Itraconazole

“ 点击蓝字 关注我们 高清志 博士，天津大学药物科学与技术学院教授，天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室主任。天津滨海新区海外高层次人才（2010），天津市国家级高层次人才（2011），中组部国家级高层次人才（2014）。主持和参与国家“十二五”重大新药创制项目、国家 973 项目、国家重点研发计划、天津抗癌重大专项和自然科学基金等科研项目。发表 SCI 学术论文 30 余篇，申请和获得新药发明专利 10 余项。主要从事靶向创新药物的设计理论、新靶点发现、药物靶向传递分子机制等研究。 N-肉豆蔻酰基转移酶抑制剂的研究进展PPS  赵传武 1, 2，张雪娇 2，杨汉煜 1, 2，高清志 1, 2* （1. 天津大学药物科学与技术学院 天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室，天津 300072；2. 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，河北 石家庄 050035） [摘要] N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）存在于真菌和原生动物等真核生物中，N-肉豆蔻酰基化是一种由 NMT 催化的蛋白质脂质修饰和共翻译修饰过程，其在信号级联转导、膜泡运输和蛋白定位等细胞进程中发挥重要作用。研究证实，NMT 对真菌、寄生虫、病毒和肿瘤细胞的存活至关重要，是一个具有前景的抗真菌、抗寄生虫、抗病毒和抗癌新靶点。综述以 NMT 为靶点的小分子抑制剂的研究进展，为开发新型 NMT 抑制剂提供参考。 近年来，寄生虫病、系统性真菌感染和癌症等疾病严重威胁着人类的生命健康。疟疾是一种由疟原虫属原生动物寄生虫引起的传染病，目前青蒿素联 合 疗 法（artemisinin-based combination therapies，ACTs）是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的疟疾治疗方法。全球首例青蒿素耐药病例出现在柬埔寨，此后其耐药形势日益严重。研究发现，疟原虫的 Kelch13 基因发生突变，导致Kelch13 蛋白及其相互作用物活性降低，减少了血红蛋白的内吞作用，进而减少了对青蒿素及其衍生物的激活，最终导致疟原虫对青蒿素及其衍生物的抗药性 [1-2]。抗真菌药如两性霉素 B 存在严重的肾毒性，咪唑类（酮康唑、联苯唑、克霉唑和咪康唑等）和三唑类（伊曲康唑、伏立康唑和氟康唑等）也因其长期广泛使用，逐渐出现耐药菌株，导致治疗失败日益增多。近年来治疗癌症的药物包括化疗药、靶向小分子药物、单抗和抗体偶联药物尽管取得了长足发展，但癌症治疗领域仍有未被满足的临床需求，临床在研阶段的药物或上市药物仍存在缺点，如缺乏足够疗效、药物相关不良反应、严重的药物相互作用或耐药性等 [3-5]。为克服上述缺点，迫切需要开发具有新作用机制的药物，其中 N-肉豆蔻酰基转移酶（N-myristoyltransferase，NMT）作为新药物靶点，已成为研究抗真菌剂、抗寄生虫剂和抗癌药的新方向。本文简介了蛋白质 N- 肉豆蔻酰基化及各类型 NMT 的结构，从药物化学角度总结了近几年NMT 抑制剂的研究进展，为研究新一代高效、低毒的 NMT 抑制剂提供参考。 1 蛋白质N-肉豆蔻酰基化及N-肉豆蔻酰基转移酶的结构 蛋白质脂质化修饰是一种复杂的蛋白质翻译后修饰（protein translational modifications，PTMs），主要通过脂肪酸、胆固醇、异戊二烯、磷脂和糖基磷脂等与蛋白质/多肽共价结合，增强自身的稳定性，同时增加蛋白质对质膜的亲和力，进而影响蛋白质的定位、稳定性、结构和功能 [6]。疾病的产生通常与某些蛋白高表达或脂质代谢异常有关，不同的脂质化会影响靶蛋白的疏水性和表面正电荷强度等方面，从而导致靶蛋白生理特性显著差异，如其构象、运输、定位和对辅因子的结合亲和力 [7]。  豆蔻酰化是细胞内蛋白发生的常见脂化修饰之一，蛋白质 N 端肉豆蔻酰化是 NMT 催化肉豆蔻酸从肉豆蔻酰基辅酶 A（myristoyl-coenzyme A，MyrCoA）到含有N-末端甘氨酸的蛋白质底物的不可逆共翻译转移过程，该过程遵循有序的双-双反应机制。NMT 首先特异性识别 Myr-CoA 并与其结合形成二元复合物；其次，结合 Myr-CoA 后形成功能性的肽类底物结合位点；最后可发生豆蔻酰化的蛋白与上述二元复合物的肽类底物结合位点结合，肉豆蔻酸盐通过亲核加成-消除反应转移到蛋白底物上，最终释放辅酶 A 和肉豆蔻酸盐化蛋白 [8]。目前，已知的可发生豆蔻酰化的蛋白包括病毒蛋白、激酶、二磷酸鸟苷结合蛋白和磷酸酶等多种蛋白，其主要参与信号转导、囊泡转运、肿瘤形成和病毒成熟等多种生物学过程。 NMT作为蛋白质N端肉豆蔻酰化反应的关键酶，在真核生物中普遍存在，但在原核生物中尚未见，在大多数哺乳动物中表达 2 种同工酶。目前 NMT 抑制剂在抗真菌、抗寄生虫和抗癌等领域均有报道 [9-10]。研究表明，白色念珠菌和新型隐球菌在无 NMT 的情况下不能在体外存活 [11]。人 NMT（HsNMT-1和 HsNMT-2）在大多数组织中表达，且对细胞存活、免疫调节和人类免疫缺陷病毒 1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）感染至关重要[12]。研究还表明，NMT 在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胆囊癌和脑肿瘤中有过度表达 [13-14]。  不同物种间 NMT 蛋白的序列一致性差别较大。以人的 NMT 序列为模板研究发现，人与真菌和各种寄生虫类种属一致性较低，HsNMT 与酿酒酵母 NMT（Saccharomyce cerevisiae NMT，ScNMT）序列一致性仅 34.5%，与利什曼原虫 NMT（Leishmania major NMT，LmNMT）、间日疟原虫 NMT（Plasmodium vivax NMT，PvNMT）和杜氏利什曼原虫 NMT（Leishmania donovani NMT，LdNMT）序列一致性分别仅为 37.6%、52.7% 和 38.4%[15-16]。然而 NMT均具有非常相似的蛋白折叠特征：鞍状 β-片层结构跨越蛋白的核心区域，其两侧被 α-螺旋所包围，三维结构内部具有假对称性（见图 1）。NMT 主要有 Myr-CoA 和肽 2 个结合区域，其中 Myr-CoA 结合区域位于 NMT 的 N 端，肽结合区域位于 NMT 的C 端。在 Myr-CoA 结合区域，Myr-CoA 分子中硫酯羰基通常与 Phe 和 Leu 氨基酸残基主链上的氨基形成一个“氧阴离子穴”，末端脂肪链部分落入由Trp15、Leu169、Val192、Trp198、Tyr202、Leu208和 Tyr404 等氨基酸残基组成的疏水口袋中，脂肪链的远端部分与 α-螺旋 C 反向平行，并与 β-折叠 f 平行，Myr-CoA 结合位点在不同种属间相对保守（见图 2）。在 Myr-CoA 与 NMT 结 合 之 后，Ab-loop区域的构象变化起到类似“开关”的作用，在不同的结构之间具有可变的构象，可部分封闭未络合物结构中的 Myr-CoA 和肽结合位点，对 NMT 催化效率至关重要。此外，B'A'-loop 也发生构象变化，与Ab-loop 共同相互作用，参与豆蔻酰化反应的全过程 [17]。与抑制剂结合形成的三元复合物（ScNMT：NHM：SC58272） 与 二 元 复 合物（ScNMT：Myr-CoA）的整体结构相似，抑制剂的结合并未引起肽结合位点区域的实质性构象变化，只是少数残基的侧链发生微小的调整（见图 2 和图 3）。这些结果表明，肽结合位点具有刚性的特点，抑制剂必须具有合适的结构和化学性质才能与其最有效地结合，这与迄今报道的 NMT 抑制剂大多数为靶向肽结合口袋相一致。NMT 蛋白序列一致性分析也说明不同种属之间肽结合口袋的肽结合序列具有多样性和特异性 [14]， 为研究特定的选择性 NMT 抑制剂奠定了基础。 2 N-肉豆蔻酰转移酶抑制剂 目前已有较多 NMT 小分子抑制剂被报道，直接作用于 NMT 的小分子抑制剂尚未上市，但其临床前研究和临床试验已取得令人满意的结果。根据结构类型不同，可将 NMT 抑制剂分为磺酰胺类、吡啶苄醚类、氮杂环丁烷嘧啶类、羟基吡咯烷类、喹啉类、嘧啶并环类、2H-1，4-苯并噁嗪-3（4H）-酮类、苯并呋喃类、苯并噻吩类和苯氧乙基吡唑类及其他类型。 2.1 磺酰胺类 Wyatt 课题组通过高通量筛选得到一类吡唑磺酰胺类 NMT 抑制剂 [15, 18]，其中化合物 DDD64558（1）对布鲁氏锥虫 NMT（Trypanosoma brucei NMT，TbNMT）和 HsNMT1 的 IC50 分别为 1.9 和 22 μmol · L-1，表明该化合物对 HsNMT 有一定的选择性；此外，通过体外抗寄生虫活性检测，该化合物表现出对布鲁氏锥虫的中等活性（IC50 = 21 μmol · L-1）。对 DDD64558 进行构效关系研究发现：1）吡唑 1位甲基取代基替换为正丙基或异丙基或无甲基取代基时，化合物活性明显减低，将三甲基吡唑替换成芳香类（如吡唑、吡啶、咪唑并吡啶、甲基吡啶、3，5-二甲基异唑、3，4-二甲基异唑、苯基和苄基等）取代基时，化合物活性均显著降低。2）将三甲基吡唑替换为6位取代喹啉或5位取代吲唑类衍生物时，部分化合物活性仍保持或提高 [19]。3）磺酰胺结构是保持活性所必需的基团，将磺胺结构替换成酰胺类、反转磺酰胺、胺类、醚类结构时，所形成的化合物的 IC50 均大于 100 μmol · L-1，但磺酰胺结构的氮原子上引入甲基则活性保持。4）芳基区改造主要探索新的相互作用，在芳环的邻位、对位或间位可连接不同类型取代基，其中 2，6-二氯苯基取代基是保持较高活性的最佳选择。  为进一步提高化合物活性， 研究人员在DDD64558 骨架 上引入氢键供体片段，增强配体与蛋白的相互作用，进而优化得到高活性的DDD85646（2）、PCLX-001（3）、化 合 物 4、化合物 5 和化合物 6，其中 LmNMT、Myr-CoA 与DDD85646 三元复合物的晶体结构（PDB：2WSA）揭示了吡唑磺胺类化合物与 LmNMT 的相互作用机制 [18]。DDD85646 的三甲基吡唑基团占据蛋白的疏水口袋，其中吡唑基团上 N 原子与 Ser330 的侧链羟基形成氢键相互作用，吡唑 N-甲基基团与 Val81的侧链相互作用，并与 Phe90 存在 π-π 堆积相互作用。磺酰胺基团通过水分子介导与 His219 的侧链以及 Asp396 和 Gly397 的骨架氨基形成氢键作用，吡啶基氮原子与 Gly205 的氨基之间形成了水介导的氢键作用，哌嗪环氮原子通过水分子与周围的氨基酸残基 Tyr92、Tyr80、Asn167 侧链和 Leu421形成网状氢键作用（见图 4 和图 5）。DDD85646对不同 NMT 均显示出强抑制活性，DDD85646 具有较低的血液清除率（CLb = 6 mL · min-1 · kg-1）、较低的表观分布容积（Vd = 0.4 L · kg-1）、适宜的半衰期（t1/2 = 1.2 h）和口服生物利用度（F = 19%）。在人类非洲锥虫病布鲁氏锥虫急性小鼠模型中，DDD85646 给药剂量为 12.5 mg · kg-1（bid），连续给药 4 d，结果显示对雌性海军医学研究所（Naval Medical Research Institute，NMRI）小鼠的治愈率是 100%[15]。 NMT 蛋白在肿瘤细胞中常伴有高表达，因此NMT 可作为抗肿瘤靶点，PCLX-001 是 DDD85646的类似物，不仅对寄生虫和真菌的 NMT 具有高抑制活性 [20-21]，且是目前唯一进入临床阶段的磺酰胺类化合物。临床前研究表明，PCLX-001 对血液瘤和淋巴瘤细胞系更敏感，在免疫缺陷小鼠模型中可显著抑制肿瘤的生长。作用机制研究表明，在 B 细胞淋巴瘤模型中，PCLX-001 可抑制对生存至关重要的早期 B 细胞受体（B-cell receptor，BCR）的信号传导，且可消除 Src 家族激酶的豆蔻酰化，还可促进非豆蔻酰化的 BCR 效应蛋白降解，包括骨髓细胞瘤病毒癌 基 因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）、 核 因 子 κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）和 磷 酸 化 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶（phosphoextracellularsignal-regulated kinase，P-ERK）， 导致体外和异种移植模型的肿瘤细胞死亡 [22]。在一项复发性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）女性患者口服 PCLX-001 的Ⅰ期剂量递增研究中，该化合物的药代动力学支持每日口服给药，药效学研究提示每日超过 20 mg 的剂量才会引起正常组织毒性 [23]。  非洲锥虫病（human African trypanosomiasis，HAT）前期临床表现为发热和淋巴结炎，后期则以脑膜脑炎为主的中枢神经系统受累为特征。因血脑屏障可阻止多种物质进入大脑，对于出现后期症状的 HAT 亟需可透过血脑屏障的药物。Brand 等 [21] 对DDD85646 进行优化改造，将分子中的吡啶基和哌嗪基分别替换为碳链和 N-甲基哌嗪，提高了分子的脂溶性。分子对接显示，化合物 4 末端哌嗪环可与C 端氨基酸残基保持较强的氢键作用，然而化合物4 的脑血比小于 0.1。对磺酰胺的 NH 进行 N-二氟甲基化，可减少分子内氢键供体数目，得到化合物 5，化合物 5 显示出较低的分子极性表面积（PSA = 58 Å2），脑血比提高至 1.6，在布氏锥虫感染第 2阶段（神经系统感染阶段）小鼠模型中表现出一定的疗效。然而，化合物 5 的 hERG 钾通道抑制活性较强（IC50 = 0.6 μmol · L-1），对 NMT 选择性不佳，导致未对该化合物进行深入研究。 Harrison 等 [19] 设计开发了具有高选择性的NMT 抑制剂化合物 6，该化合物保留了可与 C 端氢键作用的碱性片段，将三甲基吡唑替换为吲唑基团时，同样保持了与 Ser330 的氢键作用不降低活性，化合物 6 获得了突出的选择性（S = HsNMT IC50/T.brucei EC50 = 47）、良好的药代动力学特性（AUC0-8 = 2 900 μg · min · mL-1，Cmax = 11 μg · mL-1，Tmax = 1 h）和较高的耐受剂量（最大耐受剂量＞ 300 mg · kg-1，po，bid，3 d）。为克服血脑屏障，在布氏锥虫感染第 2 阶段通过选择性成纤维细胞多药耐药 1a（cardiac fibroblasts1 multidrug resistance 1a，CF1 mdr1a）缺陷雌性小鼠模型，获得了化合物 6完全治愈布氏锥虫感染第 2 阶段的口服剂量方案（50 mg · kg-1，bid，5 d），提示 NMT 可作为 HAT 后期药物研发的潜在靶点。此外，研究人员对化合物 5进行结构改造得到化合物 7，化合物 7 表现出优异的脑血比（1.9），选择性 S 为 79，然而化合物 7 心血管安全窗口较窄，未开展进一步研究。 2.2 吡啶苄醚类   研究表明，常用评价血脑屏障透过性质的实验参数建议为极性表面积（polar surface area，PSA）小于 90 Å2，氢键供体数量小于 3，脂水分配系数（cLogP）为 2 ~ 5，脂水分布系数 [cLogD（pH 7.4）]为 2 ~ 5，相对分子质量小于 500 [24-25]。吡唑磺酰胺化合物 DDD85646 的 PSA 为 101 Å2，Bayliss 等 [26]将吡唑磺酰胺片段替换为吡啶苄醚类基团得到系列化合物，其中化合物 8 的 PSA（50 Å2）显著降低，脑血比提高到 1.9，但 NMT 抑制活性显著降低，推断该系列化合物缺少与组氨酸的关键氢键作用。 2.3 氮杂环丁烷嘧啶类  Bell 等 [27] 在辉瑞公司化合物库中利用高通量筛选发现了一类氮杂环丁烷嘧啶结构的 NMT 抑制剂。其中，化合物 9 和 10 显示出有效的抗恶性疟原虫活性，其 IC50 分别为 0.48 和 1.7 μmol · L-1，且表现出对HsNMT 的选择性。Imperial college 创新公司等 [28] 公布了一项氮杂环丁烷嘧啶类 NMT 抑制剂专利，主要用途涉及癌症、病毒及微生物感染等疾病，代表化合物 11 既能有效抑制恶性疟原虫 NMT（Plasmodium falciparum NMT，PfNMT）活性，也能对肿瘤细胞表现出纳摩尔水平的抑制活性。此外体内药效表明，在 6 ~ 8 周龄雌性 CB17/ 严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠皮下移植脱氧羟脯氨酸羟化酶-2（deoxyhypusine hydroxylase-2，DOHH-2）淋巴瘤模型中，给药剂量为50 mg · kg-1（qd，po），连续给药 9 d，肿瘤明显消退。 2.4 羟基吡咯烷类 Hutton 等 [29] 通过分析辉瑞公司报道的两类高效LdNMT 抑制剂（12 和 13）蛋白晶体复合物（PDB：4CGN 和 PDB：4CGL）发现，化合物 12 与 LdNMT的氢键相互作用主要有：1）哌啶环与 C 端 Leu421的氢键；2）酰胺键羰基与 Tyr345 和 Asn376 的氢键。化合物 13 与 LdNMT 的氢键相互作用主要有：1）氨基与 Thr203 和 Asn167 的氢键作用；2）羰基与Thr203 的氢键作用；3）羟基与 Leu421 和 Tyr326的氢键作用。利用分子杂交策略改造后的化合物 14 具备化合物 12 和化合物 13 两者的氢键作用，因此，化合物 14 表现出更优异的 LdNMT 抑制活性，但对杜氏利什曼原虫细胞无明显抑制活性，这可能是其透膜性差导致的。 2.5 喹啉类 Goncalves 等 [30] 利用高通量筛选发现了一类PvNMT 喹啉抑制剂，其中化合物 15 对 PvNMT 的Ki 值较高，但对 HsNMT1 没有选择性。进一步优化得到的化合物 16 溶解性和脂溶性均得到改善，对 PvNMT 表现出微摩尔水平活性，对 HsNMT 的选择性高于化合物 15，但化合物 16 对 PfNMT 无抑制活性。通过对喹啉环 3-位、4-位和 6-位取代基进行优化发现 [31]，喹啉环 3-位引入酰胺类稳定取代基，该类化合物的 NMT 抑制活性未见明显提高，喹啉环4-位引入-SCH2CH2CN或-SCH2CH3基团，该类化合物的活性较好，喹啉环 6-位引入苄氧基吡啶脂肪胺（哌嗪、乙二胺等）片段（如化合物 17 和化合物 18）则显著提高抗恶性疟原虫的活性 [31]，这是化合物 17 和化合物 18 末端碱性中心与 NMT 蛋白 C 端氨基酸残基保持强氢键作用产生的，然而化合物 17 和化合物 18 对 HsNMT 选择性变差。有研究表明，配体诱导 Tyr211（PvNMT）构象变化可以获得疟原虫对 HsNMT 的选择性 [32]，喹啉系列化合物 4-位取代基与 Tyr211 存在相互作用，进一步优化 4-位取代基可能是该系列化合物未来研究的方向。 2.6 嘧啶并环类 Bell 等 [33] 报道了一类嘧啶并环类 LdNMT 抑制剂，主要的构效关系：1）母核骨架可选择嘧啶并噻吩、嘧啶并苯环和嘧啶并吡啶，嘧啶并咪唑和单环嘧啶骨架不可取。2）母核 2 位优选 1-甲基-4-（甲氨基）哌啶取代基，C2 取代基必须含有末端碱性中心，且碱性中心必须与嘧啶并噻吩骨架保持特定的构象，这样化合物才能与 LmNMT 肽结合口袋保持最佳作用模式。C2 取代基的第一个氮取代基不可选择大位阻取代基，优选甲基取代基。3）母核 4 位优选氨基丙腈类取代基和 N-甲基乙基胺取代基。4）母核 6位可选自叔丁基、溴取代基、甲氧基、芳基和吡唑磺酰胺取代基。5）母核 7 位取代基不可选择甲氧基取代基。其中化合物 19 表现出中等抗利什曼原虫活性，值得注意的是化合物 19 对 LdNMT 的选择性（＞ 660 倍）高于 HsNMT1。 2.7 2H-1, 4-苯并噁嗪-3（4H）-酮类 Spinks 等 [34] 报道了一类 2H-1，4-苯并噁嗪-3（4H）-酮骨架 NMT 抑制剂。其中，化合物 20的相对分子质量小，改造空间大。分子对接显示，化合物 20 吗啉酮环上的羰基与 Ser330 有氢键作用。该类化合物骨架的构效关系表明，母核结构 7位或 8 位引入取代基可保持与化合物 20 相当的抑制活性，其他位置取代则均无抑制活性。围绕母核骨架 7 位和 8 位进行改造后，系列化合物 21 ~ 26 显示出对布氏锥虫纳摩尔级抑制活性，这说明化合物 21 ~ 26 末端的碱性中心对提高活性至关重要，但系列化合物对 HsNMT 的选择性略低（化合物 24 为 69 倍除外），未来需要在选择性上进一步优化。 2.8 苯并呋喃类 Liang 等 [35] 设计并合成了一系列苯并呋喃-三唑类化合物。该系列化合物对新生隐球菌和耐氟康唑红色毛癣菌表现出一定的体外抗真菌活性，其中化合物 27 的活性相对突出。分子对接显示，该系列化合物苯并呋喃环位于由 Tyr225、Tyr354 和Leu394 残基组成的疏水口袋中，并与 Tyr225 形成π-π 相互作用，二氟苯基片段与 Phe115、Phe240 和Phe339 残基形成疏水相互作用，苯基三唑侧链伸展到由 Phe117、Tyr119 和 Phe176 构成的疏水口袋中，苯并呋喃环上的氧原子与 His227 形成氢键。另一方面，在三唑和 Leu451 之间未见氢键作用，这导致该系列化合物具有较弱的抗白色念珠菌作用。Xu等 [36] 设计开发了一类含氨基脲结构的苯并呋喃衍生物，其中化合物 28 和化合物 29 既对白色念珠菌、烟曲霉和红色毛癣菌均表现出良好的抗耐药真菌活性，又对白色念珠菌耐氟康唑菌株表现出抗真菌活性。 2.9 苯并噻吩类 Rackham 等 [37] 设计并合成了一系列抗恶性疟原虫和抗间日疟原虫的苯并噻吩类 NMT 抑制剂。该类抑制剂在体外表现出抗寄生虫活性，对 HsNMT1具有良好的选择性和优异的配体效率。其中化合物 30 在体外显示出非常有效的抗寄生虫活性。将母核苯并噻吩骨架替换为苯并呋喃时，化合物的抑制活性有所降低，因此以化合物 30 为先导化合物改造后得到化合物 31，化合物 31 在该系列中显示出较强的抗疟原虫活性，并对 PvNMT 的亲和力比对 PfNMT 高 10 倍。然而，化合物 30 和化合物31 存在不稳定酯基，可能存在未知的代谢稳定性问题。此外，上市药物统计结果显示化合物理想的配体效率依赖性亲脂性（ligand efficiency dependent lipophilicity，LELP）值小于 10[38]，鉴于化合物 31 的 LELP 值偏大，研发人员利用电子等排体策略将酯基替换为 1，2，4- 二唑基团得到化合物 32[39]，其活性显著提高，但化合物 32 的 LELP 值未见明显改善且脂溶性偏高。研究表明，1，3，4- 二唑片段的使用有利于降低化合物的脂溶性，易获得代谢稳定、hERG 抑制风险低和水溶性好的化合物 [40]，化合物 33 的 LELP 得到了一定程度的优化。此外，化合物 32 和化合物 33 的抗恶性疟原虫细胞活性较弱，这可能是苯基甲醚为较弱氢键受体导致的。化合物 DDD85646 和化合物 33 的蛋白结合模式表明，三甲基吡唑所处的结合口袋与苯基甲醚相类似，因此将化合物 33 的苯基甲醚替换为三甲基吡唑得到化合物 34[39]，化合物 34 表现出更强的抗恶性疟原虫活性，这归因于哌啶环 NH 与 Leu410/Tyr107 的盐桥作用，2 位吡唑氮与 Ser319 残基之间形成水介导的氢键作用，杂环和结合口袋之间形成多个疏水作用。 2.10 苯氧乙基吡唑类 Mousnier 等 [41] 报道了一种阻止鼻病毒（human rhinovirus，HRV）复制的 NMT 抑制剂，其中化合物 IMP-1088（35） 对 HsNMT1 和 HsNMT2 的抑制活性达到了皮摩尔水平。除了对鼻病毒有效外，IMP-1088 还对小核糖核酸病毒和口蹄疫病毒等具有强抗病毒效果。IMP-1088 还可阻断人类支气管上皮细胞中的病毒复制，甚至在与吸入性皮质类固醇氟替卡松丙酸盐联用治疗慢性阻塞性肺疾病患者和哮喘患者期间，IMP-1088 的作用也可以维持。在 IMP1088停药后，NMT 活性迅速恢复，对细胞无长期影响，此外体外实验表明，该化合物对非染毒细胞无增殖抑制作用。类似的结构研究也有其他报道 [42]，化合物 36 对 HsNMT1 具有强抑制活性，对肿瘤细胞的抑制活性达到纳摩尔水平。化合物 36 在大鼠肝细胞的半衰期 t1/2 为 80 min，体内口服药代动力学（PK）的半衰期 t1/2 为 7.1 h，人肝微粒体稳定性半衰期 t1/2 为 67 min，提示化合物 36 具有良好的代谢稳定性。石药集团近期报道了一类含苯并噻吩基的苯氧乙基吡唑类 NMT 抑制剂 [43]，专利中化合物 37 不仅对人鼻病毒（HRV 1B 和 HRV 14 亚型）表现出较强的抑制作用，还对人弥漫性组织淋巴瘤（stanford university-diffuse histiocytic lymphoma-2，SUDHL-2）细胞和微浸润人胰腺癌（minimallyinvasive adenocarcinoma human pancreatic carcinoma-2，MIA PaCa-2）细胞具有较强的抑制作用。 2.11 其他类型 Apel 等 [44] 报道的天然产物 punicalagin（38）和 iso-terchebulin（39） 对 HsNMT1 和 PfNMT 均具有明显抑制活性。Olaleye 等 [45] 开发了一类抗疟原虫和抗利什曼原虫的拟肽类抑制剂（化合物 40、41、42 和 43），该拟肽类结构的构效关系表明，不同的 R1 与 C 端氨基酸残基形成的氢键作用强弱不同，当 R2 和碳链长度 n 相同时，化合物的活性随 R1 取代基依次增强（1H-咪唑-1- 基＜ 2- 甲基-1H咪唑-1-基＜– NH2），碳链长度 n 最佳为 9，R2 处于蛋白口袋的 N 端，R2 取代基最佳选择为环己烷基。化合物 42 在该系列化合物中抑制活性突出，其分子与蛋白结合模式显示若干重要的氢键作用：1）丝氨酸羟基与 H213 之间的氢键作用；2）赖氨酸氨基与 Asp98、Asp100、Asp385 之间的氢键作用；3）R1 端氨基与 Leu412 之间的氢键作用。肽类和拟肽类抑制剂一般含有较多的氢键供体，提示其透膜性较差。有关真菌的肽类和拟肽类抑制剂也有研究显示，由于不能穿透真菌细胞膜，肽类和拟肽类NMT 抑制剂在体外抑制真菌的活性较弱 [46-47]。 3 结语与展望 N-肉豆蔻酰化已成为蛋白质修饰重要研究领域，蛋白质的 N-豆蔻酰化参与调控多种生理病理相关的细胞过程。NMT 抑制剂在抗真菌、抗寄生虫和抗癌药物等领域均有研究。大多数 NMT 抑制剂均是靶向肽结合口袋，NMT 蛋白肽结合口袋具有特异性和多样性，这为开发新型 NMT 抑制剂奠定了理论基础。  上述各类骨架化合物的构效关系显示，所报道的 NMT 抑制剂体外活性已达到个位或十位数的纳摩尔级别，但仍面临诸多挑战，磺酰胺类 NMT 抑制剂中的磺酰仲胺片段使得该类化合物 PSA 值较高，这不利于化合物透血脑屏障和治疗布氏锥虫第2 阶段的感染。尽管通过提高化合物的脂溶性可增加药物的脑血比，但也伴随较高的 hERG 抑制风险。羟基吡咯烷类 NMT 抑制剂氢键供体太多，因而透膜性较差导致无细胞活性。喹啉类 NMT 抑制剂存在不稳定的酯基片段，2H-1，4-苯并噁嗪-3（4H）-酮类 NMT 抑制剂存在选择性问题，嘧啶并环类、苯并噻吩类、苯并呋喃类和天然产物类 NMT 抑制剂的活性较弱，肽类和拟肽类 NMT 抑制剂的透膜性较差等。特别指出，一些类型的 NMT 抑制剂选择性较差，这极大地限制了 NMT 蛋白体内外分子机制研究及其抑制剂进一步开发。  在未来的研究中，为进一步提高选择性，研究人员应明确 NMT 蛋白中肽结合口袋的关键残基及相互作用，这有助于发现活性强、选择性好的 NMT抑制剂。此外，在靶点药物分子设计、天然产物结构修饰、高通量筛选和组合化学等研发策略的指导下 [48]，开发高活性、高选择性且优良药代特征的新骨架抑制剂是未来研究的发展方向。  蛋 白 降 解 靶 向 嵌 合 体（proteolysis targeting chimera，PROTAC）技术是近年来新兴的研究领域，PROTAC 双功能分子能够识别并选择性地结合靶蛋白，招募特定的 E3 泛素连接酶，形成“靶蛋白 -PROTAC-E3 泛素连接酶”三元复合物。之后，E3 泛素连接酶与 E2 泛素结合酶共同作用，对靶蛋白进行泛素化，泛素标记的靶蛋白被输送到蛋白酶体中降解，从而选择性地降低靶蛋白的水平。目前 PROTAC 技术已成功在雄激素受体（androgen receptor，AR）、 雌 激 素 受 体（estrogen receptor，ER）和白介素 1 受体关联激酶 4（interleukin 1 receptor associated kinase 4，IRAK4）等靶点上得到验证，通过优化设计可获得成药性良好的临床药物分子，因此，利用已报道的人类 E3 连接酶小分子配体和合适 NMT 抑制剂构建双功能 PROTAC分子，理论上可以降解肿瘤细胞中过表达的 NMT蛋白。鼻病毒外部的核衣壳组装依赖于人体内的NMT，通过抑制人 NMT，可以阻断病毒衣壳的复制及传染性病毒的产生，因此类似上述 AR 蛋白降解剂 PROTAC 的研究，同样可以设计得到抗鼻病毒的 PROTAC 分子。此外，现阶段还未见抗寄生虫的 PROTAC 研究报道，这主要归因于寄生虫 E3 连接酶蛋白组学以及特异性 E3 连接酶结合小分子配体的研究较少，但新一代抗真核生物寄生虫分子利用寄生虫特有的泛素化蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）已有研究，如BacPROTACs（Bacterial PROTACs）[49]。  综上所述，未来在 NMT 药物靶点研究上，期待发现更多新的抗真菌、抗寄生虫和抗癌的 NMT抑制剂。 参考文献： [1]  Birnbaum J, Scharf S, Schmidt S, et al. 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“ 点击蓝字 关注我们 黄永焯 中国科学院上海药物研究所/中科中山药物创新研究院研究员。研究方向为药物新剂型与递药新技术。入选中科院百人计划、科技部中青年创新领军人才、上海浦江人才计划。获得国家优秀青年基金和杰出青年基金、中国药学会 - 赛诺菲青年生物药物奖。发表 SCI论文170余篇。担任Int J Pharm 亚洲区编辑，Nano Lett，J Control Release， Acta Pharm Sin B，Cancer Biol Med， Med Drug Discov及《药学进展》《药学学报》《中国现代应用药学》《中药新药与临床药理》 等期刊编委。担任中国药学会药剂学专委会委员、中国药学会纳米药学专委会委员、中国抗癌协会纳米肿瘤学专委会常务委员、上海市药剂学专委会副主任委员等。 中药活性成分共晶的开发与应用进展 PPS  李泽宇 1,2#，申欢 2#，刘二刚 2，蒙钰珏 2，黄永焯 2,3* （1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2. 中科中山药物创新研究院，广东 中山 528400；3. 中国科学院上海药物研究所原创新药研究国家重点实验室，上海 201203） [ 摘要 ] 中药活性成分广泛存在水溶性低、稳定性差等问题，这在一定程度上限制了其成药性和临床应用。共晶技术作为一种常用的晶体工程策略，在改善中药活性成分的理化性质及提升其成药性方面展现出了巨大潜力。综述系统介绍了中药活性成分共晶的开发与应用进展，探讨共晶在改善中药活性成分成药性方面的潜力及局限性，以期为中药活性成分的共晶技术研究与新药开发提供参考。 药物活性成分（ active pharmaceutical ingredient， API）既是中药现代药理、药效研究的分子基础，也是构成中药性味归经特色的物质基础，是中药质量控制和标准化过程所依据的基本要素以及评价药物质量的基本指标。根据2020版《药品注册管理办法》的规定，以中药所含活性成分为药效成分，可开发为1.2类中药新药。然而，与基于靶点设计和优化的化药分子不同，中药活性成分为天然物质，其多成分、多靶点的性质增加了药效验证的难度，制约了1.2类新药开发的进展。在中药活性成分为主的新药开发过程中，常存在稳定性差、溶解性差、吸收差及胃肠道稳定性差等诸多问题。例如，以槲皮素 [1]、柚皮素 [2] 为代表的黄酮类成分，其水溶性与膜透过性均较差，导致口服生物利用率低；番茄红素 [3]、虾青素 [4] 等天然抗氧化成分，其化学稳定性不高，在常规储存条件下易发生氧化变质。以薄荷油 [5]、广藿香油 [6] 等为代表的挥发油是另一类重要的有效部位，但其不仅存在易挥发、易降解等稳定性问题，还存在溶解性问题，对于其赋形和制剂带来巨大挑战。为解决中药活性成分为主的新药开发过程中所面临的上述问题，国内外学者开发了多种剂型，如固体分散体 [7]、脂质体 [1]、微球 [8]、包合物 [9]、滴丸 [10]、微胶囊 [10] 等，并探索了多种制剂工艺，如热熔挤出 [11]、微胶囊 [10]、冷冻喷雾干燥 [10]、微射流 [12]、微流控 [13]、 3D打印（three dimensional printing， 3DP） [14] 等。创新制剂和工艺的开发与应用，在改善药物稳定性、溶解性、提高药物口服吸收率和生物利用度方面，取得了巨大进步。然而，新制剂的研究亦伴随挑战：为促进药物的溶解和释放，制剂中活性成分一般被制备成无定形态（如固体分散体 [7]、包合物 [9]、滴丸 [10] 等），或通过纳米技术将 API 颗粒的尺寸减小至纳米级（如脂质体 [1]、纳米晶 [15] 等）， 纳米药物因蕴含较高能量，需依赖稳定剂来遏制储存期间的重结晶现象 [15]；此外，天然产物分子在结构层面往往缺乏独特的专利特征，而无定形、微粉化或纳米技术的应用，虽然能优化药物的宏观物理形态（可申报制剂专利），但未改变药物的固体存在形态（晶型、盐型），从而难以对已知天然活性成分构建强有力的专利壁垒，而有效的专利壁垒是推动新药研发进程的重要保障。尽管我国在全球中药提取物与单体生产及出口领域占据领先地位 [16]，但市场上以中药活性成分为基础的 1.2 类新药仍较为罕见。统计显示，2008—2013 年国家药品审评中心承办审评的中药新药注册申请总数共计604个，其中创新度高的1类新药仅占 3.31% [17]，凸显了中药新药研发中亟待解决的关键问题。 晶体是药物分子在三维空间上的周期性堆积，是固体药物的基本存在形式之一。随着晶体工程的快速发展，通过结晶技术精细调控药物的晶型，已成为优化药物的固体性质（形状、流动性、堆密度、可压性等）和理化性质（溶解速率、引湿性等）的有效手段 [18]，该策略在制药工业得到广泛应用。其中，药用共晶以其独特的优势，为传统结晶形式（盐类、水合物、多晶型等）提供了创新性替代方案（见图1）[19]。与受限于电离性质的盐类不同，共晶技术对于非电离化合物展现出更大的适应性与设计灵活性，能够赋予药物更高的热力学稳定性，同时保留其溶解度优势。与无定形固体相比，共晶也可提供更高的热力学稳定性，且可保持溶解度优势。然而对于特定结构的药物，其分子在三维空间的组合形式是有限的，且绝大多数化合物亚稳晶型和稳定晶型间的溶解度差异并不显著（通常为 2 ~ 5倍）[18]，这限制了通过多晶型筛选来大幅提升药物溶解度的可能性。 共晶技术是通过引入第二分子作为共晶形成物（cocrystal former， CCF），与药物分子协同构建出具有全新分子堆积模式的二元晶体结构，为提高药物的成药性和晶体的可设计性提供了有力的工具 [20]。与单一晶体的多晶型变化相比，共晶可更显著地调控晶体产品的熔点、稳定性、机械性质、溶解性、固有溶出速率等 [21]。更重要的是，共晶中活性成分与配体形成的晶体在新药注册法规中被认定是一种新的药物固体形态。这为天然活性成分的专利保护提供了一种新的物质形态，使共晶技术在 1.2类中药新药研发中具有独特的优势 [22]。因此，药物共晶作为一种新型药物固体形态和优效改良手段，为中药活性成分的新药开发提供了新思路。近年来，天然活性成分的共晶研究在全球范围内取得了长足进展。本文概述了共晶的基本原理、制备工艺，并通过实际案例展示其在提升中药活性成分成药性方面的应用进展。 1 共晶的概念与形成原理 药物共晶是API和共晶形成物通过非共价键（氢键、π-π堆积作用、范德华力等）以固定的化学计量比结合在同一晶格中形成的晶体，是多组分物质的一种固态聚集形式 [20]。共晶的形成实际上是一个由溶解度及分子间相互作用力驱动的超分子自组装过程。共晶体系中超分子网络影响晶体的堆积形式（晶型）以及晶体生长的各向异性，进而决定了微观分子堆积而产生的宏观固体形态（晶习）[23]。 2 共晶的制备工艺 共晶的形成过程是打破共晶组分各自的一元分子晶体结构，重新组装形成二元晶体的过程。因此，制备过程一般利用共晶与原料晶体在溶解性或能量上的差异，通过合适的方法实现原料晶体的拆分和分子的重组[18]。根据制备过程中物料的状态，现有共晶的制备方法通常分为固体法和溶液法。固体法主要有研磨法和熔融法等，制备过程中API与 CCF均是固体，在共晶合成中不需要或只需要较少的溶剂 [24]。溶液法包括溶剂蒸发结晶法、反溶剂结晶法、冷却结晶法和混悬结晶法等 [25]。在溶液法中，溶解共晶成分需要消耗大量溶剂 [26]。目前如何选择合适的共晶制备方法仍以经验为主导，药物共晶制备方法特点如表1所示。 2.1 研磨法 研磨法制备共晶主要分为干法研磨和湿法研磨两种。干法研磨指将API和CCF混合，并通过机械研磨的方法制备共晶 [27]。湿法研磨则是在干法研磨的基础上，额外引入微量的溶剂（如水、乙醇等）以促进研磨过程中分子之间发生相互作用 [28]。研磨为表面扩散和迁移提供能量，从反应物表面除去生成的共晶，从而产生新的表面，以便生成更多的共晶。与干法研磨相比，湿法研磨通过添加少量液体可以增强分子扩散，可用于生产具有高产率和高结晶度的共晶产品。由于液体可作为加速共晶形成的催化剂，液体的选择和用量在机械化学反应中起关键作用，影响固体产物的形成和晶体的质量 [29-30]，因此湿法研磨适用于快速共晶筛选。通过比较球磨法制备茶碱-对乙酰氨基酚共晶的不同条件发现，在制备共晶的过程中，溶剂具有介导作用，但加入的量过多将导致共晶生成速率降低 [27]。在加入等量乙醇条件下，球磨时间越长，越有利于共晶生成。因此，在制备共晶时，加入少量溶剂有利于提高生产速度。中药活性成分七叶素可以通过加入少量异丙醇湿法研磨制备得到七叶素-烟酰胺共晶（见图 2）[28]。 2.2 熔融法 熔融结晶法是将药物成分与配体在合适的温度下共同熔融并充分混合，然后进行降温，冷却处理析出共晶 [26]。熔融结晶过程无需使用溶剂，显著降低了环境污染的风险，因此是一种绿色制备工艺；在实际操作中应评估药物与配体的热稳定性，以保证产品的质量与安全。熔融结晶法适合于耐热，且API与配体熔点接近的体系，制备条件相对苛刻。热熔挤出法（hot melt extrusion， HME）制备药物共晶本质也是利用熔融法的原理，常用于连续结晶。 2.3 溶液法 溶液法是最常见的共晶制备方法之一，其原理是利用溶剂作为媒介，首先削弱并打破 API 与 CCF原有的晶格能，随后通过精细调控，使两者在溶剂中重新排列组合，最终形成稳定的共晶体 [31]。溶剂蒸发法尤为常见，共晶组分以适当的化学计量比完全溶解在合适的溶剂中，随后通过缓慢蒸发溶剂，诱导溶质分子逐渐析出并自发组装成共晶结构[32]。溶剂的选择在此过程中至关重要，它不仅决定了反应物在溶液中的溶解度，还直接影响共晶的形成效率与品质。因此，采用溶剂蒸发法制备共晶的首要任务是筛选出适宜的溶剂体系，使API与 CCF在该溶剂中能够展现出相近的溶解度，从而拓宽共晶析出的热力学窗口，提升共晶形成的可能性，并为后续的工艺优化与产品应用奠定基础。有研究显示，采用溶剂蒸发法制备姜黄素-间苯二酚共晶，其溶解度与原料药相比提高了150倍 [33]。 悬浮结晶法也适用于两组分溶解度接近的共晶制备，相较于蒸发结晶法，其优势在于能显著降低能耗、减少使用溶剂量，并提高产率。然而悬浮结晶法在获取高纯度共晶方面存在一定挑战 [34]。当两组分溶解度相差较大时常选择反溶剂结晶法，通过添加反溶剂进行共结晶，反溶剂可降低API、CCF以及共晶的溶解度，使溶液迅速达到过饱和状态，诱导共晶的析出 [24]。溶剂与反溶剂的选择起关键作用，需保证共晶在反溶剂中溶解度极低，且2种溶剂还须具备良好的互溶性。 冷却结晶法是大规模制备高纯度晶体的经典方法，其晶体特性（如尺寸分布、纯度、形貌）与过饱和度密切相关，而过饱和度又与质量传递、热交换等工艺参数的调控紧密关联 [25]。因此，在共晶制备过程中，需从固液平衡关系着手，对这些因素进行精准控制。值得注意的是，结晶操作窗口的确定还需考虑共晶的化学计量比及其在起始与终止温度下的热力学稳定区域。 2.4 新型共晶制备技术 热熔挤出法作为一种成熟的工业制造技艺已广泛应用于橡胶、塑料、食品及制药工业等多个领域。采用 HME 技术可改变药物释放特性，增加药物的溶解度和生物利用度。例如，中药多酚类活性成分白藜芦醇熔点高达267℃，在熔点下加热3 min，其降解率高达40%，但是与烟酰胺通过热熔挤出制备共晶可将熔点降至135℃，且几乎无降解 [35]。HME 装置主要由输送系统和模具系统两部分组成（见图 3）[36]。输送系统通过螺杆泵将物料输送到料筒中，进行分配与混合；模具系统负责将材料加工成所需的形状。共晶生产过程包括在受控条件下通过料筒进料，该料筒配备一个或多个朝向模具的旋转螺杆；在高温下，螺杆和料筒之间的摩擦有助于促进材料的熔化与充分混合，冷却后形成共晶。HME 方法的优势是无需使用溶剂，不仅具有成本效益，还避免了额外的干燥步骤。作为一种可扩展且连续的生产过程， HME减少了处理步骤，是一种经济、高效的方法。此外，HME 能够精准控制整个生产过程，提高共晶纯度，并允许在过程中改变关键参数，如温度和混合强度等 [36]。 超临界流体（ supercritical fluid， SCF）技术是一种生产高质量共晶的环保制备方法 [37]。当气体（如二氧化碳）被压缩和加热到临界点时，兼具液体和气体双重性质，可使SCF具备优良的溶剂性质。可通过同轴喷嘴改善雾化性能，其较高的密度增强了剪切力，有利于生成更小的液滴和降低共晶颗粒的尺寸。此外，通过调整 SCF 的压力和 SCF- 溶剂混合物的停留时间，可调控共晶的形态和尺寸分布，进而调控共晶的溶解性质，例如中药黄酮类活性成分槲皮素的水溶性低，通过SCF法与脯氨酸制备共晶，其溶解度比反溶剂法制备的共晶提高了 2倍[37]。 喷雾干燥是制药工业中广泛用于获得固体粉末的技术，能够应用大规模生产共晶，在改善产品纯度、粒径、形态和密度方面具有较大优势 [38]。颗粒的微观特性对于优化其吸入性能（空气动力学）、生物利用度（提高在吸收部位的溶解速率）和可压缩性（片剂和胶囊的制造）至关重要。喷雾干燥便于调节产品的生产规模，可满足不同的生产需求。在制药工业中进行材料加工和放大生产时通常优先考虑喷雾干燥法。 超声辅助共晶技术（ultrasound-assisted solution co-crystallization，USSC）可通过缩短诱导周期以及减小亚稳区来诱导晶体在较低过饱和度下成核 [39-40]。溶液结晶（包括悬浮转晶）经常与超声技术结合使用。从溶液中产生共晶的主要挑战是需要同时达到共晶组分的过饱和，特别是当其溶解度明显不同时，即非一致可溶系统。超声波可缩短诱导时间和亚稳区宽度来改变三元相图区域，但不易建立三元相图和USSC之间的关系。咖啡因/马来酸是一对非同向可溶的化合物，可通过溶液共结晶、悬浮/浆料共结晶和研磨技术，以化学计量比 1 : 1 和 2 : 1形成共晶体 [41-42]，但获得的产物并非纯的共晶体，常伴有少量到大量的咖啡因。采用甲醇作为溶剂时，咖啡因与马来酸的溶解度差异很大，通过超声辅助技术可制备得到咖啡因-马来酸共晶 [39]，超声波在咖啡因-马来酸2 : 1 或 1 : 1 共晶体的形成和纯共晶体产物的产生过程中具有选择性，这表明超声波可促进非一致可溶对（即咖啡因 / 马来酸）的系统中形成共晶。与其他技术相比， USSC在共晶纯度方面效果更好。几种新型共晶制备技术的比较如表 2 所示。 3 药物共晶的表征 为了全面解析共晶的结构特性，包括粉末X射线衍射（powder X-ray diffraction，PXRD）、单晶 X射线衍射（single-crystal X-ray diffraction， SXRD）、红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、拉曼光谱、太赫兹时域 光谱（terahertz time-domain spectroscopy ， THz-TDS）和固态核磁共振（solid-state nuclear magnetic resonance， ssNMR）在内的一些光谱技术陆续用于共晶的结构解析与表征。这些技术共同构建了共晶结构的多维度认知框架。在物理性质探究方面，利用熔点仪、差示扫描量 热 法（differential scanning calorimetry， DSC）、差热分析（differential thermal analysis， DTA）、热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）和冷热台显微镜等技术 [43]，能够精确测定并解析共晶的热力学稳定性、热行为及相变特性。XRD在共晶验证中起核心作用，其图谱如同“指纹”般独特，能够清晰展示共晶所特有的、异于 API 与配体的衍射特征峰，从而确证共晶的形成。FTIR、拉曼光谱和THz-TDS等光谱学技术可深入揭示共晶内API与配体间的氢键网络，是解析共晶内部相互作用机制的重要工具 [43]。 SXRD是判断共晶最有效的方法之一，其对晶体结构解析精度最高，但也对晶体的完整度和尺寸要求较高。SXRD通过测定单晶的结构，可在原子水平上确定晶胞中原子的三维空间坐标，获取晶系、空间群、键长、键角、晶胞参数、原子占有率、分子间相互作用等大量微观信息。PXRD是提供有关晶体结构信息的主要方法之一。PXRD测定晶体结构的原理是将晶体的三维衍射重叠为唯一的衍射图谱，对样品要求较低。由于同一物质的不同物相具有不同的衍射图谱，故 PXRD仍是晶型鉴别的“金标准” [44]。通过湿法研磨制备吡嗪酰胺-黄芩苷共晶，其 PXRD图谱（见图4）显示该共晶的特征峰分别出现在27.10°、24.43°、21.09°、16.49°、17.97°、10.40°、8.31°和10.71°处，与吡嗪酰胺和黄芩苷单组分的特征峰存在明显差异 [24]，故利用PXRD图谱可判断共晶的形成。 热分析技术（DSC、DTA和TGA）用于确定物理性质，如熔融、结晶、升华、分解、固态转变和挥发性组分定量（即残留溶剂或气体副产物）。热台显微镜（heating stage microscope， HSM）可用于确定固相化合物的相变和热行为。扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SEM）用于固相特性的显微观测及其表征，例如晶体形状、尺寸和表面特性。原子力显微镜（atomic force microscope， AFM）也可用于表征固相化合物的表面性质 [45]。 FTIR 即分子的振动光谱，可提供形成共晶的分子间作用力的信息，被广泛应用于定性判断药物共晶是否成功制备。如果API与配体分子形成共晶，官能团红外图谱中的某些特征吸收峰会发生一定的偏移，通过该现象可判断API与CCF是否被成功制备为共晶产品。因此，通过观察FTIR中特征峰的频率和强度的变化可以推断共晶的形成 [46]。 ssNMR 技术是一种用于研究固体样品中原子核自旋行为的方法 [43]。该技术可以分析共晶中各成分之间的空间排列方式、相对位置以及相互作用。ssNMR 还可以确定共晶之间的氢键和局部构象变化以及盐形成中的质子转移，从而帮助区分共晶和盐，这对于确定共晶内部结构和相互作用的方式至关重要 [47]。 THz-TDS技术用于研究固体分子在0.1~10 THz范围内由分子间振动产生的现象。在较大的分子中， THz-TDS可记录包括晶体晶格中的组合声子模式和聚合物链的节段运动、范德华力相互作用和分子内振动 [48]。THz-TDS 通过峰型可区别晶体与非晶体，通常晶体中特征峰呈现尖峰，而非晶体中则呈现宽峰 [49]。通过反溶剂法制备的香兰素（VAN）与烟酰胺（INM）、异烟酰（NIC）共晶， VAN 在0.61THz处表现出一个吸收峰，而 NIC和INM分别在1.125、 1.94THz和1.49、 1.87 THz处表现出吸收峰[50]。VAN光谱显示了0.61、 1.10和1.17THz的特征峰值，当频率高于1.25 THz 时，曲线形状变得不清晰。VAN-NIC（1.06 和 1.41 THz）和VANINM（1.45和1.62 THz）的太赫兹光谱表现出与其各自成分不同的特征。由此推断，这些特征并非来自其各自分量的太赫兹光谱的叠加，而是形成共晶。 4 基于共晶的成药性改良 API 的物理化学性质是制剂研发过程需要重点考虑的因素。药物共晶是通过非共价相互作用形成的一种特殊结构，这种结构能够改善药物的物理化学性质，如提高溶解度、降低熔点等，进而增强药物的稳定性和机械性，可以提高中药活性成分的成药性 [33]。 4.1 溶解度与溶出度 溶解度决定了药物分子在胃肠道溶液的暴露浓度，影响药物的口服生物利用度。据统计，市场上有 40% 以上的药物是难溶性成分 [51]，因此通过制剂手段改善其溶解性及生物利用度是改良型新药研究的方向之一。晶体工程是调控 API 溶解度及溶出速率的有效技术 [52]，由于在晶格中引入了配体，共晶可比多晶型更有效地改善难溶性药物的溶解度。不少中药黄酮类化合物的溶解度和生物利用度较低，采用水溶性小分子为配体，与黄酮类化合物组装后可有效改善后者的溶解性。例如采用水溶性的脯氨酸作为配体，可得到黄酮醇（槲皮素Que和山奈酚 Kae）、黄酮（木犀草素 Lut、黄芩素 Bai 和菊花素 Chr）和异黄酮（染料木黄酮 Gen）的共晶（见图 5）[53]。Chr-L-Pro、Bai-L-Pro和Kae-L-Pro 共晶在水中的溶解度分别比对应的黄酮类成分高出约70%、50%和270%，表明脯氨酸的引入可以有效改善药物的溶解性。咖啡因也是一种常见的共晶配体，将槲皮素与咖啡因制备成共晶（QUE-CAF）后，其水溶性比槲皮素提高了14倍 [54]。 4.2 熔点与稳定性 熔点是物质的基本物理属性之一，由固相与液相平衡的温度决定 [55]。由于药物的熔融是一个热力学过程，其中跃迁的自由能等于零，因此该值由聚变焓的变化与聚变熵的变化之比决定。通过形成共晶，可以改变药物的熔点，提高稳定性。例如，羟基酪醇（HT）是一种从橄榄树中提取得到的具有较强抗氧化活性的天然多酚 [56]，该成分的熔点仅为53℃，在干燥条件下是固体，吸水后变成一种黏性液体。由于结构中存在邻苯二酚，HT对氧气高度敏感。采用重结晶的方法得到了4种HT与甜菜碱（BET）、烟酰胺（NIC）和异烟酰胺（INA）的共晶（见图 6）[56]。这几种共晶在室温下均为固态， HT-BET、 HT-NIC、HT-INA（晶型Ⅰ）与HT-INA （晶型Ⅱ）的熔点分别为148.0℃、109.6℃、 77.3℃和 101.6℃，相比于HT，熔点显著提高。 在储藏期内，药品在性状、外观、含量、有关物质、溶出释放行为等方面需具有足够的稳定性 [57]。药物与共晶配体在分子层面可通过非共价键相互作用，以合成子为基本单位重新堆积形成二元晶体 [58]。药物与配体的分子间相互作用的强度决定了晶格能，可改善药物的高温稳定性 [24]。共晶的高温稳定性特点在中药挥发油的固化增稳中具有很大优势 [59]，已在液态药物如维生素类 [60]、痤疮治疗药物异维甲酸 [61]、麻醉剂丙泊酚 [62] 等的固化方面有所应用。此外，药物与配体之间氢键和分子相互作用，可有效屏蔽活性成分分子结构中的亲水基团，阻止水分子参与形成新氢键网络，从而降低产品的吸湿性 [63]，且可避免因稀释引起的潮解或转晶现象。例如，为了避免潮解或溶剂化物形成盐，可采用共轭酸碱（CAB）对的共晶设计。以茶碱（TP）为例， TP 可与不同的二羧酸（草酸、丙二酸、马来酸、戊二酸）形成共晶 [59]，在多种相对湿度条件下均能保持较好的稳定性。茶碱-草酸共晶在高达 98% 的相对湿度下仍具有较好的稳定性。对于氧敏感药物，共晶技术可通过在晶格中引入抗氧化共构象、抑制氧渗透或改变分子相互作用的方式来增强其抗氧化性 [63]。例如采用液体辅助研磨法得到穿心莲内酯分别与抗氧化剂香草醛（1 :1）、香草酸（1 :1）、水杨酸（1 :1）、间苯二酚（1 : 1）和愈创木酚（1 : 1）的共晶，可有效改善药物的化学稳定性和溶解性问题 [64]，其中在水杨酸共晶中，穿心莲内酯向其无活性硫酸盐代谢物的化学转化被完全抑制，共晶溶解速度提高了3倍，药物溶出速率提高了 2 倍。 4.3 机械性能 机械性能（抗拉强度、断裂力、弹性、可压性）是固体药物的关键属性，对混合、研磨、造粒、压片和包衣等多种制剂过程具有显著影响 [31]。固体材料发生机械变形的机制包括弹性、塑性、黏弹性和破碎[31]。一般来说，塑性更好的材料可表现出优异的可压缩性。然而，机械性能较差的化合物成为片剂处方开发中的挑战。共晶可通过改变晶体堆积形式来调控药物的机械性能[65]。以片剂为例，片剂抗拉强度差与高弹性恢复和低塑性有关。利用共晶技术可通过调整分子堆积方式在晶体结构中形成滑移面，易于晶体的塑性变形，从而改善产品的塑性和可压性 [66]。例如，咖啡因与没食子酸酯形成1 : 1共晶后，粉末压实性能得到显著改善（见图 7）[66]。咖啡因共晶的片剂抗拉强度提高了 2倍。咖啡因-硝基苯甲酸共晶的多晶型物具有不同的压实性能和力学性能，晶型Ⅰ比晶型Ⅱ的塑性变形更好，这归因于其二维层状晶体结构[67]。 4.4 生物利用度 口服生物利用度与药物溶解性、溶出速率密切相关，而溶出速率决定于药物的晶型、颗粒大小和表观溶解度 [31]。共晶可通过提高药物溶解度、溶出速率等来改善口服生物利用度[68]。芹菜素（APG）是一种具有多种药理活性的生物类黄酮，如抗炎、抗癌和抗病毒特性[69]。然而由于APG属于生物药 剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）Ⅱ类药物，极低的溶解度和生物利用度，限制了其临床转化应用。APG和4，4'-联吡啶形成共晶后，其生物利用度提高了4倍 [69]。黄芩素（Bai）（BCS Ⅳ类）与咖啡因（Caf）形成共晶后具有较好的药动学特性，其生物利用度比物理混合物提高了4倍（见图 8）[70]。槲皮素-吡嗪酰胺共晶的生物利用度比物理混合物提高了约27倍[45]。因此，利用共晶技术是改善BCS Ⅱ类和BCS Ⅳ类药物生物利用度的有效手段。 5 结语与展望 药物共晶在改善药物稳定性、理化性质以及生物利用度方面具有显著优点，近年来已成为药物研究领域的一大热点。然而，多数研究聚焦于共晶结构的解析和药物共晶的生物利用度改善。在深入探讨共晶结构与药物溶出的相关性以及如何借助晶体工程技术实现对药物体内释放和吸收的精准调控等方面，尚缺乏深入和系统的研究。药物共晶研究仍面临一些尚待解决的难题：1）由于共晶解析的高难度，目前所广泛应用的配体结构及官能团较为简单，主要是简单结构的酰胺类（烟酰胺、异烟酰胺）、酚类（对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、间苯三酚）、羧酸类（阿魏酸、 L-酒石酸、赖氨酸、水杨酸等）、杂环类（如 4-羟基吡啶、 4， 4-联吡啶等）。大部分配体并非药用辅料，制备得到的共晶难以应用于临床实践。2）多数研究是在简化的体外条件下进行，缺乏复杂生理条件下的溶出和释放的系统研究，这限制了研究结果的实际应用。 中药应用历史悠久，已知的中药活性成分常面临无专利保护、因理化性质不佳导致成药性差等多重挑战。利用晶体工程技术制备中药活性成分共晶，不仅可改善 API 的理化性质和生物利用度，还能形成强有力的知识产权保护，是一种颇具潜力的中药新药开发途径。共晶技术在改善药物溶解性、提高稳定性和增强药效方面已展现出良好的前景，探索以药用辅料为配体进行共晶开发，将成为药物共晶研究的重要方向。 参考文献： [1]     Zhang Y Q, Gong S Q, Liu L, et al. 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