合成致死WRN的变构抑制剂设计与发现

2024-06-05

微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，由错配修复功能（Mismatch repair, MMR）缺陷引起，是公认的重要致癌途径之一。MSI是一种遗传缺陷，常见于多种癌症中，包括结直肠癌、子宫内膜癌等。WRN（Werner syndrome RecQ helicase）作为一种RecQ家族的DNA解旋酶，在多项大规模基因组筛选证实是MSI癌症的合成致死靶点。 WRN参与合成致死的机制如下：当 DNA 在复制过程中发生错配，正常细胞主要由 DNA 错配修复蛋白（MSH2或 MLH1）进行 DNA 错配修复，而微卫星不稳定性肿瘤细胞由于缺乏错配修复基因（或错配修复系统存在缺陷），存在大量的TA重复序列，形成十字形的二级结构，使复制叉停滞，并引起ATR依赖的WRN磷酸化，来解旋二级结构及完成复制。当WRN缺失时，结构特异的MUS81-EME1核酸内切酶和SLX4一起切割二级结构以试图恢复复制叉的功能。但是，过多的MUS81切割最终导致了DNA末端切割，染色体破碎甚至细胞死亡。因此，发现WRN的抑制剂对于MSI肿瘤具有重要的治疗前景。为了获得该抑制剂，来自诺华公司的研究人员利用基于ATP结合的筛选方法，从15万个化合物中筛选到化合物1，并通过基于结构的药物设计，改善渗透性和脂溶性效率得到化合物；继而降低化合物logP并改善渗透性，引入邻甲基苯胺和羟基嘧啶得到化合物3和4。其中化合物4（HRO761）具有良好的物理化学性质和药代动力学，且无明显脱靶效应。共晶结构显示，HRO761作用于WRN解旋酶核心结构域，结合在D1-D2界面上的一个非保守变构位点，诱导D1和D2结构域发生约180°的相对旋转从而发挥功能。相互作用分析发现几乎所有HRO761上的重原子都参与了与WRN的极性相互作用，从而将WRN锁定在非活性状态。在高ATP条件下，HRO761在SW48细胞（MSI细胞）中测定的半数生长抑制浓度（GI50）为40nM，而对CAL33（microsatellite-stable, MSS细胞）无显著抑制作用。为了系统评估HRO761的细胞活性，他们对20个MSI（红色）和8个MSS（蓝色）细胞系中普筛了其抗增殖活性，发现HRO761在纳摩尔浓度(IC50:50-1000 nM)下选择性抑制MSI细胞系的克隆形成，且其敏感性与细胞内WRN的依赖性(DRIVE score)相关，对MSS细胞系无影响。在CellTiter-Glo（CTG）试验中, HRO761与WRN的结合在所有检测的MSI和MSS细胞系中都是相似的，其蛋白稳定化IC50(PS50)在10-100 nM范围内，而带有突变C727A或C727S会降低与HRO761的结合，并削弱其细胞增殖抑制和PD效应，说明尽管HRO761在所有细胞中都能有效结合WRN，但只在MSI细胞中抑制WRN从而产生选择性的细胞毒性。免疫印迹分析发现，HRO761处理MSI细胞后诱导产生DNA损伤反应，包括ATM、CHK2激酶磷酸化，p53激活和γH2AX增加等，而在MSS细胞系中未见此反应。同时还发现，HRO761可诱导WRN降解和染色质结合增加；蛋白质组学分析表明HRO761处理后的WRN蛋白丰度仅在MSI细胞系中显著下调。之前文献报道，当WRN受到抑制时，WRN在染色质上被困上并被PIAS4 泛素化修饰。泛素化的WRN被泛素E3连接酶RNF4识别，然后泛素化WRN导致p97/vcp介导的染色质提取并运送到蛋白酶体进行降解。RNA测序分析显示，HRO761在4个MSI细胞系中显著调控了多个基因的表达，包括CDKN1A、MDM2等p53靶基因，而在MSS细胞和WRN敲除细胞中没有观察到基因表达变化。因此，WRN抑制剂 WRN抑制剂HRO761仅在MSI细胞中具有细胞毒作用，并诱导WRN蛋白降解。为了明确HRO761对MSI细胞的治疗作用，研究人员使用不同浓度HRO761 24h处理MSI细胞，发现其剂量依赖性激活ATM和CHK2、增加p21蛋白诱导并对p53依赖的基因呈剂量式调控。免疫荧光分析显示，随HRO761浓度升高，细胞核内绿色荧光显著增强，表明γ-H2AX含量明显升高，DNA损伤增加；细胞周期分析发现HRO761处理会使细胞阻滞在G2/M期。进一步机制研究发现，WRN降解并非细胞周期阻滞的原因，且经HRO761处理后，总CHK2蛋白水平虽有下调，但是由于在HRO761抑制生长的浓度并未导致CHK1/CHK2降解，说明HRO761致死不太可能是由于CHK2（或CHK1）丢失引起。体外实验显示，HRO761在HCT116 p53野生型和敲除型细胞中的IC50相似，且HRO761处理后两种细胞后均表现出抗增殖活性，表明HRO761作用机制不依赖于p53；同时，在p53野生型和敲除型细胞中，均可以观察到给药后ATM和CHK2磷酸化增加且WRN降解增加。上述结果说明，HRO761选择性诱导持续的DNA损伤反应，并引起细胞周期阻滞和凋亡，主要由ATM-CHK2通路驱动，而非依赖于p53。为了评价HRO761通过WRN的合成致死性能，研究人员对携带SW48移植瘤小鼠每日1次口服HRO761，发现给药后肿瘤增殖停滞，并在较高剂量下导致75-90%的肿瘤消退长达60天，之后肿瘤由于耐药性会出现剂量依赖性复发。在第7天及91天采集血样分析，HRO761的抗肿瘤功效与与血液中化合物浓度有关，且不会在体内蓄积，在GI90曲线上方的AUC与不同剂量下HRO761对肿瘤的疗效关系密切。小鼠给药后取样发现，HRO761在体内可有效抑制WRN，诱导DNA损伤反应（pKAP1增加）并激活p53通路(p21诱导)，这些变化在60 mg/kg剂量下给药后第8天后达到稳态，并随肿瘤消退而逐渐减弱。组织学分析也证实，HRO761剂量依赖性地抑制肿瘤细胞增殖（Ki67阳性），并引起细胞核增大。对不同MSI适应症的小鼠肿瘤模型和病人来源异种移植瘤（Patient-derived xenograft, PDX）模型进行大规模体内筛选，发现HRO761展现出广谱的抗肿瘤活性，其中2例完全缓解的模型分别为p53突变型（LS411N）和p53敲除型；同时。HRO761在p53敲除细胞中展现出比p53野生型细胞更好的抑制作用，再次印证了HRO761的p53非依赖性抗肿瘤机制。进一步，研究人员评估了HRO761与伊立替康联用的疗效。体外试验表明，HRO761与伊立替康在低于各自有效浓度时即可产生协同的细胞毒作用，并在高浓度HRO761处理下抑制了细胞再生长。体内研究证实，HRO761与伊立替康联用可在多个剂量组合下诱导肿瘤完全消退。这提示联合用药可能降低HRO761和伊立替康所需的个体给药剂量，从而拓宽治疗窗。综上，本研究运用化学筛选、药物设计等方法，得到具有高效抑制WRN活性的候选新药HRO761，评估了其在不同癌细胞系中的效果，验证了在MSI癌细胞模型中HRO761的合成致死效应，并对HRO761诱导合成致死效应的分子机制进行研究。目前HRO761正在开展I期临床试验，以评估其在结直肠癌等MSI实体瘤中的安全性和初步疗效。参考文献 1. van Wietmarschen, N., Sridharan, S., Nathan, W.J. et al. Repeat expansions confer WRN dependence in microsatellite-unstable cancers. Nature 586, 292–298 (2020). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-020-2769-8 2. Pérez, Fernando Rodríguez et al. “WRN Inhibition Leads to its Chromatin-Associated Degradation Via the PIAS4-RNF4-p97/VCP Axis.” bioRxiv (2023): n. pag. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1101/2023.12.08.570895 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓