100 项与 Takara Corp. 相关的临床结果
0 项与 Takara Corp. 相关的专利(医药)
中文摘要目的 对轮状病毒(rotavirus,RV)阳性临床粪便标本进行毒株分离、纯化及鉴定。方法 将感染RV的腹泻患儿粪便标本在单层恒河猴肾细胞MA104上传代培养,分离毒株,通过噬斑法克隆纯化病毒,电子显微镜(电镜)观察病毒形态和大小;采用SDS-PAGE、免疫印迹法和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)、反转录PCR及全基因组测序对病毒进行鉴定。结果 对大量临床标本进行传代筛选和噬斑纯化,得到1株RV野毒株。50%蔗糖超速离心纯化病毒在电镜下可见直径约75 nm的典型RV颗粒;SDS-PAGE和免疫印迹法结果显示在预期位置出现目的条带;IFA结果显示所分离病毒为RV;RNA-PAGE显示分离株电泳型为长型,电泳图谱中11个条带呈现4:2 :3:2排列;PCR扩增片段及全基因组测序结果表明分离毒株为G1P[8]型。结论 成功分离出1株人G1P[8]型RV野毒株,并命名为HN15D2。正文 轮状病毒(rotavirus,RV)是造成全球5岁以下婴幼儿严重胃肠炎的最常见病原体[1]。与许多细菌性胃肠炎病原体不同,RV在发达国家和发展中国家都存在,且改善社会经济条件并不能阻止RV感染[2]。中国是RV感染的多发区和高发区,RV流行株因地区和年份而不同。G1、G2、G3、G4和G9型是我国的主要流行株[3-4],婴幼儿感染率高达65%,以G1P[8]感染为主[5]。虽然对RV的研究已有几十年的历史,疫苗的问世减少了死亡病例,但是在低收入国家,每年RV相关胃肠炎仍然导致超过20万病例死亡[6],至今尚未研究出特效治疗药,疫苗是预防RV腹泻、降低死亡率的最经济有效的手段[7]。兰州生物制品研究所有限责任公司(兰州公司)研制的口服三价重配RV减毒活疫苗(Vero细胞)(G2、G3和G4)(LLR3),在河南省完成了多中心、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期临床试验,结果显示,在2个流行季节后,LLR3的保护率分别为70.3%和56.6%,保护率与上市的疫苗RotaRix和RotaTeq相当。LLR3还显示出对其他流行野生毒株,尤其是对G9型毒株的交叉保护,但对G1型毒株的保护率仅为49.3%[8]。本实验拟对Ⅲ期临床试验中收集的RV阳性粪便样本进行培养,分离毒株并通过噬斑纯化筛选、形态观察及蛋白检定和全基因组测序进行毒株鉴定,以期为后续RV疫苗的进一步研发奠定基础。1材料与方法1.1细胞恒河猴肾细胞MA104(P30)由兰州公司第二研究室保存。1.2临床样本临床样本系口服三价重配RV减毒活疫苗(Vero细胞)Ⅲ期临床试验(批件号:2011L00838)收集的腹泻患儿RV阳性的粪便样本,由兰州公司第二研究室保存。1.3主要试剂及仪器RPMI-1640培养基和胰蛋白酶(胰酶)均购自美国Gibco公司,新生牛血清购自兰州荣晔科技生物工程有限责任公司,去支原体抗生素Plasmocin、荧光素标记羊抗兔IgG(H+L)、Lumi-Light免疫印迹底物均购自美国Thermo Fisher公司,抗RV G1兔血清由兰州公司第二研究室制备,低熔点琼脂糖、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记羊抗兔IgG均购自美国Sigma公司,总RNA提取试剂盒RNeasyMini Kit,Agarose Gel DNA回收试剂盒均购自德国Qiagen公司,One-Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自日本TaKaRa公司。S1000 Thermal Cycler PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司,ImageQuant LAS4000凝胶成像仪购自美国GE公司。1.4病毒分离与培养将RV阳性粪便标本用PBS重悬,在4 °C条件下12 500 r/min、5.5 cm离心半径离心2 min,吸取上清液用0.22 μm滤器过滤除菌,分装。分别取800 μl过滤液,加入300 μg/ml胰酶至胰酶终浓度15 μg/ml,37.0 °C水浴60 min后,分别接种于单层MA104细胞,每份标本各接种1瓶T25,37.0 °C吸附1 h,弃标本滤液,补加不含血清的RPMI-1640培养基(含0.5 μg/ml胰酶、25 μg/ml去支原体抗生素Plasmocin、100 μg/ml氨苄青霉素),于36.0~36.5 °C、5% CO2培养箱中培养,3 d后逐曰在显微镜下观察细胞,ELISA检测呈阳性或致细胞病变(cytopathic effect,CPE)≥75%时收获,收获液用相同方法连续盲传5代(P5),取P5 RV阳性收获液进行空斑克隆。1.5RV阳性收获液空斑克隆纯化将P5收获液10倍系列稀释至103~108稀释度后,接种6孔板中单层MA104细胞,每个稀释度2个复孔,0.9 ml/孔,于37.0 °C、5% CO2培养箱吸附4 h,弃上清液,加入RPMI-1640培养基配制的1%低熔点琼脂糖(含胰酶0.5 μg/ml),2 ml/孔,室温下凝固后,置于37.0 °C、5% CO2培养箱中培养。5 d后加入含有中性红的RPM-1640培养基配制的1%低熔点琼脂糖,2 ml/孔,室温凝固,相同条件继续培养,4~24 h观察空斑。在高稀释度孔中挑取单个空斑,接种于24孔板MA104细胞上,培养6 d后,ELISA检测,将光密度值最强的阳性孔样品进行再次克隆,如此重复克隆5次,挑选第5次空斑克隆滴度最高的单克隆毒株,命名为HN15D2,连续传代至P5并进行毒株鉴定。1.6病毒的纯化浓缩将HN15D2病毒收获液在-20 °C冷冻后室温融化,4 °C条件下8 000 r/min、7 cm离心半径离心30 min,收集上清液,进行50%蔗糖超速离心,4 °C条件下35 000 r/min、4.5 cm离心半径离心4 h,弃上清液,用RPMI-1640培养基重悬沉淀,使其达到100倍体积浓缩。1.7电子显微镜(电镜)观察纯化病毒样品送兰州大学电镜中心分析。1.8蛋白检测对超速离心纯化的HN15D2病毒进行SDS-PAGE和免疫印迹法分析[9]。一抗为抗RV G1兔血清(1 :1 000稀释),二抗为HRP标记羊抗兔IgG(1:1 000稀释)。用Lumi-Light免疫印迹底物显色,凝胶成像仪成像。1.9免疫荧光检测在96孔板中,将HN15D2病毒以感染复数(multiplicity of infection,MOI)0.01接种 MA104细胞,并设置阴性对照。置于37.0 ℃、5%CO2培养箱中培养18 h;弃上清液,加入预冷的80%丙酮,100 μl/孔,室温固定20 min;吸出丙酮,室温干燥2 h;加入去离子水,200 μl/孔,室温2 min;弃去离子水,拍干后加入抗RV G1兔血清(1:200稀释),100 μl/孔,37.0 ℃孵育1 h;弃上清液,用含Tween的PBS(PBST)洗板6遍,拍干,加入荧光素标记羊抗兔IgG(H+L)(1 :400稀释),37.0 ℃避光孵育1 h;弃上清液,PBST洗板,拍干,加入60%甘油,在荧光显微镜下观察并拍照。病毒RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(RNA polyacrylamide gel electrophoresis,RNA-PAGE)取高滴度HN15D2病毒收获液400 μl,用苯酚-氯仿抽提法提取病毒基因组RNA,按照标准的PAGE程序进行电泳,上样量10 μl/泳道,硝酸银染色后观察病毒的核酸带型并干胶保存[10]。 VP4和VP7基因鉴定根据GenBank中RV的VP4 、VP7基因序列,用Primer 5.0软件设计引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,见表1。取HN15D2病毒P5收获液120 μl,按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,进行反转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR)。按照反转录试剂盒说明书,采用25 μl体系:取RNA模板10 μl,并依次加入One-Step缓冲液12.50 μl,加入上游引物和下游引物各1 μl,One-Step PrimeScript RT-PCR Kit 0.5 μl,共25 μl于PCR扩增仪中进行如下程序:48 ℃反转录30 min,94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,68 ℃ 2 min,进行40个循环后68 ℃延伸5 min。反应结束后,取PCR扩增产物5.0 μl,于1%的琼脂糖凝胶电泳30 min,观察并保存图谱。PCR产物经胶纯化后,进行测序,获得的基因序列通过BLAST在线与GenBank中登录的不同谱系VP7、VP4进行同源性比对分析,并利用BLAST在线构建遗传进化树。全基因组测序取HN15D2病毒P5收获液进行二代全基因组测序(由上海伯杰医疗科技有限公司完成),并对测序结果利用BLAST软件在线进行同源性分析。2结果2.1病毒分离中细胞形态变化将临床样本滤液在MA104细胞上传代2次后,显微镜下观察,发现只有少数细胞出现CPE,至P3开始出现明显的CPE,培养至6 d时细胞间隙变疏松,部分细胞圆缩、裂解和脱落形成大片的空斑,培养上清液透光性减弱;未感染细胞生长良好,未见细胞发生病变。2.2病毒空斑纯化结果空斑试验结果显示病毒在MA104细胞上吸附4 h,37 ℃,5%CO2培养5~6 d均形成典型空斑,吸附时间越长,空斑越大、越明显,形态为圆形或类圆形,边缘整齐,清晰透明;且随着病毒稀释度的增加,空斑的数量逐渐减少。挑选第5次克隆病毒滴度最高的单克隆放大培养,获得高滴度单克隆毒株。2.3电镜检测结果超速离心纯化的HN15D2病毒在电镜下可见典型的RV颗粒,完整的病毒颗粒直径约75 nm,符合RV大小,见图1。2.4病毒蛋白检测SDS-PAGE显示,纯化的HN15D2病毒抗原成分复杂,其中在相对分子质量25 000~130 000之间可见多条较为清晰的染色条带,分析可能为RV的不同外壳蛋白和非结构蛋白,见图2A。免疫印迹法分析显示,纯化的病毒与抗RV蛋白抗体结合,在预期主要抗原RV外壳蛋白VP4、VP6及VP7相对分子质量(VP4/88 000、VP6/45 000、VP7/34 000)位置出现特异性反应条带,见图2B。2.5感染细胞的免疫荧光显微镜观察结果HN15D2感染的细胞膜内出现了强烈的绿色荧光信号,阴性对照细胞未见绿色荧光,表明细胞中感染并复制的是RV。2.6病毒RNA-PAGE检定结果显示,RNA-PAGE核酸带型呈4 :2 :3 :2型,4个较大的双链RNA节段(基因片段1—4);5个中等大小的节段(基因片段5—9),其中7—9在一起形成1个特征性的三体;2个小片段(基因片段10、11),是典型A群RV基因组带型,见图3。2.7VP7和VP4基因鉴定HN15D2的VP7和VP4基因RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,VP7扩增产物长度为1 062 bp,利用Seqman软件将VP4的2个片段扩增产物拼接后,长度符合预期目的基因大小2 359 bp,见图4。利用BLAST在线构建遗传进化树。VP7(segment 9)、VP4(segment 4)遗传进化树结果显示HN15D2为 Human/RVA/G1P[8]。2.8全基因组测序结果表明,HN15D2病毒的11个全长基因片段均与A组RV处于同一个大分支,属于人RV,与Wa/G1P[8]型RV处于同一个小分支。3讨论RV属于呼肠孤病毒科RV属,病毒基因组共有11个基因节段,分别编码6种结构蛋白(VP1—VP4,VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1—NSP6)[11],其中内核蛋白有3个(VP1—VP3),内衣壳蛋白1个(VP6),外壳蛋白2个(VP4和VP7),根据VP6的抗原特异性可将RV分为(A一D和F一J)9个组,根据病毒外壳蛋白VP7和VP4特异性和多样性划分型别,依据VP7序列分为G血清型,依据VP4序列分为P基因型[12]。不同地区,流行株有所不同,如孟加拉2014—2019年主要流行株是G1P[8][13];科特迪瓦2010—2013年主要流行株是G12P[8][14];而泰国流行株则是G1P[8]、G3P[8][15];越南2002—2003 年主要是 G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]等多种流行株[16];而国内报道,湘潭县和融水县流行的P血清型优势毒株为P[8](分别为67.0%和81.6%)[17];济南和临沂P[8]占56.0%[18];与2016—2020年云南省5岁以下儿童RV监测结果分析[19]、2018—2020年辽宁省锦州地区[20]、2019—2020年湖北武汉和襄阳市等地区调查结果[21-22]以及Luchs等[23]的研究结果一致。这也提示,P[8]型可能是近年全球范围的流行株[24]。考虑到中国目前依然存在的RV胃肠炎负担和RV血清型的转变,疫苗接种仍然是预防RV腹泻、降低死亡率的最经济、有效的方法[25]。分离出流行病毒株,研发与流行株相匹配的RV疫苗以获得更广泛的覆盖范围依旧势在必行。而RV 11个节段的双链RNA由3层衣壳蛋白包绕着,要对它进行体外分离极其困难,必须用胰酶激活。胰酶将VP4蛋白裂解为VP8*和VP5*,使病毒吸附于细胞表面;VP7蛋白与整合素α4β1、αxβ2和αvβ3结合,加速RV侵入细胞[26-28];在体外,VP6蛋白自身可装配成球形颗粒,这种颗粒可以与免疫细胞结合,因此被用作一种载体以便携带VP7或/和VP4等多肽[3]。在HN15D2病毒分离过程中,活化病毒的胰酶终浓度为15 μg/ml,维持液中胰酶终浓度为0.5 μg/ml,既实现了培养过程中胰酶对VP4蛋白的激活作用,又保证了细胞不被胰酶损伤。样本在MA104细胞上培养和完成5次空斑纯化后,获得1株RV野毒株。 纯化后的HN15D2病毒在电镜下呈现为典型的RV颗粒[10]。IFA结果从蛋白质水平证实HN15D2株是RV。SDS-PAGE和免疫印迹法检测时,二抗使用的抗RV G1兔血清属于全病毒抗体,因此结果显示被测病毒的抗原成分形成多条染色带,但在预期的VP4、VP6及VP7蛋白相对分子质量处出现了对应的染色条带,表明HN15D2病毒含有RV的VP4、VP6和VP7蛋白。其中VP6蛋白是组抗原,是同一组内不同毒株共同拥有的抗原,外壳蛋白VP7和VP4是RV主要的交叉中和抗原,是疫苗设计的主要靶点[20]。HN15D2基因鉴定中,RNA-PAGE结果显示,其电泳型为长型,11个条带呈现4 :2:3:2排列,是A组RV独特的电泳图谱,全基因组测序11个基因片段与GenBank中登录的基因片段进行同源性比较,结果显示11个全长基因片段同源性均大于99%,与A组RV处于同一个大分支,属于人RV,与G1P[8]型RV处于同一个小分支,确定HN15D2型别为RV A/Human/G1P[8]。 至今我国主要使用兰州公司研制的国产口服RV活疫苗LLR,血清型为G10P[15]型;在已上市的单价羔羊G10P[15] RV疫苗的基础上,通过基因重配技术,采用G2、G3和G4型人RV分别与LLR进行基因重配,获得3个分别含有G2、G3和G4型人RV的VP7基因的人-羊RV重配株,并用这3个毒株研制了三价RV重配疫苗LLR3[8]。LLR3抗原是G2、G3、G4血清型,缺乏G9、G1和P[8]型。本研究成功分离、纯化了1株人G1P[8]型野毒株HN15D2,并对其进行了鉴定和分析,为G1P[8]的后续研究提供了数据参考,可用于RV G1型重配病毒株的制备,也为今后更广谱、多价RV疫苗研究奠定了基础。作者寇桂英1 王云瑾1 程亚慧1 关文竹1 火文1 王名强1 包红1 陈汉泉1 周旭2 李雄雄11兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室,甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州 730046;2上海生物制品研究所有限责任公司,上海 201403通信作者:周旭,Email:kathzhou@sina.com;李雄雄,Email:lixx985@163.com引用本文:寇桂英,王云瑾,程亚慧,等. 人G1P[8]型轮状病毒HN15D2毒株的分离纯化及鉴定[J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(2):76-81. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221212-00085
在过去十年间,免疫检查点抑制剂(ICI)的开发推动了癌症治疗的发展,但也有很多患者由于自身肿瘤特异性效应T细胞的缺乏,无法从其中获益,而过继性细胞转移(ACT)可解决这一问题。ACT技术包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、T细胞受体工程化T细胞疗法(TCR-T)和嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)。目前CAR-T疗法在血液瘤中的疗效已得到验证,目前全球已上市7款治疗血液瘤的CAR-T疗法(其中一款在国内上市),但在实体瘤中,由于可用抗原的稀缺性、肿瘤的异质性或肿瘤的免疫抑制一直效果不佳。而TCR疗法被认为是治疗实体瘤的有效方式。[1]01TCR与CAR-TTCR-T细胞和CAR-T细胞在结构上有所不同,CAR-T主要包含胞外抗体样结构域和胞内T细胞激活结构域,以独立于MHC的形式识别细胞表面抗原,而实体瘤上通常不表达这些抗原。TCR-T使用天然存在的(或最小化的)TCR,缺乏共刺激功能,能识别并结合MHC呈递的抗原肽,包括细胞表面蛋白和实体瘤普遍表达的胞内抗原,因此,TCR被认为可能是治疗实体瘤的有效方式。但TCR-T仅限于某些HLA等位基因的MHC蛋白,最常见的是HLA-A*02:01。因此,选择TCR-T疗法的患者必须不仅要表达目标抗原,而且还要表达相应的抗原限制的HLA等位基因。[1]CAR-T和TCR-T都会造成因癌症特异性T细胞参与而造成的毒性,CAR-T一般以细胞因子释放综合征、中枢神经系统毒性为主;TCR-T一般会发生皮肤、眼部、眼部和心脏毒性。此外,TCR疗法还有抗体形式,包括双特异性TCR、BiTE和TCRm抗体。目前首款获批上市的TCR疗法Tebentafusp,就是将CD3 scFv片段与针对gp100的可溶性高亲和力TCR相结合的双特异性TCR-scFv融合蛋白,可重定向T细胞靶向杀伤肿瘤细胞。Targeted T cell receptor (TCR) delivery and TCR‐like structures[3][1]02抗原的选择抗原选择是开发安全和高效的TCR疗法的关键。理想的抗原将在肿瘤细胞中选择性地、均匀地表达,并在其表面的MHC I类分子上产生表位。目前在临床试验中考虑的两种肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)。[2]TAA主要是组织分化抗原(TDAs)和癌症种系抗原(CGAs)。目前针对TDA的临床研究包括T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)、糖蛋白100(gp100)或癌胚抗原(CEA),但是由于在正常细胞中也会有低表达,基于此类抗原的很多临床研究出现了严重的安全性问题,包括皮肤、眼部和听觉毒性等。癌症种系抗原(CGAs)大多集中于黑色素瘤相关抗原(MAGE-A)蛋白家族成员和纽约食道鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)。TSA主要是新抗原和病毒抗原,目前发现的公共新抗原有KRAS G12D/G12V,在60-70%的胰腺癌和20-30%的结直肠癌中表达;以及PIK3CA H1047L,在大约5%的转移性乳腺癌中表达,靶向此类抗原造成的毒性会相对更低。03市场发展首个获批的TCR疗法是Immunocore的Tebentafusp,于2022年1月获批上市,治疗葡萄膜黑色素瘤,2022年首年销额达1.41亿美元,今年Q1销额0.52亿美元。截止目前,Immunocore的股价相较去年产品上市前已上涨超200%。根据“Research and Markets”研究报告,目前,全球有190多种评估TCR疗法在各种肿瘤和非肿瘤疾病方面潜力的研究在进行中,过去十年间临床注册近110项,其中研究最多的抗原是NY-ESO-1和MAGE。在过去十年中共签订了近140项TCR疗法相关合作交易,年复合增长率为23%。在未来十年预计TCR疗法市场将呈现51%的年增长率,就适应症而言,鼻咽癌、多发性骨髓瘤和头颈部癌或将成为市场的主要驱动力。03竞争格局根据智慧芽公开数据库显示,目前在研的TCR疗法中尚无III期,除了已上市的Tebentafusp,还有一款Adaptimmune的TCR-T细胞疗法(afami-cel)已提交治疗滑膜肉瘤BLA上市申请,旨在成为首个针对实体瘤的工程化T细胞疗法。此外,有研究对clinicaltrials网站上的TCR相关试验进行了统计分析,在2017年-2019年间,TCR-T临床试验数量处于加速增长阶段,且大多数的TCR试验均是针对实体瘤,在研靶点以NY-ESO-1和HPV为主。NCI是美国TCR-T试验中参与度最高的机构,在制药公司赞助的TCR-T试验中,Adaptimmune和GSK赞助的试验最多(均为8项)。统计时间截止到2021年10月3日[4]就国外而言进展最快的当属Immunocore和Adaptimmune,此外,还有吉利德Kite、blubird、Takara、TCR2 Therapeutics均已步入临床2期去年11月,阿斯利康以最高3.2亿美元收购了一家TCR-T疗法公司Neogene,以加速在实体瘤TCR-T细胞疗法领域的布局。国内广州香雪制药和华夏英泰也已迈入2期,香雪制药TCR-T细胞疗法TAEST16001于今年3月刚申报新适应症,此前获批开展的软组织肉瘤I期临床研究中,ORR达41.7%。此外天科雅、药明巨诺、永泰生物、可瑞生物、泛恩生物等企业也都已步入临床,奋力追赶中。04挑战和机遇Tebentafusp的获批和销量进一步验证了TCR疗法在实体瘤中的可行性,但对于TCR尤其是细胞疗法,当前也面临着众多挑战,包括T细胞相关的毒性问题和继发性/获得性耐药机制,而随着技术的发展,TCR疗法也将越来越成熟。TCR疗法的挑战和机遇[1]细胞系产品查询投稿丨商务合作加入交流群往期推荐双抗ADC全球在研格局今日之PD-1单抗,明日之HER2 ADC?2023,Biotech的下半场——现金为王,产品为金点击下方“药研网”,关注更多精彩内容参考[1] https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1186/s13045-021-01115-0[2]DOI:10.1126/sciadv.adf3700[3]doi: 10.1111/imr.12772[4] doi: 10.3389/fimmu.2022.835762
100 项与 Takara Corp. 相关的药物交易
100 项与 Takara Corp. 相关的转化医学