单链抗体的研究进展及其在疾病治疗中的应用

2023-12-23

细胞疗法免疫疗法

中文摘要单链抗体（single chain fragment variable，scFv）是通过基因工程改造的重组抗体，保留了抗体的靶向性，同时因为体积较小而获得了完整抗体不具有的特性，例如渗透性好、易扩散、免疫原性弱、体内存留时间短以及容易表达等。这些特性使得scFv可以作为一种十分理想的靶向性分子应用于疾病的诊断和治疗。scFv可以与荧光蛋白融合发挥疾病诊断的作用；也可以与化学毒素相连形成免疫毒素用于癌症的治疗；scFv连接到T细胞上，则构建成嵌合抗原受体T细胞，是十分具有前景的癌症治疗技术。此文综述了scFv的相关制备技术及相关药物在临床试验中的应用。正文抗体是浆细胞在体液免疫中所产生的免疫球蛋白，天然的抗体由4条肽链构成，2条重链2条轻链，共同构成Y形的结构，见图1。完整的抗体包括2个结构域：抗原结合片段（fragment of anigen binding，Fab）和可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）。Fab中的抗体可变区包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）能特异性结合抗原；Fc则帮助维持抗体的正常结构，并且在抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒性、抗体介导的吞噬作用等免疫过程中发挥重要作用。完整抗体虽然在医疗领域有很高的利用价值，但相对分子质量较大、不易扩散、表达成本高，需要进行改造以赋予多样化的功能和特性。单链抗体（single chain fragment variable，scFv）是一种十分重要的重组抗体，仅包含VH和VL。scFv中的VH和VL通过15~25个氨基酸的linker连接成链状，linker通常富含亲水性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸等，组成类似（GGGGS）n的结构，使得肽链具有足够的灵活性。linker的氨基酸组成和氨基酸数目与scFv的活性和稳定性相关，如果linker含有疏水性氨基酸，可能使得VH和VL相互缠绕，影响其活性；linker长度太短则会使scFv容易形成二聚体的结构。在使用相同linker序列的前提下，VH和VL在肽链中N端或C端的相对位置也会对scFv的结合特性有一定的影响。scFv虽然只有1条链，但包含了抗体与抗原结合的关键区域，保留了抗原结合能力，同时也获得了相对分子质量小、易扩散、免疫原性弱、体内停留时间短、容易表达等特性。这些特点使得其被广泛应用于疾病治疗和诊断等相关领域，在嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T 细胞技术、流式细胞术、免疫组织化学、靶向性抗肿瘤药物等方面都发挥了重要作用。本文主要介绍scFv库的筛选、scFv在不同系统中的表达以及在治疗和诊断中的应用。1scFv的展示和表达获得scFv可以通过对已有序列进行重组构建，也可以通过构建抗体展示系统对不同类型的scFv进行大规模地展示和筛选，以获得具有良好结合性能的scFv。常用的抗体展示技术有噬菌体抗体展示技术、核糖体展示技术、细菌抗体展示技术等，现在广泛使用的主要是噬菌体抗体展示技术和核糖体展示技术，本文以这两项技术为例进行阐述。1.1scFv的展示技术1.1.1 噬菌体抗体展示技术丝状噬菌体展示系统是目前最成熟并广泛使用的噬菌体展示系统，丝状噬菌体为单链DNA病毒，基因组的大小在6 400 bp左右，可以插入并表达10个不同的蛋白质。与插入基因表达有关的基因为表面蛋白pⅢ基因和pⅧ基因，使用pⅢ可以插入较大的片段，而pⅧ适合较小的插入片段。噬菌体抗体展示技术通过基因工程方法从B淋巴细胞库中扩增获得抗体VH和VL文库，进而通过PCR获得天然或免疫文库，或者对已有的抗体序列进行关键区域随机突变，获得突变文库和合成文库；然后把克隆的scFv文库基因序列插入到M13噬菌体质粒中，与噬菌体基因组中的pⅢ或pⅧ基因融合，在噬菌体外壳表达scFv与pⅢ或pⅧ的融合蛋白。这样得到的噬菌体质粒中有抗体基因的存在，同时又在噬菌体的表面有scFv的表达，从而做到了基因型与表现型的统一。再利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过适当的淘选方法，例如结合-洗脱-扩增-结合依次循环进行筛选，可以得到与抗原具有较强结合能力的抗体序列；并可以用测序的方法在后续进行快速鉴定。VH和VL随机配对重组以及多轮淘选过程，在一定程度上模仿了动物免疫系统中的抗体亲和力成熟过程，从众多的scFv基因序列中筛选出具有抗原结合能力的少量序列。在筛选的过程中，带有高亲和力抗体片段的噬菌体会与抗原紧密结合，而无法结合的抗体片段则被冲洗掉，从而得到了高亲和力噬菌体-抗体复合物。再通过把所得到的噬菌体-抗体复合物侵染大肠埃希菌，便可获得大量的噬菌体；通过基因工程技术使抗体基因以分泌的方式表达，则可以获得可溶性抗体片段。但是，由于这种淘选过程是在体外进行的，无法完全模仿体内抗体的阴性筛选和阳性筛选的过程，因此最后得到的抗体序列可能存在非特异性结合、或亲和力较低的现象。1.1.2 核糖体展示技术核糖体展示技术的原理是通过去除mRNA 3'的终止密码子，使得翻译结束后肽链和核糖体无法从mRNA上释放，从而形成三元复合物多肽-核糖体-mRNA；通过固相筛选或液相筛选的方法（ELISA、磁珠法等)，利用目标抗原筛选得到抗原结合能力较高的三元复合物，再通过逆转录PCR技术重新构建DNA模板，进行多轮筛选以富集与抗原具有较强结合能力的scFv。核糖体展示技术一般包括3个步骤：展示模板的构建、体外转录和翻译、亲和筛选。完整的展示模板通常由4个部分组成：5'非编码区、目的基因、间隔序列和3'非编码区，其中5'非编码区中包含了T7启动子序列和核糖体结合位点序列；间隔序列的作用是scFv与核糖体具有一定的距离，防止核糖体干扰scFv的折叠；3'端的非编码区则剔除了终止密码子，防止mRNA、蛋白质和核糖体相互分离，帮助形成多肽-核糖体-mRNA复合物。核糖体展示技术有很多优势。由于完全在体外开展，避免了向生物细胞内转化的要求，因此克服了体内筛选技术对库容的限制，其库容量可以达到1014，比噬菌体展示系统的库容量更大。而且由于完全在体外进行，因此核糖体展示技术还可以筛选一些对细胞有毒性的分子。更为重要的是，在PCR中可以使用易错PCR技术来实现体外的亲和力成熟和抗体进化。但这种展示系统的缺陷也比较明显，mRNA易降解、多肽-核糖体-mRNA复合物的稳定性也较差，显著影响了展示系统的正常运行;另外，大分子蛋白质的展示效率低也是亟待解决的问题。1.2scFv表达系统对筛选得到的高亲和力scFv进行活性验证、大规模生产等，需要使用细菌或细胞表达系统对scFv进行表达。细菌、酵母菌和昆虫、哺乳动物、植物细胞等都可以用于在体外进行蛋白质的大规模表达，而不同的表达系统有不同的特点，适合于不同种类的蛋白或抗体片段。原核生物表达系统是在scFv表达过程中最常用到的表达系统，具有生长速度快、遗传背景清晰、产量高、成本低等特点。由于scFv本身的结构比较简单，不需要很复杂的翻译后修饰过程，因此原核细胞比较适合scFv的快速表达及筛选；在使用原核生物细胞进行表达的过程中可能需要克服包涵体的出现，可以通过添加信号肽等优化方式，使scFv可溶性表达，防止合成的scFv形成包涵体，有利于后期的蛋白纯化。而相对来说，真核生物细胞能够完成更加复杂的蛋白质折叠和翻译后修饰，但需要更高的成本。真核生物表达系统主要有酵母菌网、植物、昆虫、哺乳动物细胞等种类。总体而言，由于scFv的结构相对简单、几乎不需要翻译后修饰，因此主要使用原核细胞进行表达。2scFv在疾病治疗中的应用随着scFv技术逐步发展成熟，它的应用已经遍布了很多领域，下文选择在临床试验期间表现较好的几种药物，对近年来一些scFv在疾病治疗方面的应用进行总结。2.1自身免疫病的治疗当下用于自身免疫病的治疗药物大致分为生物药物和非生物药物，其中最普遍使用的是非生物药物，例如甲氨蝶呤、皮质类固醇和柳氮磺吡啶等，但是这些药物由于没有靶向性，对正常组织的毒性较大，会导致患者容易发生感染和毒素累积的危险。生物类药物主要包括单克隆抗体（单抗）和抗体偶联药物，它们相比于非生物类药物最显著的优势是高度的靶点特异性、低不良反应和低毒性。生物类药物正在迅速发展为自身免疫病药物的主要类型，其中多种scFv融合蛋白在临床上取得良好的效果。在临床试验阶段表现较好的有Dekavil和 Brolucizumab。Dekavil是一种抗体-细胞因子融合蛋白，由靶向纤连蛋白胞外域A的全人源scFv F8和抑制炎症的细胞因子IL-10组成，用于治疗类风湿关节炎。纤连蛋白的胞外域A在关节炎部位高水平表达，在健康组织中几乎不表达，利用scFv的靶向性可将活性物质IL-10在炎症部位富集发挥抗炎作用。临床试验表明，IL-10与scFv F8的结合比单独的IL-10效果更好，Dekavil目前已经进入Ⅱ期临床试验，在类风湿关节炎的治疗中具有安全性和一定的有效性。Brolucizumab是一种靶向血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的人源化scFv，于2019年获FDA批准用于治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）。它靶向结合VEGF，抑制VEGF与其受体结合，进而抑制脉络膜层新血管的产生，从而防止视网膜液泄露到视网膜层。在2项Ⅲ期临床研究（HAWK、HARRIER）中，Brolucizumab可以显著并长期恢复AMD患者的视力；对不同类型患者的个性化治疗方案，最终均能达到长期的视力恢复。2.2肿瘤靶向治疗scFv与其他分子形成的复合物，例如scFv-细胞因子融合蛋白、scFv-毒素复合物、scFv-细胞因子受体融合蛋白等，在肿瘤治疗方面有多种应用。2.2.1 抗体-细胞因子融合蛋白 scFv-细胞因子融合蛋白中scFv部分的靶向性十分重要，scFv的靶点应是在肿瘤组织周围大量表达、而在正常组织不表达的抗原。现在受关注的靶点主要有人表皮生长因子受体2/3、连接蛋白4、人滋养层细胞表面抗原2、亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸结合蛋白1家族、癌胚抗原相关细胞黏附分子、间皮素、肝细胞生长因子受体、叶酸受体α、CD19、CD22等；研究较多的细胞因子有IL-2、IL-12和TNF等。目前scFv-细胞因子融合蛋白研究多处于实验室阶段，进入临床试验的很少，在小鼠模型中的肿瘤治疗效果较好。进入临床试验的产品大多使用IL-2、TNF或IL-12等细胞因子，其中Fibromun是基于TNF的融合蛋白，包括L19 scFv和纤维连接蛋白B结构域，以同源三聚体的形式发挥作用。Fibromun表现出显著的肿瘤靶向性和极强的抗肿瘤效果，在Ⅲ期临床试验中发现其与L19-IL-2（Darleukin）联用可以对ⅢB/C期的黑色素瘤发挥很好的治疗效果。2.2.2 免疫毒素将scFv与毒素相连接成为免疫毒素是另一种十分普遍的肿瘤靶向治疗策略，其中最常使用的毒素就是白喉毒素（diphtheria toxin，DT）。DT是棒状杆菌表达的一种外毒素，可以进入细胞质抑制蛋白表达，从而对细胞进行杀伤。这里列举2种比较有前景的基于scFv和DT的免疫毒素，DT2219和DT-AntiCCR4。DT2219同时靶向于CD19和CD22。CD19是一种表达于所有类型的B细胞表面的糖蛋白，CD22则主要表达于前体B细胞和B细胞，它们都同样广泛表达于B细胞白血病和淋巴瘤中。DT2219同时靶向这2个靶点，可能在一定程度上增加了不良反应的风险，但也提高了对B细胞白血病和淋巴瘤的应答，在临床试验中表现良好。另一研究则单独使用了靶向CD19的scFv与DT融合，在动物实验中也有较好的效果，同时没有明显的毒性，更多研究结果尚未披露。DT-AntiCCR4靶向C-C趋化因子受体4（C-C chemokine receptor type 4，CCR4）， CCR4 主要表达于T细胞相关的肿瘤，如外周T细胞淋巴瘤、急性T淋巴母细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤等细胞表面。在这种免疫毒素的研究过程中，尝试了很多融合蛋白的形式，包括DT390-scFv单体、DT390-biScFv二聚体和DT390-Fold-back双特异性抗体的形式。在体内实验中，对小鼠移植急性淋巴祖细胞白血病细胞系（CCRF-CEM）给药结果表明，二聚体和双特异性抗体融合形式均对CCRF-CEM细胞系起到了显著的抑制作用，存活率比对照组小鼠明显提高。但是由于CCR4也表达于其他细胞群体如CD4+、CD8+ T细胞，因此DT-AntiCCR4在这方面的影响还有待进一步研究。2.2.3 基于CAR-T细胞的肿瘤治疗方法 CAR-T细胞技术是一种新兴的基于scFv的肿瘤治疗方法。在CAR-T细胞系统中的CAR部分表达于T细胞膜上，主要包括1个scFv、1个跨膜结构域和1个胞内结构域，结构如图2所示。其中scFv用于特异性识别抗原，跨膜结构域和胞内结构域部分帮助跨膜传递信号以激活T细胞。T细胞一旦被激活，则可以通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞。这样的T细胞激活方式与通过T细胞受体激活T细胞有着相同的效果，但利用不相关的CD8+ T细胞杀伤癌细胞；并且使用scFv与抗原特异性结合的方式，绕过了T细胞受体在识别抗原过程中的MHC限制性，从而大大提高了有特异性杀伤能力的CD8+ T细胞数量，对癌细胞的杀伤能力显著提升。CAR-T细胞疗法正在被广泛地研究和使用，靶向的抗原十分多样，其中主要的靶点是CD19、CD20、CD22、CD33等；针对的疾病类型也非常广泛，在淋巴瘤和实体瘤方面的研究都有很多探索。经典CAR-T细胞具有固定的结构，一种CAR-T细胞只能靶向到一种抗原表位上，这种设计限制了CAR-T细胞在临床应用的可能性，大大增加了治疗成本。通用CAR-T细胞在设计时把抗原识别区域与信号传导区域分开设计，使用一个可转换组件相连接，在需要改变靶点的时候只改变抗原识别部位即scFv，而无需重新设计和合成整个CAR-T细胞。通用CAR-T细胞不仅有利于靶点的转换，而且也可以通过调节scFv靶向性组件的浓度，来稀释或增强CAR-T细胞系统的作用强度，从而有效地控制CAR-T细胞可能出现的不良反应。通用CAR-T细胞的这些特点使得它在临床应用中有更大的潜力，更加扩大了 ScFv作为肿瘤治疗相关蛋白的使用广度，同时也降低了医疗成本。3展望由于相对分子质量较小，scFv获得了很多完整抗体不具有的特性，如易扩散、免疫原性弱、体内停留时间短、易表达等。这些特性使得scFv具有特殊的用途，比如可以用于构建免疫毒素、抗体-细胞因子融合蛋白、双特异性抗体、CAR-T细胞等，从而靶向到特异性位点发挥作用。随着抗体库筛选技术和蛋白表达技术的日趋发展和成熟，scFv将在肿瘤治疗、病毒检测与防控及药物输送等领域取得突破性进展。scFv有望改进肿瘤靶向治疗，提高疫苗研发效率，并实现精确药物递送，其广泛应用将为人类健康带来福音。作者陈团结1 综述陈哲文2 审校1上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室，上海 200051；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海 201403通信作者：陈哲文，Email：13917843916@163.com引用本文：陈团结, 陈哲文. 单链抗体的研究进展及其在疾病治疗中的应用 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 283-288. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230219-00017识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。