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摘要：mRNA疫苗作为有前景的癌症疗法已经发展起来。这些疫苗可以编码与肿瘤相关的抗原，从而实现个性化的治疗方法。它们还可以针对癌症特有的突变，并克服免疫逃逸机制。它们通过操纵身体的细胞功能来产生抗原，引发免疫反应，并通过克服与特定组织相容性白细胞抗原分子相关的限制来抑制肿瘤。然而，成功地将mRNA传递到目标细胞是一个关键挑战。病毒和非病毒载体（脂质纳米颗粒和阳离子脂质体）在保护mRNA免受破坏和协助细胞摄取方面显示出了巨大的能力。细胞穿透肽、水凝胶、基于聚合物的纳米颗粒和树状分子已被研究以增加mRNA的传递效率和免疫原性。这篇全面的综述探讨了mRNA疫苗及其用于癌症的传递平台，涉及设计考虑、多种传递策略和最新进展。总体而言，这篇综述为mRNA疫苗作为有效癌症治疗的创新策略的进展做出了贡献。 1.引言 mRNA疫苗领域在mRNA疫苗成功对抗传染病之后经历了突破性的进步。mRNA疫苗在提供针对病毒病原体的特异性和引人注目的免疫反应方面的空前成功，激发了对mRNA治疗癌症疗法的强烈研究努力。癌症疫苗历来包括与癌症相关的抗原（CAAs）、免疫刺激剂和癌症特异性抗原（Ags）。与传统疫苗相比，它们提供了多种优势，如编码多种蛋白质、引发强大的免疫反应以及促进快速开发和生产。mRNA疫苗可以表达包含众多表位的完整Ags，同时绕过主要组织相容性复合体（MHC）的限制。然而，将mRNA疫苗传递到目标细胞面临着重大挑战。 mRNA疫苗的成功在很大程度上取决于推进有效的传递平台，这些平台确保mRNA的稳定性、保护和有效的细胞内传递。各种传递平台被开发出来，以提高mRNA疫苗的效力，同时最小化潜在的不良反应。基于脂质的纳米颗粒（LNPs）在mRNA疫苗开发中至关重要，它们可以成功地封装和保护mRNA分子，促进细胞摄取，实现内质网逃逸，并帮助有效地转化为Ags。脂质化学和配方技术的最新进展显著提高了LNPs的效力，导致在临床前和临床环境中成功传递mRNA。 病毒载体长期以来被用于基因传递，并作为mRNA疫苗载体获得了相当大的关注。这些载体可以有效地转导目标细胞，实现mRNA的细胞内传递以进行后续翻译。病毒载体提供高转导效率，并可以触发强大的免疫反应。然而，安全问题、预先存在的免疫力和有限的货物容量提出了挑战，这些挑战必须得到解决，以便它们在mRNA疫苗传递中的成功应用。 基于聚合物的载体作为mRNA传递平台被探索，并由于其多功能性、生物相容性和可调节属性提供了多种优势。它们与细胞膜的有害电荷组分进行静电连接，帮助细胞摄入并促进从内质网转移。此外，将靶向配体整合到聚合物载体上允许特定部位的传递和提高效力。基于肽的传递平台作为mRNA传递平台得到了发展，它们利用其低毒性、合成简便和潜在的靶向传递能力。肽可以被设计成具有固有的细胞穿透属性或针对特定细胞表面受体，促进有效的mRNA摄取和细胞内传递。细胞穿透的、pH响应的和自组装肽在增强mRNA疫苗传递和随后Ags表达方面显示出了有希望的结果。这篇综述讨论了不同mRNA疫苗在临床前和临床开发中的现状。它通过关注关键考虑因素，如mRNA修饰、Ags选择和佐剂整合，来优化它们的设计。此外，它探讨了用于将mRNA传递到目标细胞的多种策略，包括病毒载体和基于脂质的纳米结构、基于聚合物的载体、基于肽的支架系统和纳米材料。此外，这篇综述强调了最近的进展和创新方法，如树状分子和离子电渗技术，旨在克服与mRNA疫苗传递相关的挑战。这些进步旨在提高mRNA疫苗传递平台的安全性、效力和转化潜力。我们的综述最后通过追踪mRNA疫苗及其传递策略的演变，从它们在传染病和癌症治疗中的成功应用开始。这篇综述为mRNA疫苗和先进的传递平台提供了深入的分析，为这一有前景的领域的当前状态和前景提供了宝贵的见解。 2.mRNA疫苗 RNA分子作为一类治疗药物获得了显著的认可，尤其是在成功开发2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗之后。这一突破为针对传统上具有挑战性和“不可成药”的目标以及在基因层面治疗疾病开辟了新的可能性。mRNA疫苗代表了一种有前景的癌症治疗方法，提供了特定且耐受性良好的治疗选择，已在临床前研究中显示出对实体肿瘤的有效性。例如，采用生物信息学驱动的策略开发了一种专门针对卵巢癌和乳腺癌中的癌症抗原125（CA-125）的mRNA疫苗。疫苗设计包括自佐剂特性和计划增加树突状细胞（DCs）抗原呈递能力的元素。检测到干扰素-γ（IFN-g）和分化簇8阳性（CD8+）T细胞激活，验证了疫苗的潜力。为了获得强大的抗肿瘤效果，必须有效地传递和翻译编码肿瘤抗原的mRNA，并同时触发先天免疫反应以促进抗原呈递。因此，针对DCs是提高疫苗效率的有利方法。目前，已经探索了多种策略来特别针对DCs。一种方法涉及使用抗原传递载体，包括纳米颗粒或脂质体，这些载体装饰有与DC受体、DC-SIGN或CD40特异性相互作用的配体。这些配体促进DCs选择性地摄取抗原，促进抗原呈递给T细胞。此外，在疫苗配方中加入佐剂可以激活DCs，进一步增强其刺激免疫反应的能力。这种针对性疫苗在提高包括癌症和传染病病原体在内的各种疾病的疫苗精确度和效力方面具有巨大潜力。这一进展是治疗性癌症疫苗研究的一个重要里程碑。表1总结了不同的mRNA疫苗、目标抗原和临床前及临床试验的关键发现（表1）。 2.1.mRNA疫苗在临床前试验中 众多的临床前研究已经调查了针对多种类型癌症的各种mRNA疫苗。最近的研究调查了肿瘤衍生RNA作为设计基于树突细胞（DC）疫苗的抗原来源及其在肿瘤疫苗策略中的有效性。Kyte等人进行了自体肿瘤mRNA树突细胞（tDCs）作为针对黑色素瘤的疫苗的临床前评估。tDCs诱导了对肿瘤特异性抗原的T细胞反应。该研究表明tDC特异性反应，包括所有六名患者中的T细胞增殖，在两名患者中分泌干扰素-γ（IFN-g），以及一名患者中HLA的阻断。此外，Kyte等人证明tDC疫苗无毒性，并成功在黑色素瘤患者中诱发T细胞反应。Key等人的另一项研究旨在评估有趣的T细胞反应并调查它们作为加强剂量的持续长期效力。他们展示了针对抗原的显著细胞介导的免疫反应。此外，研究确认即使在来自单一细胞的T细胞克隆中，辅助性T细胞1/2（Th1/Th2）细胞因子谱也是混合的。这表明疫苗本身可能不足以作为单一疗法，并为其与免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合提供了强有力的理由。这项评估突出了这种组合作为恶性黑色素瘤疫苗策略的潜在用途。 佐剂用于选择性激活不同的免疫组分，从而增强疫苗的免疫刺激性活性。mRNA疫苗中使用的佐剂可分为三组：（1）具有自我佐剂特性的RNA，（2）传递系统的组成部分，以及（3）外部免疫刺激剂。临床前调查提供了证据，证实了将ICIs和癌症疫苗结合用于非免疫原性肿瘤治疗的使用。这种方法在免疫治疗领域呈现了一个有希望的途径。Liu等人合成了带有血凝素（HA）标签的黏蛋白1（MUC1）mRNA，以制定mRNA疫苗。使用脂质/钙/磷酸盐（LCP）系统作为佐剂开发mRNA疫苗。在这项研究中，评估了编码MUC1新抗原的mRNA疫苗的有效性，旨在激活位于淋巴结内的DCs。研究展示了成功的T细胞刺激和扩增，特别是针对三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤。为了进一步提高mRNA疫苗的抗肿瘤效力，它与明确针对细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA-4）的抗体结合使用。疫苗诱发了强大且针对性的CTL反应，疫苗和特定CTLA-4抗体的同时给药显著增强了对肿瘤的免疫反应。Gu等人调查了通过将Toll样受体（TLR）2/6 mRNA，特别是Pam2Cys（一种佐剂），纳入脂质纳米颗粒（LNPs）来增强mRNA疫苗效力。用这种疫苗进行免疫调节了引流淋巴结（dLNs）中的免疫微环境，导致包括白介素-12（IL-12）和IL-17在内的关键细胞因子的释放。抗原呈递主要由迁移性和dLN驻留的传统2型DCs促进，导致CD4+和CD8+ T细胞介导的强大抗肿瘤反应。 在另一项研究中，Tse等人证明编码构成型激活的干扰素基因刺激物V155M（STINGV155M）蛋白的mRNA作为增强CD8+ T细胞反应的有效遗传佐剂。疫苗诱导的干扰素刺激反应元件和核因子kB途径激活了I型干扰素反应，并增强了抗原特异性T细胞。用编码E6和E7肿瘤蛋白和STINGV155M的mRNA进行疫苗接种，导致人乳头瘤病毒阳性（HPV+）TC-1肿瘤小鼠模型中肿瘤生长减少。这项研究为mRNA编码佐剂在增强疫苗效力方面的有效性提供了令人信服的证据。 另一种方法涉及将mRNA疫苗NP与佐剂C16-R848结合使用，这增强了合成mRNA疫苗在癌症治疗中的效力。这种由编码卵清蛋白（OVA）的mRNA和带有C16-R848涂层的脂质-聚乙二醇（PEG）壳组成的配方，保留了佐剂的活性。它显著提高了mRNA转染效率，并通过MHC类I促进了抗原的呈递。这种方法通过增强OVA特异性CD8+ T细胞的增殖及其在肿瘤床中的积累，刺激了有效的T细胞介导的免疫反应。张和夏开发了一种自佐剂mRNA纳米疫苗用于癌症治疗。这种纳米疫苗由编码肿瘤抗原的mRNA和类似脂质的材料（C1）组成。它有效地将mRNA传递给DCs，并同时刺激TLR4，从而激活T细胞。重要的是，这种纳米疫苗在几个小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤效果。 TriMix由CD40L和CD70 mRNA以及TLR4组成，在晚期黑色素瘤中展示了佐剂活性。TriMix和TriMixDC-MEL的配方，由自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔DCs组成，在晚期黑色素瘤中展现了安全性和抗癌效果。Van Lint等人调查了CAA mRNA（酪氨酸酶相关蛋白-2 [Trp2]、Wilms肿瘤基因1 [WT1]或酪氨酸酶）与佐剂TriMix的淋巴结内递送。这种方法诱导了DCs的成熟，促进了LNs内CAA特异性T细胞的激活。研究表明选择性地摄取mRNA疫苗，导致CD11c+细胞在LNs中编码Trp2、WT1或酪氨酸酶。TriMix mRNA的存在创造了一个吸引和刺激CD4+和CD8+ T细胞的环境，特别是针对抗原。此外，这种疫苗在诱导CTLs和在小鼠模型中产生治疗反应方面显示出与mRNA电穿孔DCs相当的效力。这项研究强调了淋巴结内递送CAA mRNA，结合免疫调节mRNA作为一种有希望的疫苗策略的潜力。 Ramos da Silva等人进行了一项研究，涉及将自扩增mRNA以及未修饰和核苷修饰的非复制型mRNA封装进脂质纳米颗粒（LNPs）中，以开发疫苗。这些疫苗编码一种嵌合蛋白，包括HPV-16 E7肿瘤蛋白和1型单纯疱疹病毒糖蛋白D（gDE7）。该研究发现，即使是单次低剂量免疫接种这些gDE7 mRNA疫苗中的任何一种，都能激活特异性E7 CD8+ T细胞。此外，这些疫苗诱导的记忆T细胞反应能够预防肿瘤复发，并在不同生长阶段有效消除皮下肿瘤。此外，gDE7 mRNA-LNP疫苗在单剂量疫苗后，对同种异体小鼠肿瘤模型显示出显著的肿瘤保护效力。比较分析强调了这些mRNA-LNP疫苗比gDE7 DNA和gDE7重组蛋白疫苗的优越性。这项研究强调了基于mRNA的疫苗在癌症治疗免疫疗法中的潜力。 2.2.处于临床试验阶段的mRNA疫苗 最近的研究评估了使用mRNA疫苗针对癌症的可行性。在临床治疗的子宫癌患者中，给予含有WT1 mRNA的自体DC基础疫苗。HLA-A2阳性的患者观察到积极的肿瘤学和免疫学反应，而HLA-A2阴性的患者没有表现出这种反应。另一项临床试验涉及使用来自自体癌症干细胞的mRNA的单核细胞衍生的自体DC基础疫苗。接种疫苗的患者显示出强大的免疫反应和延长的无进展生存期。用剂量强度的替莫唑胺和编码pp65溶酶体相关膜糖蛋白的DC基础mRNA疫苗治疗胶质瘤患者，显示出延长的无进展生存期和增加的pp65细胞反应。Cafri等人开发了mRNA-4650，它编码自体癌症抗原。该疫苗包含来自患者肿瘤的肿瘤蛋白53（TP53）、KRAS或磷脂酰肌醇3激酶、催化亚单位α（PIK3CA）突变，以及多达15个预测的I类HLA新抗原。mRNA-4650在I/II临床阶段是安全的，并触发了针对预期新表位的突变特异性T细胞反应。由携带mRNA编码的肿瘤抗原癌症睾丸（CT）7、黑色素瘤抗原基因（MAGE）-A3和WT1的朗格汉斯型DC（LCs）组成的疫苗，通过抗原特异性CD4和CD8 T细胞诱导了干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）-α的释放，以及接种组内的克隆扩增。在临床研究中，基于DC的mRNA疫苗在多种癌症类型中显示出有希望的免疫反应和改善的生存期。 BNT162b2是一种核苷修饰的RNA和含有LNP的疫苗。Shroff等人比较了接受细胞毒性治疗的癌症患者和对照组对BNT162b2 mRNA疫苗的反应。首剂后，67%的癌症患者产生了中和抗体，第二剂后增加了3倍。尽管癌症患者显示出针对Spike蛋白的抗体和T细胞，但他们的反应比对照组弱。在癌症患者中识别出特定于Spike受体结合域的记忆B细胞亚群，可能预示着对额外剂量的更好反应。一项针对20名癌症患者的I期研究发现，给予第三剂疫苗使中和抗体增加了3倍，伴随轻微的不良反应，但没有T细胞改善。Harrington等人评估了16名慢性髓性白血病（CML）患者接受BNT162b2疫苗单剂量后的免疫效应，这些患者之前接受了酪氨酸激酶抑制剂治疗。在接种疫苗后21天内，87.5%的CML患者表现出抗Spike免疫球蛋白G（IgG），产生了中和抗体。在可评估的患者中，93.3%检测到T细胞反应，80%表现出多功能性反应，包括CD4+和CD8+ T细胞。慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）患者在2剂BNT162b2 mRNA疫苗接种后没有显示出体液反应。然而，近四分之一的人对第三剂疫苗有积极反应。在接受积极治疗的个体和在接种前1年内接受抗CD20治疗的个体中，抗体反应率较低。Thakkar等人发现，第三剂BNT162b2疫苗在最初血清阴性的癌症患者中诱导了57%的血清转换。这种反应保持强劲，抗体水平、T细胞活性和中和能力持续6个月。在接受第三剂疫苗后没有产生足够反应的严重免疫受损的血液恶性肿瘤患者中，临床试验中的第四剂疫苗在67%的患者中增强了免疫力。然而，BNT162b2在不同队列中的免疫原性表现出差异。在骨髓增生性恶性肿瘤患者中反应强劲，达到88%，但多发性骨髓瘤患者表现出明显较低的反应，尤其是那些接受基于抗CD38的治疗的患者。总之，基于LNP的BNT162b2疫苗对接受积极化疗的癌症患者似乎是安全和有益的。 将编码抗原的mRNA和佐剂纳入阴离子脂质体配方可以增强mRNA疫苗的有效性。Tockary等人将RNA工程化，将佐剂与编码抗原的mRNA链结合起来。最终，双链RNA（dsRNA）-连接的mRNA被装载进脂质体配方中，有效地诱导了小鼠和人类DCs，导致大量促炎细胞因子的分泌。OVA mRNA配方已在临床上评估，并在小鼠淋巴瘤（E.G7-OVA）模型中取得了显著的治疗效力。精蛋白是一种小的阳离子肽，作为药物递送候选物质显示出前景。在自然界中，它通过静电键与DNA形成复合物，在精子发生过程中保护DNA的完整性。科学家采用了这种自然方法来开发药物递送平台，使用精蛋白作为RNA载体。在一项显著的应用中，为转移性黑色素瘤开发了一种受精蛋白保护的mRNA疫苗。这种疫苗编码多种肿瘤抗原，导致在I/II期疫苗接种试验中疫苗诱导的T细胞增加和免疫抑制细胞减少。RNActive由CureVac开发，使用编码OVA的修饰mRNA与精蛋白结合，赋予自我佐剂活性，触发针对癌症抗原的免疫反应。这一过程涉及TLR4的激活。RNActive疫苗可以引发强大的免疫反应，包括体液和细胞成分。它们还可以激活包括Th1和Th2细胞在内的耐药细胞亚群，这些细胞在协调免疫反应中至关重要。此外，这些疫苗可以触发短期效应反应和长期记忆反应。基于RNActive技术的mRNA疫苗CV9202显示出固有的自我佐剂特性。它可以针对非小细胞肺癌中常见的六种抗原，并刺激针对广泛CAAs的免疫反应。 CV9103和CV9104是基于RNActive技术开发的抗癌疫苗，专门设计用于针对被诊断为前列腺癌（PC）的个体的靶向治疗。在CV9103在I/II期试验成功后，目前正在对特定的去势抵抗和高风险PC患者进行CV9104作为术前新辅助治疗的临床评估。RNActive基础疫苗CV9201旨在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。它携带表达在NSCLC中的五种抗原的遗传信息。在一项I/IIa期剂量递增研究中，该疫苗显示出有希望的反应，在治疗后检测到免疫反应，支持进一步的临床研究。 最近，IIb期KEYNOTE-942/mRNA-4157-P201试验的积极结果代表了黑色素瘤治疗的重要进展。这项研究调查了Moderna的mRNA-4157个性化癌症疫苗，该疫苗包括一个合成的mRNA，编码34个新抗原，根据患者肿瘤的独特突变特征定制。它与Keytruda（pembrolizumab）联合作为辅助治疗，在完全切除后的III/IV期黑色素瘤患者中使用。 mRNA-4157/V940是一种开创性的基于mRNA的个性化癌症疫苗，专门针对每位患者量身定制，根据他们肿瘤的突变特征编码34个新抗原。当给药时，这种合成mRNA触发适应性免疫反应，为针对患者肿瘤突变的高度靶向的抗肿瘤反应做好准备。 将mRNA-4157/V940与Keytruda（一种增强免疫系统检测和对抗肿瘤细胞能力的免疫疗法）结合使用，预计将通过促进T细胞介导的肿瘤细胞破坏提供额外的好处。试验的突出成就是与单独使用Keytruda相比，复发或死亡的显著减少（44%）。这标志着首次证明由于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断，高风险黑色素瘤患者的无复发生存期得到改善，并表明个性化新抗原方法在革新癌症免疫疗法中的潜力。mRNA-4157/V940的不良事件与早期I期试验一致，Keytruda的安全性概况保持一致。总之，这些开创性的结果突出了像mRNA-4157/V940这样的个性化mRNA癌症疫苗与Keytruda等免疫疗法结合使用的前景，以推进黑色素瘤治疗。它们强调了定制化新抗原方法在癌症免疫疗法中的重要性，为改善患者结果和癌症斗争中的生存带来了希望。 3.mRNA疫苗传递平台 正在评估几种mRNA疫苗技术以引发靶向免疫反应。最近的文献综述探讨了将mRNA治疗剂纳入创新纳米级配方以增强癌症免疫疗法的潜力。此外，一项全面的综述检查了各种专注于提高基于mRNA的癌症疫苗效力的策略。这些综述强调了使用mRNA技术进行癌症治疗和免疫疗法的持续研究和兴趣。 基于现有科学数据，mRNA疫苗技术大致可分为两组：裸mRNA传递方法，包括电穿孔和离子电渗（IP）技术；以及靶向传递系统，包括基于脂质的传递系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）和脂质体；聚合物纳米系统，如胶束、树状分子和聚合物水凝胶；基于肽的传递系统；基于碳纳米材料的传递系统；以及病毒载体介导的传递系统。选择这些标准是为了确保对mRNA疫苗传递格局进行全面准确的概述，从而在这个关键领域做出有力的结论和明智的决策。 3.1.裸mRNA传递方法 直接使用mRNA在DCs中产生T细胞反应（抗原特异性）并创造能够消除癌细胞的防御性抗体。通过使用电穿孔将mRNA传递给患者的DCs，这些疫苗技术有望增强免疫系统识别和靶向肿瘤细胞的能力。在结直肠癌的背景下，一项研究对疫苗接种方案进行了比较。具体来说，这项研究评估了两种不同方法的有效性：一种是使用与HLA-A2结合的源自癌胚抗原（CEA）的肽段脉冲的DCs，另一种是使用CEA mRNA电穿孔的DCs。分析表明，使用CEA肽段脉冲DCs有效地刺激了针对结直肠癌的特异性免疫反应。使用针对晚期黑色素瘤患者的单核细胞衍生DCs的mRNA疫苗，显示出显著的CD8+ T细胞反应。同样，将编码WT1抗原的自体成熟mRNA电穿孔DCs皮内注射给急性髓系白血病（AML）患者，也显示出积极的结果。含有自体DCs电穿孔自体癌症mRNA的黑色素瘤疫苗诱导了针对抗原的强烈免疫反应，表明其在体内引发免疫反应的潜力。从人类CD34+前体获得的LCs并用电穿孔WT1 mRNA，显示出持续呈现抗原肽段并诱导强烈的自体CTLs。这种方法消除了对外部细胞因子的需求，展示了mRNA电穿孔LCs作为癌症免疫疗法疫苗的潜力。然而，mRNA基治疗的更广泛应用面临着与它们对核酸酶的敏感性、进入抗原呈递细胞的细胞内传递以及免疫共刺激相关的挑战。克服这些挑战需要确保在传递过程中的稳定性和保护的靶向传递系统。为了推进这个领域，许多研究集中在开发针对癌症治疗背景下mRNA疫苗的靶向传递策略。 最近的一项综述提供了对合成RNA修饰的尖端方法的见解。这些创新方法主要关注核苷酸的改变，包括在50 UTR和30 UTR中纳入假尿苷以及RNA甲基化。这些修饰已被证明显著增强了基于RNA的疫苗的稳定性和效力。通过提高合成RNA的耐用性和性能，这些方法在推进疫苗开发和分子治疗领域具有巨大的潜力。这个研究方向强调了核苷酸工程在优化基于RNA的干预措施结果中的作用。 将IP技术与经皮传递系统相结合，成功地给药了最少的编码gp10025-33肽（KVPRNQDWL）的mRNA疫苗。IP刺激的mRNA疫苗传递引发了免疫反应并激活了皮肤驻留的免疫细胞。这种组合导致了免疫系统的强烈刺激，显著抑制了植入黑色素瘤细胞的小鼠中的肿瘤细胞。它还上调了IFN-γ并增加了肿瘤内CD8+ T细胞的浸润，从而有助于清除肿瘤。研究证明了IP用于传递mRNA疫苗的成功，对黑色素瘤治疗具有潜在的影响。 3.2.基于脂质的纳米系统用于mRNA疫苗传递 LNPs已被记录为mRNA疫苗的多功能传递平台。这些LNPs具有多个优点，包括易于组合和成分增强传递效率及最小化毒性。此外，通过包含佐剂或免疫细胞靶向配体，实现了对免疫反应的定制。LNPs目前在临床应用中最为先进。然而，这些系统涉及多个组分，并引起必须最小化以确保安全的炎症效应。近年来，有几项研究解决了提高LNP安全性的问题。这些努力包括开发可生物降解的LNPs，工程化具有不同脂质样分子的阳离子LNPs，设计增强内质网逃逸的LNPs，以及配制聚乙二醇化LNPs以减少不良免疫反应。此外，具有与环胺辅助的头基的环保阳离子脂质，已被证明可以提高LNPs的有效性和保护力。此外，基于交替共聚物的低炎症mRNA癌症疫苗载体PHTA展示了强大的抗肿瘤免疫反应及最小的炎症副作用，使其成为开发mRNA癌症疫苗的可能策略。 LNP颗粒的大小显著影响其免疫原性。包括稳定性和对目标蛋白的亲和力在内的多种因素，可以影响依赖LNP的RNA传递。例如，带有阳离子基团的脂质促进与内质网膜的静电相互作用，并使疫苗释放到细胞质中。此外，磷脂和聚乙二醇脂质共同促进了LNP介导的RNA传递的有效性。它们影响LNP在体内的清除和分布，进而影响基于LNP的RNA传递系统的性能。此外，包括像C12-200这样的立体纯衍生物在内的阳离子脂质可以影响LNPs的mRNA传递效率，这是由于它们的立体化学。此外，胆固醇和辅助脂质的结合显著促进了使用LNPs进行mRNA转染的有效性。因此，这些不同的脂质组分对于定制LNPs以有效传递RNA至关重要。 在四个LNP组分中，阳离子脂质起着基本作用。这些脂质在其常规pKa下带有正电荷，这使得在自组装过程中加载负电荷RNA到LNPs中成为可能。重要的是，它们在中性pH下保持不变，这有助于最小化毒性并保持LNPs在储存和传递过程中的稳定性。细胞摄取后，随着内质网pH的降低，这些LNPs重新获得正电荷，这有助于它们从内质网逃逸。磷脂中的乙醇胺基团由于其融合特性，可以增强内质网逃逸。此外，LNPs中磷脂的选择可以影响其传递特性。观察到中性磷脂主要促进肝脏传递，而带有负电荷的磷脂改变了LNPs从肝脏到脾脏的靶向。这种器官靶向的选择性可能是设计治疗应用RNA传递系统的有价值特性。 胆固醇通常被纳入作为调节LNP物理性质和纳米结构的调节剂，增强细胞内传递和体内LNP稳定性。结合聚乙二醇化脂质可能增强LNPs的胶体稳定性，延长它们的循环时间。同时，这可以减少它们被细胞摄取并阻碍它们从内质网释放。 通过使用微流体系统，可以制造精确大小的NPs，实现高效RNA封装，以高效率传递。在一项研究中，LNPs在保持一致的脂质组成的情况下系统地修改了大小。有趣的是，小鼠中较小的LNPs显示出显著较低的免疫原性，包括减少的免疫反应，包括抗体产生、免疫细胞激活和记忆细胞的产生。这些发现强调了优化LNP大小以最大化mRNA疫苗治疗效果的重要性。 LNP配方作为mRNA疫苗传递载体显示出显著潜力，证明了其引发强大CTL反应的能力。LNP介导的传递方法涉及分离患者的自体DCs及其随后与编码CAAs的mRNA转染。许多基于脂质的NPs正在作为mRNA疫苗载体进行调查，从而突出了一个积极的研究和开发领域。范等人调查了阳离子脂质辅助NPs（CLAN）作为mRNA疫苗载体。他们的发现揭示了CLAN有效地触发了DC成熟和抗原特异性T细胞增殖。此外，使用OVA mRNA封装的CLAN对携带淋巴瘤的小鼠进行静脉免疫接种，诱导了强大的OVA特异性T细胞反应，减少了肿瘤生长。这些发现突出了CLAN作为mRNA疫苗传递平台的有效性。 在一项相关研究中，一种名为C1脂质（C-12）的阳离子脂质类似化合物有效地将mRNA传递给抗原呈递细胞（APCs），同时激活TLR4并促进强大的T细胞激活。C1脂质可以通过吞噬作用促进mRNA疫苗摄取。此外，C1 LNP可以通过激活DC中的TLR4信号通路，刺激IL-12（一种炎症细胞因子）的表达。值得注意的是，依赖C1脂质的mRNA疫苗在癌症预防和治疗疫苗背景下展示了强大的抗肿瘤反应。此外，这些纳米复合物通过激活细胞质和内质网中的模式识别受体，诱导了先天DC免疫反应。它们还诱导了具有显著Th1特征的DC介导的适应性免疫。这项研究展示了阳离子脂质作为mRNA疫苗传递系统平台的潜力。 此外，一种针对淋巴结（LN）的LNP，称为113-O12B，增强了mRNA癌症疫苗的传递。它还增加了LN中的mRNA表达，并显著改善了对mRNA编码抗原的细胞介导的免疫反应。与PD-1抗体结合使用的LN靶向LNP系统在肿瘤模型中展示了改进的保护和治疗效果，展现了其作为mRNA疫苗多功能平台的潜力。 另外，一种包含棕榈酸-R848（TLR7/8的激动剂）的佐剂脉冲mRNA疫苗NPs的配方，展示了改善的mRNA转染效率和强大的获得性免疫反应。这种配方促进了特定抗原T细胞向肿瘤部位的渗透。它对淋巴瘤和前列腺癌模型有效，预防肿瘤生长和抑制已建立的肿瘤。因此，这种方法为开发有效的癌症免疫疗法提供了希望。 装载编码癌症相关抗原（CAAs）的mRNA的LNP显著减少了肿瘤，并在黑色素瘤模型中延长了总生存期。进一步包含脂多糖（LPS）增强了LNPs的免疫反应。包含修饰的N1-甲基假尿苷的mRNA的LNPs-mRNA疫苗配方在B16黑色素瘤模型中展示了显著的肿瘤减少、延长生存期和强大的免疫反应。这种配方增加了肿瘤内CD40+ DCs和多功能OVA特异性CD8+ T细胞，显示了有效传递mRNA疫苗的潜力。此外，携带OX40L mRNA的LNP显著减少了小鼠中H22肿瘤的大小。这表明LNPs可以是用于肝癌免疫疗法中系统传递mRNA疫苗的有价值工具。它们也可以作为传递mRNA疫苗的支架。Qiu等人对包裹在LNPs中的mRNA疫苗进行了系统评估。这种疫苗编码HPV的E7蛋白（HPV mRNA-LNP）。接种HPV mRNA-LNP疫苗激活了整体和HPV特异性CD8+ T细胞。此外，它通过肿瘤微环境中的不同IFN反应指导了CD8+ T细胞的功能承诺。与ICIs结合使用时，HPV mRNA-LNP疫苗进一步增强了HPV特异性CD8+ T细胞，同时保持了它们的抗肿瘤功能，导致肿瘤消退增强。这项研究突出了这种方法在癌症免疫疗法中的潜力。 包含甘露糖作为肿瘤特异性mRNA的靶向传递配体的改良LCP-NPs在正位模型中对三阴性乳腺癌（TNBC）展示了强大的CTL反应，通过与抗CTLA-4抗体共传递进一步增强。这突出了LCP系统用于靶向传递肿瘤特异性mRNA的潜力。此外，LCP-NPs被用作由RNAi基于的免疫治疗剂组成的纳米配方的载体。这种方法导致增强的T细胞反应，减少肿瘤生长，并降低转移。这些发现展示了使用LCP作为载体开发mRNA疫苗和其他基于RNA的免疫疗法的潜力。 脂质微粒（LMPs）最近作为传递mRNA疫苗的替代平台出现。像LNPs一样，LMPs可以有效地传递mRNA。它们在与免疫佐剂结合使用时显示出预防癌症的前景，确立了它们作为高效mRNA疫苗传递系统的价值。 这项研究强调了LNPs作为癌症免疫疗法框架中有前景的mRNA疫苗载体的潜力。 mRNA疫苗面临的一个重大障碍是它们易受降解。为了保护mRNA免受降解，设计了新的脂质体介导的传递方法。最近，一种通过将精蛋白和mRNA封装到1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷/胆固醇/1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇（DOTAP/chol/DSPE-PEG）阳离子脂质体中的mRNA疫苗被研究。这种配方展示了增强的摄取效率，并成功刺激了DC成熟，导致对特定肿瘤的显著抗肿瘤免疫反应。此外，由DOTAP、胆固醇缀合阳离子肽DP7、载体佐剂和mRNA组成的脂质体有效地抑制了肿瘤生长，同时增强了淋巴细胞反应。此外，合成了称为甘露糖-胆甾-缀合物（MPn-CHs）的靶向DC的脂质体，并用于配制靶向DC的脂质体（MPn-LPs），增强了mRNA表达并展示了靶向DC的mRNA疫苗的显著潜力。基于脂质体的mRNA疫苗LPX-mLMP2通过将mLMP2封装在DOTAP中合成。LPX-mLMP2展示了APCs对其的印象深刻的抗原摄取，导致有效的LMP2表达。疫苗在脾脏中积累，促进了DC成熟，并在体内引发了针对抗原的T细胞反应，最终在三次疫苗接种后显著减少了表达LMP2的肿瘤模型中的肿瘤生长。在另一种方法中，开发了修饰甘露糖的脂质体以传递总肿瘤mRNA，导致减少转移和黑色素瘤特异性CTL的产生。 最近的研究调查了阳离子脂质体用于mRNA疫苗传递，导致增强的DC成熟、肿瘤生长抑制和特异性免疫反应。 脂质体复合物（Lipoplexes）是阳离子脂质体非病毒合成脂质载体，广泛研究用于个性化癌症疫苗的临床应用。脂质体复合物用于第二代RNA疫苗。从实验室进展到临床使用的第一个产品是设计用于静脉给药的疫苗。它包括四种RNA脂质体药物产品，每个都编码黑色素瘤免疫治疗的常见肿瘤抗原。 I/II期临床试验正在评估针对非突变型癌症相关抗原（CAAs）的RNA-脂质体复合物疫苗，这些抗原包括MAGE-A3、酪氨酸酶、纽约食管鳞状细胞癌1和带有tensin同源性的跨膜磷酸酶，作为单一疗法或与抗PD1抗体联合治疗。这种疫苗能在经预处理、检查点抑制剂经验丰富的IIIB-C期和IV期黑色素瘤患者中引起持久的客观反应。值得注意的是，部分反应的患者表现出强烈的多表位CD4+/CD8+ T细胞免疫的诱导。 由聚乙二醇胆固醇（PEG-chol）和N-十六烷基-N,N-二甲基十六烷-1-溴化铵组成的mRNA脂质体复合物疫苗可以增强细胞内的蛋白表达。当作为免疫接种给小鼠时，这种疫苗增加了肺和脾脏中的蛋白表达，导致抗原特异性IgG1水平升高。尽管这些发现是有希望的，但需要进一步的研究和测试来评估这种疫苗用于人类潜在使用的安全性和有效性。 3.3.聚合物纳米系统用于mRNA疫苗传递 聚合物NPs在促进mRNA传递方面发挥着至关重要的作用，作为支架。在最近的一项综述中，概述了基于聚合物的系统的mRNA传递的关键组成部分，特别强调了分子设计标准、稳定性和生物分布等因素。 聚（β-氨基酯）（PBAE）聚合物可以与mRNA形成复合物。这些聚合物具有生物可降解性的优势，并且能够与水溶液中的带负电荷的mRNA自发自组装。它们具有独特的特性，包括高缓冲能力有助于内质网逃逸，正电荷有助于有效结合mRNA，以及能够水解降解为无毒副产品。最近，Kim等人开发了一种使用PBAE的冻干优化的mRNA疫苗传递载体。这项研究表明，通过胃肠道给药这种疫苗可以有效地传递并刺激免疫系统，导致诱导抗原特异性的细胞和体液免疫。 李等人开发了氟烷基化聚乙烯亚胺PEI（F-PEI）用于mRNA传递。F-PEI增强了细胞内mRNA传递并激活了TLR4介导的信号传导。此外，该团队使用了由F-PEI和编码肿瘤抗原的mRNA组成的自组装纳米疫苗。这些纳米疫苗诱导了DC成熟，实现了有效的抗原呈递，并随后触发了强大的抗肿瘤免疫反应。此外，基于F-PEI的mRNAOVA癌症疫苗在延迟已建立的B16-OVA黑色素瘤生长方面证明了其有效性。与ICIs结合使用时，基于F-PEI的MC38新抗原mRNA癌症疫苗成功抑制了已建立的MC38结肠癌并预防了肿瘤复发。因此，这些疫苗与ICIs的联合使用可能代表了一种增强对癌症的免疫反应并改善治疗结果的潜在策略。未来的临床试验需要验证这些方法在临床设置中的安全性和有效性。 为了mRNA传递，开发了一种新型自组装聚合物胶束，使用改性的PEI共聚物和维生素E琥珀酸酯（PVES）。这种胶束有效地将mRNA传递到各种细胞系，同时造成最小的细胞毒性。在小鼠研究中，使用PVES作为传递载体通过肌肉内给药mRNA疫苗。结果显示出强大的抗体反应，表明PVES是传递mRNA疫苗的安全有效载体。 树状分子是一类具有明确定义的树突状结构和协同多价性的聚合物，可以利用来传递mRNA疫苗。两亲性树状分子载体代表了先进的树状分子，是结合了脂质和聚合物载体特性的混合构建物。脂质组分赋予了与mRNA在其核心内部相互作用和包封的疏水性质。聚合物段提供了修改其表面性质和化学功能的灵活性，以增强靶向和细胞摄取。此外，脂质组分使树状分子能够像基于脂质的载体一样与膜融合，而聚合物段促进了类似聚合物载体的内吞作用，从而减少mRNA传递。这些载体具有精确且稳定的纳米尺寸结构，使它们适合传递mRNA疫苗。树状分子载体有效传递mRNA疫苗依赖于其两亲性质。亲水实体促进RNA结合和疏水性，从而稳定RNA复合物。这一独特的特性使得RNA作为稳定的复合物被包封，促进了其依赖内吞作用的摄取和释放到细胞质中。树状分子的两亲性质在成功的RNA传递中起着至关重要的作用。 基于聚合物水凝胶的疫苗传递系统因其在将疫苗有效地传递到特定生理部位方面的能力而受到研究关注。这些系统以其独特的属性为特征，增强了抗原传递并作为佐剂，增强了抗原诱导的免疫反应。例如，装载mRNA的聚(2-羟乙基甲基丙烯酸)水凝胶成功地传递到DC2.4细胞中。这种方法展示了延长释放和增强转基因表达的潜力，表明其作为提供免疫疗法中mRNA疫苗的替代方法的潜力。此外，聚乙烯亚胺和氧化石墨烯水凝胶被用来开发含有OVA mRNA和佐剂(R848)的纳米疫苗。这种水凝胶实现了mRNA至少30天的持续释放。释放的mRNA保护淋巴结免受降解，并促进了它们的目标传递。此外，实验数据表明，水凝胶显著增强了CD8+ T细胞特异性抗原产生，抑制了肿瘤生长。它还产生了抗原特异性抗体，有效地预防了转移。总的来说，这些发现强调了可注射水凝胶作为mRNA传递有前途方法的潜力。 3.4.基于肽的mRNA疫苗传递 细胞穿透肽(CPPs)因其能够穿越细胞膜并有效地传递核酸而迅速发展。CPPs作为肿瘤免疫疗法药物的潜力巨大。此外，通过结合适当的佐剂和应用如纳米技术等先进技术，可以显著提高mRNA疫苗传递的有效性。为mRNA疫苗传递设计了不同类型的肽(图2)。 图1. mRNA传递系统的示意图，用于高效编码抗原和激活树突状细胞（DCs） 包括封装在DOTAP/胆固醇/DSPE-PEG-精氨酸阳离子脂质体中的mRNA、阳离子DOTAP-胆固醇修饰肽（DP7）脂质体、MPn-CHs脂质体、甘露糖修饰脂质体、mRNA-脂质复合物和脂质复合物+ PEG-胆固醇在内的各种传递系统，有效地将mRNA传递到DCs中。mRNA编码的抗原刺激分泌如TNF-α等细胞因子，导致DC成熟。这些成熟的DCs随后释放IL-2和IL-12，激活CD4+和CD8+细胞，从而抑制肿瘤生长。 Lou等人开发了一种用GALA功能化的mRNA聚合物复合物的方法，展示了高转染效率和无细胞毒性的细胞摄取。用携带OVA mRNA的PPx-GALA配方处理，导致T细胞反应增加和DCs成熟，突出了其作为mRNA疫苗平台的潜力。作为mRNA疫苗传递平台，开发了一种富含精氨酸的CPP变体RALA。这种肽的独特序列和结构组织在作为mRNA疫苗载体的角色中至关重要。它与mRNA形成纳米复合物，能够在酸性pH依赖性方式中破坏膜，促进mRNA内质网逃逸并使其在DCs的细胞质中表达。RALA和修饰的mRNA含有假尿苷和5-甲基胞嘧啶，诱导了针对mRNA编码蛋白的强大CTL反应，突出了它们的优越效力。另一种方法涉及使用阳离子CPP(LAH4-L1)和聚乳酸NPs(PLA-NPs)。产生的纳米复合物通过吞噬作用和有衣小窝被DCs内化，导致大量蛋白表达。CPPs的不同肽序列，连同它们良好的生物相容性和它们所具有的特定目标内化能力，使它们成为一个有前途的替代mRNA传递平台。具体来说，使用大小<200 nm的双极CPP/mRNA复合物已证明能够有效地表达蛋白和细胞摄取。这些发现强调了CPPs作为癌症mRNA传递载体的有效性。 3.5.碳纳米材料用于mRNA疫苗传递 在癌症免疫疗法中，碳纳米材料因其独特的传递抗原和刺激免疫反应的能力而激增，以碳点(CDs)作为杰出的候选材料。Chen等人合成了能够结合mRNA并形成ACDs@mRNA纳米复合物的两亲CDs，显示出对脾脏的最佳目标传递。ACDs@OVA-mRNA配方有效地抑制了E47肿瘤生长，并增强了脾脏和癌症部位的癌症浸润T细胞，为推进肿瘤免疫疗法提供了有希望的结果。此外，荧光CDs被用作疫苗开发中的佐剂，与肿瘤蛋白抗原OVA结合。这种方法导致针对抗原的强大的细胞介导的免疫反应，成功地抑制了黑色素瘤癌症生长。这些研究强调了CDs作为疫苗接种中多功能工具的潜力。它们为改善包括癌症在内的各种医疗环境中的治疗结果提供了激动人心的机会。 图2. 肽介导的mRNA疫苗传递及免疫反应 携带OVA mRNA、RALA、含有假尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA、阳离子CPP LAH4-L1、PLA-NPs、环肽纳米管（cPNTs）、两性CPP/mRNA复合物以及与海藻酸钠结合的SA@DOTAP-mRNA的聚阳离子肽GALA配方，有效地将mRNA传递到DCs中。信使RNA转录本被转化为蛋白质，然后被蛋白酶体（酶）切割成片段。由此产生的肽片段通过内质网运输，并通过MHC I类（MHCI）呈现给CD8细胞，增强T细胞反应。ER，内质网；TCR，T细胞受体。 碳纳米管（CNTs）因其固有特性，包括惰性、非免疫原性、无毒性和高稳定性，已成为疫苗开发的有希望的传递平台。CNTs的一个关键优势是它们能够有效地运输特定的抗原目标并促进它们向免疫系统的呈递。它们独特的结构允许同时有效附着多种抗原，在其表面产生多种抗原。然而，使用尺寸大于100纳米的碳纳米材料作为mRNA疫苗传递的支架存在几个挑战。这些挑战源于诸如不溶解性、形态不均匀、较大尺寸（小于100纳米）和潜在的肺部毒性等因素。这些考虑使得CNTs在mRNA疫苗传递中的实际应用更加复杂，尽管它们具有明显的优势。研究人员必须解决这些挑战，以充分发挥CNTs在基于mRNA的疫苗领域的全部潜力。 3.6.病毒载体介导的mRNA疫苗传递 病毒载体疫苗属于使用携带编码特定抗原的外来基因的遗传改变病毒颗粒的疫苗类别。在癌症疫苗开发领域，工程化的病毒载体、自复制RNA（小干扰RNA）病毒载体和重组病毒载体已成为有前景的溶瘤病毒（OVs）。这些OVs具有携带单链RNAs、特异性靶向肿瘤细胞并启动适应性免疫的能力。这种新方法在癌症疫苗和疗法的开发中具有巨大潜力。 TroVax()是一种改良的病毒载体疫苗，表达5T4癌症相关抗原。在I/II期人体试验中，它被耐受，没有不良反应，并在前列腺癌、肾细胞癌和结肠癌中诱发了特异性抗体反应。在随后的II期人体试验中，TroVax与化疗药物或ICIs结合使用，增强了抗原交叉呈递和免疫抑制细胞的清除。值得注意的是，与TroVax和同时低剂量IL-2的治疗在肾癌和结肠癌患者的存活率上表现出改善。 图3. 病毒载体介导的mRNA疫苗传递及其对免疫反应的影响的示意图 溶瘤病毒、重组病毒和自复制病毒被设计用于高效地将mRNA疫苗传递到肿瘤部位。这触发了包括先天/适应性免疫机制在内的强大抗肿瘤反应，导致激活凋亡途径、抑制血管生成，以及随后的肿瘤溶解和退行。 一项临床前研究展示了携带与前列腺癌相关的mRNA编码的六跨膜上皮抗原前列腺1的病毒载体平台的有效性。该研究观察到对抗原具有强大、持久的CD8+ T细胞反应，特别是在雄性BALB/c和C57BL/6小鼠株中。令人惊讶的是，尽管疫苗具有高度免疫原性，但其在小鼠PC模型中的保护效率相对较低，无论是可移植的还是自发的。然而，ChAdOx1-MVA疫苗和PD-1抗体组合在临床环境中显示出有希望的抗肿瘤反应。尽管如此，使用病毒载体也存在显著的限制，包括病毒基因组整合到宿主基因组以及宿主排斥的可能性，这可能导致细胞毒性和免疫原性。这些缺点促使人们探索癌症免疫疗法中传递mRNA疫苗的替代策略。 4.结论和未来方向 mRNA疫苗已被公认为一种强大的癌症治疗方法，提供了独特且耐受良好的治疗选择，已在临床前研究中证明有效。这些疫苗可以诱导多克隆免疫反应，并促进保护性抗体的产生，这是通过直接mRNA给药或将其引入DCs实现的。mRNA疫苗的优势在于它们能够编码多种蛋白质，从而克服与特定HLA分子相关的限制。COVID-19 mRNA疫苗的成功激发了人们对其在癌症治疗中潜力的强烈研究努力。 基于mRNA的癌症疫苗提供了编码多种蛋白质、引发强大免疫反应以及促进快速开发和生产的多种优势。然而，一个持续的挑战在于实现有效的mRNA疫苗传递，专门针对肿瘤细胞，这需要进一步的研究和开发。临床前试验已经证明了针对不同类型肿瘤的各种mRNA疫苗的有效性。临床研究集中在针对CAAs的有效mRNA疫苗上。在临床环境中，涉及分离患者自己的DCs并用编码CAAs的mRNA转染的技术正在被研究。基于mRNA的癌症治疗疫苗领域正在迅速发展，有几个领域需要进一步探索和发展。 通过各种传递平台实现mRNA疫苗的有效性，同时最小化不良反应。LNPs可以封装和保护mRNA，促进细胞摄取，并有效地转化为抗原。病毒载体也作为有效的mRNA疫苗载体，但需要解决与安全性、预先存在的免疫力和有限的货物容量相关的挑战。基于肽的传递平台有望增强mRNA疫苗传递和抗原表达。此外，纳米材料如CDs、CNTs和可注射水凝胶已被用于临床前和临床免疫疗法中的mRNA传递。其他技术，包括树状分子和离子电渗，正在被探索。总体而言，癌症免疫疗法中的mRNA疫苗显示出巨大的希望，正在进行的研究努力旨在优化它们的传递、改善免疫反应，并在临床环境中评估它们的有效性。 未来的研究应该集中在改进和优化传递系统，如LNPs、病毒载体和基于肽的平台。这些努力应该旨在提高它们的效率、稳定性、安全性和可扩展性。此外，识别和选择最佳的肿瘤特异性抗原对于提高mRNA疫苗的有效性至关重要。对CAAs和新抗原的额外研究可以导致针对个体肿瘤的有效靶向的个性化疫苗，提高它们的特异性和治疗潜力。探索将mRNA疫苗与ICIs或细胞免疫疗法相结合的协同方案，有望增强抗肿瘤免疫反应。这些联合策略可以克服免疫抑制的TMEs并改善总体治疗结果。进行稳健的人类试验以评估癌症治疗中mRNA疫苗的安全性、有效性和长期效益也是必要的。扩大临床研究的范围并探索不同类型的癌症将为mRNA疫苗的医疗效用提供宝贵的见解，并指导它们未来的发展。 为大规模疫苗接种建立成本效益的mRNA疫苗是具有挑战性的。应努力优化制造技术，降低生产成本，并确保一致的质量和批次间可重复性。对mRNA疫苗的免疫原性和潜在不良反应进行深入调查是必要的，以确保它们的安全性并最小化任何意外的免疫反应。了解mRNA疫苗引起的长期效应和免疫记忆对于它们在临床上的成功实施至关重要。开发稳健的生物标记和标准化的检测方法对于监测mRNA疫苗接种后的免疫反应至关重要，这对于评估疫苗效力、预测患者结果和指导治疗策略至关重要。将免疫监测方法整合到临床试验中可以为优化疫苗设计和剂量方案提供有价值的数据。通过解决这些问题，癌症免疫疗法中的基于mRNA的疫苗领域可以继续发展，为患者提供创新和有效的治疗选择，并有可能改变癌症治疗的格局。

摘要:癌症的特征是无限的增殖和转移，传统的治疗策略通常会导致药物抗性的获得，从而突出了对更个性化治疗的需求。mRNA疫苗通过转录和翻译将外源性目标抗原的基因序列传递到人体细胞中，刺激身体产生针对编码蛋白的特定免疫反应，从而使身体能够获得针对这些抗原的免疫保护；这种方法可能被用于个性化癌症治疗。自近期冠状病毒大流行以来，mRNA疫苗的开发取得了实质性进展并得到了广泛采用。在当前的综述中，讨论了mRNA疫苗的开发、它们的作用机制、影响其功能的因素以及疫苗当前的临床应用。重点放在mRNA疫苗在癌症中的应用，旨在突出这种新颖且有前景的治疗方式的独特进展和剩余挑战。 1.引言 癌症仍然是对人类健康构成严重威胁的疾病，其发病率持续上升。近年来，新发病例数和癌症相关死亡人数呈显著上升趋势。癌症的发生是一个多因素、多步骤和复杂的过程，其病因尚未完全明确；然而，人们普遍认为它与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不健康饮食和遗传因素等多种因素密切相关。随着生命科学和技术的快速发展，我们对肿瘤的理解更加深入。寻找更有效的治疗方法以提高癌症患者的生存率，仍然是医学研究的核心话题。 mRNA疫苗是一种核酸制剂，可以通过特定的递送系统，通过转录和翻译的方式，将外源性目标抗原的基因序列传递到细胞内，转录的蛋白刺激身体产生特定的免疫反应，从而使身体获得免疫保护。mRNA疫苗是在灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗之后的新一代疫苗。随着基于RNA的技术不断进步，这种创新的治疗模式预计将取代传统疫苗，并可能有能力解决与小分子和抗体疗法相关的问题。除了在传染病中的应用，mRNA疫苗还为包括癌症、罕见病和神经系统疾病在内的疾病提供了更有效和持久的治疗机会。mRNA疫苗不仅一次覆盖多种肿瘤抗原，还通过同时递送人类白细胞抗原（HLA）-I和HLA-II分子，激活更广泛的T细胞反应，从而实现更全面的多角度攻击。因此，mRNA疫苗具有显著的抗癌潜力。目前，全球有数十项与mRNA肿瘤疫苗相关的临床试验正在进行，包括（但不限于）黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌，某些试验中，mRNA疫苗与其他肿瘤免疫药物联合使用。最近开发的mRNA-4157疫苗，已被美国食品药品监督管理局（FDA）宣布为“突破性疗法认定”，并被欧洲药品管理局纳入“优先药品”计划，预计将成为首个上市的mRNA肿瘤疫苗。 本文综述了癌症的当前治疗方法以及mRNA疫苗的开发和现状。在此基础上，还讨论了mRNA疫苗在肿瘤治疗中的价值。 2.癌症治疗  癌症是全球主要的公共卫生问题。根据美国癌症协会发布的最新全球癌症数据，预计2023年美国将有1,958,310例新癌症病例和609,820例死亡。在不同类型的癌症中，前列腺癌、肺癌、支气管癌和结直肠癌几乎占男性所有病例的一半（48%），其中仅前列腺癌就占所有诊断的29%。对于女性，乳腺癌、肺癌和结直肠癌占所有新诊断癌症的52%，其中乳腺癌（BCa）单独占女性癌症的31%。在预计的癌症死亡中，男性中肺癌、前列腺癌和结直肠癌死亡人数最多，女性中肺癌、乳腺癌和结直肠癌死亡人数最多（图1A）。 图1. (A) 不同性别癌症的基本流行病学特征。(B) 肿瘤疫苗的主要类型。 由于医学方法的不断进步，治疗癌症的方法越来越多。根据癌症的类型和阶段以及患者的具体情况，选择合适的治疗可以显著延长生存时间并提高生活质量。癌症的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和免疫疗法。然而，单一的治疗方法对癌症的治疗是不够的，简单的治疗方案增加无法达到目标。因此，需要合理和全面地使用各种方法来更好地控制和消除肿瘤；即，应尽可能采用当前的综合多学科方法。 随着疫苗接种因数字时代的新兴创新而得到推广，接种具有个体肿瘤突变的患者可能成为癌症的第一种真正的个性化治疗。所有能够刺激身体产生对抗肿瘤发生病原体因素的制剂或激活特定免疫以对抗癌症的免疫逃逸效应并治疗肿瘤的疫苗都可以称为肿瘤疫苗。预防性疫苗与传统疫苗类似，主要针对与癌症直接相关的病原体微生物，如人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）。此外，还有针对已经患有癌症的患者的疗效疫苗，这些疫苗通过主要针对肿瘤中存在的“自身抗原”的免疫反应，促进持久的免疫记忆和长期的抗肿瘤反应的建立。 目前，肿瘤疫苗的主要类型如下：i）全细胞疫苗；ii）树突状细胞（DC）疫苗；iii）蛋白质或多肽疫苗；iv）核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗（图1B）。 3.mRNA疫苗概述  mRNA疫苗的历史  在2019年冠状病毒（COVID-19）大流行期间，mRNA疫苗作为几家制药公司用于创建疫苗的尖端技术而受到关注。值得注意的是，第一个进入I期临床试验的潜在疫苗是mRNA疫苗。Brenner等人在1961年首次将mRNA识别为中枢神经系统中的中介遗传元素。Malone等人在1989年发现，当mRNA被包裹在阳离子脂质{N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵}中时，可以成功转染并表达在各种真核细胞中，这是mRNA基药物概念首次被构想出来的时候。20世纪90年代，mRNA疫苗研究蓬勃发展，临床前试验被应用于包括传染病和癌症在内的一系列疾病。1990年，首次成功进行mRNA体内表达的努力是直接注射体外转录的mRNA足以将mRNA引入小鼠骨骼肌细胞。这证明了mRNA疫苗的可行性。1992年，Jirikowski等人发现，将编码催产素和抗利尿激素的mRNA注射到遗传突变的糖尿病小鼠中，可以在注射后几小时内短时间内治愈病情。Martinon等人在1993年报告了一种体外生成的mRNA疫苗，编码流感病毒的核蛋白以激活小鼠的细胞毒性T细胞。Boczkowski等人在1996年首次发现，用mRNA脉冲的DC是触发T细胞反应的可行方法。Zhou等人在1999年展示了mRNA疫苗对抗癌症的潜力，通过直接将糖蛋白100 mRNA包裹在日本血凝病毒脂质体中注射到脾脏，导致黑色素瘤小鼠模型中肿瘤生长受限和生存时间延长。随着研究的进展和实验程序的改进，mRNA疫苗的安全性、有效性和工业制造能力在过去几十年中不断提高。目前，几种mRNA疫苗正在临床环境中进行测试，或随时可用，以对抗癌症和几种传染病，包括寨卡病毒、巨细胞病毒、流感病毒、偏肺病毒和副流感病毒。为了满足及时有效疫苗的需求，自全球严重急性呼吸综合征（SARS）CoV-2大流行以来，核酸疫苗的研究和开发激增。此外，mRNA疫苗的市值已增长至数十亿美元，预示着mRNA基药物，特别是mRNA疫苗的未来发展充满希望（图2）。 图2. mRNA疫苗的研究历史及肿瘤治疗进展。 mRNA疫苗的机制 mRNA疫苗的制造涉及几个相对复杂的步骤。首先，需要设计并合成所需的mRNA序列；该序列通常包括编码目标抗原或其他治疗蛋白的核苷酸序列，并且应包含适当的5'端帽和3'端尾序列以提高mRNA的稳定性和翻译效率。通过体外转录，合成相应的mRNA，体外转录系统通常由RNA聚合酶、缓冲溶液、核苷三磷酸、锌离子和辅助因子组成，以促进转录。将DNA模板与体外转录系统的其他组分混合，构成含有合成mRNA所有必要组分的反应混合物。然后将这个反应混合物放入适当的反应管中，并在适当的条件下进行体外转录反应。在这个反应过程中，RNA聚合酶识别DNA模板并利用它合成mRNA。合成的mRNA需要被纯化和修饰，以去除杂质并提高稳定性，某些mRNA疫苗可能还需要被包裹在脂质体中以提高其稳定性并促进体内细胞摄取。脂质体通常由磷脂和胆固醇等成分组成，可以在水相中形成具有脂质双层结构的微小脂质囊泡。可以添加表面活性剂（如聚乙二醇）以提高脂质体的稳定性和细胞摄取效率。合成的mRNA与脂质体混合形成脂质体-mRNA复合物。这些复合物可以通过内吞作用机制转染到目标细胞中，细胞膜形成内陷以将脂质体-mRNA复合物带入细胞内。内吞的囊泡将脂质体-mRNA复合物包裹在内体中，然后与细胞质中的其他细胞器融合，并将它们的内容物释放到细胞质中。脂质体-mRNA复合物的内容物释放到细胞质后，mRNA分子被细胞内的核糖体识别并翻译（图3）。 图3. mRNA疫苗的生产过程和主要结构。ORF（开放阅读框）、UTR（非翻译区）、PEG（聚乙二醇）。 一部分外来mRNA逃避了普遍存在的核糖核酸酶的破坏，并被个别细胞特有的自然过程（如发育中的树突状细胞的巨胞饮作用）内化为内体途径，由内体释放到细胞质中。宿主细胞的翻译机制将mRNA翻译成抗原蛋白。信号肽决定了编码蛋白一旦产生后的最终位置。这些可能是为了将蛋白质定位到宿主细胞内的适当细胞器而重组创建的，或者它们可能是原始蛋白质序列固有的。作为替代方案，这种编码的蛋白质可能通过其分泌影响附近细胞的功能，如果它被释放到血液中，它也可以影响远处的器官。细胞质中的蛋白酶分解对细胞重要的抗原蛋白，产生抗原肽表位。内质网是抗原肽表位转移、装载到主要组织相容性复合体（MHC I）类分子上并向CD8+细胞毒性T细胞展示的地方。为了获得更强力和持久的免疫反应，需要将蛋白质产品引导到抗原呈递细胞（APCs）中的MHC II类装载区。这可以通过向mRNA添加编码路径信号的序列来实现。一旦产生的抗原肽表位装载到MHC II分子上，就诱导了抗原特异性的CD4+ T细胞反应，并且装载的MHC II肽表位复合物出现在细胞表面（图4）。此外，通过一种称为交叉启动的过程，被DCs摄取的外来抗原也可以被处理并装载到MHC I类分子上。这允许设计、体外生产和递送任何所需序列到任何类型的细胞。当mRNA作为外来基因的载体时，由于其自我佐剂效应，它可能表现出与mRNA病毒相似的某些特征。APCs可以在翻译前识别mRNA，这种识别触发了模式识别受体的激活，包括Toll样受体（TLR）3、TLR7和TLR8。TLR3、TLR7和TLR8可以检测单链和双链（ds）RNA链，而短的和长的dsRNA丝可以在细胞质中被视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5检测。因此，可能会激活I型干扰素（IFN-I）途径，可能会产生趋化因子和促炎细胞因子，并可能激活APCs，所有这些都可能触发强大的适应性反应。 图4. mRNA疫苗的一般作用机制示意图。MHC（主要组织相容性复合体）、TCR（T细胞受体）、PFN（穿孔素）、GzmB（颗粒酶B）。 mRNA疫苗的优势 mRNA肿瘤疫苗平台提供了其他癌症疗法所没有的独特优势。与传统的放疗和化疗不同，它们容易受到药物抗性的影响，mRNA疫苗允许同时覆盖多种抗原，从而克服了癌症治疗中的疫苗抗性。mRNA疫苗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合可以在逆转抗性途径中发挥作用。因此，预计mRNA疫苗将是ICIs的有用辅助手段，两者的结合可能允许为患者实施精确和个性化的治疗。此外，传统的癌症治疗可能会对正常人体细胞造成重大损害，而mRNA疫苗可以更精确地针对肿瘤细胞。此外，mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。与其他肿瘤疫苗平台相比，mRNA疫苗具有高度的免疫原性，能够刺激患者更广泛的免疫反应。 尽管mRNA肿瘤疫苗显示出临床潜力，但其经济价值也值得注意。作为一种新疗法，mRNA疫苗在方便性和生产成本方面优于其他细胞和基因治疗产品。市场上的其他基因/细胞疗法，如嵌合抗体受体T细胞免疫疗法（CAR-T），目前的价格为数百万美元，这对患者和社会构成了重大的经济负担。这是因为CAR-T需要为患者进行一系列过程，如细胞提取、修改、体外培养和重新输注，并且很难扩大生产规模，因此很难降低单一产品的成本。相比之下，mRNA疫苗是直接体外转录的。mRNA疫苗的合成和生产步骤是标准化的，允许产品的快速和大规模生产，这将导致产品的重大成本优势。因此，预计mRNA疫苗将为经济能力较弱的癌症患者提供福音，因此在当前的医疗环境中具有重要的经济潜力。 鉴于多种优势，mRNA技术比DNA甚至传统疫苗更具吸引力。体外转录（IVT）合成消除了对细胞的需求以及随之而来的监管障碍，使mRNA生产无疑比大规模蛋白质生产和纯化更容易、更快、更清洁，与传统的疫苗方法形成对比。抗原设计的准确性允许更快地响应新出现的大流行和流行病风险，及时有效地应对。mRNA之所以精确，是因为它只产生特定的抗原并触发定制的免疫反应，与减毒或灭活疫苗不同。mRNA可以通过结合模式识别受体触发和/或促进适应性免疫反应，无需佐剂，而亚单位疫苗需要佐剂来引发免疫反应。核酸疫苗受到HLA类型的限制较少，比肽疫苗更有可能引发更广泛的T细胞反应，因为它们可以编码全长肿瘤抗原，这允许APCs同时交叉呈现或呈现多个表位，具有I类和II类患者特异性HLA。 以下描述了mRNA疫苗相对于DNA疫苗的优越之处。由于DNA疫苗无法工作的核膜屏障被移除，因为只有mRNA需要在细胞质中转录，而DNA必须在细胞核中翻译。因此，有丝分裂和非有丝分裂细胞都可能成功转染mRNA疫苗。此外，mRNA很少整合到基因组DNA中，也不会经历插入突变。第三，由于mRNA被生物过程迅速分解，并且在2-3天后不留痕迹，编码抗原的生产只是暂时的。mRNA疫苗平台的灵活性也有助于生产，因为它允许标准化生产，因为对编码抗原的修改不会改变mRNA主干的物理/化学属性。第四，与其他平台相比，由于生产基于体外无细胞转录过程，因此病毒污染物和细胞衍生杂质的安全问题较少。此外，RNA疫苗通常比DNA疫苗引发更强的免疫反应。这一点的原因尚不完全清楚，但一些理论包括低表达DNA感应机制、不同的核酸感应模式识别受体的表达、DNA进入人类细胞的传递效率低下，以及DNA需要穿过细胞和核膜并在细胞核中转录才能成功转染细胞。 mRNA疫苗的潜在限制 尽管当前SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功促进了癌症mRNA疫苗的研究，但在以下章节中讨论了mRNA疫苗在癌症应用中仍然存在限制。 苛刻的保存条件。mRNA是一个不稳定的分子，由于核糖上的羟基存在，容易被环境中的生物核酸酶裂解。它可以在冷冻保存时保持稳定活性，但对于经济欠发达地区来说，存储成本太高。载体基保护剂如脂质纳米颗粒（LNPs）只能将mRNA疫苗保存最多3个月。Cichlidin也能保护mRNA免受酶促降解，但可能使其更难翻译，影响mRNA疫苗的效力。 单独使用时相对较低的抗肿瘤效果。由于mRNA疫苗的稳定性差、蛋白质的生产周期相对较短、肿瘤细胞的异质性以及晚期肿瘤的免疫微环境通常高度免疫抑制，单独使用mRNA疫苗很难在质量上提高抗肿瘤效果。因此，癌症mRNA疫苗的临床研究进展有限。 缺乏长期实验结果。癌症mRNA疫苗的临床试验目前正在进行，通常处于早期开发阶段。特别是个性化癌症mRNA疫苗的临床试验报告结果仍然有限，且治疗效果在患者之间差异很大。癌症mRNA疫苗的长期试验结果仍然缺乏，因此将其作为癌症常规治疗的路线图还很长。有报道称mRNA疫苗可能与某些罕见的致命血栓事件有关，因此mRNA疫苗接种的安全性也值得长期观察。总之，必须监测癌症治疗中mRNA疫苗的长期疗效和副作用。 监管挑战和伦理考虑。针对个体化新抗原的mRNA疫苗的开发和生产针对个人的基因组数据，因此疫苗可能带来监管和批准挑战。 影响mRNA疫苗的因素 尽管mRNA疫苗有所有的好处，它们的基本特性仍然对它们在癌症治疗中的使用施加了某些限制。例如，mRNA和细胞膜的负电荷使mRNA分布更具挑战性。皮肤和血液中含有胞外核糖核酸酶，这些酶容易分解mRNA。由于其固有的免疫原性，mRNA可能通过激活下游与干扰素相关的途径触发先天免疫。矛盾的是，这种固有的免疫原性促进了mRNA的降解，降低了抗原表达，尽管它可能被用作佐剂样效应来增加免疫反应。体外转录产品中经常发现dsRNA污染物。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，进一步限制了mRNA的翻译并加强了先天免疫的激活。为应对这些问题，已经开发了几种技术来推进mRNA疫苗的科学。 mRNA疫苗的递送系统。众所周知，mRNA的半衰期约为7小时，没有递送系统的情况下其吸收很差。此外，mRNA是一个天然不稳定的分子，容易被内切核酸酶、3'外切核酸酶和5'外切核酸酶分解。将mRNA疫苗应用于癌症的最大挑战之一是在没有足够高的翻译水平的情况下，将mRNA送入足够数量的细胞。这需要高度针对性和有效的mRNA递送机制。迄今为止，已确定的癌症mRNA疫苗的递送载体包括LNPs、聚合物载体、肽载体、DC载体、细胞外囊泡载体和混合载体。 最发达、有前景且广泛使用的mRNA非病毒递送方法之一是LNP。它由四种组分组成，共同作用以包裹和保护脆弱的mRNA核心：胆固醇、辅助磷脂、阳离子或可电离脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质。胆固醇用作稳定剂以增加LNP稳定性，可电离阳离子脂质可以促进mRNA的自主聚集形成约100纳米的颗粒，并通过电离在细胞质中释放mRNA，PEG可以延长LNP复合物的半衰期。天然磷脂支持纳米颗粒形成脂质双层结构。目前，有LNP-mRNA癌症疫苗正在进行临床试验，例如mRNA-4157。 mRNA疫苗的纯化。体外转录的mRNA产品主要是目标mRNA、非目标mRNA、核苷酸、寡核苷酸和蛋白质的组合。通常使用色谱法将目标mRNA从系统中的其他mRNA杂质中分离出来，而沉淀和提取技术则用于消除mRNA中的常见杂质。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，而dsRNA是RNA病毒基因组复制中间体的模拟物。因此，通过纯化体外合成的mRNA产品，可以有效地减少mRNA疫苗对I型干扰素免疫反应，同时提高mRNA的翻译效率。在IVT期间，可以通过在更高温度下生成RNA或降低Mg2+含量来减少dsRNA物种。Engel等人检查了dT25共轭寡核苷酸亲和支持树脂（dT25-OAS）的纯化特性；由于其非常高的结合能力，dT25-OAS是大规模mRNA纯化的合适替代品。 mRNA疫苗的分子稳定化。提高蛋白表达通常涉及修改序列和/或结构以提高mRNA稳定性（增加半衰期）和翻译的技术。方法包括延长聚(A)尾、改变5'帽、设计非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF）序列模式以及改变特定的核苷酸序列。这些变化导致蛋白质的大量生产延长了一段时间，从几分钟到超过1周。PERSIST-seq，一个基于RNA测序的平台，最近被创建，用于全面表征各种mRNA库的细胞内mRNA稳定性。该平台已经并继续使mRNA药物增强的计算试验成为可能。 5'帽修饰。5'帽是一种保护结构，可以触发mRNA翻译，防止外切酶切割，并控制前mRNA剪接和核输出等功能。先天免疫系统使用5'帽来区分内源性RNA和外源性RNA。关于体外mRNA加帽，有两种标准方法。第一，通过在mRNA转录系统中加入正常的帽类似物m7GpppG结构，可以完成mRNA加帽和体外转录。第二，在第一次体外转录后，甲基转移酶将Cap 0甲基化为Cap 1以进行mRNA加帽。体外转录中用于mRNA加帽的最常用技术是使用帽类似物进行加帽。现在已经开发了几种帽类似物。在m7G内部的核糖部分改变的抗反向帽类似物（ARCAs）是最常报道的帽类似物。为了提高mRNA的质量，最近还开发了对ARCA结构的额外改变。例如，基于ARCA的磷修饰通过增加mRNA对eIF4E的亲和力，可能通过减少其对脱帽酶的敏感性并提高翻译效率来增加mRNA稳定性。在ARCA中插入一种新型化学改变的帽类似物可以增加mRNA的半衰期，防止它被mRNA脱帽酶2脱帽。2018年，‘CleanCap’，一种共转录加帽技术，被创造为另一种帽类似物。与传统的第一代帽类似物（如mCap和ARCA）相比，它们在较低的效率和反应产率下具有Cap 0结构，这要高效得多。 5'和3'-UTR的优化。mRNA编码区的上游（5'-UTR）和下游（3'-UTR）区域包括mRNA序列的非编码部分或UTR。UTR具有多种功能，包括控制mRNA稳定性、亚细胞定位、翻译效率和mRNA从细胞核输出。通过UTR优化，通常可以增加体内的mRNA表达水平，因此UTR是癌症mRNA疫苗设计的的关键部分。 ORF的密码子优化。ORF区域是mRNA的编码区，因此其翻译速率无疑非常重要。因此，通过选择该区域内的正确密码子，可以最大化mRNA的总翻译效率。为了实现序列优化的目标，使用的方法要么是选择高度表达的蛋白质共有的最佳密码子对，要么是保持目标细胞中高度表达的蛋白质自然存在的每种密码子的相同百分比。此外，为了加快翻译速度，ORF中不常见的密码子通常被替换为具有增加的转运RNA（tRNA）丰度的密码子。在这种情况下，可以确保在生产外来mRNA和/或使用宿主密码子增加高度表达基因的翻译时，具有足够的tRNA水平。为了控制翻译延伸速率，可以优化ORF的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量。另一种与更高GC含量直接相关的密码子优化技术是尿嘧啶枯竭。RIG-I可以识别富含尿嘧啶的区域，当它被激活时，蛋白质表达可能完全停止。 聚(A)尾修饰。在mRNA构建的3'端是一个被称为聚(A)尾的聚腺苷酸区域。它对mRNA的酶稳定性和翻译都很重要。为了控制翻译效率，它特别与几种聚腺苷酸结合蛋白结合，并与mRNA序列5'端的7-甲基鸟苷帽（m7Gppp）合作。根据早期研究，聚(A)尾在控制mRNA的稳定性和翻译效率方面至关重要。发现较长的尾巴可以在多种细胞类型中增加蛋白质表达水平。另一方面，根据Lima等人的研究，较短的聚(A)序列可能会促进这种封闭循环形状以实现有效翻译。总之，为了最大化mRNA的翻译效率，应该根据不同的细胞类型修改聚(A)序列的长度。 修饰核苷酸。某些mRNA核苷酸在mRNA成熟期间经历转录后修饰。可以使用这些天然存在的修饰核苷酸（如5-甲基胞嘧啶和伪尿嘧啶）合成IVT mRNA。当IVT mRNA具有如伪尿嘧啶等修饰核苷酸时，表现出更好的翻译效率和稳定性。这被假设是因为核苷酸防止TLR、RIG-I和RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）被激活，使IVT mRNA对细胞质TLR（如TLR3、TLR7和TLR8）以及RIG-I和PKR不可检测。然而，有建议称，未修饰的mRNA疫苗可以帮助免疫系统识别肿瘤细胞，在这种情况下，不需要修改癌症mRNA疫苗。 佐剂。佐剂是一类物质，无论是天然的还是人造的，都能被免疫系统轻易识别并用来增强预期的免疫反应。注射其相应的佐剂可以提高对抗原的免疫反应，即使mRNA疫苗本身具有自我佐剂效应。目前，向mRNA中添加佐剂是一个热门的研究课题。 一种名为TriMix的mRNA佐剂由三种免疫调节分子组成：CD70、CD40配体和活性TLR-4。对III期或IV期黑色素瘤患者进行TriMix mRNA治疗，连同额外的肿瘤抗原mRNAs，这导致持久的临床缓解和增强的免疫反应。最近建立了一种用于c16-r848的mRNA疫苗NP技术的佐剂脉冲。这种技术显著提高了ova特异性CD8+的扩增，这使得激活的T淋巴细胞能够穿透体内的肿瘤床，而在没有佐剂的mRNA疫苗NP中没有观察到这一点。RNActive（curevac Ag）疫苗平台和RNAdjuvant是其他流行的佐剂。此外，某些mRNA递送载体，如精蛋白和阳离子脂质，可能增强佐剂的效果。Pam2Cys是一种合成的中性脂肪酸，可以通过TLR2/6途径发出信号，已被证明能触发体液和细胞应用免疫反应，这使其成为一个有前途的候选佐剂。最近的一项研究将Pam2Cys整合到mRNA-LNP中以提高mRNA疫苗的效力。在使用这种疫苗的预防性和治疗性肿瘤模型中，CD4+和CD8+ T细胞依赖的抗肿瘤反应显著增强，同时记忆抗肿瘤反应也得到了建立。因此，Pam2Cys在开发未来的癌症mRNA疫苗中具有重要价值。 4.mRNA疫苗在传染病中的应用  mRNA疫苗主要用于治疗癌症和传染性疾病。目前，约有140项临床研究正在评估mRNA疫苗治疗各种疾病。自我复制或复制RNA疫苗和非复制mRNA疫苗是已经评估的两种主要类型的RNA疫苗。复制体是自我复制的mRNA，由RNA病毒产生，其结构病毒蛋白被替换为编码RNA聚合酶和抗原的mRNA。因此，这些mRNA增强了免疫原性并延长了蛋白质表达，从而提高了效率。 自我复制的mRNA有两种ORFs，一种编码目标抗原序列，另一种编码病毒复制机制，与传统的非复制IVT mRNA的“成熟”真核mRNA不同。这允许细胞内长期RNA扩增。非复制mRNA疫苗的递送机制可能进一步被识别，因为它可以直接注射到一系列解剖区域或通过体外装载DCs。虽然现在有几种机会使用自我复制的mRNAs来预防传染病，但其作为癌症疫苗的使用主要限于临床前研究，并且只有少数临床研究已经进行。 由病毒感染引起的疾病。基于核酸的疫苗通过在免疫期间在体内表达疫苗抗原，模仿病毒感染来诱导体液和细胞毒性T细胞反应。这一好处对于消除感染或细胞内病原体至关重要，需要强烈的体液和细胞免疫反应来提供有效的保护（图5）。 图5. mRNA疫苗在治疗多种疾病方面展现出巨大潜力。NSCLC（非小细胞肺癌）、HIV（人类免疫缺陷病毒）、HSV（单纯疱疹病毒）、SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）。 引起流感的病毒。避免流感的最有效方法是接种疫苗。与传统疫苗相比，编码流感病毒效应蛋白（s）的保守区域的mRNA疫苗可能诱导产生特定抗体，改善预防和理想的治疗效果。此外，由于开发过程更快，mRNA疫苗对新型流感病毒的开发更简单。这表明mRNA疫苗可以作为管理流感的快速和适应性工具，无论是季节性还是大流行性。 人类免疫缺陷病毒（HIV）。在首次使用裸露的mRNA（ihivarna）结合新的HIV免疫原序列（HTI免疫原）进行的人类临床试验中，使用DC激活方法（trimix：CD40配体（CD40L）+ CD70 + 编码组成性活性TLR4（CATLR4）RNA）和疫苗接种，疫苗安全且耐受性良好。它迅速增加了外周CD4 T细胞中的HIV-1 DNA和RNA，并触发了适度的HIV特异性T细胞反应。激活性佐剂trimix和来自HIV-1结构蛋白的16个保守片段（GAG、pol、Vif和Nef）组成了HTI trimix。它编码了一个强大的激活信号和一个高效的HIV重组抗原，使其成为mRNA基治疗HIV-1的有前途的新型疫苗候选物。根据临床前的发现，它可能成功刺激T细胞，成熟DC的释放和抗病毒细胞因子的释放（特别是IFN-γ）。HTI-TriMix的I期和IIa期临床研究在2019年底完成。IIa期研究中的HIV-1阳性个体在0-2周和4周接受了三次疫苗接种，这是通过超声引导使用腹股沟淋巴结确定的。 单纯疱疹病毒（HSV）。最近开发了一种针对HSV-2病毒颗粒上发现的C、D和E糖蛋白的三价疫苗。在HSV-2侵袭后，疫苗可以保护动物免受生殖器感染和随后的病毒脱落。此外，疫苗产生了交叉反应性抗体，中和了HSV-1并提供了对HSV-1感染的保护。因此，这种疫苗为生殖器HSV-1和HSV-2感染提供了强大的保护，并且是适合人体测试的候选疫苗（图5）。 黄病毒。许多黄病毒，如寨卡病毒、波瓦桑病毒、登革病毒和蜱传脑炎病毒，已使用mRNA疫苗进行治疗并预防感染。对寨卡病毒的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。Richner等人创建了一个包含野生型或突变型ZIKV结构基因的LNP包裹的修饰mRNA疫苗，以评估小鼠的免疫原性和保护。在I/II期人类临床研究中，一个类似的疫苗称为mRNA-1893，在10或30微克剂量的初次加强免疫后，导致超过90%的血清转化（图5）。 COVID-19。对COVID-19的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。迄今为止，已经生产了几种疫苗，包括mRNA-1273、BNT162、ARCT-021和cvncov疫苗（cv07050101）。mRNA-1273和BNT162b2 COVID-19疫苗几乎相同的94至95%的疫苗效力，以及它们快速的开发和测试周期一年，是科学和医学领域的显著成就。 在开发中的mRNA疫苗中，目前只有针对COVID-19的mRNA疫苗上市。根据已公布的临床数据，COVID-19 mRNA疫苗提供了高水平的保护和安全性。接种mRNA疫苗后，接种者产生的中和抗体水平显著高于那些从COVID-19中康复且未接种疫苗的人，并且表现出增强的免疫反应和记忆。mRNA COVID-19疫苗为16岁及以上个体提供了95%的整体保护，并且能够有效地对20多种病毒变体产生反应。大多数接种mRNA COVID-19疫苗的患者中没有发现临床意义上的安全问题。在一小部分接种新冠mRNA疫苗的人中观察到心肌炎，特别是在年轻男性接种第二剂疫苗后发病率最高。 由细菌感染引起的疾病。针对细菌和寄生虫抗原种类的mRNA疫苗开发尝试有限，其中许多仍处于临床前测试阶段。 Maruggi等人检查了表达A组链球菌抗原（GAS）和无乳链球菌（GBS）的自我放大mRNA疫苗的有效性和免疫原性。自我放大mRNA载体能够有效地产生两种原型细菌抗原：GBS的2a型菌毛骨干蛋白和双突变的GAS溶血素O。在感染GAS和GBS的小鼠中，自我放大mRNA疫苗产生的抗体反应能够持续提供保护。Jawalagatti等人开发了一种创新策略，用于创建可口服的mRNA疫苗。 5.mRNA疫苗在各种肿瘤中的应用  大约25年前，首次展示了基于mRNA的癌症疫苗的可行性。从那时起，mRNA疫苗在癌症治疗中的应用已在多项临床前和临床研究中进行了探讨。到目前为止，只进行了少数几项mRNA癌症疫苗的临床研究。大多数试验集中在急性髓系白血病（AML）、多发性骨髓瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤和肾细胞癌，以及胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌（BCa）、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌的mRNA疫苗，并且仍处于早期阶段（I和II）（图5）。Moderna和默克夏普多美公司宣布，2023年7月，首个mRNA个性化癌症疫苗（mRNA-4157）和抗程序性细胞死亡1（PD-1）单克隆抗体（Keytruda）的组合疗法进入了III期临床试验。这是首个进入III期临床试验的mRNA癌症疫苗。表I总结了mRNA疫苗治疗癌症的临床试验。 胰腺癌。越来越多的数据表明，胰腺癌的肿瘤内和肿瘤间异质性，特别是与免疫微环境和基因改变有关，与治疗抵抗性相关。传统的癌症治疗方法通常会导致获得性抵抗，强调了需要针对性、个性化的护理。在患有胰腺导管腺癌的患者中，最近使用辅助定制的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran的I期临床研究表明，疫苗刺激了T细胞活性，这可能与疾病的复发延迟有关。在临床试验中，19名患者中有16名在接受了Atezolizumab治疗后接受了cevumeran治疗；接受mRNA疫苗的16名患者中有8名产生了持续产生IFNγ的T细胞易位，证明了mRNA疫苗的免疫持久性。对疫苗有反应的受试者的中位无复发生存期（RFS）在中位随访时间为18个月时尚未达到。反应者的RFS明显高于非反应者。因此，可以得出结论，Atezolizumab（一种抗PD-L1单克隆抗体）与mRNA疫苗结合，诱导了广泛的T细胞活性，并延迟了胰腺癌的复发。Kang等人表明，在进行手术切除并有延迟复发风险的胰腺导管腺癌（PDAC）患者中，个性化的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran（BNT122）与Atezolizumab和mFOLFIRINOX（PDAC手术后的标准辅助化疗方案）结合使用，诱导了显著的T细胞活性。 结直肠癌。针对结直肠腺癌的mRNA疫苗有限。一个重大困难是从几种疫苗候选中筛选出可能适合特定类型癌症的mRNA疫苗。Liu等人确定的潜在mRNA疫苗候选物包括靶向抗原血栓蛋白2、卵泡抑素样3、肌钙蛋白T1、大囊泡、胶原蛋白三螺旋重复含1和NADPH氧化酶4。该研究还描述了CRC的异常基因表达模式和突变景观。结果可能有助于确定适合免疫治疗的CRC患者，并为创建mRNA癌症疫苗提供理论基础。 黑色素瘤。为了开发mRNA疫苗并确定合适的疫苗接种人群，Ping等人分析了黑色素瘤中的潜在肿瘤抗原。他们的分析揭示了蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素11（SIGLEC11）、环状寡腺苷酸激活的单链核糖核酸酶和单链脱氧核糖核酸酶1、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1和ADAM样解刀蛋白1可能是黑色素瘤mRNA疫苗的抗原靶标，为黑色素瘤mRNA疫苗的开发奠定了基础。根据Sittplangkoon等人的研究结果，在黑色素瘤模型中，未修饰的mRNA疫苗可能导致产生IFN-I或触发下游信号级联反应，这两者对于引发强效的抗肿瘤T细胞反应至关重要，这些反应调节肿瘤的发展和转移。最近的一项临床研究结果显示，实验性疫苗mRNA-4157/V940结合pembrolizumab可能作为高危黑色素瘤治疗的辅助治疗。与单独使用PD-1抑制剂治疗的患者相比，接受这种组合治疗的个体在手术后复发风险显著降低。 乳腺癌（BCa）。Li等人确定了可能适合mRNA疫苗接种的BCa患者群体以及用于创建抗BCa mRNA疫苗的潜在BCa相关抗原。总共鉴定出三种肿瘤相关抗原：CD74、干扰素调节因子1和蛋白酶体激活亚单位2。这些抗原经常出现突变、扩增或上调，并且与免疫细胞浸润和预后相关。具有B类免疫亚群的患者的肿瘤微环境（TME）可能对mRNA疫苗反应良好。在前列腺腺癌（PRAD）免疫亚型2和3组的患者更有可能从免疫接种中受益，PRAD mRNA疫苗的潜在抗原，包括Kelch样家族成员17、肉碱棕榈酰转移酶1B、IQ基序含有GTP酶激活蛋白3、Lck相互作用跨膜适配器1、YjeF N-末端结构域含有3、卷曲螺旋结构域含有180、MutS同源物5和钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G-型受体3。 肝细胞癌（HCC）。北京协和医学院医院正在进行针对肿瘤抗原mRNA治疗疫苗ABOR2014（IPM511）的首次人体临床试验。该疫苗编码了在HCC患者中经常上调的近20种HCC抗原。该研究旨在评估IPM511单独使用以及与PD-1抑制剂治疗结合使用在经过一线标准治疗后病情进展的晚期HCC患者的安全性、耐受性和初步疗效。该研究目前正在进行中，尚未公布结果，主要研究者表示，IPM511在使用这种方法治疗的第一位患者中已经显示出安全性和临床可行性。 食管癌。最近报道了一项针对晚期食管鳞状细胞癌的个性化mRNA癌症疫苗结合PD-1抑制剂治疗的研究。参与研究的患者首先使用来自病变组织的全转录组测序进行新抗原筛选。开发了一种针对这些新抗原的个性化mRNA癌症疫苗。随后，患者接受了mRNA癌症疫苗与PD-1抑制剂的组合治疗，患者获得了部分缓解；治疗方案的安全性在可控范围内。因此，mRNA疫苗可能是晚期食管癌患者有效的治疗策略。 6.mRNA疫苗在肿瘤治疗中的功能性实现  mRNA疫苗的免疫治疗  癌症现在可以通过免疫治疗有效治疗，鉴于早期临床结果积极，FDA已经授权越来越多的免疫疗法。癌症免疫治疗的基础是免疫系统识别和消除癌细胞的能力。随着近年来针对增强对恶性肿瘤的免疫反应的多类药物的出现，这一研究领域迅速扩大。这些包括各种疫苗接种方法、采用T细胞治疗、免疫检查点抑制剂和细胞因子。 肿瘤抗原。肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）是两类由mRNA编码的抗原，传统上一直是免疫治疗的靶标。鉴于免疫记忆，专门针对TAAs或TSAs的疫苗可能会针对并杀死表达抗原上调的癌细胞，并提供持久的治疗反应。 TAAs。TAA对肿瘤细胞并不独特。虽然它们也可能存在于健康组织和细胞中，特别是在胚胎组织中，这些抗原在肿瘤中的表达显著升高。Conry等人开发了第一种mRNA癌症疫苗；这种疫苗表明，用编码癌胚抗原（CEA）的mRNA免疫的小鼠在受到CEA表达肿瘤细胞挑战时显示出抗CEA抗体反应。自从这一初步发现以来，TAA研究受到了显著关注，并取得了积极的临床研究结果。Huang等人在胆管癌中鉴定了三种肿瘤抗原，包括CD247、Fcγ受体Ia和转录域相关蛋白，这些抗原与改善的预后和抗原呈递细胞的浸润有关。这些抗原可能作为针对胆管癌的mRNA疫苗的潜在候选物。然而，TAA免疫方法确实存在一些缺点。TAA通常不在恶性细胞中发现。此外，由于并非所有发现的TAA都能诱导抗肿瘤免疫反应，选择TAA可能具有挑战性，疫苗开发成本高昂。肿瘤本身可能会下调TAA，允许在专注于特定抗原时逃脱。最后，TAA也可能存在于正常组织中，针对它们的疫苗可能会引起外周和中枢耐受反应，这可能导致疫苗效力差或针对正常组织的自身免疫。 肿瘤特异性抗原（TSAs），也称为新抗原，是肿瘤细胞因体细胞随机变化而独有的抗原，因此不存在于正常组织和细胞中。肿瘤特异性突变是癌症免疫治疗的诱人靶点，这些突变可能导致新抗原的产生，从而允许开发定制疫苗，因为这些突变的抗原在健康组织中不表达，因此可以被T细胞识别。基于新抗原的疫苗接种相对于基于TAA的疫苗具有以下特点，突显了它们的优势。由于新抗原仅由肿瘤细胞产生，它们只能触发特定于肿瘤的T细胞反应，限制了对非恶性组织的伤害。新抗原提供了通过逃避T细胞对自身表位的中央耐受来引发针对肿瘤的免疫反应的潜力。此外，由于这些疫苗增强的新抗原特异性T细胞反应的持久性，可能提供长期防止疾病复发的保护，并提供超出治疗的免疫记忆。为了使患者对转移性胃癌产生免疫，Cafri等人最近将经过验证和表征的新抗原和预测的新表位以及驱动基因突变结合到一个单一的mRNA构建中。开发的疫苗证明是安全的，并且产生了针对预期新表位的T细胞反应，这些新表位在免疫之前尚未被发现。尽管取得了进展，使用新抗原仍然面临几个挑战；这些障碍源于生物学和技术因素，包括潜在抗原和HLA分子的多态性，对我们对不常见HLA等位基因的HLA结合基序的理解存在差距，以及肿瘤的异质性。 mRNA疫苗的肿瘤抗原递送方法 mRNA转染的DC疫苗。DC可以转染表达肿瘤抗原的mRNA和总肿瘤mRNA，然后可以将其传递给宿主并启动免疫反应。将转染TAA mRNA或总mRNA的DC皮下应用于带瘤小鼠已被证明可以诱导T细胞免疫并抑制已建立肿瘤的生长，这也支持了这两种不同转染方法的可行性。接受顺铂治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的患者，当Kongsted等人转染表达多种TAA的DC时，没有出现不良反应；约50%的研究参与者表现出免疫反应。现在正在进行一项针对肺癌患者的1期临床试验，评估MIDRIXNEO，这是一种针对肿瘤新抗原的定制mRNA加载的树突状细胞疫苗。 直接注射。有几种方法可以直接将编码肿瘤抗原的mRNA注入宿主体内。局部细胞，如APC，吸收mRNA并将其转移到细胞质中进行翻译。通过淋巴结内注射是传递肿瘤抗原的最常见方法之一。2012年对29名晚期黑色素瘤患者的1期研究开始了；这项试验的未发布数据显示，淋巴结内mRNA注射是安全和可行的（NCT01684241）。编码酪氨酸酶、前黑素体蛋白、MAGE家族成员A3（MAGE-A3）、MAGE-C2和肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原以及TriMix mRNA在静脉内注射时耐受性良好。在另一项1期临床研究中，研究了针对III期和IV期黑色素瘤患者的新抗原特异性mRNA疫苗的淋巴结内递送，该疫苗由针对患者的20种突变组成（NCT02035956），这表明可以利用个体突变。 通过皮肤给药。通过皮肤可能实现由mRNA表达的肿瘤抗原的给药。小鼠通过基因枪将编码增强型绿色荧光蛋白和黑素细胞自身抗原TRP2的IVT mRNA注射到皮肤上。这成功地引发了针对抗原的细胞免疫，对B16肺转移和诱导类似白癜风的毛发脱色起到了保护作用。在一项涉及21名转移性黑色素瘤患者的1/2期临床试验中，将编码六种与黑色素瘤相关抗原的mRNA通过皮内注射，使用精蛋白凝聚的裸mRNA，安全且成功地注射到4名可评估患者中的2名。此外，在7名可测量疾病的患者中，有1名对疫苗表现出完全反应。 通过鼻内给药。通过mRNA编码肿瘤抗原的粘膜途径可以有效地引发全身免疫反应和局部粘膜免疫。通过鼻内递送可以达到鼻相关淋巴组织，这是一个有利的位置，可以促进抗原内化，以促进对癌细胞的保护反应。在侵袭性刘易斯肺癌模型中，Mai等人通过腹腔内免疫小鼠，使用阳离子脂质/精蛋白复合物携带编码角蛋白19的mRNA，这减缓了肿瘤的发展并引发了强大的细胞免疫反应。 通过静脉内给药。Sahin等人研究了编码四种非突变肿瘤相关抗原的黑色素瘤fixvac（bnt111）静脉内脂质体RNA（rna-lpx）疫苗。rna-lpx疫苗是一种成功的免疫治疗方法；针对疫苗抗原实现了强大的CD4+和CD8+ T细胞免疫，伴随着有利的临床反应。在某些反应者中，抗原特异性细胞毒性T细胞反应是持久的，并且常常记录采用T细胞治疗。 mRNA编码的免疫调节剂。肿瘤免疫疗法，也称为主动非特异性免疫疗法，是最早使用免疫系统调节剂的医学领域之一。体外靶细胞转染，或静脉内或肿瘤内递送，是体内通过mRNA产生免疫调节剂的主要方法。由于细胞因子，免疫系统的细胞可以在短距离内进行通信，细胞因子是先天和适应性免疫的重要调节剂。为了刺激癌症患者的免疫系统，细胞因子疗法已成为一种重要的治疗手段，并且是当前临床癌症研究的主要课题。mRNA编码细胞因子基免疫疗法的目标是以最少的毒性和系统暴露从递送重组蛋白中增加TME中的细胞因子数量。 鉴于其强烈的促炎特性，IL-12是癌症免疫疗法的一个有希望的选择。IL-12信号诱导1型T辅助细胞（Th1）分化、CD8+细胞获得细胞毒性活性以及激活IFN-γ的产生，所有这些都改善了吞噬功能和局部炎症。T细胞转染mRNA产生由p35和p40亚基组成的单链IL-12（scIL-12）是研究的主题之一。在同源和异种移植小鼠模型中，scIL-12表达T细胞的肿瘤内注射导致注射和远处肿瘤病变的完全排斥。通过与4-1BB配体（4-1BBL）mRNA共电穿孔，进一步增强了T细胞的抗肿瘤效果。已经显示，新型肿瘤内IL-12 mRNA治疗可以刺激Th1 TME转化和强大的抗肿瘤免疫。此外，在对检查点抑制剂有抵抗力的小鼠肿瘤模型中，将免疫检查点抑制剂与IL-12 mRNA结合使用，增加了抗癌反应，增强了总生存期（OS）和肿瘤退缩。 已经验证了多种mRNA编码不同细胞因子的免疫治疗效果。Hotz等人在肿瘤内给药后检查了编码四种细胞因子的mRNA，IL-12、IFN-α、IL-15 sushi和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。这些细胞因子可能促进免疫记忆的发展，并具有强大的抗癌作用。Hewitt等人表明，在各种TME中，直接肿瘤内给药编码这些细胞因子的mRNA产生了强烈的抗癌反应。 肿瘤免疫疗法除了细胞因子外，还涉及mRNA编码的刺激配体和受体。免疫系统从刺激配体和受体接收炎症信号，这些信号可用于癌症免疫治疗。通过暂时为细胞提供刺激受体，mRNA可用于暂时激活强大的炎症信号。虽然这些免疫刺激剂不被视为癌症疫苗，但它们通常与其他免疫治疗方法（如检查点阻断调节剂）联合使用，以增强体液和细胞反应。一些研究表明，使用编码共刺激分子的mRNA电穿孔后，DC的免疫刺激活性显著增加，包括CD83、肿瘤坏死因子受体超家族成员4（也称为OX40）和4-1BBL。Trimix mRNA是一种由三个mRNA分子组成的mRNA基佐剂，编码CATLR4、激活刺激因子CD40L和共刺激分子CD70，该佐剂于2016年创建。Loomis等人表明，通过肌肉注射连接的体外转录mRNA-TLR7激动剂，可以在体内增强抗原特异性的细胞介导和体液反应。TriMix mRNA单独使用（TriMix mRNA加TAA mRNA，或自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔的树突状细胞与编码CD40配体、CD70和组成性激活的TLR4的mRNA，称为TriMixDC-MEL）以及与ipilimumab检查点抑制剂（一种阻断CTLA的单克隆抗体）联合使用，都能引发强大的免疫反应，从而带来有希望的临床反应和延长无病生存率（NCT01676779和NCT01302496）。这些II期研究是针对III/IV期黑色素瘤患者进行的治疗。 mRNA编码的抗体。自从首个抗体被批准用于癌症治疗以来，肿瘤学领域以越来越快的速度开发了基于抗体的治疗方法。因此，现在有几种获批的抗体和正在进行临床审查的其他候选物。Thran等人展示了mRNA在体外产生各种抗体和抗体类型的能力。此外，编码肿瘤抗体的mRNA可能引发强大的抗肿瘤免疫。 抗体在肿瘤治疗中的参与可以通过以下方法分类：i) 抗体在结合目标受体后，可能通过诱导凋亡信号或去除关键的生长信号，促进肿瘤细胞的直接死亡。ii) 通过附着于癌细胞特异性抗原，激活免疫介导的细胞死亡，诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。iii) 阻断免疫检查点，涉及阻止PD1或CTLA4抗体，重新激活针对癌细胞抗原的T细胞反应，并触发免疫介导的细胞死亡。iv) 直接与癌细胞结合的T细胞，启动免疫介导的细胞死亡。 单克隆抗体（mAb）、mAb片段和工程变体（如二价抗体、三价抗体、小抗体和单域抗体）是参与肿瘤免疫治疗的抗体类别。单克隆抗体和双特异性抗体都经过了广泛的研究和使用。 首个获得癌症治疗许可的mAb，利妥昔单抗，靶向CD20并诱导CDC，以及较小程度的ADCC。它用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。在体外前B细胞淋巴瘤模型中，编码这种mAb的mRNA是有益的。由于曲妥珠单抗抑制激酶活性、下游信号和人表皮生长因子受体2（HER2）/Erb-B2受体酪氨酸激酶2受体二聚体化，癌细胞饿死并最终死亡。通过与癌细胞上的诱导凋亡受体结合的拮抗性抗体，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体和抗体-药物偶联物，尤其是向癌细胞传递有毒有效载荷，也可能诱导直接肿瘤细胞死亡。当使用靶向肝脏的LNP配方鞘内给药时，从血清中检索到编码mRNA的曲妥珠单抗，并表现出ADCC。在HER2/neu阳性乳腺癌异种移植模型中，这种方法增加了存活率。通过将抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）mAb表达的自放大RNA注入小鼠肿瘤，可以促进转染细胞中PD-L1 mAb的翻译和CD8+ T细胞向肿瘤的浸润。尽管mAbs在癌症方面有多个积极的例子，但较差的组织穿透限制了完整抗体在肿瘤质量上均匀分布的能力。因此，已经努力修改抗体的结构，产生了具有改善的组织穿透性的新型抗体片段。抗体片段的发现在双特异性抗体（BsAbs）的研究中极大地帮助了，并被用作创建这些抗体的构建块。世界上第一个同时结合两种抗原的抗体是在1960年代由Nisonoff等人通过使用适度的再氧化方法将两个兔多克隆抗体血清的抗原结合片段结合起来创建的。 BsAbs相对于常规mAbs的一个可能好处是它们能够同时靶向两个不同的位点，并在一定程度上绕过肿瘤药物抗性。然而，由于BsAbs的血清半衰期很短（仅几个小时），它们必须不断使用输液泵给患者施用。克服这个限制的一个可能方法是使用mRNA直接在患者中产生治疗性抗体。 最近的一项研究强调了一种成功的双特异性靶向方法；一种临床上批准的LNP封装mRNA表达C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CCL5（bisccl2/5I），可以双特异性结合和中和。这显著促进了TAM向抗肿瘤M1表型的极化，并降低了TME中的免疫抑制。BisCCL2/5i与PD-1L抑制剂联合使用已被证明在小鼠模型中，原发性肝癌的胰腺、结直肠和肝脏转移中实现长期存活。Wu等人描述了使用mRNA编码具有消融Fc免疫学效应功能的BsAb。该抗体，也称为XA-1，靶向人PD-L1和PD-1。与直接用于癌症的抗体治疗不同，这项工作表明，使用XA-1 mRNA LNPs治疗可以有效地通过肝细胞产生内源性治疗性BsAbs。 mRNA编码的抗原受体。通过产生转基因T细胞受体（TCRs）或CARs，由于mRNAs的短暂性质，已经有可能为naïve T细胞提供肿瘤选择性。编码CARs或TCRs的mRNA已被证明具有价值；生成CARs或TCRs的短暂表达可以防止细胞因子释放综合征的发展，这是慢性T细胞激活的负面后果。CAR-T细胞作为最有前途的癌症过继免疫治疗方法引起了相当大的兴趣。 CAR-T治疗中，从患者体内提取免疫T细胞，通过体外基因改造，赋予其识别癌细胞表面的“嵌合抗原受体”（CAR）。这些改造后的细胞在实验室中扩增后，再输回患者体内。通常，细胞外的TAA特异性抗体结合域与细胞内的T细胞信号区域融合，形成嵌合受体。几乎每种肿瘤相关抗原都可能成为CAR-T细胞的靶标。然而，CAR-T治疗中也存在一些风险，包括针对非肿瘤组织的毒性。体外转录的mRNA CAR-T细胞作为一种安全的治疗方案正在兴起，因为它们可以避免针对性的抗肿瘤毒性。大多数研究使用mRNA电穿孔的CARs，这是一种实用且可扩展的方法，能够在不损害细胞产品活性的情况下实现淋巴细胞转染率超过90%。CAR表达在T细胞表面大约持续7天，并且在遇到目标细胞后内化的CARs不会恢复。然而，体外转录mRNA方法也有其缺点。包括较差的肿瘤浸润、当T细胞数量有限时制造困难、重复注射CAR-T细胞时副作用的风险，以及mRNA重定向T细胞的短寿命，导致编码蛋白的表达持续数天。最重要的是，电穿孔有各种缺点，可能严重影响生成的CAR-T细胞的质量。实际上，脉冲电场的应用可能会不可逆转地破坏细胞质膜的完整性。在存活的转染细胞中，可能会观察到转基因表达减少、异常的基因表达谱和较差的活性。实际上，研究表明，与未修饰和未纯化的mRNA相比，使用化学修饰的1mΨ mRNA和/或进一步纯化以去除dsRNA的mRNA，小鼠T细胞电穿孔的CAR编码mRNA显示出显著降低的检查点分子（PD-1和淋巴细胞激活基因3）上调。这赋予了免疫沉默的mRNA转染T细胞更大的杀伤力，即使在细胞的CAR表达消失后也能持续。当前结果必须在mRNA CAR-T细胞的生产中考虑，以满足临床试验的目标，目前正在进行mRNA CAR研究，针对血液和实体肿瘤恶性肿瘤。 目前，mRNA CAR-T细胞受到极大关注，并在肿瘤治疗研究中显示出有希望的结果。使用mRNA CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤已经看到了有利的临床前和临床结果。主要靶标包括CD19、CD37、CD33和CD123。已经进行了针对淋巴瘤和白血病的mRNA CAR-T细胞治疗的临床前研究。针对霍奇金淋巴瘤的CD19方法和针对复发/难治性急性髓系白血病的CD123方法都在临床研究中进行了测试。这两项研究表明mRNA CAR-T治疗是安全的。Jetani等人最近提出了一种新的mRNA CAR-T细胞治疗方法，他们确定了siglec-6作为AML中CAR-T细胞的新靶标。Lin等人创建了一种新的CD8+ CAR-T细胞产品Descartes-08，用于治疗多发性骨髓瘤；该产品初步显示出持续的反应和强大的治疗指数。间皮瘤、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤是已经研究了mRNA CAR-T治疗的实体恶性肿瘤。 组合疗法-免疫疗法和mRNA疫苗。mRNA治疗与另一种治疗方式的结合可能在肿瘤治疗中显示出巨大潜力。肿瘤抗原与免疫调节剂之间的相互作用是当前研究的主要焦点。 早期研究表明，将TAA和IL-12 mRNA转染到成熟的DC中可以增强TAA特异性CTLs，这可能被用来触发由NK效应细胞和CTLs介导的针对肿瘤的免疫反应。通过测试编码HLA-II类靶向信号（DC-LAMP）、黑色素瘤相关抗原、CD40配体、CATLR4和CD70融合蛋白的mRNA，证明了使用trimixdc Mel的细胞免疫疗法的安全性和免疫原性。在研究的IV剂量水平下，看到了具有持久疾病控制的抗肿瘤效果。 最近，在转移性肾细胞癌的3期研究中使用了Sunitinib和rocapuldencel-T。通过电穿孔自体免疫，使用成熟的单核细胞衍生的DCs制备的放大肿瘤RNA和CD40L RNA，并没有提高接受组合治疗的患者的总生存期。然而，与总生存期相关的免疫反应得到了增强。 mRNA疫苗的蛋白质疗法 诱导癌细胞死亡的方法。通过使用mRNA疗法，可以使得癌细胞产生一种致命的细胞内蛋白，导致细胞自我毁灭。Van Hoecke等人通过宫内传递编码混合谱系激酶结构域样蛋白的mRNA，导致肿瘤生长停滞和诱导坏死性肿瘤细胞死亡。 蛋白质替代疗法。IVT mRNA在蛋白质替代疗法中的使用是基于产生可以激活或抑制细胞途径的外来蛋白，以及补充缺失或表达不足的蛋白质。自1992年首次用于蛋白质替代的临床前评估以来，IVT mRNA注射已被用于针对几种蛋白质。 鉴于它们的可及性，肝脏、肺和心脏是IVT mRNA基于蛋白质替代治疗的主要靶标。然而，其他组织和器官，如皮肤、眼睛的背面或鼻腔，也被视为潜在的靶标。罕见和遗传性疾病是这种治疗方式的主要目标。疾病引起的下调蛋白与遗传异常有关，并由治疗性IVT mRNA编码。 IVT mRNA作为蛋白质替代疗法正在作为癌症治疗的一种方式进行研究。然而，这是非常困难的，因为它需要反复给药，有时甚至是全身分布，以及靶向mRNA表达。据我们所知，目前在蛋白质替代领域还没有开始使用IVT mRNA的临床试验。 在96%的高级别浆液性卵巢癌患者中存在肿瘤蛋白（TP53）的突变。由TP53基因表达的p53蛋白识别并修复细胞中的DNA损伤，并在损伤无法修复时诱导细胞死亡，从而避免异常细胞的增殖，防止癌症的发生。当TP53基因突变时，表达的突变p53蛋白失去了其致癌效应。在最近的一项研究中，一个团队合成了编码正确p53蛋白的mRNA，并将其装载到脂质体中进行传递，从而允许mRNA在癌细胞中表达功能性p53蛋白。经过上述mRNA治疗后，来自患者的卵巢类器官开始萎缩和死亡，小鼠模型中的原发性肿瘤和转移瘤几乎完全消失。这些发现表明，基于IVT-mRNA的蛋白质替代疗法可能重新激活癌细胞中的致癌蛋白，因此可能成为癌症治疗的宝贵治疗选择。 基因编辑的mRNA疫苗。mRNA技术表达可编程核酸酶，如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶和成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关内切酶（Cas）9系统，允许基因编辑作为一种潜在的治疗手段。通过向细胞基因组提供特定部位的变异，例如纠正有害突变或引入保护性变化，这些基因组工程技术允许替换或修改基因表达。CRISPR-Cas9由Cas9核酸内切酶和单导向RNA（sgRNA）组成，是一种广泛使用的基因编辑工具。CRISPR-Cas9治疗可用于永久性地消除癌细胞存活基因，避免了重复给药的需要，从而提高治疗效果。癌细胞或T细胞被转染了封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中的Cas9 mRNA和sgRNA。mRNA在细胞质中翻译以产生Cas9蛋白，然后与sgRNA复合形成对特定DNA序列有亲和力的核糖核蛋白。接下来，核糖体复合物转移到细胞核以破坏肿瘤存活基因。当这种情况发生在T细胞中时，PD-1和内源性TCR基因被敲除以在肿瘤细胞中诱导凋亡。Ling等人使用针对E6或E7致癌基因的Cas9 mRNA和gRNA治疗宫颈癌。结果表明，这种方法不仅有效地敲除了致癌基因，还逆转了免疫抑制微环境以实现抗肿瘤效果。 再生医学 再生医学的目标是通过重新建立或恢复其正常功能来替代、再生或恢复受损或被破坏的组织、器官或细胞。调节细胞生物活性的蛋白质，如细胞分裂、迁移和分化以及生长因子、细胞因子和转录因子，对再生过程至关重要。将体外转录mRNA转染到体细胞中表达转录因子，是传统的体细胞重编程和转分化的有吸引力的替代方法。在再生医学中使用体外转录mRNA的主要目标是增加1型糖尿病患者分泌胰岛素的能力。使用细胞和间充质干细胞工程进行肿瘤治疗尚未得到广泛关注。已经证明，使用前列腺素E2受体拮抗剂从干细胞中诱导出具有转移干细胞特性的干细胞外泌体，并用于癌症治疗和再生医学。干细胞外泌体可以降低肿瘤抗性。是否可以使用mRNA疫苗表达具有转移干细胞特性的干细胞外泌体用于癌症治疗，这是一个考虑点。 7.结论和未来展望  由于新型抗肿瘤药物和疗法的不断发展，癌症患者的生存几率有所提高；然而，包括肿瘤药物抗性、剂量毒性等问题在内的一些问题，不断带来新的困难。与标准治疗方法相比，大多数恶性肿瘤的生物治疗旨在通过刺激自身免疫和阻断关键信号转导来预防肿瘤生长和发生。人们对于mRNA基技术的长期效果缺乏一些担忧；研究人员正试图使用mRNA治疗挑战目前的疾病治疗方法。 自从Wolff等人证明体外转录的mRNA可以在活细胞中产生蛋白质以来，mRNA疫苗在几个应用中已显示出成功。作为一种有前途的新型平台，基于mRNA的疫苗需要克服冷链保存的限制，并提供更好的适应性、有效性、简便性和可扩展性，以及降低成本。mRNA疫苗在传染病方面已显示出益处，癌症是mRNA技术的预定目标。在未来2-4年内，使用定制癌症疫苗的几项积极的临床研究应该完成。 在肿瘤治疗中使用组合mRNA治疗似乎有着有希望的前景。包括手术、放疗和化疗在内的目前肿瘤治疗方法效果很好。作为一种新型生物治疗，mRNA治疗需要额外的临床试验，以提供一个更好的整合计划，然后才能有效地纳入当前程序。此外，mRNA技术可以与免疫疗法结合使用；目前，大多数研究集中在免疫调节剂上。由于其独特的优势，mRNA也预计将取代ILs、IFNs和细胞集落因子等重组蛋白药物。由于体外转录mRNA在基因编辑技术中减少误差的能力，肿瘤基因治疗可能会取得进展。假设通过将目标基因引入载体来完成肿瘤基因治疗，mRNA治疗最终可能会降低遗传家族性肿瘤的流行率。因此，更广泛的癌症患者可能会从这些新解决方案中受益。 未来对癌症mRNA疫苗的研究应该集中在治疗性和预防性疫苗的开发上。个性化mRNA疫苗为对当前治疗无反应的肿瘤，如胰腺癌，提供了新的治疗策略。此外，mRNA技术可以用来开发针对癌症重要原因的病毒的疫苗，如HPV和HBV。研究表明，在动物研究中，HPV mRNA疫苗比HPV重组蛋白疫苗和HPV DNA疫苗对肿瘤更有效，支持使用mRNA技术开发预防肿瘤的预防性疫苗的未来，这将在临床试验中进一步评估。 此外，mRNA疫苗的灵活性、适应性和快速生产能力将为未来预防和治疗传染病和癌症提供激动人心的可能性，这将有助于减少全球疾病负担。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

本研究提出靶向MITF-M表达中的CREB和crtc磷酸化回路可预防获得性皮肤色素沉着，该研究为治疗皮肤色素紊乱提供了一种合适的策略。 阳光下的紫外线(UV)辐射会导致皮肤色素沉着、老化和致癌。UV-A辐射通过现有黑色素色素的氧化修饰和现有黑色素小体向表皮上层的空间再分配来刺激立即色素沉着，但不依赖于黑色素色素的从头合成。UV-B辐射导致表皮黑素细胞中重色素黑素体的产生增加和表皮角化细胞中黑色素生成激素的上调，从而导致色素沉着延迟。 UV-B辐射稳定并激活p53，这是一种上调促鸦片黑素皮质素(POMC)表达的转录因子。α-促黑素细胞激素(α-MSH)由POMC经翻译后加工产生，由表皮角质形成细胞分泌。除α-MSH外，p53转录因子还位于其他黑色素生成激素的启动子区域，最大限度地诱导表皮角质形成细胞，从而促进皮肤色素沉着。 α-MSH特异性地与皮肤表皮黑色素细胞表面的黑色素皮质素1受体(MC1R)相互作用，通过Gα亚基变构激活腺苷酸环化酶，导致环磷酸腺苷(cAMP)水平升高。反过来，cAMP与蛋白激酶A (PKA)无活性全酶中的调节亚基结合，并将催化亚基与调节亚基解离，从而激活PKA在细胞底物上的激酶活性，包括cAMP反应元件(CRE)结合蛋白(CREB)、盐诱导激酶(SIKs)和amp活化蛋白激酶(AMPK)。 PKA直接磷酸化核CREB，这是一种与小眼相关转录因子M (MITF-M)启动子区顺式作用CRE基序相互作用的转录因子，在CREB结合蛋白(CBP)和p300的募集中起重要作用。CBP和p300 (CBP/p300)在核小体组蛋白上显示乙酰转移酶活性，从而在染色质重塑中具有转录活性。 MITF-M可在黑素细胞兼性黑色素形成条件下被诱导，并作为主转录因子与MITF-M靶基因启动子区域的顺式作用M-box和E-box相互作用，编码黑色素小体的生物发生、色素形成和转移的黑色素生成蛋白。黑色素生成程序在表皮-真皮边界的黑色素细胞的黑色素小体中合成黑色素色素。 酪氨酸酶(TYR)具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶的双重催化活性，在真黑素和泛黑素的生物合成途径中将酪氨酸转化为多巴醌。酪氨酸相关蛋白1 (TRP-1)和多巴色胺自变酶(DCT)在真黑素的生物合成中也是必需的，而非黑色素的生物合成。然后，色素黑素体转移到覆盖表皮的角质形成细胞的细胞质中，从而决定皮肤颜色并屏蔽皮肤细胞核，以保护皮肤免受紫外线辐射引起的风险。 图片来源：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/38164184/ 近日，来自韩国忠北大学药学院的研究者们在Int J Biol Sci杂志上发表了题为“Targeting phosphorylation circuits on CREB and CRTCs as the strategy to prevent acquired skin hyperpigmentation”的文章，该研究揭示了靶向CREB和crtc的磷酸化回路可预防获得性皮肤色素沉着。 cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和CREB调控的转录共激活因子(crtc)共同参与小眼相关转录因子M亚型(MITF-M)的转录激活，而MITF-M是表皮黑色素细胞生物发生、色素沉着和黑色素小体转移的主要调节因子。本文通过阐明Yaku A对兼性黑色素形成的抑制活性和机制，提出以MITF-M表达中的CREB和crtc磷酸化回路为靶点，作为预防皮肤色素沉着的基本原理。研究者采用人表皮黑素细胞、小鼠皮肤和小鼠黑色素瘤细胞，采用Western blotting、逆转录聚合酶链反应、免疫沉淀和共聚焦显微镜进行研究。 α- msh诱导的和camp依赖的黑素细胞通过磷酸化回路对CREB和crtc在MITF-M表达中的作用 图片来源：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/38164184/ 研究结果提示，在MITF-M表达的crtc去磷酸化过程中，α-促黑素细胞激素(α-MSH)诱导的黑色素生成程序可能开启蛋白激酶a -盐诱导激酶(PKA-SIKs)的轴，而不是PKA-AMP激活的蛋白激酶(PKA-AMPK)的轴。在没有细胞外黑色素生成刺激的情况下，SIK抑制剂而不是AMPK抑制剂刺激了黑素细胞培养中的黑色素生成，其中SIK抑制剂增加了crtc的去磷酸化，但绕过了CREB的磷酸化以表达MITF-M。 Yaku A可预防紫外线B (UV-B)照射下小鼠皮肤色素沉着，并抑制α-MSH或SIK抑制剂激活的黑素细胞培养物中黑色素的产生。在机制上，Yaku A通过双重靶向抑制MITF-M的表达:1)PKA催化CREB磷酸化的上游PKA全酶的camp依赖解离，以及PKA- siks轴介导的α- msh诱导的crtc去磷酸化，以及ii) SIK抑制剂诱导的crtc去磷酸化后crtc的核输入。 Yaku A抗黑色素活性的分子机制 图片来源：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/38164184/ 综上所述，本研究提出靶向MITF-M表达中的CREB和crtc磷酸化回路可预防获得性皮肤色素沉着，该研究为治疗皮肤色素紊乱提供了一种合适的策略。(生物谷 Bioon.com） 参考文献: Song-Hee Kim et al. Targeting phosphorylation circuits on CREB and CRTCs as the strategy to prevent acquired skin hyperpigmentation. Int J Biol Sci. 2024 Jan 1;20(1):312-330. doi: 10.7150/ijbs.86536.