人G1P[8]型轮状病毒HN15D2毒株的分离纯化及鉴定

2023-06-03

临床3期疫苗免疫疗法

中文摘要目的对轮状病毒（rotavirus，RV）阳性临床粪便标本进行毒株分离、纯化及鉴定。方法将感染RV的腹泻患儿粪便标本在单层恒河猴肾细胞MA104上传代培养，分离毒株，通过噬斑法克隆纯化病毒，电子显微镜（电镜）观察病毒形态和大小；采用SDS-PAGE、免疫印迹法和间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、反转录PCR及全基因组测序对病毒进行鉴定。结果对大量临床标本进行传代筛选和噬斑纯化，得到1株RV野毒株。50%蔗糖超速离心纯化病毒在电镜下可见直径约75 nm的典型RV颗粒；SDS-PAGE和免疫印迹法结果显示在预期位置出现目的条带；IFA结果显示所分离病毒为RV；RNA-PAGE显示分离株电泳型为长型，电泳图谱中11个条带呈现4：2 ：3：2排列；PCR扩增片段及全基因组测序结果表明分离毒株为G1P[8]型。结论成功分离出1株人G1P[8]型RV野毒株，并命名为HN15D2。正文轮状病毒（rotavirus，RV）是造成全球5岁以下婴幼儿严重胃肠炎的最常见病原体[1]。与许多细菌性胃肠炎病原体不同，RV在发达国家和发展中国家都存在，且改善社会经济条件并不能阻止RV感染[2]。中国是RV感染的多发区和高发区，RV流行株因地区和年份而不同。G1、G2、G3、G4和G9型是我国的主要流行株[3-4]，婴幼儿感染率高达65%，以G1P[8]感染为主[5]。虽然对RV的研究已有几十年的历史，疫苗的问世减少了死亡病例，但是在低收入国家，每年RV相关胃肠炎仍然导致超过20万病例死亡[6]，至今尚未研究出特效治疗药，疫苗是预防RV腹泻、降低死亡率的最经济有效的手段[7]。兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）研制的口服三价重配RV减毒活疫苗（Vero细胞）（G2、G3和G4）（LLR3），在河南省完成了多中心、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期临床试验，结果显示，在2个流行季节后，LLR3的保护率分别为70.3%和56.6%，保护率与上市的疫苗RotaRix和RotaTeq相当。LLR3还显示出对其他流行野生毒株，尤其是对G9型毒株的交叉保护，但对G1型毒株的保护率仅为49.3%[8]。本实验拟对Ⅲ期临床试验中收集的RV阳性粪便样本进行培养，分离毒株并通过噬斑纯化筛选、形态观察及蛋白检定和全基因组测序进行毒株鉴定，以期为后续RV疫苗的进一步研发奠定基础。1材料与方法1.1细胞恒河猴肾细胞MA104（P30）由兰州公司第二研究室保存。1.2临床样本临床样本系口服三价重配RV减毒活疫苗（Vero细胞）Ⅲ期临床试验（批件号：2011L00838）收集的腹泻患儿RV阳性的粪便样本，由兰州公司第二研究室保存。1.3主要试剂及仪器RPMI-1640培养基和胰蛋白酶（胰酶）均购自美国Gibco公司，新生牛血清购自兰州荣晔科技生物工程有限责任公司，去支原体抗生素Plasmocin、荧光素标记羊抗兔IgG（H+L）、Lumi-Light免疫印迹底物均购自美国Thermo Fisher公司，抗RV G1兔血清由兰州公司第二研究室制备，低熔点琼脂糖、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔IgG均购自美国Sigma公司，总RNA提取试剂盒RNeasyMini Kit，Agarose Gel DNA回收试剂盒均购自德国Qiagen公司，One-Step PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）购自日本TaKaRa公司。S1000 Thermal Cycler PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司，ImageQuant LAS4000凝胶成像仪购自美国GE公司。1.4病毒分离与培养将RV阳性粪便标本用PBS重悬，在4 °C条件下12 500 r/min、5.5 cm离心半径离心2 min，吸取上清液用0.22 μm滤器过滤除菌，分装。分别取800 μl过滤液，加入300 μg/ml胰酶至胰酶终浓度15 μg/ml，37.0 °C水浴60 min后，分别接种于单层MA104细胞，每份标本各接种1瓶T25，37.0 °C吸附1 h，弃标本滤液，补加不含血清的RPMI-1640培养基（含0.5 μg/ml胰酶、25 μg/ml去支原体抗生素Plasmocin、100 μg/ml氨苄青霉素），于36.0~36.5 °C、5% CO2培养箱中培养，3 d后逐曰在显微镜下观察细胞，ELISA检测呈阳性或致细胞病变（cytopathic effect，CPE）≥75%时收获，收获液用相同方法连续盲传5代（P5），取P5 RV阳性收获液进行空斑克隆。1.5RV阳性收获液空斑克隆纯化将P5收获液10倍系列稀释至103~108稀释度后，接种6孔板中单层MA104细胞，每个稀释度2个复孔，0.9 ml/孔，于37.0 °C、5% CO2培养箱吸附4 h，弃上清液，加入RPMI-1640培养基配制的1%低熔点琼脂糖（含胰酶0.5 μg/ml），2 ml/孔，室温下凝固后，置于37.0 °C、5% CO2培养箱中培养。5 d后加入含有中性红的RPM-1640培养基配制的1%低熔点琼脂糖，2 ml/孔，室温凝固，相同条件继续培养，4~24 h观察空斑。在高稀释度孔中挑取单个空斑，接种于24孔板MA104细胞上，培养6 d后，ELISA检测，将光密度值最强的阳性孔样品进行再次克隆，如此重复克隆5次，挑选第5次空斑克隆滴度最高的单克隆毒株，命名为HN15D2，连续传代至P5并进行毒株鉴定。1.6病毒的纯化浓缩将HN15D2病毒收获液在-20 °C冷冻后室温融化，4 °C条件下8 000 r/min、7 cm离心半径离心30 min，收集上清液，进行50%蔗糖超速离心，4 °C条件下35 000 r/min、4.5 cm离心半径离心4 h，弃上清液，用RPMI-1640培养基重悬沉淀，使其达到100倍体积浓缩。1.7电子显微镜（电镜）观察纯化病毒样品送兰州大学电镜中心分析。1.8蛋白检测对超速离心纯化的HN15D2病毒进行SDS-PAGE和免疫印迹法分析[9]。一抗为抗RV G1兔血清（1 ：1 000稀释），二抗为HRP标记羊抗兔IgG（1：1 000稀释）。用Lumi-Light免疫印迹底物显色，凝胶成像仪成像。1.9免疫荧光检测在96孔板中，将HN15D2病毒以感染复数（multiplicity of infection，MOI）0.01接种 MA104细胞，并设置阴性对照。置于37.0 ℃、5%CO2培养箱中培养18 h；弃上清液，加入预冷的80%丙酮，100 μl/孔，室温固定20 min；吸出丙酮，室温干燥2 h；加入去离子水，200 μl/孔，室温2 min；弃去离子水，拍干后加入抗RV G1兔血清（1：200稀释），100 μl/孔，37.0 ℃孵育1 h；弃上清液，用含Tween的PBS（PBST）洗板6遍，拍干，加入荧光素标记羊抗兔IgG（H+L）（1 ：400稀释），37.0 ℃避光孵育1 h；弃上清液，PBST洗板，拍干，加入60%甘油，在荧光显微镜下观察并拍照。病毒RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳（RNA polyacrylamide gel electrophoresis，RNA-PAGE）取高滴度HN15D2病毒收获液400 μl，用苯酚-氯仿抽提法提取病毒基因组RNA，按照标准的PAGE程序进行电泳，上样量10 μl/泳道，硝酸银染色后观察病毒的核酸带型并干胶保存[10]。 VP4和VP7基因鉴定根据GenBank中RV的VP4 、VP7基因序列，用Primer 5.0软件设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。取HN15D2病毒P5收获液120 μl，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，进行反转录PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）。按照反转录试剂盒说明书，采用25 μl体系：取RNA模板10 μl，并依次加入One-Step缓冲液12.50 μl，加入上游引物和下游引物各1 μl，One-Step PrimeScript RT-PCR Kit 0.5 μl，共25 μl于PCR扩增仪中进行如下程序：48 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，68 ℃ 2 min，进行40个循环后68 ℃延伸5 min。反应结束后，取PCR扩增产物5.0 μl，于1%的琼脂糖凝胶电泳30 min，观察并保存图谱。PCR产物经胶纯化后，进行测序，获得的基因序列通过BLAST在线与GenBank中登录的不同谱系VP7、VP4进行同源性比对分析，并利用BLAST在线构建遗传进化树。全基因组测序取HN15D2病毒P5收获液进行二代全基因组测序（由上海伯杰医疗科技有限公司完成），并对测序结果利用BLAST软件在线进行同源性分析。2结果2.1病毒分离中细胞形态变化将临床样本滤液在MA104细胞上传代2次后，显微镜下观察，发现只有少数细胞出现CPE，至P3开始出现明显的CPE，培养至6 d时细胞间隙变疏松，部分细胞圆缩、裂解和脱落形成大片的空斑，培养上清液透光性减弱；未感染细胞生长良好，未见细胞发生病变。2.2病毒空斑纯化结果空斑试验结果显示病毒在MA104细胞上吸附4 h，37 ℃，5%CO2培养5~6 d均形成典型空斑，吸附时间越长，空斑越大、越明显，形态为圆形或类圆形，边缘整齐，清晰透明；且随着病毒稀释度的增加，空斑的数量逐渐减少。挑选第5次克隆病毒滴度最高的单克隆放大培养，获得高滴度单克隆毒株。2.3电镜检测结果超速离心纯化的HN15D2病毒在电镜下可见典型的RV颗粒，完整的病毒颗粒直径约75 nm，符合RV大小，见图1。2.4病毒蛋白检测SDS-PAGE显示，纯化的HN15D2病毒抗原成分复杂，其中在相对分子质量25 000~130 000之间可见多条较为清晰的染色条带，分析可能为RV的不同外壳蛋白和非结构蛋白，见图2A。免疫印迹法分析显示，纯化的病毒与抗RV蛋白抗体结合，在预期主要抗原RV外壳蛋白VP4、VP6及VP7相对分子质量（VP4/88 000、VP6/45 000、VP7/34 000）位置出现特异性反应条带，见图2B。2.5感染细胞的免疫荧光显微镜观察结果HN15D2感染的细胞膜内出现了强烈的绿色荧光信号，阴性对照细胞未见绿色荧光，表明细胞中感染并复制的是RV。2.6病毒RNA-PAGE检定结果显示，RNA-PAGE核酸带型呈4 ：2 ：3 ：2型，4个较大的双链RNA节段(基因片段1—4)；5个中等大小的节段(基因片段5—9)，其中7—9在一起形成1个特征性的三体；2个小片段(基因片段10、11)，是典型A群RV基因组带型，见图3。2.7VP7和VP4基因鉴定HN15D2的VP7和VP4基因RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，VP7扩增产物长度为1 062 bp，利用Seqman软件将VP4的2个片段扩增产物拼接后，长度符合预期目的基因大小2 359 bp，见图4。利用BLAST在线构建遗传进化树。VP7（segment 9）、VP4（segment 4）遗传进化树结果显示HN15D2为 Human/RVA/G1P[8]。2.8全基因组测序结果表明，HN15D2病毒的11个全长基因片段均与A组RV处于同一个大分支，属于人RV，与Wa/G1P[8]型RV处于同一个小分支。3讨论RV属于呼肠孤病毒科RV属，病毒基因组共有11个基因节段，分别编码6种结构蛋白（VP1—VP4，VP6、VP7）和6种非结构蛋白（NSP1—NSP6）[11]，其中内核蛋白有3个（VP1—VP3），内衣壳蛋白1个（VP6），外壳蛋白2个（VP4和VP7），根据VP6的抗原特异性可将RV分为（A一D和F一J）9个组，根据病毒外壳蛋白VP7和VP4特异性和多样性划分型别，依据VP7序列分为G血清型，依据VP4序列分为P基因型[12]。不同地区，流行株有所不同，如孟加拉2014—2019年主要流行株是G1P[8][13]；科特迪瓦2010—2013年主要流行株是G12P[8][14]；而泰国流行株则是G1P[8]、G3P[8][15]；越南2002—2003 年主要是 G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]等多种流行株[16]；而国内报道，湘潭县和融水县流行的P血清型优势毒株为P[8]（分别为67.0%和81.6%）[17]；济南和临沂P[8]占56.0%[18]；与2016—2020年云南省5岁以下儿童RV监测结果分析[19]、2018—2020年辽宁省锦州地区[20]、2019—2020年湖北武汉和襄阳市等地区调查结果[21-22]以及Luchs等[23]的研究结果一致。这也提示，P[8]型可能是近年全球范围的流行株[24]。考虑到中国目前依然存在的RV胃肠炎负担和RV血清型的转变，疫苗接种仍然是预防RV腹泻、降低死亡率的最经济、有效的方法[25]。分离出流行病毒株，研发与流行株相匹配的RV疫苗以获得更广泛的覆盖范围依旧势在必行。而RV 11个节段的双链RNA由3层衣壳蛋白包绕着，要对它进行体外分离极其困难，必须用胰酶激活。胰酶将VP4蛋白裂解为VP8*和VP5*，使病毒吸附于细胞表面；VP7蛋白与整合素α4β1、αxβ2和αvβ3结合，加速RV侵入细胞[26-28]；在体外，VP6蛋白自身可装配成球形颗粒，这种颗粒可以与免疫细胞结合，因此被用作一种载体以便携带VP7或/和VP4等多肽[3]。在HN15D2病毒分离过程中，活化病毒的胰酶终浓度为15 μg/ml，维持液中胰酶终浓度为0.5 μg/ml，既实现了培养过程中胰酶对VP4蛋白的激活作用，又保证了细胞不被胰酶损伤。样本在MA104细胞上培养和完成5次空斑纯化后，获得1株RV野毒株。纯化后的HN15D2病毒在电镜下呈现为典型的RV颗粒[10]。IFA结果从蛋白质水平证实HN15D2株是RV。SDS-PAGE和免疫印迹法检测时，二抗使用的抗RV G1兔血清属于全病毒抗体，因此结果显示被测病毒的抗原成分形成多条染色带，但在预期的VP4、VP6及VP7蛋白相对分子质量处出现了对应的染色条带，表明HN15D2病毒含有RV的VP4、VP6和VP7蛋白。其中VP6蛋白是组抗原，是同一组内不同毒株共同拥有的抗原，外壳蛋白VP7和VP4是RV主要的交叉中和抗原，是疫苗设计的主要靶点[20]。HN15D2基因鉴定中，RNA-PAGE结果显示，其电泳型为长型，11个条带呈现4 ：2：3：2排列，是A组RV独特的电泳图谱，全基因组测序11个基因片段与GenBank中登录的基因片段进行同源性比较，结果显示11个全长基因片段同源性均大于99%，与A组RV处于同一个大分支，属于人RV，与G1P[8]型RV处于同一个小分支，确定HN15D2型别为RV A/Human/G1P[8]。至今我国主要使用兰州公司研制的国产口服RV活疫苗LLR，血清型为G10P[15]型；在已上市的单价羔羊G10P[15] RV疫苗的基础上,通过基因重配技术，采用G2、G3和G4型人RV分别与LLR进行基因重配，获得3个分别含有G2、G3和G4型人RV的VP7基因的人-羊RV重配株，并用这3个毒株研制了三价RV重配疫苗LLR3[8]。LLR3抗原是G2、G3、G4血清型，缺乏G9、G1和P[8]型。本研究成功分离、纯化了1株人G1P[8]型野毒株HN15D2，并对其进行了鉴定和分析，为G1P[8]的后续研究提供了数据参考，可用于RV G1型重配病毒株的制备，也为今后更广谱、多价RV疫苗研究奠定了基础。作者寇桂英1 王云瑾1 程亚慧1 关文竹1 火文1 王名强1 包红1 陈汉泉1 周旭2 李雄雄11兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室，甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州 730046；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海 201403通信作者：周旭，Email：kathzhou@sina.com；李雄雄，Email：lixx985@163.com引用本文：寇桂英，王云瑾，程亚慧，等. 人G1P[8]型轮状病毒HN15D2毒株的分离纯化及鉴定[J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(2):76-81. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221212-00085