Hib-DTP-acellular poliovirus vaccine(Sanofi)

美国微生物学家Pearl Kendrick发明了百日咳疫苗导读2020年1月，百年一遇的全球新冠肺炎疫情大规模爆发。上次类似规模的疫情发生在第一次世界大战期间的1918年，也被称作「世纪大流感」(The Great Influenza)。 本次新冠疫情是现代人类历史上所面临的最严重的全球性公共安全危机之一，对于地缘政治、生活方式、工作方式、种族主义及民族主义、生物制药及生命科技领域产生深远影响。 对于疫苗行业，这次疫情中创新技术mRNA的崛起，结构性地改变了行业格局，范式转移(Paradigm shift)再次发生。柳达（知名生命科技投资专家） | 撰文01病毒与疫苗基础知识病毒是一种肉眼难以看清，需要借助显微镜才能观察到的微小生物，可感染人类、动物及植物。病毒是无法独立繁殖的，需要宿主细胞存在而繁殖。法国科学家路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）可能是第一个将病毒的病原微生物称为"Virus"的科学家，从此微生物被分为细菌(Bacteria)及病毒(Viruses)两大种类。病毒体积太微小，直到1940年电子显微镜的出现，人类才比较了解它们的存在。法国科学家路易斯·巴斯德疫苗接种(Vaccination)起源于1796年英国医学家Edward Jenner，他被称为「疫苗之父」，他所发明的「牛痘接种法」使人类战胜了天花。英国医学家Edward Jenner需要强调的是：疫苗与其他药物有着较大的区别：1、大部分预防性疫苗是依靠政府的大订单获利，因此，医生和患者对于产品没有太多选择；2、针对婴幼儿的疫苗多为强制性，这是公共健康的基础；3、由于传染性疾病的特点，政府对于疫苗接种有较大的影响力，因此，政府官僚体系的决策(与科学界一致或者不一致)都会影响公众对于疫苗的接种程度及普及率；4、治疗性疫苗与预防性疫苗在研发、销售渠道、市场推广等方面都有较大区别。疫苗可分为抗病毒疫苗及抗细菌疫苗。在20世纪30年代，全球只有两种抗病毒疫苗被使用：天花疫苗、狂犬疫苗。这是因为病毒的培养困难较大，导致病毒学的发展落后于细菌学，尤其在疫苗应用方面。当时已经有很多细菌疫苗，例如：伤寒疫苗(1896年)、霍乱疫苗(1896年)、鼠疫疫苗(1897年)、白喉疫苗(1923年)、破伤风疫苗(1927年)、结核病疫苗(1927年)及百日咳疫苗(1926年)。自50年代起，得益于培养技术的进步，细胞培养促使病毒学跨越式发展，抗病毒疫苗产业初步成型。在70年代，随着分子生物学时代的到来，人类发现病毒的一个基本特性为：病毒在繁殖时具备高频突变的能力，可以迅速演变，并且当病毒跨越物种屏障时，它的变异频率更高。相比之下，细菌则较为稳定。现有的疫苗技术路线包括灭活疫苗、病毒载体疫苗、mRNA疫苗、重组蛋白疫苗及减毒活疫苗等，前三种当前的应用最广、产量最大随后，研究者将病毒疫苗分成两大类：减毒活疫苗及灭活疫苗。减毒活疫苗的原理为：通过使病原体变异后，在人体内生长繁殖，最终使人类获得免疫性，病毒变得无害。采用这类技术，可预防众多疾病，例如：黄热病、麻疹、水痘、脊髓灰质炎(口服)、日本脑炎等。灭活疫苗的原理为：采用化学或者加热的方法中和对人体具有致病性的病原微生物，使其无法在人体内繁殖。这类疫苗包括：狂犬疫苗、流感疫苗、甲型肝炎疫苗、注射型骨髓灰质炎疫苗等，技术的优势是制备比较容易；缺点是免疫力较低，需要多次接种。02疫苗行业发展历程让我们回顾现代疫苗行业在过去40年左右的发展历程。上世纪80年代末，疫苗处于行业边缘化的地位。疫苗被视为人道主义色彩的公益产品，许多国家都有独立的疫苗生产机构供应全国，而私人机构很少参与这一领域。之后的变革对于疫苗领域产生深远影响，范式转移由此发生：1、苏联的解体及全球化。突发的政治经济变化使苏联阵营的国家们不再愿意发展疫苗，他们希望在国际市场上购买物美价廉的疫苗。这为西方制药企业提供非常好的商业机会；2、肺炎球菌结合疫苗(Prevenar)在上市后就获得史无前例的成功，成为「重磅炸弹」产品，年销售超过10亿美元。行业开始意识到疫苗是可以成为获利丰厚的产品；3、人们逐渐意识到健康水准与经济发展的直接关系。盖茨基金会为此作出卓越贡献，慷慨捐赠疫苗帮助众多发展中国家，希望提高这些国家的公众健康，促进经济发展。在另一方面，基金会为疫苗行业注入前所未有的发展活力；4、由于疫苗的稀缺性及垄断性，疫苗价格开始攀升，这个行业开始变得有利可图，西方资本主义制药企业开始在全世界购买疫苗试验室及工厂。有些制药企业兼并收购不太成功，就随后退出疫苗领域，例如：瑞士诺华制药曾经收购凯龙疫苗(Chiron)，后又将整个疫苗业务卖出。截至2020年，全球疫苗领域基本被四家超过百年历史的跨国制药集团垄断：英国葛兰素史克、美国默沙东、法国赛诺菲及美国辉瑞制药。疫苗行业的规模大约330亿美元，占全球生物制药及生命科技行业的3%。这四家公司获得全球疫苗市场90%的收入。在发展中国家，例如：中国、印度、俄罗斯等，也有各自的疫苗企业，但是主要以本国市场为主。同时，在已经上市销售产品的创新性以及产品研发的丰富性方面，发展中国家的疫苗企业依然同这四家全球行业领导者有较大差距。这四家企业在全球有较好的布局，以合作、合资、直接生产等形式开拓及渗透发展中国家市场，例如：默沙东在中国的疫苗有独家代理；葛兰素史克在中国有疫苗的合资公司；赛诺菲在美国、法国、中国、墨西哥都设有原液生产基地。这段期间疫苗的发展方向也呈现以下趋势：1、由单类型疫苗到多联疫苗。多联疫苗可大幅度减少婴儿的接种次数，简化接种方案，因此有效提高了产品的市场渗透率。多联疫苗主要以百白破的联合疫苗为主；2、伴随着生物科技在安全性、生产及免疫原性的技术积累，多价疫苗是全球疫苗发展重点。在2000年以后，这类产品的数量明显增多。肺炎疫苗是其中代表品种，肺炎链球菌包含90多种亚型，十价疫苗较七价疫苗有着更高的血清型覆盖率。目前，肺炎疫苗的覆盖率不到50%，市场依然有较大增长空间；3、伴随着技术升级，新疫苗品种已取代旧疫苗品种，例如：GSK的二代带状疱疹疫苗Shingrix在安全性上远优于上一代品种；Heplisav-B是25年来首款FDA批准的乙肝疫苗，其使用的新型佐剂增强了保护能力，减少了接种次数；4、癌症疫苗成为各家企业的研发重点。2010年，美国Dendreon公司研发出全球第一个前列腺癌治疗性疫苗Provenge，这是里程碑事件，疫苗由防御性属性向治疗性属性转变。在2020年美国临床肿瘤学会(ASCO)，这款前列腺癌症疫苗的现实世界研究结果表明：在常规口服药治疗方案的任意进程中添加Provenge，可以降低死亡率45%，总生存率延长14.5个月。2020年，新冠疫情的大爆发是引爆点(The tipping point)，全球疫苗行业再次发生「范式转移」，背景如下：1、去全球化发生及各地极端民族主义、种族主义盛行。在全球化时代主宰世界的美国开始去全球化，强调「美国第一」。英国、德国、瑞典等欧洲国家开始反移民；2、疫苗、检测试剂、个人防护设备等开始被视为国家战略性物资，相关产业被视为国家战略性领域。各国开始思考、实施重置全球供应链，实现制造本地化；3、以Trump为代表的部分西方发达资本主义国家政客为了自己选票，罔顾科学常识，利用全球互联网煽动仇恨及民粹主义给全球抗击疫情带来史无前例的挑战，这是人类社会文明的倒退。就连从来不发表政治评论的科学界三大刊物《柳叶刀》、《新英格兰医学杂志》及《自然》杂志都对美国总统Trump提出公开批评；4、在这次疫情中，传统四大疫苗公司的应对如下：美国辉瑞与德国BioNTech合作；美国默沙东放弃两款候选疫苗的开发计划；葛兰素史克及赛诺菲合作开发，目前尚未成功。结论是：这四家全球疫苗领导者在创新技术上没有突破，对于此次抗击新冠疫情没有突出贡献。令人意外的是，两个生命科学新秀异军突起：美国Moderna及德国BioNTech，他们的mRNA产品最先被美国FDA批准使用。在纳斯达克上市不到三年，他们的市值就进入了全球前30的生物制药及生命科技公司之列。还需要指出的是，这两家公司的技术最初是以治疗癌症为主要方向；由于世纪大流感的爆发，主要生产Covid-19疫苗的公司预计2021年销售额如下：美国辉瑞335亿美元，美国Moderna 180亿美元。全球疫苗市场规模预计达到1,000亿美元；我们必须清醒地意识到：由于气候变化对于人类及动物生存环境的巨大影响，人类爆发大规模传染性疾病的概率及频率会大幅增加。应对全球性的危机必须要有全球协调一致的解决方案，各国政府如果不从「人类命运共同体」的角度去认知，而是采用「零和游戏」的思维，那么受伤害的是全人类，没有任何国家、个人是例外。03疫苗行业的4大领导者1.葛兰素史克源于英国，自20世纪60年代开始从事疫苗业务。如今，共有30多个疫苗品种获批上市，用于预防21种疾病，每年可供应10亿剂疫苗。公司疫苗研发中心在比利时，生产基地在法国、德国及匈牙利。2015年，GSK以52亿美元价格收购诺华制药的全球疫苗业务，丰富产品组合。公司在脑膜炎疫苗系列、流感疫苗系列、重组带状疱疹病毒疫苗、肝炎疫苗系列、10价肺炎疫苗的研发实力处于全球领先，这些产品的年销售额均在5亿美元以上。2017年，重组带状疱疹疫苗Shingrix获得美国FDA批准上市，这是新一代的重组蛋白疫苗，可以预防90%以上的带状疱疹及带状疱疹后神经痛并发症；2020年，Shingrix销售额为19.9亿英镑。GSK研发产品线非常丰富，有1、3的疫苗品种是针对于发展中国家流行的疾病，包括世界卫生组织重点提出的三大传染病：爱滋病毒、结核病、疟疾。除此之外，还包括COPD疫苗及呼吸道合胞病毒(RSV)预防疫苗等有较大商业价值的品种。2.默沙东源于德国，于1891年由美国默克与沙东合并而成。1960年至今，公司已研发及生产40多种疫苗，包括麻疹疫苗、乙肝疫苗、水痘疫苗、HPV疫苗等。1981年，公司研发出全球首个基因重组乙肝疫苗。2014年，九价HPV疫苗Gardasil在美国获批上市，可以预防90%以上的宫颈癌。2020年，HPV疫苗销售额为39亿美元；水痘疫苗Varivax销售额为19亿美元；23价肺炎球菌疫苗Pneumovax23销售为11亿美元。3.赛诺菲源于法国，赛诺菲巴斯德(Sanofi Pasteur)是赛诺菲集团旗下疫苗公司。其历史可以追朔到1885年，路易巴斯德(LouisPasteur)研发出狂犬疫苗。公司产品线非常丰富，有多达20多种病毒及细菌性疫苗，包括：水痘、霍乱、白喉、甲肝、乙肝、乙脑、肺炎、破伤风等。重要品种有：五联疫苗Pentacel，年销售额超过20亿美元；流感疫苗Fluzone及Flublok，全球市场份额领先，年销售额约20亿美元。4.辉瑞制药源于美国，成立于1849年，疫苗历史始于1892年天花疫苗的研发。2009年，辉瑞制药收购美国Wyeth获得13价肺炎疫苗Prevnar；2014年，收购美国Baxter的疫苗业务；2015年，收购英国GSK的两款疫苗。辉瑞疫苗收入主要来自13价肺炎疫苗，年销售额约60亿美元，是全球销售前十药品中唯一疫苗品种。肺炎是全球儿童感染性死亡的首要原因，肺炎球菌是肺炎最重要的病原之一，是引发中耳炎、脑膜炎、菌血病的主要病原菌。辉瑞制药研发的治疗前列腺癌疫苗处于临床I期。2020年，辉瑞与BioNTech联合开发mRNA新冠肺炎疫苗。截至2021年7月中旬，已供应10亿剂疫苗，并还有21亿剂的合约。根据公司预计，全年mRNA疫苗收入将达335亿美元。这四家全球疫苗领导者在疫苗领域的研发历史悠久，伴随及主导疫苗的发展历程。首先，它们在市场上销售的产品非常丰富，已经获得全球医生、患者、护士的高度认可；其次，它们的研发产品兼顾防疫性疫苗及治疗性疫苗，也覆盖发达国家市场及发展中国家市场；再者，这些公司通过自我研发或者兼并、收购已经铸成强大的竞争壁垒。经验积累、技术的竞争优势在未来一段时间内依然存在。鉴于以上判断，对于任何新的疫苗领域进入者，竞争都非常激烈。因此，笔者认为人类疫苗领域的投资机会应为：1、投资于创新技术突破，例如：mRNA；以及投资有极大潜力的中国市场。04mRNA的崛起2021年9月《自然》专题文章“The Tangled History of MRNA Vaccines”比较详细地描述这项突破性技术的发展历史，文章强调：是几百名科学家历经几十年的努力工作，才借助此次疫情大爆发使mRNA价值得以体现。2005年，科学家Katalin Kariko及Drew Weissman共同发明出修饰核苷mRNA技术来抑制mRNA的免疫原性，并即申请了专利，并将这一突破性研究发表在《Immunity》，促成了mRNA疗法的诞生。2007年，Derrick Rossi利用这一技术应用在干细胞研究。2010年，Rossi同知名的美国MIT教授、美国三院院士(RobertSamuelLanger)及着名的美国剑桥风险投资集团(Flagship Pioneering)的首席投资执行官Noubar Afeyan创立了Moderna。在德国，Sahin及Tureci夫妇利用风险投资资金创立了BioNTech，利用mRNA技术来发展肿瘤疫苗。传统疫苗的产量是一个严峻问题，制造工程耗时数月。相比之下，mRNA技术可以在数周内完成大量生产。在Moderna成立不久，盖茨基金会就投资了mRNA的疫苗计划，这款疫苗主要用于治疗由赛卡病毒及HIV引起的疾病。2020年1月，中国科学家公布了新冠病毒基因序列。Moderna和BioNTech都在第一时间开始了mRNA疫苗的研发工作。疫苗的设计都是将编码新冠病毒树突状蛋白的mRNA包裹在脂质体内，当疫苗注射到体内时，体内的细胞可以通过mRNA合成大量的病毒蛋白，并且诱导免疫系统识别该蛋白，从而产生对新冠病毒的免疫记忆，以抵抗病毒感染。12月2日，BioNTech的疫苗在英国上市，为全球首款新冠疫苗，并在12月11日获得了美国FDA批准的紧急使用权。12月18日，Moderna的疫苗在美国也获得新冠疫苗的紧急使用权。1.BioNTech创立于2008年，总部位于德国美因茨，专注于开发信使核糖核酸 (mRNA)个性化疗法，针对癌症、传染病和慢性感染病等。公司主要产品包括：1、Comirnaty，与美国辉瑞于2020年合作开发，为美国和欧洲获批的首个mRNA新冠疫苗。截至2021年第一季度，新冠疫苗的全球供应使得公司实现收入20.5亿欧元，同比增加73倍；2、个性化新抗原BNT122，一种试验性mRNA癌症疫苗，处于临床II期，与Keytruda联用治疗黑色素瘤。除此之外，公司已与美国辉瑞、比尔盖茨基金会等合作开展对流感、爱滋病毒、结核病等其他感染领域的疫苗开发。2019年，公司于美国纳斯达克上市。截至2021年7月，市值约为750亿美元。2.Moderna创立于2010年，总部位于美国马斯诸塞州剑桥，专注于癌症免疫治疗，包括基于mRNA的药物发现、药物研发和疫苗技术。公司核心产品包括：1、mRNA-1273，是一款mRNA新冠疫苗，获得了FDA的紧急使用授权批准，为公司第一款获批的疫苗。截至2021年第一季度，mRNA新冠疫苗收入为17亿美元，使得公司总收入同比增长240%；2、mRNA-1647，是一款针对巨细胞病毒(CMV)的研究性mRNA疫苗，处于临床II期。2018年12月，公司于美国纳斯达克上市。截至2021年7月，公司被纳入标普500指数，股价较年初涨幅超过了150%，市值达到1,400亿美元。几点常识有助于理性理解，辨别是非：1、有效率的不同主要是因为采用不同的技术路线，因此需要在同一技术路线中比较产品差异。但是这一点非常有挑战，因为现实中很难做两个疫苗产品的对比试验；2、只有严肃的临床试验结果，并且数据公开、透明，才有实际参考价值。大部分关于疫苗传闻毫无意义，并且经常断章取义，只会使公众产生恐慌心理及对于科学不信任的态度；同时，必须注意到临床试验大部分是由疫苗公司赞助的；3、mRNA为突破性新型技术，它的临床副作用目前并不清楚，必须长期观察；4、mRNA的稳定性是一大挑战，因此需要在零下数十度才可储存数月；并且，需要在全程温度监控条件下冷链运输。这种条件即便对于美国这样高度发达的国家都是挑战，目前绝大部分的冷藏药品在零上2-8度即可。对于发展中国家，如何保持超低温冷链运输、储存是非常大的挑战；5、mRNA疫苗的价格大约20-30美元一支。发达经济体相对比较容易承担，但是对于地球上大部分发展中国家，这笔开支都是严峻而现实的问题。05中国疫苗市场灼识谘询公司报告显示，2019年中国疫苗市场的规模大约为425亿人民币。在销售前十的品种中，进口疫苗占六席。2019-2030年，疫苗市场的复合增长率预计超过10%。中国疫苗市场的集中度非常低，只有中国生物技术股份有限公司超过10%，且29家疫苗企业中有19家企业仅签发一种疫苗。大部分疫苗企业是从代理商起步，研发积累薄弱。2019年12月1日起实施的《中华人民共和国疫苗管理法》对于疫苗研发、生产、流通、预防接种及监督管理做出系统性规定，有利于创新及提升集约度。近几年，个别中国疫苗公司在品种创新、市场占有率、公司市值都有显着提升。这次新冠疫情的大爆发更是极大促进了疫苗领域，有些上市疫苗公司市值已经达到1,000亿人民币，例如：智飞生物(300122.SZ)、沃森生物(300142.SZ)、康泰生物(300601.SZ)、康希诺(688185.SH)、万泰生物(603392.SH)等。但是必须清醒地意识到：这些公司的市值更多的是享受中国市场发展的红利，它们在具备全球竞争力方面还有不少差距。建议它们积极地参与全球投资、并购，长期持续地投资在品种研发上。截至2021年7月，中国科兴疫苗及中国国药疫苗已被WHO纳入紧急使用清单。中国对外援助和出口疫苗的数量超出了其他国家的总和，出口对象也主要是发展中国家。截至2021年9月，中国已对外捐赠疫苗超过2,600万剂，向105个国家和4个国际组织提供了9.9亿剂疫苗、原液，居全球首位。在香港资本市场上，有两家与中国相关的疫苗公司值得关注：一家为康希诺，在本书「优秀案例」章节有详细介绍；另一家为艾美疫苗，简介如下：艾美疫苗创立于2011年，起源于北京。从事人用疫苗的研发、生产、销售及疫苗物流配送，是中国最大的民营疫苗全产业链集团之一。2020年，公司取得了约6,000万剂的批签发量，是仅次于中国生物(CNBG)的第二大疫苗制造企业。公司也是唯一在全球拥有全部五种经过验证的人用疫苗平台技术的中国疫苗企业。公司产品覆盖全球前十大疫苗品种，在产疫苗包括乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗，是中国第一大乙肝疫苗及第二大狂犬疫苗的生产商。在研疫苗包括四种抗COVID-19疫苗(分别采用mRNA、灭活病毒、重组腺病毒载体和重组蛋白技术)、一种手足口病EV71-CA16二价疫苗、三种肺炎球菌病疫苗等，大部分针对人口基数大的主要疫苗可预防传染病。注：本文节选自由香港商务印书馆出版的《生命科技投资启示录·捕捉下一只独角兽》，略有改动，文章已获出版社及作者授权。（欢迎转发，请联系：shuisongye）作者简介柳达柳达先生是一位药剂师，但更是一位投资者，双重身份的结合令他眼光独到。独角兽是科学家的梦想，也是投资者的追求。它的诞生，要有好的初心、好的研发团队、好的领军人物、好的投资者，以及好的政策环境。独角兽，是人心中的祥瑞。遇见它，对研发团队而言，意味着梦想成真；对投资者而言，则意味着巨大的回报；对于人类社会，它的意义显然要大得多。因为每一个生命科技独角兽的诞生，都是点亮人类战胜不治之症征途的一个火把。封面图来源：网络推荐阅读柳达：罕见病与孤儿药是行业范式转移的必由之路，将为人类健康作出巨大贡献专栏 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摘要：组分百日咳疫苗与共纯化百日咳疫苗相比，成分更明确、纯度更高、更易于工艺控制，已成为目前百日咳疫苗开发的主要趋势。本文从生产工艺、质量研究等方面，对组分百日咳疫苗在早期研发及临床申报阶段的药学研究常见问题进行探讨。百日咳是由百日咳鲍特杆菌( Bordetella pertussis, BP) 感染引起的一种急性呼吸道传染病,是导致儿童死亡的重要感染性疾病之一[1]｡百日咳传染性强､感染率高,人类是其唯一宿主,主要感染对象为6 岁以下儿童,其中1 岁以内婴幼儿的发病率占一半以上｡近些年青少年和成年的发病率有所上升,被称为“百日咳重现”( pertussis re-emerge) [2],引起WHO 的高度关注｡疫苗接种是预防和控制百日咳发病的有效手段,最早在20 世纪30 年代被成功开发,目前已在世界范围内被广泛应用｡百日咳疫苗包括全细胞百日咳疫苗( whole-cell pertussis vaccine, wP) 和无细胞百日咳疫苗( acellular pertussis vaccine, aP) [3],无细胞百日咳疫苗根据纯化工艺不同又可以分为共纯化百日咳疫苗和组分百日咳疫苗｡国外企业( 如赛诺菲巴斯德公司和葛兰素史克公司) 已上市的联合疫苗中通常含有组分百日咳疫苗,国内生产企业的已上市产品主要为共纯化百日咳疫苗｡近年来已有多家国内企业申报吸附无细胞组分百白破联合疫苗并获批临床试验｡目前一般将百日咳疫苗的各个单组分原液与佐剂混合制备成吸附原液,再与白喉､破伤风类毒素等联合使用,制备成联合疫苗｡组分百日咳疫苗纯化､脱毒､制剂工艺等方面的研究是此类产品开发的关键｡因此本文对组分百日咳疫苗的生产工艺､质量研究等方面的常见药学问题进行梳理与探讨｡1百日咳疫苗简介1．1 百日咳疫苗的发展20 世纪30 年代，全细胞百日咳疫苗研制成功并广泛使用［4］，显著降低了百日咳发病率。但由于其为全菌体制剂，接种后常出现局部反应或少见但严重的全身反应。在20 世纪70 年代英国、瑞典和日本等部分国家出现了抵制疫苗接种的情况，且随后这些国家的百日咳发病率急剧上升［3］。从20 世纪70 年代起，研究者对百日咳杆菌进行了更加深入的研究和工艺改进。1981 年，日本率先研制成功了共纯化无细胞百日咳疫苗［4］，即以百日咳毒素( pertussis toxin，PT) 和丝状血凝素( filamentous hemagglutinin，FHA) 为主要有效成分，以盐析、超速离心等工艺获得的混合抗原溶液。与全细胞百日咳疫苗相比，其不良反应发生率和严重程度明显下降，具有良好的安全性和免疫原性。由于无细胞百日咳疫苗的有效成分是混合抗原，不同批次的疫苗原液中各种抗原比例可控性较差［5］。后续欧美国家采用柱层析单独提取不同抗原组分，脱毒后再按一定比例混合，制备无细胞组分百日咳疫苗，其抗原组分还增加了百日咳杆菌黏附素( pertactin，PRN) 、百日咳菌毛血清型2 和血清型3 ( fimbriae serotype 2＆serotype 3，Fim2＆3) ［5］，此类疫苗抗原组分比例固定、纯度较高、批间一致性较好。现阶段，利用其他抗原成分进行百日咳疫苗的研发也在进行中，如腺苷酸环化酶素( adenylate cyclasetoxin，ACT) 和外膜囊泡( outer membrane vesicles，OMV) 可作为候选抗原。研究表明，小鼠血清抗体可以结合于ACT 的C-末端RTX 域( 751 ～ 1706氨基酸) 。将RTX751( 751 ～ 1706) 添加至适当剂量的无细胞百日咳疫苗中，能增强小鼠抗感染的能力［6］，提示可以将RTX751 作为一种保护性抗原。此外，OMV 是一种来自百日咳杆菌膜表面的非复制性球形脂质体囊泡，包含外膜蛋白、脂多糖及核酸等物质，经适宜的方式脱毒处理后仍具有良好的免疫原性。小鼠体内实验表明，口服百日咳OMV 疫苗后可诱导细胞免疫反应和体液免疫反应［7］。1．2 百日咳杆菌的抗原组分百日咳杆菌的有效抗原成分主要包括PT，FHA，PRN，Fim2＆3 以及腺苷酸环化酶毒素( ACT) 、气管细胞毒素( tracheal cytotoxin，TCT) 和不耐热毒素( heat labile toxin，HLT)等活性成分。其中，PT 由S1 ～ S5 这5 种亚基组成，分子质量约为117 kDa，具有典型的AB 型细菌外毒素结构，是百日咳杆菌的主要致病因子; FHA 是百日咳杆菌的主要黏附因子，存在于百日咳杆菌膜表面; PRN 能够介导对宿主细胞的黏附，可以通过加热或酸处理从外膜脱落，分子量约为69 kDa; 百日咳菌毛为存在于细菌表面的黏附因子，通常分为血清型2 和血清型3。尽管百日咳疫苗是作为联合疫苗的一个部分使用，但目前已上市产品中所含的百日咳抗原组分和配比不尽相同，包括: ①PT 单一组分。② PT 和FHA 二组分。③ PT，FHA，PRN 三组分。④ PT，FHA，PRN，Fim2＆3 五组分［1］。2生产工艺组分百日咳疫苗的生产工艺复杂,包括细菌发酵､杀菌､各组分抗原纯化､脱毒､抗原吸附与配比混合等多个工艺步骤｡由于不同纯化方式提取组分百日咳抗原时回收效率和抗原纯度及活性易受脱毒及纯化方式､工艺条件等因素的影响,因此工艺开发过程中应明确工艺步骤对产品关键质量属性的影响因素,尤其是纯化工艺和脱毒工艺,以确保工艺和质量的一致性｡2.1 纯化工艺通常在细菌发酵培养结束后,分别收集培养上清液和菌体沉淀,百日咳疫苗的抗原组分可以通过不同的纯化工艺获得单一组分｡研究者应在工艺开发过程中确定关键工艺参数和过程控制指标,并开展全面的生产工艺验证｡应对各阶段中间产物( 如粗提液､纯化液) 进行鉴别､蛋白质含量测定､抗原含量测定､细菌内毒素检查以及各纯化步骤抗原回收率检测｡对于纯化液还应进行纯度检测,如SDS-PAGE 法或其他检测方法｡对PT 纯化液还应进行百日咳毒素毒性检查( CHO 细胞簇集试验) ,确保脱毒前PT 抗原仍保持其生物学功能的完整性,但脱毒后不应有残余毒性｡杂质残留方面,除对细菌内毒素等常见杂质进行控制,还建议对纯化液中ACT,TCT 及β-环糊精等产品相关杂质残留进行控制｡2.2 脱毒工艺PT 是百日咳杆菌的主要毒性来源,也是最重要的抗原成分[8]｡在脱毒完全的前提下又要保留其免疫原性,是脱毒工艺的重点与难点｡脱毒方式一般分为化学脱毒( chemical detoxification)和基因脱毒( genetically detoxification) ｡目前应用较为广泛的是化学脱毒,即选择一定浓度的戊二醛､甲醛或两者联合使用对PT 进行处理,也有将过氧化氢作为脱毒剂使用｡由于纯化工艺和纯化效果的差异,且FHA 和PRN 的毒性来自少量残留的PT,研发者可根据不同的纯化策略以及PT 残留毒性的检测结果,制定合适的脱毒工艺｡此外,采用基因脱毒的方式也可以对PT 进行脱毒,即通过基因工程技术使PT 的S1 亚基点突变,获得PT-9K/ 129G 突变体,显著降低S1 的酶活性,从而大幅度减少PT 毒性但保留其免疫原性[9]｡根据WHO 在2014 年发布的《Recommendations to assure the quality, safety and efficacy of acellular pertussis vaccines》相关要求[10],在不过度影响免疫原性的前提下应尽可能降低PT 残留毒性,确保在疫苗有效期内不会发生毒性逆转｡在工艺开发过程中研究者应首先确定各组分的脱毒剂类别,并对脱毒剂使用浓度､脱毒时间､温度等工艺参数进行充分研究｡同时,脱毒前还应考察蛋白浓度及抗原含量对脱毒效果的影响｡建议对各组分的多批次脱毒液进行百日咳毒素毒性检查( CHO 细胞簇集试验) 以验证脱毒效果,并在成品阶段进行特异性毒性检查,避免PT 仍具有残留毒性; 进行百日咳效价检测以保证免疫原性符合要求｡此外,还应开展脱毒剂( 如甲醛､戊二醛) 以及其他工艺相关杂质的去除效果研究｡在进行脱毒验证时,每批脱毒的规模应与实际生产规模相匹配｡3制剂工艺3．1 抗原配比目前已上市的组分百日咳疫苗的组分和配比存在一定差异。以我国的上市品种为例: 葛兰素史克公司生产的b 型流感嗜血杆菌( 结合) 和吸附无细胞百白破联合疫苗( Infanrix+Hib) 曾于2009 年在我国获批上市，组分百日咳含量为25μg PT，25 μg FHA，8 μg PRN; 赛诺菲巴斯德公司生产的吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎和b 型流感嗜血杆菌( 结合) 联合疫苗( Pentaxim) 于2010 年7月获批进口，其组分百日咳含量分别为25 μg PT 和25 μg FHA。《Recommendations to assure the quality，safety and efficacy of acellular pertussis vaccines》中明确［10］在吸附无细胞百白破疫苗临床试验研究阶段进行对照疫苗的选择时，对照苗通常应选择与正在研发中的无细胞百日咳疫苗含量和组成最相似的产品。现有已进入临床试验阶段的多个含组分百日咳的疫苗品种中，研究者从降低疫苗研发风险的角度考虑［11］，3种抗原组分及配比均参照葛兰素史克公司的已上市同类产品制定，即每0．5 mL 含25 μg PT，25 μg FHA，8 μg PRN。国内申报品种与国外同类品种的抗原组分设计一致，有利于研发阶段的对比研究和临床使用的便利性。建议后续申报的三组分疫苗参考该组成剂量进行配比。3．2 与其他疫苗联合使用组分百日咳疫苗各个组分的原液制备完成后，与佐剂分别进行吸附、混合，制成含有3 个组分的吸附原液。吸附原液可作为联合疫苗的一部分，与白喉类毒素、破伤风类毒素、灭活脊髓灰质炎疫苗、流感嗜血杆菌结合疫苗联合使用。在进行制剂工艺研究时，除了按照相关指导原则开展制剂工艺研究外［12］，还应重点关注各组分间的相互作用。可开展相互作用研究包括各组分疫苗的相容性、非活性成分的影响以及抗原-佐剂相互作用［13］。相容性方面应重点关注不同工艺流程和工艺参数对各组分疫苗免疫原性的影响，尽量保证各组分免疫原性较单组分不应有显著下降; 非活性成分则应考察不同辅料，抗原-佐剂相互作用方面，建议参考相关指导原则对吸附机制、结合状态、吸附前后理化特性和生物学特性变化等方面进行研究。4质量研究和质量控制4.1 结构确证一般应在脱毒前对纯化液进行纯度检测和抗原含量检测,验证各组分的完整性,并对纯化液和脱毒液进行蛋白质总量检测｡目前常用SDS-PAGE 电泳法进行百日咳疫苗各组分的纯度检测｡应明确各目的条带位置和含量,并设置标准品或参考品､空白对照进行比较｡每种抗原的总纯度一般均可达到95 %以上｡完整的PT 抗原在电泳图谱中应显示5 个亚基条带,分别对应S1,S2,S3,S4 和S5 亚基｡由于S1 亚基是PT 的主要免疫原性成分以及毒性作用部分,因此需重点检测S1 亚基含量,但由于其特异性抗体难以获得,目前尚无针对S1 的检测标准,但可采用质谱技术进行各个亚基完整性的确证｡若PT 脱毒后产生多聚体,应采用适宜的方法进行分析,必要时进行相应质控｡FHA 抗原不稳定且易降解,应结合多批次检测结果,确定主带含量标准,并设置降解条带的限度标准｡PRN 抗原较稳定,电泳条带在69 kDa 附近｡也可以采用灵敏度较高的快速蛋白液相色谱( fast protein liquid chromatography,FPLC) 和HPLC 进行纯度检测,但该方法的设备昂贵,检测成本较高｡由于脱毒剂会使蛋白发生交联,鼓励研发者对百日咳各组分进行结构确证研究,深入探究蛋白结构与功能的关系; 分析脱毒前后的蛋白结构变化以及免疫原性变化; 完善各组分单聚体/多聚体检测方法学研究,采用质谱法分析各个色谱峰的归属｡对各组分的蛋白理化性质进行深入探究,如采用质谱法检测氨基酸分布及肽段覆盖等｡4.2 效价检测《中华人民共和国药典》2020 年版收载了吸附无细胞百白破联合疫苗,其组成成分中含有共纯化百日咳疫苗｡成品检定中要求,采用改良小鼠脑腔攻击法( mouse intracerebral challenge assay,MICA) 进行百日咳疫苗效价检测,应不低于4.0 IU·剂-1,且95%可信限应不低于2.0 IU·剂-1[14]｡MICA 法可直接反映疫苗对感染的保护力,我国一直沿用至今｡WHO 相关指导原则提供了2 种方法评价百日咳疫苗免疫原性[10],即小鼠免疫原性检测( mouse immunogenicity test,MIT) 和MICA 法｡MICA 法以无细胞百日咳疫苗国际标准品为对照,检测方法和判定标准与《中华人民共和国药典》相同｡同时鼓励开发MIT 法和MICA 法的替代方法,如小鼠鼻腔攻击实验｡而《欧洲药典》( 10.8 版) 中无细胞百日咳疫苗效价检测的方法为血清学效价检测法( 小鼠或豚鼠法) [15]｡该方法为体外检测法,易于操作,重复性好,也减少了实验动物的用量｡此外,还开发了CHO 细胞抗体中和法,但目前检测耗时长且只能滴度定量[16],其方法学完善尚在进行中｡5稳定性研究百日咳疫苗在不同的生产阶段会产生多个中间产物，如各组分的纯化液、脱毒液、原液以及吸附原液。在不同的生产阶段，百日咳疫苗各中间产物的储存条件和有效期各不相同，应对各组分的中间品开展全面的稳定性考察，应在拟定的有效期内观察各个百日咳组分的有效性和安全性指标变化情况，如抗原含量、蛋白含量、特异性毒性等，科学合理地制定储存条件和有效期。建议尽可能以连续生产为原则进行中间产物的投料，避免不稳定中间产物的长期贮存( 如吸附前的纯化液等) ，完成半成品配制后立即进行成品灌装。6展望目前国内企业生产的组分百日咳疫苗研发尚在临床研究阶段，生产工艺和质量控制仍在不断完善中，在上市阶段会伴随着工艺变更、规模放大、质量提升等变化。因此本文仅根据当前对组分百日咳疫苗研究的认知对部分问题进行探讨，以期对组分百日咳疫苗研发提供借鉴，推进国产组分百日咳疫苗的发展。参考文献 详见 《中国新药杂志》 2022 年第31 卷第21 期