Tolbutamide

图1 致敬！为二甲双胍努力过的科学家们 二甲双胍（dimethyl biguanide，metformin）是抗糖尿病药物，也是经典口服降糖药老牌选手，自1957年问世，应用于临床已有60多年的历史，是当前全球应用最广泛的口服降糖药之一。近年来，虽然有多个新型降糖药物上市，但二甲双胍仍是全球使用量迅速增加的经典口服降糖药物。 如今，二甲双胍更是被国内外主流指南列为Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）首选药物，然而，“抗糖尿病大佬”的发现、上市和广泛应用的过程并不是一帆风顺的，甚至可以说是曲折的，那就让我们来回顾一下吧。 山羊豆，植物降糖种子选手 首先要出场的当然是二甲双胍的始祖——一种名为山羊豆的牧草，其原产于欧洲、亚洲西南部与非洲北部，现在已经遍布世界各地。 图 2 山羊豆  山羊豆（galega  officinalis），又称山羊芸香、西班牙三叶草、意大利艾鼬、法国紫丁香和教授杂草。在中世纪的欧洲，野生的山羊豆是一种动物催奶剂（Galega 在希腊语中是“牛奶兴奋剂”的意思）。山羊豆还具有广泛的药用价值，人们将山羊豆的地上部分作为草药用于缓解多尿，这正是糖尿病的典型症状之一。 其实，早在公元前1500年，人们就已经认识到糖尿病的基本临床特征——烦渴、多尿和体重下降，尿液的甜味能吸引苍蝇和蚂蚁。 1891年，山羊豆还被用作饲料而被引入美国，在畜牧业中用于牲畜催乳，提高产乳量。然而有一天，食用山羊豆的牲畜出现肺水肿、低血压、麻痹等症状，更有甚者因此而死亡，人们才意识到这牧草有毒，并将其列入了《联邦有害杂草名单》（Federal Noxious Weed List）。为了铲除它，美国花费了大量的人力和物力。  那为什么如此梦幻如此温柔的法国紫丁香是一朵“带刺的玫瑰”呢？那是因为其中含有大量的胍类化合物（guanidines），这是一类含有3个N原子、碱性极强的小分子物质。19世纪初，动物研究发现胍类物质具有降血糖功效，但最初的乐观被失望所冲平，胍类物质毒性极强，不适合用于临床。  后来，一位名为Geoges Tanret的科学家在山羊豆中发现了一种低毒性的胍类生物碱，即山羊豆素。但是由于一战的爆发，研究不得不中止，战后，Tanret又重新开始了对山羊豆素的研究，1927年，他发表了在兔和狗中所进行的关于山羊豆素的临床前研究。实际上，此项研究已经很类似于现代的毒理学研究。在研究中，不断增加山羊豆素的剂量，直到动物出现类似低血糖的症状。结果中可以看出：山羊豆素和血糖的量效反应关系是陡直的。注射较高剂量的山羊豆碱，的确具有降血糖的作用，随后进行的人体试验验证了这一结论。 然而，“豆无完豆”，由于山羊豆碱的个体治疗效果反应不一以及降糖持续时间较短，山羊豆碱也没有成功应用于临床。 图3 山羊豆素和二甲双胍化学结构式  1922年，爱尔兰都柏林化学家Emil，Werner和James Bell首次成功合成了二甲双胍。直到1929年，德国的2篇报道偶然发现，在伴有发热的动物模型（兔子和狗）中使用这种化合物具有降血糖的生物学作用。然而，由于在非糖尿病动物中需要高剂量才能达到适度的降糖作用，二甲双胍不被看好，双胍类药物也没有被开发用于糖尿病治疗，在随后的十年中被渐渐遗忘。后来的后来，人们才对二甲双胍的研究越来越深入的时候，才知道二甲双胍的实际潜力在当时是被低估了的。  几乎同时期，一系列胍类衍生物被源源不断地合成出来，但这些研究主要关注的是胍类化合物的合成问题。 德国科学家Hesse和Taubmann则关注了这些化合物的药理作用，他们对烷基取代的双胍类的生物学作用进行了更为全面的研究，并用狗和兔进行了药理学方面的研究。结果发现，受试化合物中二甲双胍的降糖效果最强，对某些动物药效甚至可以延续到第2日。  通过疟疾和流感，再次被发现 虽然二甲双胍出生于1922年，却没能趁早出名，只奈何生不逢时，被同时代诞生的胰岛素抢去了光芒。在这样的潮流下，二甲双胍岌岌无名过了数十年，天无绝人之路，在其他医学领域的一次偶然，使人们重新关注起抗糖尿病治疗的药理学研究，关注到二甲双胍。  20世纪40年代中期，一种名为proguanil（白乐君）的胍类抗疟药的研发与使用，将重新燃起希望。据报道，这种药物在动物实验中可以降低血糖含量。 无独有偶，在地球的另一边，在对其他胍类抗疟药物的研究中，菲律宾的Eusebio Garcia 医生在进行抗疟活性实验时使用了二甲双胍。1949年，二甲双胍被发现有助于治疗当地爆发的流感。这就导致了盐酸二甲双胍被作为一种名为氟胺的抗流感药物被使用，在治疗过程中，部分流感患者出现了低血糖的症状。  这接二连三的“意外的低血糖事件”，仿佛不像是偶然，激起了人们在更大范围内研究抗糖尿病药物的兴趣。 Jean Sterne的一大步 二甲双胍的“贵人”当属是法国糖尿病学家的JeanSterne，是他慧眼识英雄，将二甲双胍由降血糖潜能转化为治疗现实。 1956年，在实验室老板Jan Aron的鼓励下，Sterne对氟胺的数据进行了批判性的评估，并回忆起他多年前作为实习生时参与的一项失败了的关于山羊豆碱的研究。 也许二甲双胍会更好？ 于是，他同实验室的药剂师Denise Duval合作，首次对二甲双胍进行了基础和临床研究。首先，他们对一系列的胍类化合物在正常动物模型和糖尿病动物模型中的药效学进行了严格而系统的研究。在不知不觉中，他们重复并扩大了对胍类化合物的研究，并指出了胍类化合物具有高剂量、有限的降糖性能和高毒性等问题。 事实上，这一问题早有人已经提出，如果Sterne在进行早期研究时，阅读了Hesse和Taubmann研究的相关文献，很可能不必费力重复这些工作。 他们之所以挑选二甲双胍作为临床研究的对象，是因为其在正常和糖尿病动物模型中的降糖效果好且副作用最小，更重要的是，已经有报道人使用氟胺治疗疾病的案例。 试验对象有了，那到哪里去找合适的受试患者呢？ 这就不得不提起Sterne的另一份在巴黎Laennec医院的工作，不仅如此，他还说服了就职于Beaujon医院的Elie Azerad博士一起合作完成二甲双胍的临床研究。万事俱备了，试验就如期开始了。 试验主要针对的是接受胰岛素治疗的患者，包括青少年糖尿病和成年后出现糖尿病的患者。结果表明，二甲双胍可以替代部分成年期糖尿病患者对胰岛素的需求，降低其他糖尿病患者的胰岛素水平，但不能满足青少年发病患者对胰岛素的需求。此时，他们还注意到，试验过程中没有发生明显的低血糖，(当时有报道称使用磺脲类药物发生了严重低血糖事件)，可见二甲双胍对非糖尿病患者没有或几乎没有影响。  对于二甲双胍的基础研究，他们从一开始就是严格而系统的，不像其他早期研究者那么随意。他们十分关注化合物的合成和提纯、给药途径（口服比静脉给药有更好的耐受性）、治疗的剂量和疗程等。  Aron实验室第一次确认了血糖下降和二甲双胍毒性与药物剂量之间存在的关系，发现该药治疗的安全剂量窗口很宽，在啮齿类动物狗和兔中进行了长期（1—2年）的、大剂量药物的安全性研究。  Sterne的研究工作的重点部分是研究二甲双胍的作用机制，其中最最重大发现是证实二甲双胍降糖作用的前提是动物或人的胰腺要有一定功能。以往的研究者对血糖正常的动物要使用非常大剂量的二甲双胍才能看到降糖效果，而这剂量很可能会引起糖尿病动物的毒副反应。而且以往的研究均在血糖正常的动物中进行，低估了二甲双胍真正的安全有效剂量范围。 Sterne的研究结果显示：与血糖正常的动物相比，二甲双胍对因胰腺被部分破坏而导致糖尿病的动物具有更强的降糖效果。也就是说，二甲双胍在非糖尿病患者中并没有降糖效应。  该研究结果于1961年发表于法国。在15名血糖控制不佳的糖尿病患者中，3000mg单剂量二甲双胍能显著降低血糖；而对于7名使用胰岛素治疗、血糖控制良好的糖尿病患者和10名非糖尿病受试者，二甲双胍几乎没有降糖作用。 图4 1961年Sterne研究结果  这是一个的突破性成就！ 只有认识到二甲双胍具有选择降糖的能力，才能真正地确定它的有效降糖的剂量范围，这对于界定二甲双胍的有效治疗剂量和中毒剂量是多么可喜可贺的事。在以胰岛素或胰岛素促分泌剂的糖尿病治疗时代，Sterne、Aron及Aron实验室继承人充满热情、检测和科学的态度为二甲双胍的研究做出了卓越突出的贡献，可以说，没有Sterne，就没有今天的格华止！ Sterne医生一生发表过很多关于二甲双胍的文章，其中最最著名的就是1957年研究论文，首次将“氯胺”应用于糖尿病的临床治疗，并为其更名为“Glucophage”意为“噬葡萄糖者（glucose eater)”,中文译作“格华止”。 Sterne还曾预言：“二甲双胍口服耐受性很好，即使在长期应用后，也不会引起脏器的损害。小剂量口服具有抗高血糖作用，至于它的作用机制及其在糖尿病治疗中的最终地位还有待进一步的研究。” 这是一篇里程碑的飞跃——二甲双胍作为一种糖尿病治疗方法出现了！Sterne在研究和医师教育中发挥了突出的作用，帮助将二甲双胍从实验室阶段引入欧洲临床实践。 历史可能会倾向于认为二甲双胍的糖尿病症状是偶然发现的，但我们必须感激Sterne敏锐的求知欲、他的远见卓识、他惊人的实验技能和他敏锐的临床第六感。  一时间“一种新的可替代胰岛素的降糖口服药”风靡全球。 图5 格华止外包装图 双胍类的选择尽管二甲双胍于1958年在英国上市，1972年在加拿大上市，却在欧洲没有得到应有的重视。上市的同一年，二甲双胍的兄弟们——苯乙双胍在美国上市，商品名DBI；丁二胍在德国成功上市，商品名为Silubin。由于苯乙双胍降糖效果较强：口服苯乙双胍100mg即有显著的降糖效果，而二甲双胍每日的用量则需要1000~2000mg。因此风靡一时，相比之下，二甲双胍仅在法国得到应用，关注的目光少之又少。  然而，令谁都没想到的是，成功，对于苯乙双胍来说可能只是黄粱一梦，上市后的第二年被报道其导致乳酸性酸中毒，尽管发生率低，但死亡率极高，而后在绝大多数国家逐渐被停用，而作为同一族系的手足兄弟，二甲双胍也受到人们对其可能也具有乳酸性中毒的猜测与质疑，名誉有损，在停药的边缘徘徊。 具有讽刺意味的是，在停用苯乙双胍后不久，发现约9%的欧洲人的CYP2D6基因是突变型，该基因编码的细胞色素CYP2D6酶，可能会导致未代谢苯乙双胍的积聚，从而引起乳酸酸中毒：这是一个现代药物基因组学可以解决的问题啊。（能解决为什么要退市？冤不冤？还不是没赶上好时候）  不同于传统的经验医学，在这个反正都要讲证据的循证医学的时代，细致的观察性研究无疑是伸在二甲双胍面前的一双援助之手。具有讽刺意味的是，一项大型临床研究——美国大学糖尿病研究（UGDP）的结果却是给二甲双胍的临床应用带来了生存的威胁。这项随机研究以安慰剂加饮食控制为对照组，评估在2型糖尿病患者中使用甲苯磺丁脲、苯乙双胍或胰岛素对血管终点事件的影响。在随访7年后发现，甲苯磺丁脲组和苯乙双胍组的死亡例数明显增加。毫无疑问，UGDP研究加速了在临床上淘汰苯乙双胍，但也引起了人们对应用双胍类和磺脲类药物治疗2型糖尿病的担忧。  直到30年后，1998年，糖尿病研究领域著名的“英国前瞻性糖尿病研究（United Kingdom Prospective Diabetes Study, UKPDS）”计划中，大量的临床试验充分肯定了二甲双胍的降血糖作用。而且出减轻高血糖所致的糖毒性外，二甲双胍还具有心血管保护作用。不仅如此，二甲双胍还是目前唯一在随机对照研究中被证明具有明确心血管保护的口服降糖药。  因苯乙双胍的退市，美国食品和药物管理局(FDA)曾对二甲双胍犹豫不决，但最终还是批准了，1994年12月29日，二甲双胍由百时美施贵宝公司生产正式在美国上市。 医生们使用后赞不绝口，二甲双胍作为一种安全、有效的降糖药物逐渐被医学界所认可。2000年，二甲双胍缓释制剂获得批准，缓释制剂相比于普通制剂胃肠道副作用有所减轻。 此外，二甲双胍与磺脲类药物的新组合，以及后来与其他类口服降糖药的新组合也出现了，当这些药物以不同的作用模式联合使用时，意想不到的疗效好。 与之前的联合用药的关键性的区别是，新组合是以二甲双胍为主要成分的，而其他药物的剂量则是为辅助二甲双胍和最大程度降低低血糖而量身打造的。  二甲双胍是目前最广泛使用的口服降糖药，2011年，被纳入WHO基本药物示范目录。2012年，二甲双胍被美国糖尿病协会（American Diabetes Association, ADA）与欧洲糖尿病研究协会（European Association for the Study of Diabetes, EASD）的专家联合推荐为治疗T2DM的一线首选药物。 图6 二甲双胍发现时间轴 其他适应症 图7 二甲双胍的降糖机制 二甲双胍在降糖治疗中是不寻常的，因为它似乎没有一个单一的机制靶点；相反，它能通过多个单独但总体上很重要的效应，影响胰岛素抵抗和代谢、血管和其他生理功能。 除了降血糖以外，二甲双胍在多个其他医学领域也展现了自己的风采。 其中较早被注意到的是其对心血管的保护作用。T2DM与心血管疾病终点时间紧密相关，UKPDS研究及其随后10年随访结果发现，二甲双胍主要通过降糖作用，改善胰岛素抵抗（insulinresistance, IR），降低基础与负荷后胰岛素水平，直接或间接地起到心血管保护作用。  多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS)是导致育龄妇女不孕的最常见内分泌疾病。其发病机制是胰岛素抵抗作用，而二甲双胍恰是胰岛素增敏剂，可降低患者胰岛素水平，较少胰岛素对卵巢的刺激；还可以改善卵巢血供、改善月经周期及促进排卵等。  在英国，一项大型对照研究显示，二甲双胍治疗与降低癌症的发生风险具有相关性。目前，关于二甲双胍的抗肿瘤机制还在研究和讨论中。2009年，currie对62809例糖尿病患者进行回顾性队列研究时发现，二甲双胍组的肿瘤患病率均比其他各组底，提示二甲双胍联合胰岛素治疗比胰岛素弹药治疗更能延缓癌症发展。其后，更多的研究发现其还可以降低许多消化道肿瘤和前列腺终究等肿瘤风险。  二甲双胍对下丘脑中枢的直接调控作用表现为摄食量的减少和体中的减轻，除此之外二甲双胍还可能影响衰老过程中的分子和细胞机制，从而推迟机体老化并增加寿命，在自发性高血压鼠中，长期食物中加入二甲双胍能延长雌性杂交小鼠近40%，有望成为抗衰老药物。更有甚者“使用二甲双胍能活到120！”的说法。  二甲双胍的功效不可枚举，此处篇幅有限，就不一一列出了。  如今，二甲双胍已经上市62年了。从草药到受人尊敬的治疗药物的惊人之旅一直动荡不安。它被发现，被遗忘，被重新发现，被重新利用，被拒绝，被拯救，被证明无罪，并且可能有更多的秘密等待解开。每一个成功者的背后都有许多个不为人知的努力，Jean Sterne的一大步，是二甲双胍的关键性的一步。 如今，我们提到二甲双胍，就会想到“经典药物”“金标准”这些光环名词。然而，抛开这些，仅从二甲双胍的发现、埋没又发现的过程中，我们可以学习到什么呢？也许这个问题是一个哈姆雷特式的问题，答案可能有一千种。  但，我们都得思考，为什么它是经典，是金标准？怎么发现下一个经典？  参考文献： [1] Clifford J Bailey，Ian W Campbell，Juliana CNChan等编；余学锋译.二甲双胍金标准[M].上海：上海科学技术出版社.2009. [2] Wong E. Metformin: Its History, Safety, and Updated LabelingRecommendations[J]. The Journal for Nurse Practitioners, 2017, 13(9): 643-644. [3] Bailey C J. Metformin: historical overview[J]. Diabetologia, 2017,60(9): 1566-1576. [4] 付炎, 王于方, 吴一兵, 等. 天然药物化学史话: 二甲双胍 60 年——山羊豆开启的经典降糖药物[J]. 中草药, 2017, 48(22): 4591-4600. [5]Witters L A. The blooming of the French lilac [J]. J Clin Invest, 2001,108(8): 1105-1107. [6] Sterne J. Du nouveau dans lesantidiabétiques le NN-diméthyl-diguanidine [J]. Maroc Médical,1957, 6:1295. [7] Inzucchi S E, Bergenstal RM, Buse J B, et al.Management of hyperglycemia in type 2 diabetes: apatient-centered approach: Position statement of the American diabetesassociation (ADA) and the European association for the study of diabetes (EASD)[J]. Diab Care, 2012, 35(6): 1364-1379. [8]  张素琴, 刘峰. 二甲双胍降糖外作用的研究进展[J]. 实用医药杂志, 2017(08):84-87. [9] 潘小康. 二甲双胍降糖机制研究进展[J]. 中国糖尿病杂志, 2016, 24(7). [10] 母义明, 纪立农, 宁光,等. 二甲双胍临床应用专家共识(2016年版)[J]. 中国糖尿病杂志,2016, 24(10):871-884. 药事纵横征稿启事

深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769●  　  ●    　●目前全球有约4.6亿糖尿病患者，每年有420万人死于糖尿病，我国有近1.3亿糖尿病患者。在 1 型糖尿病中，胰岛β细胞遭到机体免疫系统无情地破坏，部分或完全失去了分泌胰岛素的功能，造成体内胰岛素绝对缺乏，引起了血糖水平持续升高，于是糖尿病出现了。胰岛移植虽可以改善患者的胰岛素不足问题，但是供源不足，临床上无法大规模开展。近年来，蓬勃发展的干细胞技术解决了一部分细胞来源问题，但也存在局限性——胰岛β细胞的转化率低、稳定性差等。因而建立一个稳定高效的胰岛β细胞制备方案很重要。本文综述了细胞起源、生物材料和用于制造人类胰岛类器官的先进技术的最新进展，并讨论了它们的优点、缺点和未来的挑战。作者望这篇综述能为构建人类胰岛类器官提供一个跨学科的视角，并为组织工程和再生医学提供见解。1胰岛β细胞是目标人类胰岛人体的胰岛素来源胰岛，胰岛是许多大小不等和形状不定的细胞团，散布在胰腺的各处。胰岛中的细胞主要由α细胞，β细胞，δ细胞和pp细胞组成。1型糖尿病是由胰岛β细胞受损，导致胰岛素分泌绝对不足造成的。1型糖尿病发病机制胰岛素是机体内唯一可以降低血糖的激素，由胰岛β细胞分泌而来。针对 1 型糖尿病，想要拯救分泌不足的胰岛素，生产源源不断的可分泌胰岛素的 β细胞是目标。类器官类器官（Organoid），最早定义是通过细胞分离和重聚来模拟器官发生。自2009年，荷兰科学家Clevers团队开发小肠类器官以来，类器官的定义变成了由器官特异性细胞组成的三维（3D）结构，其来源于多能干细胞（PSC）或成人干/祖细胞。类器官organoid被描述为“体外微型器官”或某种程度上的“人造器官”，可模拟体内器官景观，展示体内发现的一系列细胞类型，并展示器官功能的某些方面。Organoid技术已经成为一种工具，可弥合细胞和组织/器官水平的生物模型之间的差距，在保留某些生理功能的同时，更真实地描述体内组织的空间组织以及细胞和细胞外环境之间的相互作用。在过去的十年中，胰岛类器官作为一种很有希望的糖尿病模型引起了越来越多的关注，它可以揭示胰岛相关疾病的机制，并且是一个测试药物效力和毒性的良好平台。例如，胰岛类器官可以填补我们有关早期（8周妊娠）和晚期妊娠人类胰腺组织（妊娠22周）的人类胰腺发育知识的空白，有望成为糖尿病治疗中移植的新胰岛资源。2制造人类胰岛类器官的细胞构建胰岛类器官，需要胰腺内分泌细胞。适合构建胰岛类器官的细胞类型，包括：1）人类多能干细胞来源的胰岛细胞；2）通过去分化和再分化在成人胰岛中富集的胰腺内分泌细胞；3）非胰岛谱系细胞（如导管、腺泡细胞和肝细胞）。不同方案制备胰岛类器官，在结构和功能上存在显著差异。同时，辅助细胞（包括内皮细胞和间充质细胞）在胰岛类器官形成过程中有促进作用（图1）。PSC衍生的胰岛细胞系多能干细胞（PSC），包括胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC），都是理想的胰岛细胞来源。从PSC获得β细胞是一种很常见的方法，利用PSC衍生的胰岛内分泌细胞制造3D人类胰岛类器官。早在2001年，hESC系H9通过悬浮培养中形成了类胚体的形态。在分化19天后，这些类胚体平均有1–3%的胰岛素阳性细胞和更复杂的结构（如上皮或内皮样细胞结构）。随后，从PSC中提取的胰腺内分泌细胞可以体外培养富集，形成簇状结构。人ESC来源的胰岛素生成细胞也可以自我聚集成胰岛素阳性簇，并通过移植或与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）混合实现血管化。除了PSC衍生的内分泌细胞外，内胚层祖细胞也可能是胰岛类器官生成的一种有希望的资源，这可能会大大缩短体外培养时间并降低经济成本。来自人类胰岛或非胰岛谱系的胰岛内分泌细胞人类胰岛细胞也是胰岛类器官的一种细胞来源。在研究中，人类胰岛被制成单个细胞，并重新聚集成具有标准尺寸的小胰岛类器官，也被称为假胰岛。重新聚集的人类胰岛的形态与天然胰岛相似，可以改善糖尿病小鼠的糖尿病逆转。由于成熟胰岛内分泌细胞的增殖能力有限，替代方案可能是制备大量的胰岛素生成细胞。在这些研究中，通过扩张成人胰腺组织或从胎儿胰腺消化的胰腺祖细胞成功生成了人类胰岛类器官。此外，来自β细胞去分化的内分泌祖细胞可以分化为NGN3阴性、激素阳性的β（胰岛素）、α（胰高血糖素）和δ（生长抑素）类细胞。另一项研究说明了利用仿生支架构建细胞间和细胞-基质连接，以诱导β细胞去分化，从而进行再分化。或者，内胚层来源的分化细胞的反式分化也应用于胰岛类器官的生成，例如肝脏、胃肠道上皮和外分泌胰腺细胞。然而，脱分化和再分化的不同培养效率因情况而异，胰岛的扩增也存在很多争议，这限制了从成人组织中提取胰岛类器官的发展。因此，人们一直致力于寻找具有向内分泌细胞扩张和分化能力的成年胰岛内分泌祖细胞。有报道在成年小鼠胰腺中发现的新的PRORC阳性内分泌祖细胞可以在成年体内平衡期间生成新的内分泌细胞。在体外，这些PROCR阳性的前体细胞可形成以β细胞为主的功能性胰岛类器官，并被α、δ和PP细胞包围。然而，人类胰岛是否包含对应的祖细胞群仍不清楚。与PSC衍生的内分泌细胞相比，利用成人组织中的细胞可以避免移植后形成畸胎瘤的风险，糖尿病患者的胰腺细胞可以成为生成人类胰岛类器官的更自然的来源。胰岛类器官的辅助细胞内皮细胞和间充质细胞等也对胰岛的存活和功能起支持作用。胰岛有丰富的血管供应，为人类胰岛提供充足的氧气、营养供应、微调血糖传感和调节。内皮细胞可以产生多种因子，如结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和BMP-4，可增加人ESC衍生的胰腺祖细胞贴壁培养中胰岛素的表达，并介导胰岛特异性成熟。例如，HUVEC或内皮细胞已与人类胰腺祖细胞或内分泌βH1β细胞混合，以促进胰岛类器官的自我聚集、成熟和血管化[35、39、57]。除了外源性添加内皮细胞外，内皮生长因子还可以诱导人胰岛类器官的血管生成。血管生成素-2已被证明在胰岛类器官内诱导VE钙粘蛋白+内皮细胞和NG2+周细胞的广泛传播。此外，血管生成素-2可以部分补充内皮细胞对β细胞的体内旁分泌刺激，通过促进F-肌动蛋白重塑和调节钙离子内流动力学，使人类胰岛类器官具有天然的葡萄糖刺激胰岛素分泌水平。MSC也参与胰岛样类器官的构建，包括自组织、血管网络的构成和旁分泌功能：（a）间充质细胞触发自凝，这种由肌动球蛋白细胞骨架轴产生的牵引力导致细胞群的定向和剧烈运动。（b） 在肌内人胰岛移植模型中，除了触发自凝聚外，间充质细胞还支持内皮细胞相互作用：人胰岛内皮细胞从移植中心迁移到周围组织，与受体内皮细胞形成嵌合血管；（c） 据报道来自骨髓的大鼠间充质细胞通过释放HGF和TGFβ等营养因子，在水凝胶环境中支持包裹的小鼠胰岛，葡萄糖激发后胰岛素分泌增加。3制造人类胰岛类器官的材料人胰岛类器官中的生物材料可以为细胞提供3D结构的支持、细胞外环境（ECM）的模拟以及在移植后的隔离保护。用于人胰岛类器官构建的天然基质天然基质是细胞外基质（ECM）衍生物或类似物，可模拟体内组织或器官的天然ECM。天然基质分为三大类：多糖材料、蛋白质/肽基材料（如胶原蛋白、明胶、弹性蛋白和纤维蛋白）和脱细胞ECM材料。多糖材料多糖材料由于具有快速凝胶特性，适合在体外制造3D支架。1980年，首次将海藻酸钠应用于生物人工内分泌胰腺的胰岛微囊化。海藻酸钠可以保护胰岛细胞在移植后免受炎症反应的影响。海藻酸钠还可以通过包裹来源于PSC的胰腺内分泌祖细胞，用于生成人类胰岛类器官。缺点是海藻酸钠细胞粘附和细胞相互作用能力较低，无法提供细胞存活所需的细胞锚定。2020年，海藻酸钠和壳聚糖组成的胶囊，用于生成人类胰岛类器官。该胶囊具有高度的均一性，通过包封来自iPSC的胰腺内分泌细胞，为人类胰岛类器官提供3D培养。基于多糖材料在体外支持3D支架和模拟ECM生成人类胰岛类器官方面显示出巨大潜力。蛋白质/肽基材料蛋白质/肽基材料由存在于天然ECM中的基质蛋白制成，包括胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白。在这些蛋白质中，胶原蛋白是种类最丰富的结构蛋白，已被广泛用于三维干细胞培养。除了为胰岛类器官构建人工3D结构外，基于蛋白质的材料还将增强胰岛类器官的功能和成熟度。如I型胶原和IV型胶原的高表达被证明有助于人类胰腺的发育，I型胶原和IV型胶原的结合将导致培养的人类胰岛中胰岛素基因的表达高于纤维连接蛋白或层粘连蛋白。V型胶原基质的存在促进了人类胰岛类器官的再生和葡萄糖反应性激素的产生。脱细胞ECM材料脱细胞ECM（dECM）材料从脱细胞组织/器官中获得。dECM材料可以更好地模拟体内组织或器官的生态位。体内ECM具有组织特异性成分，包括特异性生长因子和大分子成分，以及机械性能。因此基于dECM的材料不仅可以作为支架，可用于在体外培养中确定特定的细胞命运。脱细胞胰腺ECM基材料成为改善胰岛细胞微环境的合适基质，并促进人PSC向胰岛细胞分化。在胰腺dECM材料上从PSC分化的细胞显示出与天然胰岛相似的细胞组成，并呈现出胰岛标志物表达增加和更多胰岛素分泌以响应葡萄糖刺激。总的来说，dECM的材料为细胞提供了一个近乎自然的微环境，但有几个限制妨碍了它们的临床应用：a）获得dECM凝胶的过程，包括脱细胞、提取和纯化，既耗时又昂贵；b）原材料资源，尤其是生物质资源的批次间可变性；c）几乎不可能控制生物物理性质和生化成分；d）这些凝胶来自可能遭受细胞相容性和病原体传播的生物体。用于人类胰岛类器官构建的合成基质材料用于药物治疗的合成基质材料通常具有生物相容性和无毒性，具有可控性、再现性、降解性和良好的机械性能等优良特性。常见的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG）及其衍生物、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-乙醇酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）、聚己内酯（PCL）。根据具体应用，合成基质可以定制为不同的特性，例如，提供ECM特性以增强体外细胞间的相互作用，并模拟天然胰岛的硬度，这使得合成基质成为一种有前途的基质材料。PCL是一种具有高机械稳定性的生物相容性和生物可降解聚酯，通过将PCL与价格合理、热稳定性高、亲水性强的PVA混合，可以改善其较差的细胞亲和性。基于PEG的基质也是一种多功能工具，用于模拟细胞微环境，并为人类胰岛类器官提供平台。与悬浮培养相比，由PEG/胶原蛋白I混合基质制成的3D培养平台对人类胰岛类器官具有优势：a）能够长期培养胰岛类器官b）保持聚集大小和形态c）不会对胰岛分化产生不利影响d）提供聚集恢复的手段。为了改善合成基质的低细胞-基质相互作用，科学家将天然成分与合成聚合物混合，例如明胶/PLGA和PEG/胶原I基质，它们也被定义为半合成基质材料。4人胰岛样类器官的制备方法3D培养为类胰岛提供一个更真实的环境和结构组织，类似于天然人类胰岛。构建的标准方法包括传统的自聚集法、改良的自聚集法和水凝胶包埋法。还将讨论3D生物打印、脱细胞器官支架和芯片上器官等新出现的方法（图3）。胰岛类器官三维结构的传统细胞自聚集细胞自聚集（自组织），是一个分离的细胞可以自组装成组织样结构的过程。低粘附性培养材料、辅助细胞和软基质等因素，均可促进细胞自聚集。例如，低附着板可以刺激人PSC衍生的游离胰腺祖细胞、内分泌细胞或人β细胞自发聚集成3D胰岛样器官。提供悬浮培养条件的旋转烧瓶可以诱导胰岛类器官的3D结构。将人胚胎干细胞悬浮在旋转瓶中形成类胚体，获得3D结构，然后进行逐步的胰岛内分泌分化。此外，间充质细胞可以帮助启动自我聚集，并改善聚集功能。MSCs触发的自组织胰岛样类器官被放置在3D打印的组织捕捉器中，并植入小鼠体内90天，具有检测血管、更多胰岛素阳性细胞和人类C肽分泌。软基质也有助于细胞的自聚集。因此，传统的体外细胞自聚集可以产生令人印象深刻的类器官微观和功能复杂性。然而，由于缺乏预先定义的外部模式指示，传统的细胞自聚集总是会导致聚集维度变化很大的异质类有机物群体，每个聚集体的细胞数量被认为在细胞簇分化和功能性中发挥作用。胰岛类器官三维结构的改良细胞自聚集确定簇的大小对于人类胰岛类器官的生成非常重要。无论是体外培养还是植入，与小尺寸胰岛相比，大尺寸胰岛都会导致坏死增加和细胞活力降低。小型人类胰岛类器官（250个细胞）的细胞胰岛素含量比大型同类器官（1500个细胞）高2.8倍。为了获得同质大小的类有机物，相应地开发了用于某种程度上受控的细胞自聚集的替代方法，例如悬滴、微接触打印和微孔平台。悬滴法通过重力形成细胞团，通常用于胚状体的形成，完全不接触任何人工支持基质或表面。Montanari及其同事报道通过将单个人类胰岛细胞与悬挂的微滴中的MSC混合而生成胰岛类器官的方法，这些微滴在体内具有功能性胰岛素分泌。通过悬滴，可通过改变细胞悬浮液浓度、液滴体积和培养时间来调节胰岛类器官的大小。然而这种方法是劳动密集型的，不适用于大型工程。Mendelsohn及其同事报告了一种微接触打印策略，通过在玻璃盖玻片上打印共价连接的细胞粘附蛋白层粘连蛋白斑点。这项技术提供了对细胞簇形状和大小的特殊控制，而高速打印使生产β细胞聚集体的高通量方式成为可能。然而，这些细胞簇只有两到三层细胞，甚至不能从基质上移除。因此，它们也不适用于胰岛模型、生物学试验或植入。微孔可能是一种有希望的基于自组织的胰岛类器官生成方法。微孔由多个微米大小的腔室组成，通过光刻或微图案化产生，材料范围广泛，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚乙二醇和琼脂糖水凝胶。在琼脂糖微孔平台上，细胞被捕获并聚集成葡萄糖反应的“假胰岛”或大小稳定且均匀的胰岛素产生类器官，这提高了移植后胰岛细胞的存活率。此外，凹形微孔底部较薄，增强了大鼠胰岛球体的透氧性，因为在充足的供氧条件下，胰岛球体呈现出长期可持续性、增强的生存能力和增加的激素分泌。经证明，涂有组合ECM蛋白的薄膜微孔阵列支架可促进人类胰岛功能和存活率。然而微孔仍然存在局限性，例如细胞聚集体的尺寸范围狭窄、微孔制备所需的特殊程序以及细胞分布的低可控性。此外，尽管带有悬浮液的自聚集类有机物显示出极好的营养扩散，但缺乏某些物理化学支持，如自然器官生态位，会降低胰岛类有机物的稳定性和细胞活力。基于水凝胶的人胰岛类器官包埋和封装除自聚集外，将细胞包埋在水凝胶基质中也是建立胰岛类器官三维结构的一种很有前途的方法。在这种方法中，分离的细胞颗粒通常悬浮在聚合物溶液中，直到细胞均匀分布，然后通过聚合物的交联形成水凝胶。水凝胶基质为聚集细胞提供初始指导，并作为胰岛类器官形成的后续物理支持和约束。将人类ESC与I型胶原和基质凝胶溶液的混合物包埋，形成初始半径为8 mm、厚度为2.5mm的3D支架，可建立胰岛类器官。在另一份报告中，人类胎儿胰腺组织的小块被包裹在Matrigel中，并扩展成具有胰岛内分泌命运的类器官。将细胞包埋在水凝胶中建立的胰岛类器官不仅可以形成胰岛细胞的三维结构，提供模拟胰岛自然生态位的细胞-细胞外基质相互作用，而且有助于其长期存活。为了维持移植后胰岛在体内的可持续性，“胰岛包裹”可能是一个很好的策略。包封方法就像一个胶囊，由被基质材料包围的胰岛组成。Stock及其同事用聚乙二醇-马来酰亚胺（PEG-MAL）与二硫代PEG（SH-PEG-SH）交联制成的保形涂层，并辅以PepGel肽和PEG低聚乙硫醚（PEG-OES）纳米纤维，将源自人类干细胞的类胰岛有机物包裹起来。在这项研究中，胰岛样类器官在体外与未包封的胰岛保持相当的胰岛素分泌曲线和刺激指数长达7天，甚至可以防止在海藻酸钠和聚乙二醇-海藻酸钠较大微囊中包封的胰岛中可见的中央坏死。此外，将胰岛类器官移植到糖尿病小鼠体内，使糖尿病得以长期逆转，并在没有免疫抑制的情况下维持正常血糖80天以上。但这种封装应用仍存在一些局限性:由于封装的胰岛较小，植入的胶囊无法固定在精确的位置，也不容易从患者身上完全取出；当包封在更大的配置中时，存在扩散问题，导致氧气扩散不良，严重损害胰岛的生存能力；封装后胰岛的寿命和扩展性仍不足以满足后续医学应用。人胰岛类器官的三维生物打印通过3D生物打印技术构建人体类器官受到了特别关注。通过模仿器官的自然异质结构，类器官形成有望在所需位置定位不同类型的细胞，或在特定位置诱导祖细胞成为所需类型，如打印。3D生物打印技术能够以高精度和可重复性将所有组件打印和模式化为3D结构，包括空间分布的细胞、生物材料（bioink）和生物活性因子。因此，3D生物打印提供了构建类器官的理想策略。在胰岛方面，通过3D打印，PLA和纤维蛋白水凝胶被用于容纳人PSC衍生的β细胞簇。在移植到小鼠体内后，SC-β细胞嵌入3D打印设备可运行12周，可回收，并保持结构完整性。Duin及其同事通过3D挤压生物打印技术制作了具有嵌入大鼠胰岛的大孔水凝胶结构。这种大孔结构可以增加表面与体积的比率，并将胰岛与周围体液/血管之间的距离减少到几百微米以下。在培养过程中，检测到具有特定几何形状的嵌入bioink（褐藻酸盐和甲基纤维素）中的胰岛，其存活率约为80%，葡萄糖反应性长达七天。此外，3D生物打印技术通过其重建复杂形态和多细胞环境的潜力，在制造具有血管结构的胰岛组织样结构方面发挥了独特的作用。基于3D海藻酸钠-明胶生物打印技术，制作了一种具有小鼠胰岛（核心）和内皮祖细胞（保护壳）的同轴结构。在这项工作中，3D生物打印被证明可以精确控制多种细胞类型的分布，这有可能改善血管重建和抑制免疫反应。通过制作微通道，3D生物打印模拟天然血管树，为胰岛灌注充足的氧气和营养供应。通过3D生物打印，胰腺的dECM被证明是一种很有前途的胰岛类器官生物墨水，并且dECM显示出剪切变稀的行为，这有利于嵌入细胞的存活，因为通过打印喷嘴时剪切应力被释放。尽管采用了革命性的生物打印技术方法，人工胰腺制造的改进潜力巨大，但其技术开发的早期阶段阻碍了其生产准备过程。需要解决的是a）合适的bioink：bioink材料的选择受到严格印刷条件的限制，几乎所有水凝胶都很脆弱，不稳定，无法保证胰岛的长期存活。具有良好的生物相容性、适当的生物和物理化学性质的现有标准或商业生物油墨很少b）打印速度：在当前的生物打印技术中，人体大小的组织和器官需要太长的打印时间，从而影响打印细胞的细胞活力。用于胰岛类器官的脱细胞器官支架目前，体外建立的胰岛类器官受到毫米级大小的限制，限制了在移植中的直接使用。为解决这个问题，可以从人类尸体上制备脱细胞支架，并用分离的器官特异性前体或直接用含有实质、血管和其他辅助细胞类型的类器官进行接种。加上生理上合适的培养方法和生物反应器培养，这些支架可以在体外支持更大器官结构的生长。人胰岛器官芯片芯片上器官是一个新的概念。与微流控技术结合，类有机物在提供仿生细胞或组织微环境方面具有显著优势。与静态培养相比，微流控技术引入了一种可促进营养物质、氧气和废物运输的灌流，以模拟血液流动。已经开发了一种器官芯片微流控装置，以促进IPSC和3D胰岛类器官胚胎体的形成，这可以改善胰岛类器官的功能和成熟。Walker及其同事通过悬滴分散人类胰岛细胞，制备了胰岛类器官，并在微流控系统中培养胰岛类器官以促进其存活。在接下来的研究中，Oxy芯片被用于支持具有更好的氧气利用率和胰岛功能的主要人类胰岛类器官，其中芯片孔的聚（甲基丙烯酸甲酯）基底被透氧全氟烷氧基（PFA）膜取代。微流控平台也可用于创建3D模型，不同类型的细胞保持在分离的隔间内，并通过微通道阵列连接。与静态和常规模型（大小不一的天然胰岛）相比，动态条件下的胰岛类器官可能对药物（如甲苯磺丁脲和GLP-1）表现出更高的敏感性。总之，胰岛类器官与微流控系统相结合将是疾病建模、高通量药物分析和再生医学的完美平台。机械刺激在人胰岛类器官构建中的作用机械刺激对细胞的影响已引起广泛关注。据报道，机械信号可能会影响β细胞的分化和功能。在人类胰岛类器官的构建中，机械刺激也起着重要作用。细胞聚集产生的几何结构被认为是胰岛类器官生成过程中最直接的机械刺激。Hogrebe及其同事发现，烧瓶3D旋转培养中的细胞骨架状态不同于2D贴壁培养，这严重影响了β细胞的定向分化。生物材料的存在会对人类胰岛类器官产生多种机械刺激，如硬度、地形和机械压力。生物材料的硬度（杨氏模量）可以调节细胞自聚集，用于人类胰岛类器官构建和β细胞分化。β细胞可以感知地形，并将其转化为生物信号，从而促进体外长期人类胰岛培养。在微流控平台中，剪切应力由流速决定，并影响胰岛类器官的形态和功能。检测到灌注较慢的动态条件可改善大鼠胰岛类器官丰富的微绒毛、紧密的细胞连接和增强的葡萄糖反应性，而灌注较高或静态条件下则相反。总之，细胞聚集、生物材料和构建人类胰岛类器官的技术都可以通过机械刺激影响类器官的存活、分化和功能。目前其机制主要集中在机械损伤引起的细胞死亡，调节YAP、整合素和细胞骨架动力学等机械信号。最适合人类胰岛类器官的最佳机械环境尚未确定。在人类胰腺中，胰岛被外分泌部分和丰富的血管组织包围，这些组织可以为胰岛提供刚度、地形和机械压力。因此，未来人类胰岛类器官构建的研究不仅要关注类器官本身，还要了解天然胰岛的机械环境。5挑战和展望目前人胰岛类器官的发展道路上还存在着三大挑战：类器官中胰岛细胞类型、比例以及空间位置错乱；类器官的批次、个体之间的巨大差异性；受到免疫排斥、缺氧等因素影响，移植后的胰岛类器官存活率低。胰岛类器官可以促进人类胰岛的研究，尤其是在人类胰岛发育、糖尿病疾病模型和胰岛移植领域。自从埃德蒙顿方案首次获得成功以来，胰岛并不是移植的唯一来源。近年来，基于干细胞的糖尿病临床试验已经被提出并实施。2014年，ViaCyte提交了人类ESC源性胰腺祖细胞移植治疗T1D的首次试验（NCT02239354）。2021年1月，SEMMA启动了一项HESC来源的β细胞治疗T1D的临床试验。蓬勃发展的人类胰岛再生无疑将使再生医学更接近糖尿病患者，并有望补充遗体胰岛的临床移植需求。主要参考文献：Lai Jiang, Yiru Shen，Yajing Liu, Lei Zhang，Making human pancreatic islet organoids:          Progresses on the cell origins, biomaterials and three-dimensional technologies，                Theranostics 2022, Vol. 12, Issue 4：: 1537-1556END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!