SH2D3A

摘要：目前针对COVID-19的mRNA疫苗的使用首次展示了mRNA疫苗在传染病领域的潜力。在这里，我们将总结有关改进型mRNA疫苗，即自身扩增mRNA（saRNA）疫苗的当前知识。这种方法可能通过扩增编码抗原的RNA来增强抗原表达。将回顾RNA设计、RNA递送以及RNA诱导的先天免疫反应。 1.RNA疫苗 传统疫苗主要基于灭活或减毒病原体，并且需要长时间的开发，这使得对新出现的病原体的快速反应变得困难。然而，基于核酸的疫苗可以克服这一缺点，RNA作为疫苗候选物的建议早在30多年前就已提出。在当前COVID-19大流行期间使用mRNA疫苗已经证明了它们在对抗新兴传染病方面的可行性和明显优势。 mRNA疫苗的生产在技术上简单、快速、成本效益高，且无需细胞和动物材料，易于适应。mRNA疫苗可以从线性化的质粒DNA模板或基于聚合酶链反应的模板通过体外转录使用噬菌体RNA聚合酶如T7、T3或SP6聚合酶来生产。在体外转录过程中或转录后酶促添加帽子结构。所有组件都是无动物材料的；然而，制造必须使用无RNase的材料进行。通过DNase处理去除残留的DNA，并通过基于珠子的方法、色谱法或沉淀进一步纯化所得的mRNA。这些无细胞生产步骤可以轻松标准化并扩大规模，以获得临床级材料。RNA疫苗候选物的生产速度快，有报道称流感疫苗候选物仅在8天内就已生产出来。 与基于DNA的疫苗相比，mRNA没有整合到宿主基因组的风险。mRNA是非感染性的，并且由于宿主细胞RNases的降解而在细胞中短暂存在。这些安全特性也已通过COVID-19 mRNA疫苗得到证明，它们主要只显示轻微的不良反应事件。与载体疫苗相比，没有预先存在的抗载体免疫，并且可以重复进行mRNA免疫。最后，COVID-19 mRNA疫苗已被证明是有效的，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应。 mRNA疫苗由编码免疫原性抗原的开放阅读框（ORF）、5'-和3'-非翻译区（UTR）、5'-帽子结构和3'-聚腺苷酸尾（poly-A）组成（图1）。像细胞mRNA一样，mRNA疫苗直接在位翻译成相应的抗原。将mRNA转移到抗原呈递细胞允许宿主细胞蛋白酶体处理表达的抗原，并随后装载到主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上。此外，在吞噬分泌的抗原并在内体内降解后，肽可以由MHC II类分子呈递。从而分别刺激CD8+和CD4+ T细胞。T细胞激活还需要共刺激分子和细胞因子分泌，这可能来自mRNA疫苗的先天免疫感应（见下文）。除了细胞免疫反应外，通过分泌抗原激活B细胞也可以刺激体液免疫反应。因此，mRNA疫苗接种诱导了抗原特异性的体液和细胞免疫反应。 图1. mRNA疫苗的结构元素 为了有效，mRNA疫苗需要进行几项改进，以增强mRNA的稳定性、调节RNA对先天免疫反应的调节，并使mRNA在体内有效递送。几个元素被优化：1.1.提高mRNA稳定性和翻译效率 病毒或真核基因的5'-和3'-UTR序列调节mRNA的半衰期和翻译，因此UTR序列被优化用于mRNA疫苗接种。 5'-UTR主要涉及RNA被核糖体识别和下游基因的翻译。通常添加Kozak序列以提高翻译效率。3'-UTR主要调节mRNA的稳定性。例如，高表达的β-珠蛋白基因的3'-UTR增加mRNA的稳定性。也可以通过细胞库筛选识别新的3'-UTR元素。 此外，3'-聚腺苷酸尾的长度调节mRNA的稳定性并增强翻译。聚腺苷酸尾通常由大约200个单元组成，但在树突细胞(DCs)中平均大小为120-150个核苷酸。此外，聚腺苷酸尾通过聚腺苷酸结合蛋白和翻译启动因子与帽子结构相互作用，形成环。发现高表达基因具有短的聚腺苷酸序列并有效地形成环。聚腺苷酸尾对真核基因表达的影响已在中进行了综述；然而，聚腺苷酸长度在RNA疫苗中的确切作用仍需要进一步研究。在mRNA疫苗中，已证明100个核苷酸的聚腺苷酸尾足以有效表达抗原并诱导免疫反应。 真核细胞区分自身和非自身mRNA的一种机制是帽子结构。真核帽子是一个7-甲基鸟苷(m7G)帽子，通过5'-5'-三磷酸桥(ppp)(m7GpppN结构)与mRNA相连。Cap-0结构只包含m7G帽子。对第一核糖体部分的2'-羟基进行进一步甲基化产生cap-1，对第二核糖体进行额外甲基化产生cap-2结构。病毒RNA通常包含cap-0结构，含有cap-0结构的RNA被先天免疫系统识别（见下文）；因此，cap-1/2结构对疫苗开发更优越。例如，具有抗反向帽子类似物(ARCAs; m27,3'-OGpppG)的体外转录mRNA已证明增强了翻译。可以通过2'-O-甲基转移酶酶促添加Cap-1结构，或通过CleanCap技术共转录。 此外，抗原序列可以通过密码子优化来增加抗原表达。为此，目的在于消除可能减慢翻译效率的稀有密码子，将同义突变引入基因中。密码子优化还影响GC含量和RNA二级结构，这两者都影响翻译效率，因此可以进行优化。 1.2.mRNA疫苗候选物的体内递送 对于体内应用，基于RNA的疫苗需要被细胞吸收。由于它们的大分子量、负电荷和快速被核酸酶降解，通过细胞膜的磷脂双层传递是具有挑战性的。不同的方法可以用于mRNA的体内递送。 最简单的递送方法是裸mRNA。它可以通过清道夫受体介导的内吞作用被细胞吸收；然而，只有少量的mRNA被释放到细胞质中。因此，大多数细胞类型的mRNA吸收效率不高，不成熟的树突细胞除外，它们作为正常生物学功能的一部分通过微囊泡吞噬作用吸收mRNA。通过裸mRNA的皮内或淋巴结内接种后，mRNA被淋巴结树突细胞吸收，抑制微囊泡吞噬作用会消除内部化。 然而，为了在细胞中获得高水平的mRNA并递送到大量细胞，需要改进的递送方法。通过电穿孔，例如使用基因枪，可以增加细胞内吸收。通过电穿孔将mRNA转移到树突细胞作为癌症疫苗已被证明在癌症患者中是安全的。已经开发了用于体内递送的mRNA配方，这些配方增加了mRNA的稳定性和细胞吸收。其中最广泛使用的是与脂质纳米颗粒(LNP)配方的mRNA。LNP是胆固醇、可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和辅助脂质的混合物，最初用于癌症免疫疗法。脂质的类型和它们之间的比例决定了配方的效率，mRNA疫苗的最佳比例与siRNA递送的不同。在当前COVID-19大流行中的使用表明，LNP配方的COVID-19疫苗在人类中具有高效性和安全性。在随机对照试验中，与安慰剂相比，COVID-19 mRNA疫苗减少了参与者确诊有症状的COVID-19的比例，并减轻了疾病的严重程度。疫苗和安慰剂治疗组之间在严重不良事件方面几乎没有或没有差异。 1.3.调节先天免疫反应以增强mRNA疫苗的蛋白表达 外来RNA在细胞内被先天免疫系统识别，这通常会导致抗原表达的抑制。然而，这种先天免疫反应也可以对疫苗产生佐剂效应。已经使用了几种策略来优化免疫原性。在体外转录过程中，T7 RNA聚合酶的RNA依赖性RNA聚合酶活性和RNA的重新结合允许在3'端自我引物化，以进行互补RNA合成，从而产生双链RNA(dsRNA)。dsRNA可以强烈激活先天免疫反应。在病毒感染期间，dsRNA可以被Toll样受体(TLRs)、视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体、蛋白激酶R(PKR)、寡腺苷酸合成酶(OAS)和NOD-, LRR-, 和pyrin结构域包含1(NLRP1)感知，这导致激活多种信号级联，导致炎症、细胞生长抑制或细胞死亡。可以通过RNA的纯化来去除dsRNA，例如，通过高性能液相色谱或基于纤维素的纯化。或者，可以通过优化核苷酸三磷酸比例或构建突变聚合酶进行RNA合成来减少体外转录过程中dsRNA的产生。此外，修饰核苷的掺入可以减少单链mRNA的免疫原性。例如，伪尿嘧啶和1-甲基伪尿嘧啶防止先天免疫系统的感知，并实现更高的抗原表达率。DNA模板也可能影响mRNA疫苗的先天感知，尽管大部分DNA应该已经通过纯化步骤或DNase处理被去除。外来的细胞质DNA被几种DNA传感器如cGAS和IFI16识别，它们主要通过适配蛋白STING发挥作用。然而，残留DNA对mRNA疫苗的影响尚未详细研究。体外转录的残留蛋白也可能刺激先天免疫反应，但这些蛋白通常通过纯化被去除。 1.4.mRNA疫苗的储存温度 当前的COVID-19 mRNA疫苗需要在-60或-80°C的温度下储存Comirnaty，或在-50°C的温度下储存Spikevax。这些低温储存要求影响mRNA疫苗的全球分布，特别是在低收入和中等收入国家。不正确的储存可能导致RNA的氧化和水解，并可能改变其功能。冻干可能是另一种储存方法，因为它可能在更高的温度下实现长期稳定性。 2.作为自身扩增疫苗候选物的阿尔法病毒复制子  抗原表达与传递给抗原呈递细胞的mRNA量相关；然而，mRNA也被RNases降解。因此，为了刺激强大的免疫反应，需要大量的mRNA和重复的免疫接种。当前的COVID-19疫苗每剂含有30-100微克mRNA。自身扩增(sa)RNA疫苗需要较少的初始RNA量，因为mRNA在细胞内扩增。例如，只有10纳克saRNA的剂量就能在小鼠中诱导SARS-CoV-2特异性免疫反应，5微克saRNA已成功用于临床试验。基于这一原理的疫苗利用单链正义或负义RNA病毒的基因组。负义病毒需要通过它们自己的RNA依赖性RNA聚合酶介导的新蛋白合成来启动转录，并需要技术上要求高的反向遗传学来构建。因此，大多数saRNA疫苗基于正义感的阿尔法病毒委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(SINV)或森德堡森林病毒(SFV)的基因组。正义感阿尔法病毒的基因组RNA被直接翻译。阿尔法病毒是包膜的、单链的、正义感RNA病毒，属于Togaviridae家族。阿尔法病毒基因组包含11-12 kb，具有50-甲基鸟苷帽子和30-聚腺苷酸尾(图2A)。它由两个ORF组成：第一个编码四个非结构蛋白(nsP1-nsP4)，第二个编码五个结构蛋白(衣壳和包膜蛋白E3-E2-6K-E1)。nsPs直接作为多蛋白从基因组RNA的第一个ORF翻译，并构建复制复合体(replicase)，它履行病毒复制的基本功能。nsP1是加帽酶，具有鸟嘌呤-7-甲基转移酶和鸟苷转移酶活性。nsP2是一种蛋白酶，需要处理非结构多蛋白。此外，nsP2具有RNA解旋酶和RNA三磷酸酶活性，并且它诱导宿主细胞蛋白表达的关闭。nsP3介导病毒-宿主和蛋白-蛋白相互作用，这对病毒复制至关重要，nsP4是病毒RNA依赖性RNA聚合酶。复制复合体首先合成全长的负义RNA，它作为合成全长基因组RNA或亚基因组RNA的模板(图2B)。与nsPs相反，结构蛋白是从亚基因组RNA翻译为多蛋白，(图2B)。 基因组包含几个对RNA复制、转录和包装成病毒颗粒重要的序列。这些元素被称为顺式作用元件或保守序列元件(CSEs)（图2A）。5'-UTR包含负链和正义链合成的核心启动子元件。在nsP1编码序列内的一个51个核苷酸长的序列元素对RNA扩增很重要。类似地，30-CSE序列在负链RNA合成中充当启动子，从而实现RNA扩增。因此，5'和3'-CSEs的存在确保了由阿尔法病毒复制酶特异性RNA扩增。对于亚基因组RNA合成的启动，需要亚基因组启动子(SGP)作为一个CSE（图2B）。这个序列通常位于nsP4编码序列中，包括转录起始位点上游的19个核苷酸和下游的2-5个核苷酸。此外，nsP1或nsP2编码序列中的包装信号确保基因组RNA被特异性地包装进病毒颗粒。 图2. 阿尔法病毒基因组和复制：(A) 阿尔法病毒基因组的图解。(B) nsPs 直接从基因组RNA翻译并促进病毒复制。负链中间体作为基因组和亚基因组RNA合成的模板。结构蛋白从后者翻译并形成传染性病毒。3.自身扩增RNA疫苗候选物 对于构建saRNA疫苗，阿尔法病毒的结构蛋白被抗原基因替换，该基因插入在SGP的控制之下（图3A,B）。与传统的mRNA疫苗相比，添加7-8 kb的阿尔法病毒复制酶基因显著增加了RNA的长度。此外，病毒CSEs被用作saRNA疫苗中的5'-和3'-UTR。因此，就像在阿尔法病毒复制中一样，复制酶可以扩增saRNA并转录亚基因组RNA。然后从亚基因组RNA翻译抗原。由于复制酶有效扩增编码抗原的RNA，与从mRNA获得的相比，将表达更高量的抗原。因此，可以使用较少的RNA实现类似的免疫反应。 图3. RNA疫苗方法：(A) 常规mRNA由50-帽子、50-UTR、抗原序列、30-UTR和聚(A)尾组成。抗原直接从mRNA在位翻译。(B) 自身扩增RNA还包含病毒50-和30-CSEs以及阿尔法病毒nsP1-nsP4基因。抗原被置于亚基因组启动子(SGP)的控制之下。复制酶(nsP1-nsP4)直接在位翻译并由于CSEs特异性扩增saRNA。(C) 跨扩增RNA疫苗由两个RNA组成。一个是编码阿尔法病毒复制酶的常规mRNA。第二个是编码抗原的跨复制子(TR) RNA，它由复制酶在转录后扩增。 多项使用saRNA疫苗候选物的临床前试验已被报道，主要目的是预防传染病。在这里，saRNA编码病毒糖蛋白作为中和抗体和细胞免疫反应的目标。基于阿尔法病毒的saRNA在动物模型中作为SARS-CoV-2感染的疫苗候选物成功进行了测试。最近，针对多种蝙蝠和人类冠状病毒刺突抗原表达的跨沙贝科病毒saRNA疫苗候选物的临床前数据显示，它能够保护动物免受致命异源感染。此外，还对针对流感病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒、VEEV和HIV-1的saRNA疫苗进行了临床前测试。这些疫苗候选物主要与LNPs配方，并诱导了高特异性的抗体和T细胞反应，显示出对小鼠挑战感染的保护。saRNA疫苗也被适应用于对抗细菌感染、寄生虫如弓形虫和癌症。 saRNA疫苗的临床前开发导致了针对SAR-CoV-2和流感的saRNA疫苗的首次临床试验。目前，在clinicaltrials.gov上列出了十项saRNA疫苗的临床试验，其中九项针对SARS-CoV-2（表1）。saRNA的应用不仅限于疫苗开发；还开发了使用saRNA的被动免疫策略。通过saRNA传递的寨卡病毒特异性单克隆抗体保护小鼠免受寨卡病毒感染。此外，正在开发使用mRNA或saRNA进行基因替代治疗的新基因疗法方法。 对于临床开发，仍然需要阐明RNA扩增和抗原表达持续多长时间。在给予荧光素酶saRNA后，表达在一个月后恢复到基线水平。此外，从理论上讲，如果saRNA表达具有出芽能力的病毒糖蛋白，它可能被包裹在囊泡中，导致saRNA转移到其他细胞。在saRNA疫苗的安全评估中应考虑这一点。 4.跨扩增（ta）RNA疫苗候选物  最近，通过建立taRNA疫苗的原理，进一步开发了saRNA疫苗[115]。对于taRNA疫苗，使用两种RNA。第一种是体外转录的mRNA，编码阿尔法病毒复制酶，可以直接在体内翻译。第二种RNA，即跨复制子（TR）RNA，编码相应的抗原，置于SGP的控制之下（图3C）。由于含有阿尔法病毒50'和30'-CSEs，TR-RNA通过阿尔法病毒复制酶进行跨扩增。最初，为VEEV建立了一个称为“splitzicon”的分裂复制子系统。借助荧光报告基因作为抗原，确定了自扩增taRNA所需的成分。最近，使用编码复制酶基因的非复制mRNA和表达流感病毒血凝素的TR-RNA构建了流感病毒taRNA疫苗候选物。与saRNA疫苗候选物相比，taRNA能够以较少的抗原RNA诱导保护性免疫反应。这可能是因为只扩增了短的TR-RNA而不是长的saRNA。重要的是，研究表明，与短RNA相比，阿尔法病毒复制酶对RNA的扩增更快、更有效。 此外，使用编码阿尔法病毒复制酶的密码子优化mRNA诱导了更强的免疫反应。基于另一种阿尔法病毒——基孔肯雅病毒（CHIKV）的taRNA疫苗候选物诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并能够保护小鼠免受CHIKV挑战感染。此外，还描述了一种新型双价taRNA疫苗候选物，涉及传递三种RNA：一种编码复制酶和两种编码抗原的TR-RNA。与saRNA疫苗相比，taRNA疫苗在安全性、可制造性和优化潜力方面有所改进。使用两种RNA最小化了RNA转移到更多宿主细胞的风险。taRNAs的RNA比saRNAs短，因此扩大生产更容易。然而，需要生产两种RNA，并且尚未证明有效的体内传递配方。 5.saRNA疫苗的生产和传递  saRNA和taRNA像mRNA一样，通过体外转录从DNA模板生产，并添加帽结构。除了已建立的帽试剂外，最近还开发了CleanCap试剂AU，用于阿尔法病毒saRNA的加帽，以允许共转录加帽具有天然Cap-1结构。saRNA疫苗可以作为体外转录的RNA传递，也可以包装成病毒颗粒（VP）。当包装在VPs中时，原则上可以被视为减毒病毒。它们应该在人类中显示有限的复制，但仍然能够诱导良好的免疫反应，而没有疾病迹象。已经描述了使用这种传递方法的疫苗候选物用于CHIKV。已经报道了CHIKV基因中的几种缺失，例如nsP3中的大缺失（∆5nsP3）或在衣壳中，一些这些减毒病毒已经进入了临床开发。然而，基于VP的传递有几个缺点；它们通常具有次优的安全概况，并且总是保留恢复为致病病毒的潜力。此外，载体是免疫原性的，这使得加强免疫变得困难。通过体外转录生产saRNA疫苗，像传统的mRNA疫苗一样，绕过了这些障碍。 在临床前模型中，taRNA的免疫接种主要通过皮内注射稀释在无RNase PBS中的RNA进行。同样，裸露的saRNA能够诱导针对HIV 1和寨卡病毒的特异性免疫反应。然而，RNA剂量很高，与mRNA疫苗相当。已经证明有多种配方可以改善mRNA的体内传递。由于存在阿尔法病毒复制酶基因，saRNA疫苗比mRNA长，需要新的传递配方。探索了多种saRNA配方方法。在将saRNA配方与脂质体、固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和乳液进行比较时，使用1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷聚合物纳米颗粒诱导了最强大的免疫反应。还根据先前为siRNA和mRNA优化的LNP配方开发了优化的saRNA LNPs。将saRNA与LNPs配方作为COVID-19疫苗候选物，将小鼠诱导强大免疫反应所需的剂量减少到仅为10 ng。LNP配方也可以类似地适应taRNA系统。从而，RNA稳定性和传递可能会得到改善，并且通过肌肉内应用以较低的RNA剂量刺激强大的免疫反应。 6.saRNA疫苗候选物及诱导先天免疫反应  作为非自身分子，RNA疫苗被细胞途径感知，并有效地激活先天免疫系统。如上文所述，可以采用几种方法来规避先天免疫激活；然而，对于sa/taRNA疫苗，核苷修饰在扩增步骤中会丢失，因此益处较小。在taRNA疫苗中，复制酶mRNA可以进行核苷修饰；然而，其效果仍有待评估。此外，RNA可以初步纯化以减少先天感应。 与mRNA疫苗相比，细胞内RNA扩增产生dsRNA，从而更强烈地激活先天免疫反应。RNA可以被多种模式识别受体识别，包括TLR3、TLR7、RIG-I样受体、黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）、PKR和OAS。由此产生的信号级联导致产生I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子。尽管先天反应具有辅助作用，可以促进特异性免疫反应，但它也可以诱导RNA降解，从而减少抗原表达。 已经为saRNA疫苗描述了减少IFN激活的策略。例如，表达来自避免免疫感应的病毒的蛋白质可以抑制先天反应。在单独的mRNA上编码牛痘病毒的E3、K3和B18R蛋白以及流感A病毒的非结构蛋白1，在体外和体内增加了抗原表达。同样，saRNA上顺式编码的抑制先天反应的蛋白能够增加刺激的免疫反应。阿尔法病毒通过关闭宿主细胞转录和翻译来对抗先天免疫反应。因此，IFN的产生也减少了。此外，阿尔法病毒感染和复制酶表达是细胞毒性的，并诱导宿主细胞凋亡。复制酶nsPs包含影响RNA扩增和宿主细胞反应的元素。nsP2诱导宿主细胞关闭导致细胞死亡。这对疫苗应用的确切影响还有待阐明。有趣的是，已经描述了CHIKV nsP2中的突变，这些突变减少了细胞病变效应。此外，在体外方法中，已经鉴定出VEEV nsPs中的突变，这些突变增强了原位亚基因组RNA的合成。在CHIKV适应A549细胞过程中，复制酶基因中发生了两个突变，增加了病毒复制。因此，sa/taRNA疫苗候选物的复制酶可以进一步优化，以提高抗原表达和免疫。 除了减少IFN激活的策略外，还探索了通过使用佐剂来调节saRNA疫苗接种后的免疫反应。例如，已经评估了与基于佐剂MF59的阳离子纳米乳液配方的saRNA或与TLR激动剂配方的saRNA。尽管诱导了强大的免疫反应，直接益处仍有待证明，且缺乏临床数据。此外，LNP配方具有佐剂效应。比较皮内电穿孔与LNP传递的研究表明，LNPs强烈诱导先天免疫反应，减少了小鼠皮肤中saRNA的抗原表达。 7.saRNA疫苗用于人类 saRNA疫苗的临床前开发导致了针对SAR-CoV-2和流感的saRNA疫苗的首次临床试验。已完成的基于saRNA的COVID-19疫苗候选物的临床试验数据看起来令人鼓舞，最近进行了第一阶段I试验。基于VEEV的saRNA疫苗（LNP-nCoVsaRNA），表达SARS-CoV-2的前融合稳定化刺突糖蛋白，耐受性良好，没有与疫苗接种相关的严重不良事件。尽管血清转化率没有达到100%，但血清阳性参与者中特异性抗体浓度与来自康复期血清的值相似。然而，人类对SARS-CoV-2的反应明显低于小动物模型预测的反应。另一种基于VEEV的saRNA疫苗候选物（ARTC-021），表达SARS-CoV-2刺突糖蛋白，也被发现是安全的，并且有100%的血清转化率。抗刺突IgG滴度等于COVID-19康复期血浆中的那些。目前正在进行一项更大的临床试验，使用ARTC-021作为加强疫苗（NCT05012943）。这些例子表明，saRNA技术正在进入临床开发，但需要进一步改进以产生有效的疫苗。 8.结论 在COVID-19大流行期间使用mRNA疫苗已经证明了它们在预防传染病方面的可行性。saRNA疫苗候选物将进一步完善这一策略，它们有望以更少的RNA实现有效性。然而，仍然需要进一步的研究，特别是提高RNA传递的效率和研究先天感应的作用。目前还不确定使用更少的RNA（在体内扩增）在临床上是否比标准mRNA疫苗有利。在小鼠模型中进行了比较saRNA与mRNA优势的临床前研究，这些模型不能适当地重现人类的先天免疫反应。saRNA疫苗的第一阶段临床试验刚刚完成，mRNA与saRNA的直接比较仍有待进行。像RNA疫苗一样，saRNA疫苗可能不仅限于传染病，还可能用于基因治疗、抗癌或输送基于蛋白质的治疗剂。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：基于alpha病毒（alphaviruses）、黄病毒（flaviviruses）、慢病毒（lentiviruses）等单链RNA病毒的自复制特性，研究者们将其结构基因替换为其他抗原基因或目标蛋白基因，由此开发了自复制RNA（saRNA）平台技术。 委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）等alpha病毒是saRNA序列设计的常用骨架，首款上市的saRNA疫苗ARCT154即使用了VEEV自复制骨架序列。下文菌菌将结合文献报道分析VEEV自复制骨架序列的多样性，包括UTR序列和非结构蛋白（即RNA复制酶）编码序列，以期为自复制RNA(saRNA)的序列设计提供参考。 图1：VEEV自复制骨架序列元件（UTR, nsp 1-4） 01  VEEV来源的5' UTR序列 VEEV来源的5’UTR序列由44个核苷酸组成（NCBI Reference Sequence: NC_075022.1）。与野生型毒株和其他毒株相比，VEEV TC-83的5’ UTR存在一个点突变G3A，即第3位的G突变为A。那么，VEEV 5’ UTR的G3A突变是否影响病毒基因复制或蛋白编码？ 据文献报道，G3A突变严重影响VEEV 5'UTR的二级结构，但对编码序列的翻译活性影响不大。在兔网织细胞裂解物（RRL）体外翻译系统中，G3A突变表现出更高的mRNA翻译效率；在仓鼠肾成纤维细胞（BHK-21）细胞中，G3A突变对蛋白表达水平的几乎无影响。其他方面，VEEV G3A突变增加了病毒基因组的复制，下调了亚基因组RNA的转录，从而影响了基因组和亚基因组RNA合成的比例。G3A突变是VEEV低致病性表型的一种关键影响因素。 据菌菌调研，天然的VEEV 5’ UTR序列和G3A突变体在自复制RNA的开发中均有应用。 图2：5’ UTR中的G3A突变对蛋白表达的影响 02  VEEV来源的nsp序列 VEEV的非结构蛋白编码区域是其基因组中的第一个编码序列（CDS），包括4个非结构蛋白（nsp1-4），其序列特征和多样性如下所示： 2.1 VEEV非结构蛋白1（nsp1） 根据NCBI公开序列，VEEV的nsp1由535个氨基酸组成。Nsp1具有甲基转移酶和鸟苷酸化酶功能，在病毒复制过程中催化基因组RNA和亚基因组RNA的加帽反应，这一反应是阿尔法病毒属的专有特质。VEEV的nsp1基因含有一个 51 nt 的保守序列元件（CSE），它对病毒复制和感染性至关重要。 关于nsp1突变体的研究主要在nsp1/nsp2切割位点。一项小鼠试验表明，具有nsP1 A533I突变的RNA复制子的抗原表达水平略低于野生型A533，且免疫原性也更低。 图3：VEEV nsp1突变对复制子RNA翻译效率和免疫原性的影响 2.2 VEEV非结构蛋白2（nsp2） VEEV的非结构蛋白2（nsP2）由794个氨基酸组成，是一种加工病毒非结构蛋白的半胱氨酸蛋白酶（nsP2pro）。nsp2同时具有多种酶活性，在形成α病毒非结构蛋白复制子复合体中扮演关键角色。 下表列举了常见的nsp2突变及其对应的病毒表型，包括VEEV Q739L、VEEV CD、VEEV P713G/P713S等。其中Q739L突变体导致复制子早期（6 h）复制效率较低，长期（18-24 h）复制效率与野生型一致。 值得注意的是，Arcturus Therapeutics在ARCT154（首款上市的saRNA疫苗）的序列设计策略中，其自复制RNA骨架序列中使用了nsp2突变体Q739L。 2.3 VEEV非结构蛋白3（nsp3） nsp3在甲病毒RNA的复制中起着至关重要的作用，包含557个氨基酸。一项研究以“增强亚基因组蛋白表达”为导向，筛选到多个VEEV突变体，包含nsP3突变。其中K1434E能够增强复制子RNA水平和亚基因组mCherry RNA水平，而S1583G、E1595D、V1645M会抵消K1434E的促进功能，但可以提高翻译的持久性。 2.4 VEEV非结构蛋白4（nsp4） nsp4含607个氨基酸，是复制子结构中最为关键的病毒RNA依赖RNA性聚合酶（RdRp），能够增加自复制RNA的拷贝数。理论上，RdRp与RNA 的5’ 和3’ 非编码区结合就足以进行自我扩增。未来有希望基于深度学习算法来设计更短的RdRps，突破saRNA过长带来的工艺难题。 序列进化来看，nsP4聚合酶是甲病毒中最为高度保守的蛋白。目前关于nsp4突变体对基因组RNA和亚基因组RNA影响的研究较少，主要集中在耐药突变方面。 03  VEEV毒株完整基因组序列 此外，NCBI公开了多种VEEV毒株的完整基因组序列，详见下表： 04  总结 自复制RNA病毒包括alpha病毒（alphaviruses）、黄病毒（flaviviruses）、慢病毒（lentiviruses）等，基于以上复制子框架构建的自复制RNA(saRNA)具有低剂量高表达的优势，逐渐被开发用于表达病原体抗原、癌症抗原、或其他异源蛋白。 本篇文章菌菌以saRNA序列设计为主题，以最常用的复制子框架VEEV为例，阐述了非编码区和非结构蛋白编码区不同突变的影响。非编码序列中，VEEV 5’ UTR的G3A突变影响RNA的二级结构，但对蛋白表达的影响并不显著。野生型VEEV 5’ UTR序列和G3A突变体在自复制RNA的开发中均有应用。 非结构蛋白编码序列方面，多项研究报道了nsp1-4突变对基因组RNA和亚基因组RNA的影响，包括RNA复制、亚基因组蛋白翻译效率、免疫原性等，有望用于开发更安全有效的saRNA疫苗/药物。其中nsp2和nsp3突变序列应用在了首款上市的saRNA疫苗ARCT154的设计中。 参考文献  [1] Kulasegaran-Shylini R, Atasheva S, Gorenstein DG, Frolov I. Structural and functional elements of the promoter encoded by the 5' untranslated region of the Venezuelan equine encephalitis virus genome. J Virol. 2009 Sep;83(17):8327-39. doi: 10.1128/JVI.00586-09. [2] Kulasegaran-Shylini R, Thiviyanathan V, Gorenstein DG, Frolov I. The 5'UTR-specific mutation in VEEV TC-83 genome has a strong effect on RNA replication and subgenomic RNA synthesis, but not on translation of the encoded proteins. Virology. 2009 Apr 25;387(1):211-21. doi: 10.1016/j.virol.2009.02.027. [3] Li Y, Teague B, Zhang Y, Su Z, Porter E, Dobosh B, Wagner T, Irvine DJ, Weiss R. In vitro evolution of enhanced RNA replicons for immunotherapy. Sci Rep. 2019 May 6;9(1):6932. doi: 10.1038/s41598-019-43422-0. [4] Bhalla N, Sun C, Metthew Lam LK, Gardner CL, Ryman KD, Klimstra WB. Host translation shutoff mediated by non-structural protein 2 is a critical factor in the antiviral state resistance of Venezuelan equine encephalitis virus. Virology. 2016 Sep;496:147-165. doi: 10.1016/j.virol.2016.06.005. [5] Lello LS, Bartholomeeusen K, Wang S, Coppens S, Fragkoudis R, Alphey L, Ariën KK, Merits A, Utt A. nsP4 Is a Major Determinant of Alphavirus Replicase Activity and Template Selectivity. J Virol. 2021 Sep 27;95(20):e0035521. doi: 10.1128/JVI.00355-21. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：疫苗用于控制动物的传染病。与其他类型的疫苗接种（如活疫苗、减毒或灭活疫苗）相比，基于mRNA的疫苗具有显著优势。由于只使用病原体遗传物质的一小部分，且mRNA疫苗的剂量率低，病原体逆转自身的可能性最小。为了传递mRNA疫苗，需要一种载体或运输工具来保护mRNA疫苗免受宿主细胞RNases的侵害。临床试验表明，mRNA疫苗在对抗影响动物的各种传染病（包括病毒性和寄生虫性）方面有效，能够诱导细胞介导的免疫反应和体液免疫反应，这些疾病包括狂犬病、口蹄疫、弓形虫病、寨卡病毒、利什曼病和COVID-19。当前的综述旨在强调mRNA疫苗在动物病毒性和寄生虫性疾病中的应用。 1.引言 疫苗用于控制和预防动物传染病的出现。由于疫苗的广泛使用，一些疾病如天花和小反刍兽疫已从世界中完全根除，许多其他疾病的发病率在全球范围内大幅降低。通过疫苗接种，天花和小反刍兽疫等疾病已从世界中根除，这是疫苗接种成功的故事。传统疫苗开发方法为动物的许多传染病和人畜共患病提供了持久的保护，此类疫苗的例子包括灭活疫苗、活减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。然而，通过这些传统方法未能预防或充分控制的疾病需要新的方法来开发疫苗，特别是针对那些更能欺骗和逃避宿主适应性免疫反应的病原体。对于病毒疫苗的开发，主要障碍是快速开发和大规模制剂及其部署，而不是传统方法的有效性。同样，传统疫苗开发方法对于非传染病（如癌症）也不适用。由于这个原因，迫切需要开发更有效和广泛适用的疫苗平台。 传统疫苗方法的有希望和有效的替代方法是使用mRNA疫苗。目前，许多技术和研究发明使mRNA疫苗成为预防和控制动物工业中许多病毒和寄生虫疾病的有效工具。使用mRNA疫苗有几个好处，如（i）安全性；感染逆转和插入突变的潜在风险最小，是一种非整合性和非感染性方法。抗原修饰减少了mRNA的免疫原性并增强了其安全性。（ii）有效性；mRNA疫苗的稳定性和翻译可以被修改，从而通过将mRNA分子制剂到载体分子中，可以实现mRNA在宿主细胞质中的快速吸收和表达。由于其最小的遗传物质，mRNA可以避免抗载体免疫，并且可以重复接种。（iii）生产；mRNA疫苗可以快速大规模生产。 细胞质含有RNases（酶），这些酶迅速降解裸露的mRNA。因此，也开发并使用了一种转染试剂用于mRNA疫苗，它保护疫苗遗传物质免受RNases的侵害，并促进mRNA被细胞吸收。一旦进入宿主体内，当mRNA到达细胞质时，核糖体（细胞翻译机制）开始从mRNA产生蛋白质，翻译后，这些新合成的蛋白质经历翻译后修饰，从而产生完全功能性和正确折叠的蛋白质（图1，使用Biorender创建）。这种mRNA药理机制使其对需要跨膜或细胞质蛋白的疫苗和蛋白质替代疗法有利。必须将这些蛋白质正确地输送到其功能位点。完成工作后，这些mRNA被宿主细胞的正常生理机制降解。 图 1. mRNA疫苗（纳米颗粒）在宿主细胞中的呈现和抗原翻译 通过动物中自我复制的纳米颗粒RNA疫苗的免疫接种，可以引起对各种传染病的强烈免疫反应（T细胞和B细胞）。在体内，mRNA的载体包括含有可离子化的氨基脂质的纳米颗粒，这些被认为是此目的的最佳选择。含脂质mRNA疫苗的最佳解剖部位是皮内途径，因为皮肤中存在大量异质免疫细胞。这种含脂质mRNA纳米颗粒疫苗的特性优于其他形式的疫苗。 2.mRNA疫苗引起的免疫反应 在过去疫苗开发过程中，各种形式（灭活或活减毒）疫苗的作用机制是未知的。然而，通过活减毒疫苗在动物、细胞系或不利生长条件下的开发，以及灭活或灭活疫苗在控制动物（牛瘟、猪瘟和马传染性贫血）和人类（麻疹、腮腺炎、天花、脊髓灰质炎和风疹）的传染病方面取得了成功。分子生物学理论和技术的进步导致了对疫苗机制的广泛了解，例如灭活疫苗产生抗原特异性抗体，而活减毒疫苗引起宿主的体液免疫反应，这对根除细胞内病原体是必要的。RNA基非病毒疫苗的免疫接种刺激了滤泡辅助T细胞和生发中心B细胞的产生（图2，使用Biorender创建）。这些疫苗模仿活微生物的疫苗接种或感染。 图2. mRNA疫苗接种引发的先天和适应性免疫反应。(1) 当mRNA疫苗被接种时，RNA感受器识别疫苗颗粒并激活先天免疫反应，导致干扰素和细胞因子的产生。(2) 这些干扰素和细胞因子促进树突状细胞的成熟，这些细胞迁移到淋巴结以呈现感兴趣的抗原。(3) 在淋巴结中，由树突状细胞启动T细胞和B细胞。树突状细胞激活T细胞。辅助性T细胞促进产生抗体的浆细胞的成熟。辅助性T细胞和细胞因子共同促进B细胞分化为记忆B细胞。(4) 细胞免疫和体液免疫被激活，免疫细胞向感染的组织或细胞移动。(5) 被病毒感染的细胞受到抗原特异性T细胞的攻击。(6) 通过抗体中和病毒。 mRNA疫苗引起的免疫反应机制仍需进一步阐述。mRNA疫苗被细胞受体感知和激活细胞受体的过程尚不清楚。细胞内有两种受体参与识别和诱导免疫反应，即内体性Toll样受体（TLRs）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）。TLRs进一步细分为TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9，它们存在于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中。TLR-3参与识别包括由单链RNA（ssRNA）产生的45个以上碱基对的双链RNA（dsRNA），而富含鸟苷、尿苷或多尿苷的RNA由TLR-7和TLR-8激活。TLR-8只能与ssRNA结合，而TLR-7可以与ssRNA和dsRNA结合，并增强抗原呈递、细胞因子分泌和B细胞免疫反应刺激。内体TLR-9受体参与抗原呈递细胞，并作用于激发宿主的免疫反应。 RIG-I样受体作为模式识别受体，RLR家族的其他成员包括黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和遗传学和生理学实验室2（LGP2）。RIG-1参与识别ssRNA和dsRNA，最终导致干扰素的产生，而MDA5存在于细胞质中，参与识别病毒RNA复制期间产生的长dsRNA。mRNA疫苗刺激了先天免疫。 mRNA疫苗接种激活了先天免疫系统和适应性免疫系统。mRNA疫苗激活宿主适应性免疫反应，增强了细胞因子和干扰素的产生，这些因子参与了免疫防御细胞的招募，即自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞。先天免疫系统损害了抗原的表达，从而降低了疫苗的有效性。有一份报告指出，当IFN拮抗剂与mRNA疫苗一起使用时，观察到疫苗的相当大的效果。因此，为了避免先天免疫系统（例如mRNA的修饰）的过度反应，必须共同给予拮抗剂，以维持疫苗的有效性。 3.动物传染病的mRNA疫苗开发 疫苗被认为是控制和预防人类和动物传染病最成功的预防性和治疗性工具（见表1和表2）。疫苗可以挽救成千上万的动物和人的生命，并节省资金。由于疫苗接种，麻疹、脊髓灰质炎和小天花等严重传染病已被根除或接近根除，许多其他疾病的发病率和死亡率也大幅降低。 3.1.口蹄疫 口蹄疫是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的有蹄动物的传染性病毒疾病，在发展中国家和不发达国家尤为常见。根据抗原和遗传属性，FMDV有O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七个血清型。尽管口蹄疫的死亡率很低，但FMD的爆发会导致严重的经济损失，并对活体动物及其产品的国内外贸易产生负面影响。病毒的传播方式是通过气溶胶、直接接触感染动物、通过污染物、人类和其他非敏感动物。无口蹄疫国家通过严格的检疫和限制从口蹄疫流行国家进口敏感动物及其产品来维持这一状态。在控制家畜（牛、水牛、绵羊和山羊）中的FMD方面，最有效的方法是限制感染动物及其产品从其所在地向健康易感动物的流动，屠宰暴露和感染的动物，消毒受污染的地方和设备，以及接种疫苗。 表1：针对传染病的mRNA疫苗 表2：mRNA疫苗对动物和人类传染病的免疫反应 目前用于控制和预防FMD的传统疫苗通过激活先天免疫反应和适应性免疫反应来诱导保护。这些疫苗不提供长期保护，需要多次加强剂量来维持群体中足够的免疫水平。这些传统疫苗也有一些缺点，如基因毒性潜力、较低的细胞免疫、较短的保护期限，以及在接种和感染动物之间难以进行血清学区分。为了克服所有这些问题并在过去十年中开发更安全的下一代FMD疫苗，进行了许多尝试。2010年，进行了一项研究，阐述了在小鼠中由mRNA FMDV（基因工程）诱导的免疫，并证明它可以在实验室动物中引起强烈的免疫反应。这为开发基于mRNA的疫苗提供了可能性，以实现对动物自然感染的长期保护。口蹄疫病毒对干扰素（IFN）敏感。因此，Rodriguez-Pulido及其同事进行了一项研究，表明FMDV的dsRNA可以在IBRS-2（猪肾细胞系）和新生小鼠中引起免疫反应，并且体外转录RNA对预防FMD的有效性。结果表明，3'非编码区的dsRNA在SK-6细胞系中诱导了强大的IFN alpha/beta激活。进一步，这种dsRNA在新生小鼠体内也证实了自然免疫反应的诱导。这认识到dsRNA具有开发针对动物FMDV疫苗的潜力。同一组研究了对应于内部核糖体进入位点的非感染性RNA作为FMD疫苗设计的佐剂的潜力，当它与常规疫苗一起增强了小鼠对FMDV挑战的免疫反应时。此外，Rodriguez-Pulido及其同事分析了合成非感染性RNA在猪中的免疫调节效应。这项研究证明了这些RNA分子与常规疫苗共同给予可以增强针对FMDV的特异性抗体滴度。此外，FDMV能够与宿主细胞发生突变和重组。病毒与宿主细胞的重组可能比单独的非活性病毒引起更强的免疫反应。宿主细胞中存在的酶（RNAses）在它们进入细胞后如果不适当修饰和/或通过封装（加帽）保护，会迅速降解裸露的RNA。同样，在反向遗传过程中，体外合成的RNA也会被酶降解。Semkum及其同事建立了一个DNA载体pKLS3（FMDV的小型基因组），它最小化了RNAses对合成mRNA的降解。它可以用来驱动FMDV感兴趣的基因的转录，因为它包含转录和翻译病毒所需的最小顺式作用组分。用于生产疫苗的mRNA是在体外转录的，编码特定的抗原。pKLS3有潜力用作转录系统，用于表达mRNA，可能在生产基于mRNA的疫苗中有用。对于FMD疫苗（基于mRNA）的开发，现有信息提供了一个有希望的途径。 3.2.狂犬病 狂犬病是由狂犬病病毒引起的病毒性疾病，可以感染所有温血动物，包括人类。它是一种人畜共患病，每年大约有60,000人因狂犬病病毒感染而死亡。超过95%的狂犬病病例是由狂犬动物的咬伤引起的，特别是狂犬狗的咬伤。这是一种严重的病毒性疾病，以急性脑炎为特征，通过狂犬动物的咬伤或通过与狂犬动物的唾液接触粘膜从狂犬动物传播给人类和其他易感动物。病毒通过表面糖蛋白（狂犬病病毒糖蛋白）附着在其细胞受体上，并沿着周围神经传播到大脑。为了预防狂犬病，早期疫苗是在哺乳动物的神经组织中生产的，但后来被胚胎蛋和组织培养中开发的疫苗所取代。全世界都需要一种负担得起且有效的狂犬病疫苗，因为目前可用的疫苗由于某些限制（如生产能力、储存要求、成本和接种时间表）无法满足需求。以前为了开发狂犬病疫苗，使用了多种不同的病毒疫苗生产方法。CureVac®应用的新概念是使用mRNA编码主要的狂犬病病毒抗原狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）。在研究mRNA疫苗对狂犬病的免疫反应的第一阶段临床试验中，选择了疫苗候选物（CV7201）。CV7201证明可以诱导保护性免疫反应，这受到疫苗剂量和接种途径的影响。阳离子蛋白鱼精蛋白被用作CV7201中编码狂犬病病毒糖蛋白抗原的热稳定mRNA的稳定剂。与传统的商业灭活狂犬病病毒疫苗相比，mRNA疫苗诱导了更好的免疫反应，通过促进合成病毒中和抗体，这些抗体对保护是必要的。在第一阶段试验中，发现需要高剂量的狂犬病mRNA疫苗才能提供显著的抗体滴度以保护。为了降低狂犬病疫苗（CV7201）的剂量率，采用了一种新方法，即使用脂质纳米颗粒（LNPs）包裹mRNA抗原。这项临床试验表明，mRNA疫苗是安全的，其反应原性概况可能是可以接受的，这种技术形式比传统疫苗提供了许多优势。同样，在接种编码RABV-G的mRNA的家猪和老鼠中确认了中和抗体的产生。RABV-G mRNA疫苗诱导了CD4+和CD8+的产生，并提供了对脑内致死性感染挑战的保护。这项研究表明，编码RABV-G的基于mRNA的疫苗在小型和大型动物中是可行的，并且可能是控制动物病原体疾病的有希望的方法。 3.3.利什曼病 利什曼病是由雌性白蛉沙蝇叮咬传播的一种寄生虫性人畜共患病。引起该病的病原体是利什曼属（L.）的原生动物寄生虫。该病有不同形式，最常见的包括由不同种类引起的内脏利什曼病、皮肤利什曼病和粘膜皮肤利什曼病，如L. donovani、L. chagasi、L. infantum、L. braziziliensis、L. maxicana和/或L. archibaldi。狗是宿主，而人类是偶然宿主。第一代和第二代疫苗都是为了预防人类疾病而开发的，但缺乏完全保护。为了更好地提供保护，正在考虑基于mRNA的疫苗。Savar等人设计了两种组合的融合蛋白（LmSTI1-PpSP15和PpSP15-LmSTI1）用于疫苗开发。融合蛋白包括L. major的应激诱导蛋白1（LmSTI1）和来自白蛉沙蝇（PpSP15）的SP15。这种组合还基于alphavirus-derived self-amplifying mRNA以病毒复制子粒子的形式在in silico研究中设计。in silico分析显示了抗原组合的有效性。后来使用基于自复制mRNA（SAM）的疫苗在细胞系Baby Hamster Kidney成纤维细胞（BHK-21细胞）中表达了融合蛋白。结果表明，使用SAM载体的PpSP15-LmSTI1表达水平很高。同样，研究了其他融合重组抗原（LEISH-F2和LEISHF3+）对L. donovani的影响，采用异源主要增强方案进行免疫。C57BL/6和TLR7−/−小鼠接种了表达LEISH-F2抗原的RNA基疫苗，随后接种了亚单位疫苗。结果表明，单独使用RNA基疫苗的免疫（同源免疫）没有提供显著的保护。然而，当小鼠使用异源方案的增强剂免疫时，产生了强大的抗原特异性T细胞反应（CD4和CD8），并对细胞内寄生虫提供了显著的保护。需要进一步研究以识别新抗原并开发有效的针对利什曼病的基于mRNA的疫苗。 3.4.弓形虫病 弓形虫是一种专性细胞内原生动物，负责所有温血动物的弓形虫病。它的复杂生命周期包括在确定宿主（猫科动物）中的性繁殖和在中间宿主（猫和其他温血动物）中的无性繁殖。全球大约有一半的人类被弓形虫感染，但这种感染的流行率在不同国家之间变化，从10%到80%不等。人类可以通过食用未煮熟的肉类中的组织囊肿或污染食物中的卵囊偶然获得这种感染。主要为了保护免受弓形虫感染，免疫依赖于由CD4+和CD8+介导的细胞免疫反应，并最终刺激细胞因子（伽马干扰素）的分泌。除此之外，体液免疫也在限制弓形虫病方面发挥重要作用，通过抗弓形虫抗体抵抗寄生虫的入侵，通过调理作用促进寄生虫的吞噬作用，并最终激活经典补体途径。Chahal等人最近开发了一种完全合成的树突状纳米颗粒疫苗，其中包含封装的mRNA复制子编码抗原，这些抗原能够引发免疫反应并提供对弓形虫感染的保护。这种mRNA复制子同时编码六种抗原，如密集颗粒蛋白6（GRA6）、棘蛋白18（ROP18）、棘蛋白2A（ROP2A）、表面抗原1（SAG1）、顶端膜抗原1（AMA1）和表面抗原2A（SAG2A）。这是一种完全保护性的单剂量mRNA疫苗（mRNA复制子纳米颗粒），用于预防和控制弓形虫。尽管如此，它可能需要时间才能商业化。Luo等人分析了小鼠中针对弓形虫挑战的自复制RNA疫苗的活性，该疫苗编码核苷酸三磷酸水解酶-II（NTPase-II）。进一步，他们评估了疫苗与脂质纳米颗粒的联合效应。小鼠的免疫接种结果产生了强大的免疫反应。细胞和体液免疫反应都被激发，产生了高特异性抗弓形虫抗体和IFN-γ。与对照组相比，接种疫苗的小鼠大脑囊肿减少了62.1%，并显著延长了动物的存活时间。现有信息为生产预防弓形虫病的mRNA疫苗提供了一个有希望的途径。 3.5.寨卡病毒病 寨卡病毒最初是在1947年从乌干达寨卡森林的一只哨兵恒河猴的血液中分离出来的。该病毒通过蚊子（埃及伊蚊）的叮咬传播。它具有人畜共患的重要性，是神经和胎儿异常（如脑钙化、小头症、听力和视力丧失）的罪魁祸首。最初，它与轻微的发热症状相关。然而，它传播到美洲和太平洋岛屿，导致严重的后果，如吉兰-巴雷综合征、先天性寨卡综合征和自然流产。最近，它已成为一种流行病，因此，需要开发一种有效且安全的疫苗。已表明有多种类型的疫苗可以保护非人灵长类动物和小鼠，如灭活疫苗、亚单位疫苗和/或基于腺病毒的疫苗。然而，开发一种针对寨卡病毒的有效且安全疫苗仍然是必要的。Essink及其同事评估了两种先前开发的基于mRNA的疫苗mRNA-1325和mRNA-1893在人类中的安全性和免疫原性。mRNA-1325脂质纳米颗粒包裹是第一代疫苗，编码来自2007年密克罗尼西亚寨卡病毒分离株的前膜（prM）和包膜E结构蛋白，即prME。而mRNA-1893是第二代疫苗，编码来自寨卡病毒（RIO-U1）分离株的相同蛋白prME。RIO-U1寨卡病毒是从巴西感染寨卡病毒的孕妇尿液中分离出来的。mRNA-1325和mRNA-1893疫苗的prME中分别有一个和五个氨基酸残基的差异。在小鼠的临床前研究中，编码prME的修饰mRNA疫苗显示出有希望的结果，并保护小鼠免受寨卡病毒挑战。在成年人类的第一阶段临床试验中，研究了两种mRNA疫苗的不同剂量反应。两种疫苗都被所有健康志愿者很好地耐受，并且没有向疫苗传达严重的不良反应。由于只有一个氨基酸残基，mRNA-1325的寨卡病毒特异性中和抗体（nAb）反应较差。另一方面，由于五个氨基酸残基，mRNA-1893疫苗以较小的剂量引起了强大的nAb反应，与mRNA-1325相比。所获得的结果是有希望的，Essink及其同事向第二阶段临床试验迈进。然而，为了检查疫苗的有效性，将需要第三阶段的临床试验。 3.6.冠状病毒病 许多动物种类，包括人类，都可能被冠状病毒感染。对兽医重要的冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒、牛冠状病毒和禽传染性支气管炎病毒。目前，冠状病毒被认为是一种新兴病原体，负责动物和人类的急性和慢性感染，包括肠道、呼吸和中枢神经系统。2003年，由于严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）在人类中爆发，震惊了世界。2012年至2016年，在阿拉伯半岛，由于名为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的冠状病毒，人类中报告了几次爆发。该病毒在中东和非洲的骆驼中流行。近年来，全球大流行感染了呼吸系统的冠状病毒病2019（COVID-19），由一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的传染性病原体引起，它起源于蝙蝠。世界卫生组织宣布COVID-19是重大的公共卫生紧急情况。对于鸡来说，为了预防由传染性支气管炎病毒引起的传染性支气管炎病，有许可的疫苗可用。然而，对于预防其他动物的冠状病毒病，开发一种安全有效的疫苗是一个未满足的需求。对于COVID-19疫苗的开发，采用了几种方法，如灭活病毒、活减毒、重组蛋白、腺病毒载体、流感病毒载体、DNA和mRNA疫苗。mRNA疫苗方法是COVID-19预防的一场变革。一种编码刺突蛋白的自复制mRNA疫苗在小鼠中提供了针对SARS-CoV-2的保护。编码刺突蛋白三聚体受体结合域的RNA疫苗针对几种SARS-CoV-2变体在恒河猴和小鼠中显示出显著的保护。BioNTech和辉瑞合作开发了一种基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗。BNT162b2编码病毒刺突糖蛋白的全长。这是美国FDA批准的疫苗，在16岁及以上的人中两剂间隔21天的效力为95%，在随后的六个月，其效力变为91.3%。Moderna还开发了一种基于mRNA的疫苗（mRNA-1273），编码病毒融合刺突蛋白的全长。在18岁及以上的个体中，两剂间隔28天的第三阶段临床试验的效力为94.1%。 4.mRNA疫苗的类型 中心法则表明，mRNA在翻译（DNA编码蛋白）和由细胞质中的核糖体合成蛋白之间处于中心位置。目前，有两种主要类型的mRNA用于mRNA疫苗的开发，即自复制mRNA或复制体mRNA疫苗和非复制mRNA或非复制mRNA。在自复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA编码抗原以及病毒RNA的复制机制保持不变，这使得mRNA可以在细胞内自我复制，从而实现丰富的蛋白表达。而在非复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA仅编码感兴趣的基因，其中包含5'和3'的非翻译区。 4.1.自复制mRNA疫苗 在自复制mRNA疫苗中，感兴趣的抗原取代了阿尔法病毒基因组的结构蛋白，但RNA的复制机制保持不变。通过使用自复制mRNA，可以通过最小剂量的抗原编码RNA翻译，向宿主细胞传递大量的抗原。当自复制mRNA进入细胞质时，它与宿主核糖体结合产生非结构蛋白1（nsP1）、nsP2、nsP3和nsP4。它们是依赖核糖核苷酸的RNA聚合酶的组成部分。病毒蛋白酶（nsP2）进一步将这些蛋白质调节成单个蛋白质。这些蛋白质发挥许多重要作用，例如nsP1在建立RNA复制复合体和质膜复制复合体之间的联系方面的作用，nsP2作为蛋白酶和解旋酶，nsP3介导宿主-病毒与蛋白质的相互作用，nsP4是一种依赖RNA的RNA聚合酶。在编码区域基因组中，生成病毒RNA，表达病毒蛋白，并包装病毒基因组。自复制mRNA疫苗具有许多优点，包括由于能够自我复制而具有高表达水平，缺乏结构病毒蛋白基因，以及能够持续长达两个月。除了它们更大的尺寸和无法耐受各种合成修饰之外，还有一些缺点。 4.2.非复制mRNA疫苗 非复制mRNA疫苗包含编码感兴趣的蛋白，而不是像自复制mRNA疫苗那样需要mRNA复制的蛋白。非复制mRNA的基本结构与天然mRNA相同，包括5'帽子、聚(A)尾部、5'不饱和区、3'不饱和区，以及编码感兴趣基因的区域。5'和3'不饱和区元素在mRNA分子的稳定性和复制中起着至关重要的调节作用。5'是mRNA稳定性的重要元素，促进蛋白合成。聚(A)尾部具有保护功能，防止mRNA分子被RNases外切核糖酸酶降解。非复制mRNA疫苗的优点包括相对较小的尺寸（大约2-3 kb），与自复制mRNA疫苗（10 kb）相比，只携带所需的感兴趣基因，防止了任何其他可能导致宿主内不需要的免疫反应的蛋白表达，并且其构建容易。而缺点包括不稳定、半衰期短和表达水平低。 5.mRNA疫苗的配方和传递 mRNA疫苗的配方和传递系统决定了宿主细胞内抗原的表达效果和持续时间，以及它们引起的免疫反应的效力。mRNA分子的物理化学性质，如负电荷和大尺寸，使它们（裸露的mRNA）难以穿过细胞的质膜。模式识别受体可以轻易识别外源mRNA，并通过干扰素导致裸露mRNA的降解。因此，为了增强mRNA的细胞摄取和它们对核酸酶降解的抵抗力，需要一个传递载体。用于mRNA管理的传递载体包括树突细胞（体外）、电穿孔和基因枪（物理传递）、基于聚合物的传递和基于纳米颗粒的传递工具（LNPs）。LNPs是其中最有效和广泛使用的传递载体。 在体外，转录系统可以用来生产合成mRNA。这个转录系统由编码mRNA的DNA模板、噬菌体RNA聚合酶、RNA和合成帽子类似物组成。在某些情况下，也可以使用来自癌细胞的完整RNA用于疫苗。体外提取的mRNA或从肿瘤细胞获得的mRNA可以裸露或与载体一起管理。mRNA疫苗携带编码抗原的转录物进入宿主细胞，在那里使用宿主的翻译机制来产生抗原，然后刺激宿主的免疫系统。mRNA的细胞内稳定性和翻译效率很大程度上受其结构的影响。合成mRNA的设计基于真核RNA蓝图，在5'端有一个帽子，在3'端有一个聚A尾部。通过添加3'和5'非翻译区，可以进一步增强其稳定性和效力。这些非翻译区包含调节元素。 当mRNA疫苗被配制在脂质纳米颗粒中时，可以增强免疫反应，这也保护了mRNA免受细胞质RNases的侵害。由于其某些好处，如易于准备、毒性较小，以及能够被宿主细胞机制降解，脂质纳米颗粒长期以来被用作药物载体。脂质纳米颗粒有四个组成部分，如阳离子脂质（可离子化）、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇。由于RNA是带负电荷的分子，它与带正电荷的阳离子脂质颗粒形成复合物。脂质颗粒的可离子化特性使复合物无毒，并在宿主生理pH下保持中性或轻微带正电荷的表面。这种特性还通过最小化非特异性细胞表面脂质和蛋白质之间的相互作用，促进mRNA释放到细胞质中。还有许多其他mRNA传递系统，如精蛋白、脂质复合物、多聚体纳米颗粒、胶束复合物纳米颗粒、脂多聚体，以及阳离子纳米乳液。 6.未来展望 在人类中接种mRNA疫苗所取得的成功结果为mRNA基础疫苗在兽医医学中的发展打开了大门。目前，只有少数mRNA疫苗在动物中针对其自然宿主的特定传染病进行了研究。全球寄生虫和病毒感染对动物健康和工业家畜生产构成重大威胁。全球最严重的病毒感染缺乏适当的预防策略，包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、疙瘩皮肤病病毒（LSDV）、牛白血病病毒（BLV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）等。传统疫苗对上述许多疾病安全有效，但仍需要研究以更好地预防疾病。对于传染病疫苗的开发，mRNA有潜力解决疫苗学中出现的许多挑战。在未来，疫苗不仅用于预防措施，还用于预防、控制和治疗动物和人类的癌症和肿瘤。 非洲猪瘟病毒是导致猪的高死亡率和出血的原因。中国是最大的猪肉生产国，由于缺乏有效的策略，这种疾病传播到许多其他国家，导致2019年约有七百万头猪死亡。目前，使用活减毒疫苗进行控制。活减毒疫苗的开发需要猪骨髓细胞或肺泡巨噬细胞，这既耗时又成本高昂。作为这种方法的替代方案，最近通过iVAX（计算疫苗设计平台）识别了非洲猪瘟病毒编码蛋白中的T细胞表位。在细胞免疫反应中，T细胞执行重要功能，参与在识别病毒的T细胞表位后直接杀死病毒感染的细胞。因此，为了充分利用T细胞表位的潜力，需要进一步调查以促进mRNA疫苗（针对T细胞）的开发。 猪繁殖与呼吸综合征病毒是导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病的原因，影响猪农经济。PRRSV有两种抗原上不同的基因型。目前，使用活减毒或灭活疫苗预防性地控制疾病，但这些疫苗仅对同源菌株提供保护，对异源菌株的效力为零或部分。2019年，显示具有PRRSV GP5-Mosaic（糖蛋白5）序列的DNA疫苗候选物是免疫原性的，并对猪的病毒感染提供保护。借助in silico算法，可以组装不同PRRSV菌株的片段，这些片段诱导免疫反应，使用mRNA疫苗平台制作单一疫苗。这样的疫苗可以为两种类型的菌株提供广泛和有效的免疫，无论是同源还是异源菌株。 冠状病毒引起许多新兴大流行疾病，如严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒病，感染了牛、水牛、猫、狗和猪等各种动物。抗体通过与冠状病毒的刺突(S)糖蛋白结合来中和病毒，该蛋白由S1和S2亚基组成。受体结合域(RBD)位于S1亚基中，参与特异性受体结合，而S2亚基参与宿主和病毒细胞膜的融合。随着对动物冠状病毒(猪急性腹泻综合征冠状病毒、牛冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒)的细胞表面受体和新型受体结合域的研究进展，基于RBD的mRNA疫苗似乎是限制动物冠状病毒疾病出现和再现的有效策略。 在兽医领域经济上重要的 Pestiviruses，如牛病毒性腹泻病毒、经典猪瘟病毒和边缘病病毒。Pestiviruses 编码的三种糖蛋白包括 E1、E2 和 Erns(E 核糖核酸酶)。E2 是中和抗体的主要靶标。用作疫苗的 E2 亚基激活了体液免疫反应和细胞介导的免疫反应，因此基于 E2 的 mRNA 疫苗可以提供有效的保护。需要进一步评估 mRNA 疫苗，以评估在自然动物宿主中疫苗管理后发生的过敏反应。用于动物的疫苗必须是经济实惠且易于获得的，以便兽医可以访问它们。在未来，mRNA 疫苗在动物中的使用似乎是一种非常有效的方法，用于控制各种病原体疾病，由于上述讨论的许多优点。 7.结论 目前，科学家们对基于RNA的方法在疫苗开发中的兴趣日益增加，这些疫苗可用于预防和控制疾病。mRNA疫苗在用于临床前和临床试验的动物模型中激发了安全且持久的免疫反应。它在兽医领域对动物传染病有很强的潜力，并且比其他形式的疫苗具有某些优势，如感染风险消失、无逆转为毒力的风险，并且可以在一种疫苗中组装多种抗原，同时对多种病原体进行免疫，易于准备且处理和储存非常方便。mRNA疫苗为预防传染病提供了显著的保护性免疫来源，这一点已经通过COVID-19疫苗的成功应用得到证实。这一成功为预防一系列传统疫苗方法具有挑战性的传染病开辟了新的可能性。由于疫苗的快速发展，它可能是应对新兴传染病的一个有希望的平台。然而，要充分利用mRNA疫苗在未来的潜力，必须解决某些挑战，如配方、疫苗犹豫和广泛获取。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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