mRNA序列设计案例分享：辉瑞辉瑞/BioNTech BNT162b2序列全解析

2024-05-08

信使RNA疫苗寡核苷酸

导读：体外转录RNA（IVT RNA）包括mRNA、自复制RNA(saRNA)、反式扩增RNA(taRNA)和环状RNA(circRNA)，近年来在预防和治疗用生物制剂的开发中备受关注。IVT RNA是一种精心设计的序列，以模拟天然RNA转录本发挥翻译蛋白的生物学功能。IVT RNA的开发领域正在从人类拓展至动物，包括畜牧业、水产业和宠物领域。在多种类型的IVT RNA中，mRNA最为经典，且在大规模人群中验证了其疗效和安全性。mRNA序列由5个关键结构元件组成：5'帽结构（Cap）、5'非翻译区（UTR）、编码区（CDS）、3'非翻译区（UTR）和poly（A）尾巴。mRNA结构极其不稳定，容易被降解。“万变不离其宗”，合理的序列设计是提高mRNA稳定性的一种有效策略。本期文章，菌菌将以BioNTech和辉瑞联合开发的mRNA疫苗BNT162b2为实例，分享mRNA疫苗的序列设计策略。01 BNT162b2的编码序列设计mRNA的编码区（CDS），也称为开放阅读框（ORF），在体内翻译产生具有生物活性的目标蛋白，如病原体关键抗原、肿瘤抗原、抗体或其他功能性蛋白，CDS序列的设计和优化至关重要。CDS的设计策略主要为密码子优化，以提升蛋白翻译效率。密码子的优化包括两个水平，分别为复合密码子家族和家族内密码子优化。1.1 复合密码子家族优化例如，鉴于宿主锌指抗病毒蛋白（ZAP，基因名 ZC3HAV1）以病毒 RNA 中的 CpG 二核苷酸为靶标，并招募细胞RNA降解复合物来降解病毒RNA基因组，因此避免使用 CGN 密码子在病毒进化上是合理的。与之对应地，NC_045512中的 SARS-2-Spike 包含42个Arg残基，其中30个由 AGR 密码子编码，只有12个由 CGN 密码子编码。然而，人类基因使用CGN的频率高于AGR密码子。辉瑞/BioNTech采用了典型的复合密码子优化策略，在BNT-162b2的CDS区域减少了8个AGR密码子，对应增加了CGN密码子。mRNA疫苗的高CpG同时赋予其较高的稳定性和安全性。Moderna开发的mRNA-1273也使用了这一策略，但在数量上有所差异，菌菌将在下期文章中对mRNA-1273序列进行详细解析，敬请关注。类似地，高表达的人类核糖体蛋白中，81%的亮氨酸通过CUN密码子编码。因此，在mRNA疫苗BNT-162b2中，多数的UUR被替换为CUN。1.2 家族内密码子优化家族内密码子优化的原则是替换为高表达基因优选且被最丰富的tRNA解码的最佳密码子。基于上述原则，在编码Arg的密码子中，CGG被认为是CGN家族中的最优解，BNT-162b2和mRNA-1273也基于此进行了优化。而在Glu编码密码子的优化方面，辉瑞/BioNTech采用了自由优化策略。BNT-162b2保留了14/34个GAA密码子，而没有选择全部替换为tRNA丰度最高的GAG密码子。当前密码子优化主要以CAI（密码子适应指数）为基本的优化参数。BNT-162b2的CAI约为0.95，相比天然新冠病毒S蛋白编码区域（CAI＜0.7）大幅改善。02 BNT162b2的非编码区序列设计2.1 BNT162b2 5’ UTR序列设计5’UTR为非编码区域，位于mRNA编码区（CDS）上游，是核糖体起始翻译的结合位点。5’UTR主要发挥2个重要功能：提升mRNA稳定性和起始翻译。在mRNA疫苗研发过程中，有三种 5’UTR序列优化策略。第一种也是最简单的，直接选取高表达的人类基因 5’UTR，例如人alpha珠蛋白的 5’UTR。这一策略在mRNA序列设计中较为常见，BNT162b2直接选取了人alpha珠蛋白基因的5’UTR，在此基础上针对Kozak序列进行了优化，具体为使用GCCACCAUG替换了ACCAUG。第二种方法是使用病原体mRNA自身的5’UTR，这一策略目前主要用于自复制RNA(saRNA)的序列设计，如日本厚生劳动省（PMDA）获批的ARCT-154。关于ARCT-154的序列解析可戳链接查看：全球首款自复制RNA(saRNA)传染病疫苗ARCT-154的序列解析第三种是通过指数富集（SELEX）的方式来实现 5’UTR的系统演化，这种方法有一定的筛选难度较大。不同的5’UTR序列可能适用于不同的mRNA编码序列、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可扫描文末二维码联系菌菌~2.2 BNT162b2 3’UTR序列设计3’UTR位于mRNA编码区（CDS）下游，与5’UTR的功能和设计原则较为相似。辉瑞/BioNTech融合了天然序列和SELEX筛选序列。BNT162b2 3’UTR的部分片段来自人类线粒体12S rRNA（mtRNR1），其余片段为人AES/TLE5基因。AES/TLE5上存在2个C→U(Ψ)突变以提高结合能量。BNT162b2的CDS与3’UTR中间存在6个碱基），随后是136 nt的AES突变序列片段，再下游是139 nt的mtRNR1序列。2.3 BNT162b2 poly(A)序列设计为维持mRNA疫苗的稳定性，BNT162b2采用了分段式poly(A)序列：长度为110 nt的poly(A)由30个腺苷、10个非纯A序列、以及下游的70个腺苷组成。03 总结随着mRNA工艺路线的不断升级，无疑推动了各类体外转录RNA（IVT RNA）疫苗/药物的开发进程，深刻地影响生物医药领域的格局。IVT RNA的开发前景广阔，当前正在从人用药领域拓展至畜牧养殖、水产养殖和宠物领域。合理的序列设计是mRNA开发的首要目的。基于多年的技术沉淀，耀海生物开发了自有的mRNA体外转录质粒载体、建立了天然UTR和改造UTR库、自主研发了mRNA纯化工艺和检测方法，全力推动mRNA制品的研发进程。参考文献[1] Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3;9(7):734. doi: 10.3390/vaccines9070734. [2] WHO. Messenger RNA vaccines.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。