N1 Life联创斯坦福Wender院士发布最新RNA递送载体，实现可调肝外靶向｜智递前沿分享

2024-06-04

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信使RNA细胞疗法疫苗核酸药物免疫疗法

编写｜Janice 校对｜Shuyi 导读 N1 Life联合创始人、斯坦福大学Paul Wender院士作为通讯作者，在知名学术期刊Journal of American Chemistry Society发表了与Robert Waymouth教授和Howard F. Chang（张元豪）教授合作成果，标题为：“Organ- and Cell-Selective Delivery of mRNA In Vivo Using Guanidinylated Serinol Charge-Altering Releasable Transporters”，本文介绍了Wender院士课题组在开发具有器官和细胞选择性的mRNA递送载体的新进展。新一代载体，即GSer-CARTs载体具有肝外靶向、可调控、可预测等特点，实现了circOVA的体内高效递送，并通过诱导免疫反应抑制肿瘤生长。随着mRNA疫苗产品的成功开发，RNA药物领域获得了广泛关注。然而，要实现RNA药物的广泛应用，其中重大挑战在于开发安全、有效且可扩展的递送系统，能够使RNA分子穿过细胞和器官屏障，并在特定部位释放RNA以发挥作用。过去几年，以脂质纳米颗粒(LNP)为代表的RNA递送系统取得了极大进展。脂质纳米颗粒(LNP)在静脉注射时主要将RNA递送至肝脏，肌肉注射时可以实现局部递送，但实现RNA向其他器官如肺和淋巴系统的高效选择性递送仍然是行业内的一大技术挑战。为了实现器官和细胞选择性递送，一种策略是用靶向特定细胞表面受体在LNP表面进行修饰，这种"主动靶向"的策略相比于无靶向配体的LNP能改善对白细胞、T淋巴细胞和脑细胞的体内mRNA递送。还可通过在体内进行文库筛选鉴定影响生物分布的靶向配体。此外，"蛋白冠效应"即LNP表面与血液中配体结合发生的修饰，也能有效参与器官选择性递送。另一种基础策略来实现mRNA的高效和选择性递送，即设计在体内给药后能失去阳离子电荷的mRNA载体。Chang、Levy、Waymouth和Wender研究组之前报道了这一策略的例子，即电荷改变型可释放载体(Charge-Altering Releasable Transporters， CARTs)。Wender实验室此前报道过CART载体的早期设计及后续优化和应用，通过分步简易组装构建的载体，可以有效递送包括mRNA、siRNA、siRNA在内的多种RNA分子。蛋白冠的关键作用：mRNA递送系统体内发生‘身份转换’，实现器官靶向｜臧晓羽博士在BioCon的分享特性与原理 CARTs是由Initiator(通常是羟基亲核试剂，用于引发聚合)、一个或多个脂质模块以及一个独特的阳离子α-铵酯模块组成的嵌段寡聚物，其中铵酯模块可与多阴离子RNA静电复合。在低pH(<5.5)条件下，CARTs与mRNA形成稳定复合物;而在生理pH(~7.4)条件下，阳离子铵模块发生氧-氮acyl转移，不可逆地转化为非带电的内酰胺副产物，从而触发多阴离子RNA的释放。CARTs已被用于制备CAR-NK细胞、CAR-T细胞、有效的SARS-CoV-2疫苗，以及在小鼠模型中治愈癌症和转移性癌症。与主要递送至肝脏的LNP系统不同，CARTs展现出肝外趋向性。例如，加入fingolimod配体的CARTs表现出对脾脏的选择性；而最近报道的CARTs在没有靶向配体的情况下，表现出显著的脾脏或肺选择性。因此，CARTs技术为实现mRNA的器官选择性递送提供了新的策略。本文中，Wender研究团队开发了用于RNA递送的新型含胍转运体，其设计目的是将胍基团降解为中性副产物，从而实现高效的mRNA释放和翻译。作者基于此前CART载体分子的研究，将常用的带电铵阳离子基团更换为胍基化丝氨醇，因此称为GSer-CART。图【1】GSer-CART和GSer-CART/mRNA复合物的生物物理特性及原理研究过程首先，研究团队通过模型化合物的研究揭示了一种新的机制：低pH（<5.5）下胍基与碳酸基团形成双氢键环，转运体与mRNA形成稳定包装的复合体，高pH，即在生理的中性pH（~7.4）下，胍基失去正电荷，从而消除其与磷酸基团的静电结合，复合物内的胍基可以迅速通过环化级联反应转化为电中性的副产物，使得二者分离，实现mRNA在细胞内的释放。图【2】GSer-CART在体内的可调节器官靶向性在随后的体内实验中，研究团队将体外递送效率最高的6种GSer-CARTs通过静脉注射到BALB/c小鼠体内。结果表明，不同侧链化学结构的CART和不同配方参数的复合体会产生不同的器官倾向性。研究者发现高电荷比有利于肺传递，低电荷比有利于脾传递，分别可达到肺（高达96%）或脾（高达98%）的靶向递送和器官内蛋白质表达，表明调整电荷比可以控制GSer-CART的器官倾向性。与已获批并在多个产品及临床研究中使用的LNP制剂相比，GSer-CART的这一特点大大优于现有技术，CART在肝脏表达极少，且其器官倾向性与不同的给药途径无关，是mRNA靶向递送至除肝脏和肌肉外其他器官的一大突破。在本篇工作中，GSer-CART载体技术的应用扩展到了circRNA，即环状RNA。circRNA因其独特的闭合环状结构，没有容易受到核酸外切酶攻击的5'和3'末端，这种结构特点赋予circRNA较高的稳定性，使其半衰期通常显著长于线性mRNA，因此具有更高的稳定性和更持久的蛋白质表达，在细胞内长期存在，发挥持续的调控功能。circRNA有巨大的临床潜力。circRNA在体液(如血液、唾液、尿液)中的稳定存在，使其成为理想的无创性液体活检标志物。特异性表达的circRNA有望成为疾病早期诊断、预后评估和治疗监测的有力工具。此外，circRNA还可能成为新型治疗策略的关键靶点，如circRNA疫苗、circRNA载体等。过去的一项发表在PNAS上的研究表明，通过CART递送载体的包裹和递送，circRNA还可诱导强烈的T细胞免疫，并在用CART包封circRNA后，腹腔注射的研究中诱导了肿瘤的清除。研究人员用两种GSer-CART来递送编码卵清蛋白（OVA）的circRNA（circOVA）。结果表明，GSer-3b/circOVA能诱导强烈的T细胞反应，在小鼠肿瘤模型中，可显著抑制肿瘤生长。该小鼠模型为C57BL/6J小鼠，通过皮下注射B16F10-OVA-Luc cells建立。图【3】GSer-CART/circOVA复合物能够引起强烈的抗肿瘤反应并抑制肿瘤生长根据图【3】a中显示，在第1天和第21天通过视网膜后注射5微克与GSer-CART复合的circOVA。在加强免疫10天后通过MHC I类四聚体染色分析血液、脾脏和肺T细胞的抗原特异性CD8 T细胞反应。通过在加强免疫后9天对小鼠进行放血来测量抗体反应，研究者观察到GSer-3b/circOVA(脾脏趋向性)组的抗Ova IgG显著升高。值得注意的是，与阴性对照相比，GSer-3b在小鼠中诱导了强大的T细胞反应。这些发现强调，使用与编码抗原序列的circRNA(circOVA)复合的GSer-CART可以在免疫后有效地引发抗原特异性CD8 T细胞反应。值得注意的是，脾脏特异性GSer-3b制剂产生了最强的抗体和T细胞反应，这可能归因于脾脏为激活树突状细胞和启动抗原特异性T细胞反应提供了理想环境。观察到的强大细胞毒性T细胞反应促使我们进一步探索GSer-CART/circOVA作为癌症疫苗的潜力。将B16F10-OVA-Luc细胞皮下接种到C57BL/6J小鼠中，并在肿瘤注射后6、10和14天静脉注射GSer-CART/circOVA，与对照组(ONA-circFOR)相比，GSer-3a/circOVA和GSer-3b/circOVA复合体均表现出显著的肿瘤生长抑制作用(图6d)。图【3】c显示的则是接种B16F10-OVA细胞后的肿瘤生长监测的示意图。在肿瘤细胞接种后的第6、10和14天，通过视网膜后注射5微克与GSer-CART复合的circOVA，并在21天内监测肿瘤体积。最后，我们研究者通过血液代谢物和炎症细胞因子分析证明了GSer-CART/mRNA复合物是无毒的，并且这些复合物可以在不同温度下储存，具有不同程度的稳定性(补充说明，补充图15)。这些结果共同证明了GSer-CART用于mRNA递送的递送效率、选择性、多功能性、耐受性和稳定性。这些结果共同证明了GSer-CARTs对mRNA递送的功效、选择性、多功能性、耐受性和稳定性。总结这项研究展示了新型CART载体技术具有极大的临床应用潜力。通过调整GSer-CART的化学结构和配方组成，可以在静脉注射时控制器官选择性(肺、脾脏)和细胞选择性(脾脏巨噬细胞)递送，而无需使用靶向配体。先前已报道CART结构变化表现出器官趋向性，能够有效地将mRNA递送到多种器官(肺、脾脏、肝脏)，可以有(主动)或没有(被动)靶向配体的使用。然而，识别针对特定器官和细胞的新型制剂参数在很大程度上仍然是经验性的，预测选择性mRNA递送的方法仍然有限。先前的文献表明，mRNA纳米颗粒的蛋白质冠层成分在决定器官趋向性方面起作用，但纳米颗粒性质、蛋白质冠层形成和趋向性之间的结构联系尚未得到很好的建立。在这项工作中，研究者观察到电荷比控制器官趋向性，并且趋向性与纳米颗粒的生物物理性质相关: 肺趋向性纳米颗粒在生理pH值下，与脾脏趋向性纳米颗粒相比，表现出更高的表面电荷，这些纳米颗粒在小鼠血浆中孵育时，由于其与蛋白质的结合，尺寸显示出更显著的增加。调整电荷比的策略与先前关于器官趋向性LNP系统的工作部分相似，其中阳离子脂质的添加促进了肺趋向性，而阴离子脂质促进了脾脏趋向性。然而，在LNP系统中，尺寸和表面电荷均未被报道与器官趋向性相关，表明LNP和CART的器官靶向机制可能不同。此外，LNP是用各种脂质制备的，一些LNP暂时被PEG脂质屏蔽，因此掩盖了不同器官趋向性LNP之间尺寸和表面电荷差异的观察。需要进一步的研究来阐明器官趋向性和生物物理性质之间的潜在机制。我们目前的研究强调了纳米颗粒生物物理性质的关键重要性，特别是在血浆环境中电荷比控制的器官趋向性。重要的是，这些性质可作为一种成本和时间有效的策略，用于筛选未来的GSer-CART配方，以确定目标器官趋向性，作为动物实验的前奏，并且通常鼓励更广泛的社区采用这一策略来预测和/或设计具有特定器官和细胞趋向性的纳米颗粒。作者介绍 Robert M. Waymouth教授是斯坦福大学化学系的Robert Eckles Swain讲席教授。他分别于1982年、1987年和1988年获得华盛顿与李大学学士学位、加州理工学院博士学位以及在瑞士苏黎世联邦理工学院完成博士后研究。 Waymouth教授的研究致力于开发新的催化策略，用于合成功能性分子，包括生物活性聚合物、合成燃料和可持续塑料。他与合作者开发了高选择性催化剂和连续流反应器，以及用于合成可降解聚合物和寡聚物的催化策略，将其作为"分子转运器"应用于基因和药物递送。 Waymouth教授与Wender教授共同发明了一种新型RNA递送技术，即电荷改变型可释放转运体(CARTs)，其在mRNA癌症疫苗领域展现出巨大潜力。这项技术为安全高效的RNA递送提供了新的解决方案。作者介绍 Howard Y. Chang教授是斯坦福大学医学院皮肤科和遗传学教授，也是霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的研究员，美国科学院院士。他在哈佛大学获得学士和医学博士学位，麻省理工学院获得生物学博士学位。 Chang教授以在长非编码RNA(lncRNA)和非编码基因组领域的重要发现而闻名。他的研究重点是基因活动在细胞命运控制中的协调机制。他的团队在表观遗传学和RNA生物学方面做出了开创性贡献，发明了多种基因组和RNA分析新方法。此外，Chang教授与斯坦福大学的Wender教授和Waymouth教授合作，开发了创新的RNA递送系统GSer-CART。该系统能高效、选择性地将治疗性RNA递送到特定器官，在癌症疫苗等领域展现出广阔应用前景。 Chang教授的长期研究目标是破译人类基因组中的调控信息，用于疾病诊断和治疗。他的卓越成就获得了多项重要奖项和荣誉，是美国国家科学院、医学院和人文与科学院的成员。作者介绍 Paul A. Wender教授是斯坦福大学化学系Francis W. Bergstrom教授，同时也在化学与系统生物学系担任兼职教授。他在在耶鲁大学获得化学博士学位，并在哥伦比亚大学完成了NIH的博士后研究。在加入斯坦福大学之前，Wender教授曾在哈佛大学任教。 Wender教授的研究团队利用新的计算工具、化学反应、试剂、策略和设计，致力于解决化学、合成、生物学、医学和材料科学领域的难题。通过与医学院、成像中心、化学生物学项目和分子治疗项目的合作，以及广泛的内外部协作，Wender教授的实验室强调利用化学、设计和合成来解决生物学和医学中的重大问题，包括根除艾滋病毒、克服耐药性癌症、癌症免疫治疗以及治疗阿尔茨海默病等认知障碍。 Wender教授在合成化学和医药化学领域取得了卓越成就，他开发的合成策略被广泛应用于天然产物和药物分子的合成。此外，他发明的细胞穿透肽技术为药物递送开辟了新的途径。近年来，Wender教授与Chang和Waymouth教授合作，开发出创新的GSer-CART递送平台，利用电荷中和机制实现了治疗性RNA在特定器官的高选择性递送，在RNA疫苗等领域展现出巨大应用潜力。 Wender教授的科研成果获得了众多奖项，包括四面体奖(Tetrahedron Prize)、普雷洛格奖章(瑞士联邦理工学院)、Arthur Cope奖(美国化学会)、Cohen医药化学卓越奖(以色列化学会)和德国生物活性物质与生物技术莱布尼茨联盟研究奖等。他在教学方面也屡获殊荣，包括Hoagland奖、Bing教学奖和院长教学奖。Wender教授是美国国家科学院院士、西班牙皇家科学院外籍院士，以及美国科学促进会和美国人文与科学院的院士。 N1 Life持续开发基于斯坦福院士课题组技术平台的mRNA递送工具，目前已开发成功的ChARLS递送体系在包裹效率、稳定性、安全性、工艺等各个方面具有极大优势，并可实现体内的肝外器官靶向和免疫细胞递送。关于N1 Life N1 Life是一家立足于中美，布局全球的创新生物医药公司，两大核心技术平台包括基于多肽载体偶联的转运递送技术和基于多功能高分子聚合物的靶向核酸递送技术。公司在推进自有管线的同时，和药企、科研机构开展多个管线合作项目，覆盖皮肤、眼科和肿瘤领域。 END ● 蛋白冠的关键作用：mRNA递送系统体内发生‘身份转换’，实现器官靶向｜臧晓羽博士在BioCon的分享 ● PTAB支持BioNTech和Pfizer对Moderna发起专利挑战｜重磅玩家寸步不让，mRNA+LNP技术专利战梳理