Insulin Glulisine Recombinant

☝ 点击上方 一键预约 ☝   最新最热的医药健康新闻政策曾几何时，降糖药物是胰岛素的天下。在2018年全球销售额TOP 100的头部药物中，共有15款降糖药物入围，而其中8款为胰岛素类药物。按销售额计算，当年胰岛素药物占全球头部降糖药物的49.5%。然而，随着GLP-1、SGLTE2、DPP-4等新式降糖药物的逐渐崛起，胰岛素药物在全球头部降糖药物的比重不断降低，至2022年已经仅为16.7%。图：全球头部降糖药物格局，来源：锦缎研究院究竟是何原因导致了百年胰岛素的衰落？其背后又存在哪些启示？这两个问题将是本篇报告所谈论的重点。01当降糖不再是唯一目标胰岛素是人类历史上最伟大的医学发现之一。在探明胰岛素之前，人类对于糖尿病几乎没有办法，甚至弄不明白它的发病原理。直至1910年，英国科学家沙弗提出糖尿病人是由于缺乏胰腺在正常状态下分泌的一种物质所导致，这才揭开了胰岛素的神秘面纱。1921年，加拿大生物学家弗雷德里克·班廷与他的学生查尔斯·贝斯在前人理论基础上，向一只狗注射了8毫升的胰腺粗提取物，由此初步证明了胰岛素的有效性。次年，加拿大糖代谢领域的权威麦克劳德与生物化学家科利普找到了一种从胰腺中获得胰岛素的实用方法，并完成了医学史上首个糖尿病人的胰岛素疗法临床试验。自此之后，胰岛素便成为人类治疗糖尿病的唯一药物。这一趋势直到20世纪50年代才被打破。1956年，人类第一代非胰岛素降糖药物磺脲类药物走上历史舞台，口服降糖药物的问世使2型糖尿病从纯胰岛素治疗模式中解脱出来；一年之后，另外一款降糖药物二甲双胍也成功上市，由此开启了人类对于降糖药物新模式的摸索。20世纪后期，降糖药物的研发达到高潮。首先是1986年，第一个α糖苷酶抑制剂阿卡波糖于瑞士上市，阿卡波糖也曾一度因其独特的机理而在国内获得巨大成功；而后在1998年和1999年，非磺酰脲类产品瑞格列奈与噻唑烷二酮类吡格列酮分别获批上市，至此降糖药物的种类已经增至6款。尽管降糖药物的选择更加多元化，但胰岛素依然是当时最为成熟的品类。进入21世纪后，新式降糖药物集中爆发，目前火爆的GLP-1、DDP-4和SGLT2类药物分别在2005年、2006年和2013年被研发出来，从而让2型糖尿病人的选择愈发丰富。图：市场中主要降糖药分类，来源：中信证券由于糖尿病人很容易出现其他并发症，与只能起到降糖效果的胰岛素相比，兼具减重、降压、降尿酸等功效的新型降糖药无疑更具优势，如GLP-1受体激动剂的减重适应症，SGLT2抑制剂的心衰适应症等。之所以新型降糖药可以成功，正是满足了糖尿病患者降糖之外的需求，使得以一点点蚕食胰岛素的市场份额。02内卷之下的价格战除新型降糖药异军突起的因素外，胰岛素行业内卷所带来的价格战也是逐渐衰落的重要原因。胰岛素的内卷最早发生于国内。早在2021年的时候，我国就组织了针对胰岛素的专项集采。相关数据显示，集采之前的2020年，我国公立医疗机构终端胰岛素及其类似药销售额约270亿元，诺和诺德、赛诺菲、礼来三家外资企业市场份额合计超70%，国内企业中仅甘李药业市占率勉强突破10%。这种竞争格局下，外企掌握了绝对话语权，国家出手集采也在意料之中。那一次胰岛素集采中，专项集采数量对应金额约为170亿元，约占2020年胰岛素市场的三分之二，按照集采前价格计算，集采可为国家医保节省约90亿元。最终，胰岛素专项集采中选产品平均降幅高达45%。胰岛素集采过后，市场格局发生剧变，进而加速实现国产替代。虽然短期内对参与企业的经营造成较大影响，但随着“以量补价”效应逐渐显现之后，海外药企因利润空间降低，市场份额逐渐缩减，国产胰岛素企业业绩或将触底反弹。失去胰岛素市场这块大蛋糕后，胰岛素“三巨头”礼来、诺和诺德、赛诺菲只得将更多注意力放到美国市场，但谁也没有想到的是美国也会“集采”。2022年8月，美国国会通过的《通胀削减法案》，要求医疗保险部分覆盖患者的胰岛素自付费用上限为每月35美元，自2023年1月1日起生效。为了保住自身的市场份额，礼来、诺和诺德和赛诺菲相继主动“断崖式”降价。具体来看，礼来的赖脯胰岛素注射液Humalog和二代人胰岛素Humulin均降价70%；诺和诺德不同品种胰岛素降价幅度在65%-75%之间；赛诺菲将其在美国广泛使用的甘精胰岛素注射液Lantus的标价下调78%。如此大幅的降价幅度，惨烈度甚至远超国内市场。一直以来，美国市场都是胰岛素避风港。自1996年以来，美国市场上的胰岛素的价格上涨超过十倍，胰岛素“三巨头”也在这一过程中赚得盆满钵满。而经此一役后，各家胰岛素“断崖式”降价，仅美国市场就将蒸发近百亿美元的市场规模。03遭遇技术瓶颈不少人都将胰岛素“断崖式”降价归结为政策驱动的产业内卷。然而，政策因素外，胰岛素产品本身遭遇技术瓶颈也是核心原因之一。在过去一个世纪的发展中，胰岛素共实现了三次技术迭代，而正是这一次次技术跃迁，造就了胰岛素的百年辉煌。图：胰岛素迭代历史，来源：东兴证券20世纪80年代之前，所有胰岛素制剂均来源于动物，先是猪胰岛素，随后是牛胰岛素。尽管胰岛素治疗有所提升，但动物源性药物的免疫原性却是一个无法规避的问题，同时由于必须从动物提取，因此生产效率低下，被淘汰只是时间问题。不同于第一代胰岛素的动物源属性，第二代重组人胰岛素利用基因工程合成，其氨基端序列与人胰岛素成分完全相同。1983年，基因泰克联合礼来推出了首款重组DNA人胰岛素；而诺和诺德的第二代胰岛素则在1991年获批上市。尽管解决了免疫原性问题，但这些胰岛素仍是锌制剂，其药代动力学特征比生理胰岛素慢，这仍是一个不完美的解决方案。随后多年中，人类再次利用基因工程对技术对人胰岛素的氨基酸序列及结构进行了局部修饰，并由此研发出了第三代胰岛素产品——人胰岛素类似物。与第二代胰岛素相比，第三代胰岛素符合生理性胰岛素分泌曲线，能模拟人体分泌胰岛素，让全天空腹血糖更加平稳。根据作用时间，人胰岛素类似物可分为速效(超短效)、长效以及预混。第一个速效胰岛素赖脯胰岛素于1996年上市，2000年和2004年，门冬胰岛素与谷赖胰岛素先后问世。几乎在同一时期，专家通过延长六聚体的解离时间，或是单体进入血液后增加与白蛋白的结合，从而缓慢地进行降糖作用，由此研发出长效胰岛素产品。第一个每日一次的长效胰岛素甘精胰岛素于2000年获批，地特胰岛素于2005年获批。图：胰岛素产品分类，来源：头豹研究院尽管经历两次迭代后，第三代胰岛素产品已经能够基本解决糖尿病人的实际需求，但业界还是为了更长效的降糖时效而努力。2012年上市的德谷胰岛素为第四代胰岛素，是一款超长效人胰岛素类似物，降糖持续时间超过42小时。历数四代胰岛素产品，从短效到超长效，它已经完美解决了人类降糖需求，这也导致各巨头均将迭代方向延伸至提供患者依从性上，然而结果却并不美好。吸入式胰岛素曾被认为是取代胰岛素注射的主要研发方向。全球第一款吸入式胰岛素产品Exubera于2006年获FDA批准上市，但该产品的生物利用度仅相当于注射胰岛素的10%，吸入剂量和效率难以精准控制，并有导致肺癌的风险报告。最终其销量远不及预期，上市仅一年便终止销售。而另一款由Mannkind研发的Afrezza仍在艰难地推广。口服给药是胰岛素研发的长期追求，自从胰岛素问世以来研发人员始终在探索能够实现口服给药的方法。但百年来阻碍口服胰岛素的两大难关仍未被征服：生物利用度较低与药效学个体化差异较大。诺和诺德曾于2012年宣布将投资近40亿美元研发口服胰岛素，但很快就于2016年宣布终止该项目的研究。在如此多的研发无果后，胰岛素无疑陷入“注射困局”。04告别胰岛素时代美国胰岛素市场遭遇变故之后，恐怕各大药企对胰岛素的研发动力已经所剩无几。诺和诺德2023年半年报中，只有设计为每周用药1次的周制剂胰岛素类似物Icodec的研发管线和在Icodec的基础上开发了胰岛素复方周制剂Icosema（Icodec+司美格鲁肽）的III期临床，除此之外，再无胰岛素相关研发。另一家胰岛素巨头礼来的研发管线中，也仅有一款LY3209590为胰岛素相关产品，这是一款每周一次的基础胰岛素-Fc融合蛋白，由一个工程化的单链胰岛素类似物融合到IgG Fc区域，以达到长效目的，目前正在同步开展5项III期临床。作为全球胰岛素生产企业三巨头之一的赛诺菲，更是在2019年宣布停止糖尿病领域的研发以集中资源发展管线中的优势产品，这无疑是处于阴霾中的胰岛素研发的一个缩影。国内方面，依然还是以填补技术空白为主。通化东宝布局了三代、四代胰岛素的研发项目，包括精蛋白锌重组赖脯胰岛素、德谷胰岛素等；甘李药业布局了四代胰岛素GZR4和新型预混双胰岛素复方制剂GZR101。然而，与胰岛素研发相比，国内胰岛素“双雄”对GLP-1似乎更感兴趣。通化东宝GLP-1相关研发达到6项，甘李药业也在重点推进一款GLP-1周制剂GZR18。不可否认，胰岛素的出现曾经成为人类的救命稻草。可随着人类在降糖领域的不断拓局，功能单一的胰岛素药物无疑优势不再，甚至有市场份额进一步降低的风险。放眼未来，胰岛素将从“创新药”逻辑，逐渐切换为“仿制药”逻辑，虽然其依然是降糖药物不可或缺的一部分，但技术含金量则在持续降低。尤其是失去赚钱效应后，关于胰岛素的技术研发或将难以再更进一步。（来源:医曜 作者:黄仲平）药闻康策新媒体矩阵微信公众号点击下方  一键关注  【免责声明】1.“药闻康策”部分文章信息来源于网络转载是出于传递更多信息之目的，并不意味着赞同其观点或证实其内容的真实性。如对内容有疑议，请及时与我司联系。2.“药闻康策”致力于提供合理、准确、完整的资讯信息，但不保证信息的合理性、准确性和完整性，且不对因信息的不合理、不准确或遗漏导致的任何损失或损害承担责任。3.“药闻康策”所有信息仅供参考，不做任何商业交易或医疗服务的根据，如自行使用“药闻康策”内容发生偏差，我司不承担任何责任，包括但不限于法律责任，赔偿责任。欢迎转发分享、收藏、点赞、点在看

1982年，重组人胰岛素注射液优泌林(HumulinR)成为FDA批准的第一种以蛋白质为基础的疗法。今天，基于蛋白质的药物已构成了一个接近4000亿美元的市场，有数百个蛋白药物获得批准上市。在过去的150年里，在利用蛋白质创造新药方面取得了根本性的进展(图1)。1891年基于抗体的白喉治疗方法是一个重要的里程碑，并被授予了第一个诺贝尔医学奖。二十年后，从猪胰腺中提取胰岛素用于治疗糖尿病标志着另一个重大进步--使用外源蛋白质治疗内源性缺陷。然而该规模生产具有挑战性。此外，从动物中提取的蛋白质可能会在患者中引发免疫反应，并可能引发动物相关的疾病。1982年，重组DNA技术被用来在细菌宿主中生产胰岛素，这是一个突破性的时刻。重组DNA技术的应用成功帮助避开了动物来源蛋白的难以规模化和免疫原性方面的挑战。图1. 蛋白质疗法重大进展的时间线尽管如此，由于蛋白质对聚集、降解、变性和伴随的活性丧失的固有敏感性，仍有一些内在的瓶颈需要解决。此外，体内清除不及时、非特异性分布、免疫原性和毒性也引起了相关的关注。基于蛋白设计的进步和有意识地引入化学和结构修饰大大的解决了此类难题，这才促使了蛋白质疗法的巨大成功。本文我们就驱动蛋白质疗法化学设计的关键考虑因素和策略，从而实现这些蛋白疗法的全部潜力做一个简要介绍。推动蛋白质疗法化学设计的关键考虑因素要发挥有效的治疗作用，蛋白质必须具有具备某些理想特性(图2)。一个关键的考虑因素是蛋白质在储存条件下和体内的稳定性。许多蛋白质容易聚集、降解和变性，这可能会显著降低效率。许多蛋白质对温度的变化很敏感。此外，某些蛋白质表面的残基可以与容器表面表现出良好的相互作用，导致吸附并降低可用于治疗作用的活性成分的浓度。因此，一些结构修饰(例如，定点突变和聚乙二醇化)被用来改善蛋白质的溶解性和稳定性。图2. 基于蛋白质的疗法的理想特征以蛋白质为基础的疗法也必须表现出适当的药代动力学和药效学才能发挥最佳作用。例如，一种快速从体内清除的蛋白质不适合需要持续作用的临床应用。另一方面，一种蛋白质循环很长时间可能会引起副作用。同样，蛋白质药物不能干扰人体的神经功能或引起不必要的免疫反应。为了应对这些挑战，各种策略已经被开发出来，包括聚乙二醇化、糖基化、脂化和蛋白融合。开发基于蛋白质的药物的另一个重要考虑因素是靶向性。从降低治疗剂量和减少副作用的角度来看，将药物靶向特定组织或器官的能力是非常有必要的。例如，ADC可以用来将药物靶向表达特定抗原的细胞。许多蛋白质容易在肝、肾和脾中堆积，纳入靶向部分可以促进在这些器官之外的分布。目前大多数以蛋白质为基础的药物都有细胞外靶点。与小分子药物相比，相对较大的尺寸和不均匀的表面电荷使大多数蛋白质不能渗透到细胞膜。细胞内给药受到高度追捧，因为拦截有害的细胞内过程可以带来高效的药物。新出现的化学策略，如添加细胞穿透肽、supercharging和DNA嫁接，已显示出巨大潜力。虽然对化学修饰可以赋予蛋白质几种有利的特性，但它们也可能改变药物的效力。通常，高效力是一个理想的特征，因为它可以降低治疗剂量。设计基于蛋白质的疗法的主要挑战是既能获得某种功能，又不会导致另一种功能的丧失。图3总结了现有的和新兴的化学设计战略实现这一平衡的策略。图3. 结构和化学设计策略及其对蛋白质类药物性能的影响已建立的化学设计策略位点突变位点特异性突变已经成为一种广泛使用的方法来增强蛋白质的性能。这方面的一个经典例子是具有不同作用动力学的胰岛素变体的开发(表1)。例如，在α链的第21个氨基酸上用甘氨酸取代天冬酰胺，并在β链上添加2个精氨酸，产生了甘精胰岛素，这是一种作用时间长达24小时的长效变体。这些氨基酸修饰提高了等电点(pI)接近生理pH，导致注射时沉淀，从而降低了吸收率。也可以进行替代，以减少自结合并增加吸收速率。例如，Insulin Glulisine β链天冬酰胺(第3位)和赖氨酸(第29位)分别与赖氨酸和谷氨酸交换。其等电点从5.5降至5.1增加了溶解度，同时减少了六聚体的形成，从而使得快速起效。表1. FDA批准的胰岛素变体位点特异性突变也可用于调节蛋白质在溶液中的稳定性，从而产生更稳定的配方。一种公认的修饰包括用其他氨基酸如丝氨酸取代半胱氨酸，以防止形成非天然的二硫键或半胱氨酸氧化。它已被用于获得批准的各种蛋白质疗法，包括aldesleukin (Proleukin), interferon β1b (Betaseron), 和pegfilgrastim (Neulasta)。位点特异性突变也通常用于控制体内基于IgG的抗体行为。例如，可以通过在Fc区域引入突变来调节半衰期，这些突变改变了与FcRn结合。Fc结构域M428L/N434S(LS变体)和M252Y/S254T/T256E(YTE变体)的是此类修饰的两个常用的例子。相比亲本抗体eculizumab(Soliris)，LS变体raverizumab(Ultomiris)已被FDA批准以增加循环半衰期。除了调节半衰期，Fc突变还可以增加或降低抗体效应器功能，例如ADCC、ADCP、CDC。一个经典的例子是治疗关节炎的融合蛋白abatacept(Orencia)，其Fc部分的C220S/C226S/C229S/P238S突变导致与CDC和ADCC相关的细胞毒性显著降低。引入位点特异性突变的主要挑战是突变可能会对结构产生负面影响例如，阻止蛋白质的正确折叠，降低构象/胶体稳定性或导致蛋白质功能下降。此外，在某些情况下，很难事先预测突变可能如何影响蛋白质的稳定性和功能。聚乙二醇化延长蛋白质疗法半衰期的最常见策略之一是将聚乙二醇链附着到表面。聚乙二醇化增加了总的流体力学直径，降低药物从体内的清除率。此外，聚乙二醇化可以提高溶解性，防止蛋白质降解或保护免疫原性表位不被免疫系统识别。第一种聚乙二醇化的蛋白质 Adagen，于1990年获得批准，在接下来的三年里，FDA又批准了几种药物。先前批准的蛋白质也已经被聚乙二醇化，以产生作用时间更长的变体，减少了频繁给药。例如，用于治疗血友病A的turoctocog alfa(NovoEight，FDA于2013年批准)被转化为长效药物turoctocog alfa pegol(Eperoct，FDA于2019年批准)。早期聚乙二醇化通过赖氨酸和N末端上的氨基的结合，以非特异性的方式大量修饰蛋白质，由此产生的异质性产品可能具有非常不同的治疗特性。后来大量的努力集中在蛋白质的特定部位的异构化，以克服这些缺点。一个例子是certolizumab pegol(Cimzia)，它通过经过改造的未配对半胱氨酸与聚乙二醇结合。聚乙二醇化会对蛋白质活性产生负面影响，在某些情况下，活性损失高达~99%。此外，一些报告称聚乙二醇本身可以具有免疫原性，这促使人们研究使用非聚乙二醇型聚合物作为替代品。聚乙二醇化也引起了人们对体内不必要的聚乙二醇聚积的担忧。为了缓解这个问题，一些研究人员探索了将生物可裂解部分加入到聚乙二醇链中。Fc融合Fc融合蛋白构成了一类工程疗法。通常，FC融合是为了提高循环半衰期。Fc部分能够通过增加融合蛋白的流体动力学直径来减缓肾滤过，并通过与FcRn受体的相互作用来延长循环半衰期。这种方法的代表例子是efmoroctocog alfa(ELoctate)和eftrenonacog alfa(Alprolix)。与传统的凝血Factor VIII蛋白相比，ELoctate的循环时间延长了约1.4-1.8倍，从而减少了患者注射的频率。Alprolix的Factor IX循环时间比未修饰的Factor IX高约3倍。添加Fc部分还有助于增加效应器功能(ADCC、ADCP等)。FDA批准的治疗炎症的TNF-α阻滞剂etanercept (Enbrel)说明了Fc融合的另一个潜在益处。TNF-α受体被融合到Fc部分后，形成二硫键而二聚化。这种二聚化导致了与TNF-α的亲和力明显高于TNF-α受体本身。Fc融合的益处是能够对整个结构进行基因编码。这与聚乙二醇化不同。缺点为Fc融合可引起不想要的效应器反应。与其他蛋白融合增加蛋白质治疗半衰期的一种常见策略是将其与另一种循环时间较长的蛋白质融合。人血清白蛋白(HSA)因其较长的半衰期(~19天)而成为广泛使用的融合伙伴。此外，与HSA的结合增加了结构的大小，降低了肾滤过的速度，并保护其融合伙伴免受体内潜在的蛋白酶降解。临床成功的一个重要例子是用于治疗血友病B的albutrepenonacog alfa(Idelvion)。HSA的融合将半衰期从~22延长到~102 h。融合蛋白也可以导致双特异性蛋白的产生。FDA批准的T细胞激活剂blinatumomab就是一个著名的例子。在这里，抗体的不同ScFv通过一个多肽部分连接在一起。一个scFv识别T细胞上的CD3，而另一个scFv识别恶性B细胞上的CD19。因此，同时结合这两个靶点将癌细胞与激活的免疫细胞联系起来。T细胞可以分泌各种酶，从而导致癌细胞死亡。糖工程学糖基化是由细胞内的酶机制介导的翻译后修饰，其中寡糖基团共价连接到蛋白质结构上，最常见的是天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(O-连接)残基。某些治疗性蛋白质，如胰岛素，不是糖基化的，因此可以在原核宿主中表达。然而，大多数被批准的结构都是糖基化的。不能糖基化的宿主不适合表达该类蛋白。在这方面，蛋白质疗法兴起的一个关键进展是使用重组DNA技术在适当的宿主细胞中表达糖蛋白。“合适的”宿主细胞通常是哺乳动物--与其他真核宿主相比，人类体内的糖基化结构的免疫原性较低。除了影响免疫原性外，糖基化还可以影响蛋白质的稳定性、体内活性和药代动力学。因此，使用糖工程已成为调整蛋白质性质的一种经过充分研究的策略。在某些情况下，糖工程涉及改变或增加糖基化位点。世界上最著名的例字促红细胞生成素类似物Darbepoetin alfa(Aranesp)，它为N-连接糖基化设计了两个额外的位点。由于蛋白质大小的增加，使药物的半衰期提高了约3倍，从而减缓肾脏过滤。抗体的糖基化工程也产生了几个具有增强特性的药物。例如，CHO宿主细胞可以编程表达缺乏岩藻糖基的抗体。抗体Fc区的去岩藻糖化可增加与FcγRIIIa受体的结合，从而增强了免疫效应细胞的招募和激活。Mogamulizumab是临床使用的一个经典案例。糖工程优化蛋白质仍然存在挑战，例如很难预先预测变化的糖型将如何影响蛋白质的性质，以及在不同的糖基化特性和不同位点时活性可能丧失。脂化脂基与蛋白质的结合已被用于增强蛋白药物的治疗性能。由于脂类能够与HSA结合，从而增强了整个结构的特征，因此经常脂化可以以增强药物的药代动力学。这一策略提供的一个潜在优势是，脂类和HSA之间的相互作用是可逆的。因此，一旦不再被伴侣结合和阻止，治疗性蛋白质成分就可以诱导发挥其作用。在某些情况下，脂质基团的存在还可以促进皮下注射的可逆多聚体的形成，从而导致体内的延长释放。Insulin detemir是第一个获得FDA批准的脂化蛋白质。它由在LysB29位用肉豆蔻酸修饰的desB30组成。脂化作用促进注射时形成二聚体，从而减缓吸收，并增加白蛋白结合，导致半衰期为~4-7h。与其他几种修饰的情况一样，脂化的一个限制是如果修饰接近活性/结合部位，可能会失去蛋白质的活性或结合强度。根据性质的不同，一些脂类也可能在体外促进聚集或在体内引发免疫反应。计算设计蛋白质的功能可以通过计算设计来增强。推动计算蛋白质设计的中心假设是安芬森的热力学假设--蛋白质折叠成它们的最低能量构象。因此，可以系统地研究不同氨基酸序列对结构的影响，并将其与功能相关联。计算机设计可用于优化治疗蛋白的各种化学、物理和药理性质。计算设计已被证明可以提高稳定性、结合亲和力、抗体效应器活性和免疫原性等。最近，从头蛋白设计已经成为设计治疗性蛋白的一条特别有吸引力的路线。这使得可以利用蛋白质生物物理学的基本原理从头开始设计蛋白质。这一领域的努力导致了IL-2和IL-15、PD-1激动剂和SARS-CoV-2抑制剂等有效模拟物的鉴定。一个值得注意的例子是IL-2 mimic NL-201，这是世界上第一个蛋白质疗法的从头设计，已经显示出作为抗癌免疫疗法的潜力。天然的IL-2由于与IL-2受体的α链结合而产生的毒性限制了其临床应用。相反，NL-201仅与IL-2受体的β和γ链结合，从而诱导抗肿瘤效应T细胞的增殖，同时避免毒性。此外，由于IL-2和IL-15受体在结构上的相似性，NL-201还能够与IL-15受体的β和γ链结合，从而导致抗肿瘤NK细胞的扩增。蛋白计算设计中的主要挑战是浏览蛋白质复杂的构象能量图景并定位所需的低能量结构。该方法还需要高效的采样方法、计算能力和机器学习算法的持续改进，以准确预测所需的结构。新兴的化学设计策略近年来，多种新兴的化学设计策略也得到大大的开发，旨在进一步优化蛋白疗法的性能（图4）。                                        图4. 新兴的化学设计策略Supercharged 蛋白Supercharged 蛋白构成了一组结构，每Kda包含一个以上的净电荷。这些高度带电的蛋白质既可以是工程制造的，也可以在自然界中找到，并具有独特的性质。例如，它们对热或化学压力引起的聚集表现出很强的抵抗。这意味着，在由于压力而去折叠时，Supercharged的变体可以重新折叠并显示出显著的活性。此外，正supercharged蛋白可以通过与细胞表面蛋白多糖结合而大量进入细胞，使其适用于需要细胞内递送。已经通过突变改造了几种蛋白质来创造supercharged变体，包括谷胱甘S-转移酶和GFP。Supercharged还可以用作融合伙伴，在细胞内运送其他蛋白质。非聚乙二醇型聚合物的附着聚乙二醇以外的聚合物对蛋白质的共价修饰仍然是一个活跃的研究领域。在这方面，DNA是一种很有希望的选择，其中蛋白质与DNA的密集功能化导致被称为蛋白质球形核酸(ProSNAs)的结构具有几个优势。首先，DNA壳可以增强结构的稳定性，既增加了对蛋白酶降解的抵抗力，又增加了溶解性。其次，与未经修饰的蛋白相比，ProSNAs显示出更长的循环时间和更多的分布到肝脏以外的区域。最后，DNA在蛋白质核心周围的密集排列导致了细胞表面清道夫受体的识别，使细胞的摄取能力比未经修饰的蛋白质高出280倍。几份研究报告已经利用了ProSNAs，包括用于体内递送高活性蛋白质和用于癌症生物标记的细胞内检测。这些结构的一个缺点是，它们的摄取是通过内吞作用发生的，这意味着如果治疗靶点在细胞溶质中，则必须有足够量的内体逃脱。其他融合伙伴使用多肽链作为蛋白质治疗的融合伙伴是一个活跃的研究领域。与聚乙二醇化结构相比，这些结构提供了几个潜在的优势，包括能够对其产物进行基因编码以消除对化学连接的需要，获得更均一的最终产品，并提供更大的设计空间，其中可以精确地调整多肽的长度和同一性以产生所需的整体性质。Stemmer等人的研究成果报告了他们使用E. coli表达和筛选不同多肽序列的大型文库，每个文库包含864个氨基酸。对候选者进行了遗传稳定性、聚集倾向、热敏感性和溶解性等因素的评估。基于这些标准，一种名为XTEN的候选多肽被用作融合伙伴，并对其递送有利特性的潜力进行了评估。XTEN部分被证明是非免疫原性的，即使在聚乙二醇化引起免疫反应的情况下，当与GFP融合时产生~12倍增长的循环时间，并且具有强大的溶解性，从而增强了其有效载荷伙伴的稳定性。值得注意的是，半衰期高度依赖于XTEN序列的长度，这提供了一种改变药代动力学性质的可调方法。目前XTEN融合技术已被用于多个融合蛋白药物开发。其中生长激素XTEN融合蛋白处于III期临床研究阶段，半衰期延长到131h，明显高于天然生长激素。艾塞那肽融合XTEN后，猴子体内试验证实半衰期从30min提高到60h。使用其他融合伙伴也可以赋予结构与靶向相关的有趣特性。例如，可以利用转铁蛋白融合，从而运输蛋白质穿过血脑屏障。非天然氨基酸(UAA)将UAA插入到蛋白质结构中是一个特别有趣的工作领域，因为它们可以被定点放置，并且它们的双正交官能团可以被用于化学连接。例如，UAA在A D C应用以实现进行位点特异性偶联。引入UAA的抗体与药物连接子可定点、定量偶联，获得 DAR 均一、药效高、稳定性好、安全性高的 ADC。Ambrx 公司的 ARX788 是首个利用非天然氨基酸开发的抗体偶联药物，目前处于临床研究阶段。ARX788选择的非天然氨基酸是乙酰苯丙氨酸（pAF），pAF上的酮基可与有效载荷AS269上的羟胺基团形成肟键，发生位点特异性的偶联，从而产生均质的ADC。小结基于蛋白质的疗法给现代医学带来了革命性的变化。该疗法期望具有一系列理想的性质，包括构象和胶体稳定性、充足的循环时间、高效和无毒性。加强这些特性的结构/化学设计策略的出现对该领域是不可或缺的，并促进了该领域的大大进步。未来这些技术的进一步突破将会推动蛋白质疗法的持续进化。参考文献Engineering protein-based therapeutics through structural and chemical design.Recent advancements in fusion protein technologies in oncotherapy: A review.Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond.