瑞士型权利要求的演进2.5.2医药用途权利要求撰写方式2.5.3中国新颖性评判标准与案例2.5.4中国创造性评判标准与案例 2.6制备方法与新产品制造方法2.6.1制备方法专利侵权与创造性判断2.6.2新产品制造方法专利侵权诉讼 2.7手性化合物2.7.1药理活性与毒副作用2.7.2中欧新颖性评判标准分析2.7.3中美创造性评判差异分析2.7.4审查差异与启示 2.8药物制剂2.8.1药用辅料发明的中美评判标准2.8.2剂型转换发明的创造性判断 2.9药物组合物2.9.1化学药组合物创造性评析2.9.2中药组合物创造性评析 2.10抗体2.10.1肿瘤免疫疗法研究进展2.10.2单抗药物市场之争2.10.3中欧专利审查“支持”问题2.10.4国外专利布局分析与举例2.10.5国外专利布局考虑因素2.10.6中欧专利审查创造性标准2.10.7对我国医药企业的启示 2.11基因与微生物2.11.1中国基因专利创造性评析2.11.2美国基因专利创造性评析2.11.3微生物可专利性演变2.11.4微生物专利无效与侵权诉讼 2.12胚胎干细胞2.12.1伦理要求变化2.12.2可专利性案例分析2.12.3中国相关法律规定2.12.4其他国家/地区相关法律规定 第3章 医药专利法律问题 3.1优先权认定3.1.1在后申请中缺少的技术特征3.1.2技术方案是否实质相同3.1.3在先申请是否为“首次申请” 3.2商业成功3.2.1商业成功的中美相关规定3.2.2中国关于“商业成功”的案例3.2.3美国关于“商业成功”的案例3.2.4商业成功在中国的可操作性探讨 3.3技术偏见3.3.1“肯定的”技术偏见与“消极的”技术偏见3.3.2中国无效诉讼案例3.3.3美国同族授权专利审查档案3.3.4案例分析与启示 3.4实验数据3.4.1说明书充分公开问题3.4.2补充实验数据问题3.4.3补充实验设计问题3.4.4实验数据真实性问题 3.5等同侵权3.5.1数值范围特征3.5.2封闭式权利要求3.5.3放弃的技术方案 第4章 医药专利法律制度 4.1药品专利链接制度4.1.1中美药品专利链接制度对比4.1.2韩国和加拿大如何选择4.1.3欧盟和印度如何选择4.1.4中国实践中可能存在的困境 4.2药品专利期限补偿制度4.2.1计算方法4.2.2适用对象4.2.3保护范围4.2.4限制规定差异 4.3Bolar例外条款4.3.1条款起源及发展状况4.3.2中国Bolar例外条款4.3.3Bolar例外条款与行政审批4.3.4仿制药研发的未来出路 第5章 医药专利典型案例评析 5.1张某田诉欧意药业有限公司等侵犯发明专利权纠纷再审案5.1.1案情概述5.1.2最高人民法院的改判5.1.3针对该案的法律分析5.1.4该案所带来的启发 5.2礼来公司诉华生公司发明专利侵权案5.2.1案情概述5.2.2针对该案的法律分析5.2.3该案所带来的启发 5.3国家知识产权局、中惠公司与众生公司发明专利权无效行政纠纷案5.3.1案情概述5.3.2光盘背景介绍5.3.3判决要旨及诉讼应对策略5.3.4新药光盘不能视为现有技术 5.4确认不侵犯专利权若干问题的分析5.4.1案情概述5.4.2法理分析5.4.3侵权比对分析5.4.4禁止反悔原则5.4.5本案带来的启发案例索引后记