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前言 从1922年胰岛素首次应用于临床治疗以来，多肽药物已历经100多年的发展。多肽通常由10-40个氨基酸组成，分子质量一般小于10kDa。由于多肽分子量介于小分子与生物大分子之间，因此多肽药物兼具高选择性、高活性、低浓度和低毒副作用的特点。近年来，随着度拉糖肽、索马鲁肽和替尔泊肽等多个爆款药物的获批，多肽类药物研发成为全球最热门药物研发领域之一。截至2023年11月，全球约90款多肽药物上市，中国已上市多肽药物约有40余款，主要涉及GLP-1/1R、Insulin、HER2等多靶点，其中最热门的靶点莫过于GLP-1/1R。针对多肽药物的药代动力学研究，药性评价部已整理发布专题文章，亦可在文末扩展阅读：多肽药物的研发和药代动力学研究策略多肽类药物的代谢特征及优化策略多肽药物的发展及其分析策略本文将围绕2023年工业界发布的多肽药物ADME研究的行业白皮书《Metabolism and Excretion of Therapeutic Peptides: Current Industry Practices, Perspectives, and Recommendations》[1]来介绍多肽药物体内ADME的研究现状和研究策略，并且分享放射性标记技术在多肽药代动力学研究应用中的关键考量。多肽药物放射性ADME研究现状根据结构差异，多肽药物可分为三个类型：(a) 仅由天然氨基酸组成的线性肽（TPepA）；(b) 含有非天然氨基酸和/或具有亲脂性侧链的有机连接物的线性肽（TPepB）；(c) 环肽（TPepC）。白皮书总结了2011年至2022年FDA批准的31款多肽药物。我们在已报道数据基础上总结2023年FDA新增批准的6款多肽药物，分别为Trofinetide（曲芬尼肽）、Rezafungin（瑞扎芬净）、Paxlovid（帕罗韦德）、Flotufolastat F 18、Motixafortide（莫替沙福肽）和Zilucoplan，补充在图1中。这37款多肽药物包括TPepA天然氨基酸线性肽8个，TPepB非天然氨基酸线性肽19个，TPepC环肽10个。图1. 2011年至2023年FDA批准的多肽药物汇总（左右滑动，查看更多）2011年至2023年FDA批准的37款多肽药物体外代谢研究总结见表1（代谢和排泄研究汇总详见文末附表A），三个类型多肽药物均在多种生物基质中进行了体外代谢研究，肝相关基质最常被用于研究含有非天然氨基酸和有机连接基团的TPepB和TPepC。其中部分药物如Difelikefalin（地非法林）、Odevixibat（奥维昔巴特）等采用14C和/或3H放射性标记进行了体外多种生物基质的研究。表1. 2011年至2023年FDA批准的多肽药物体外代谢研究总结注：NS，提交的公开文件中未提及任何相关研究；括号()中数字表示FDA批准的37个多肽药物中开展该基质类型体外代谢研究的数目。在这37款药物中，73%的药物（主要为TPepB和TPepC）通过放射性标记进行了动物或/和人体内ADME研究，总结见表2 (代谢和排泄研究汇总详见附表A）。获批的多肽药物中，9款药物（博赛泼维、特拉匹韦、奥比他韦、帕利瑞韦、格佐匹韦、伏沙匹韦、地非法林、奥维昔巴特和曲芬尼肽）的结构与小分子相似（分子量小于1000），含有非天然氨基酸，均进行了人体放射性标记ADME研究，阐明多肽药物在人体内代谢及消除规律。表2. 2011年至2023年FDA批准的多肽药物放射性标记体内代谢和排泄研究总结注：NS，提交的公开文件中未提及任何相关研究；括号()中数字表示FDA批准的37个多肽药物中开展体内放射性标记研究的数目。多肽药物体内ADME研究的行业建议目前还没有针对多肽药物代谢和排泄研究的监管指南，综合行业现状和监管机构要求，白皮书提供了是否需要进行放射性标记ADME实验以支持多肽药物上市研究的决策树（图2）。对于仅含天然氨基酸的肽，无需进行体外代谢产物鉴定和体内代谢/排泄研究，遵循ICH-S6(R1)[2]以进行监管备案。但是当需要代谢信息帮助理解PK/PD的关系时需要进行该研究。对于含非天然氨基酸和/或有机连接基团的肽（TPepB和TPepC），有以下三种情况需要考虑：如果该多肽药物含有已上市的非天然氨基酸或有机连接基团，且在人体中显示安全，则可能没有必要进行放射性标记的ADME研究。但仍需进行代谢研究，以评价主要循环和潜在活性代谢物。如果多肽药物含有新型非天然氨基酸和/或被嵌入任何尚未上市药物的新的有机连接基团，一般建议对新的基团进行放射性标记以开展多肽药物的ADME研究，从而表征其代谢和消除途径。值得注意的是，如果包含多个(≥3)新型非天然氨基酸和/或有机连接基团，无需对所有这些新的基团进行标记。若提供足够的体外和/或体内ADME数据或文献来证明特定非天然氨基酸或有机连接基团的安全性，则可以不进行放射性标记代谢和排泄研究。图2. 多肽药物ADME研究行业建议放射性核素在多肽药物体内ADME研究中的使用情况和标记位点考量放射性示踪标记是一种广泛应用于研究小分子以及多肽、寡核苷酸和ADC等药物体内ADME特性的技术。与小分子类似，多肽药物通常用14C、3H[3-6]标记，其它放射性核素，比如18F或125I标记也有少量应用。在2011年至2023年期间获得FDA批准的37款多肽药物中，17款药物应用14C标记进行体内ADME研究，4款药物应用3H标记，另有4款药物研发早期应用3H标记，后期应用14C标记化合物，1款药物为125I标记，1款药物（诊断药物）为18F标记，其它药物为仅含天然氨基酸的线性肽（TPepA）或者有足够的安全性支持数据，未进行放射性标记的ADME研究。14C标记与其他放射性同位素相比更具优势[7] ：如采用3H标记，可能由于氢-氚交换导致3H从分子中丢失[8]，从而影响ADME研究的准确性；如采用125I标记，125I标记可能会改变分子的结构和组成及ADME性质（特别是小肽）。尽管14C是一种常用的放射性同位素，但与3H标记相比，它也具有一定的局限性。例如，14C的比活度远低于3H标记[7] ，这会使低剂量药物的放射性检测变得困难。通过在同一分子中引入多个14C原子可以提高比活度，而对于分子量较大的多肽在低剂量给药时，14C标记样品的放射性检测分析仍然存在挑战，可采用加速器质谱法（AMS）分析低放射性浓度的14C样品[9] 。与此同时，选择放射性标记的位置也至关重要，引入放射性标记位置，应能够示踪重要生物转化途径或循环代谢产物。在放射性标记ADME研究之前，多肽药物在体外和体内非放射性标记定性代谢特征有助于确定最合适的标记位点[10]。如放射性标记在天然氨基酸上，天然氨基酸释放后可能重新整合到试验种属的蛋白质中[11]，因此开展体内实验存在伦理问题，并且可能影响排泄物中放射性的总回收率。根据经验，外源性基团如新型非天然氨基酸和具有亲脂性侧链的有机连接物是多肽中优于天然氨基酸的首选标记位点。在需要跟踪多肽药物多个部分的情况下，可以尝试在两个或多个不同位置进行放射性标记。放射性示踪技术在多肽药物体内ADME研究中的案例分析图3. [3H]-索马鲁肽结构索马鲁肽是诺和诺德开发的一种GLP-1受体激动剂，用于治疗2型糖尿病。其分子量为4113.6，使用放射性核素3H标记位于索马鲁肽侧链十八烷二酸基团酰胺键中羰基的α,β位（共2个标记位点），如图3[12]所示。研究者分别开展了3H索马鲁肽在大鼠、猴和人体内放射性ADME研究，采用液体闪烁计数仪（LSC）测定总放射性强度。结果显示，大鼠总放射性回收率为94%，远高于人的75%和猴的58%，详见表3[12]。其中大鼠尸体总放射性强度占比为22%，是其总回收率高于人和猴的主要原因。人和猴总放射性回收率偏低，推测可能是由于3H索马鲁肽在体内发生氢-氚交换而从分子中丢失导致，也可能是3H索马鲁肽水解生成3H十八烷二酸进入体内循环所致。为提高多肽类药物人体物质平衡总放射性回收率，降低氢-氚交换的影响，推荐采用14C标记化合物开展多肽药物ADME研究，但仍需要综合考虑多肽药物的给药剂量，分子量和14C标记的放射性比活度。表3. 单次皮下给药[3H]-索马鲁肽后的放射性排泄总结[12] 结语 ✦放射性标记技术为多肽药物体内ADME研究提供一种有力工具，在应用中需要根据具体情况选择合适的同位素和标记位置，以确保研究结果的准确性和可靠性。药明康德药性评价部（DMPK）拥有放射性标记物合成、物质平衡、组织分布、代谢物谱和代谢产物鉴定等技术平台，且拥有超十年放射性项目研究经验及数百次放射性受试物的NMPA和FDA申报经验，助力全球客户快速推进多肽药物研发流程。附表A. 2011年至2023年FDA批准的多肽药物代谢和排泄研究汇总表参考文献：[1] He M M, Zhu S X, Cannon J R, et al. Metabolism and excretion of therapeutic peptides: current industry practices, perspectives, and recommendations[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2023, 51(11): 1436-1450.[2] International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2011) S6(R1) Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology‐Derived Pharmaceuticals. London, UK.[3] Subramanian R, Zhu X, Kerr S J, et al. Nonclinical pharmacokinetics, disposition, and drug-drug interaction potential of a novel d-amino acid peptide agonist of the calcium-sensing receptor AMG 416 (etelcalcetide)[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2016, 44(8): 1319-1331.[4] Jensen L, Helleberg H, Roffel A D, et al. Absorption, metabolism and excretion of the GLP-1 analogue semaglutide in humans and nonclinical species[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2017, 104: 31-41.[5] Lee S, Lee D Y. Glucagon-like peptide-1 and glucagon-like peptide-1 receptor agonists in the treatment of type 2 diabetes[J]. Annals of pediatric endocrinology & metabolism, 2017, 22(1): 15.[6] Subramanian R, Zhu X, Hock M B, et al. Pharmacokinetics, biotransformation, and excretion of [14 C] etelcalcetide (AMG 416) following a single microtracer intravenous dose in patients with chronic kidney disease on hemodialysis[J]. Clinical Pharmacokinetics, 2017, 56: 179-192.[7] Dell'isola A, Brown R T, Jones S, et al. Synthesis of carbon‐14–labelled peptides[J]. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 2019, 62(11): 713-717.[8] Knadler M P, Ackermann B L, Coutant J E, et al. Metabolism of the anticoagulant peptide, MDL 28,050, in rats[J]. Drug metabolism and disposition, 1992, 20(1): 89-95.[9] Fifield L K. Accelerator mass spectrometry and its applications[J]. Reports on Progress in Physics, 1999, 62(8): 1223.[10] Knadler M P, Ackermann B L, Coutant J E, et al. Metabolism of the anticoagulant peptide, MDL 28,050, in rats[J]. Drug metabolism and disposition, 1992, 20(1): 89-95.[11] International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2011) S6(R1) Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology‐Derived Pharmaceuticals. London, UK.[12] Jensen L, Helleberg H, Roffel A D, et al. Absorption, metabolism and excretion of the GLP-1 analogue semaglutide in humans and nonclinical species[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2017, 104: 31-41. （下滑查看更多）作者：薛佳，李鹏，郭莲，曹卫群，张玲玲编辑：钱卉娟设计：倪德伟，张莹莹免责声明“药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！