Imipramine Pamoate

重度抑郁障碍（Major Depressive Disorder, MDD）是一种常见的精神疾病，严重影响患者的正常生活。抑郁症的发病机制尚未完全阐明，目前主流观点是“单胺假说”,即抑郁由5-羟色胺（5-HT）为主的神经递质缺失致使单胺能神经元活动不足而引起。传统抗抑郁药物也是基于该假说而开发的。以异丙嗪为代表的单胺氧化酶抑制剂是第一代抗抑郁药物，因其肝脏毒性较强已退市。1956年第二代抗抑郁药物丙米嗪被发现可以靶向单胺类递质再摄取转运子，如5-HT转运体（serotonin transporter, SERT）、去甲肾上腺素转运体（Norepinephrine transporter,NET）。但该类非选择性单胺再摄取抑制剂有很多副作用。1987年，美国礼来公司开发的第三代抗抑郁药物选择性SERT抑制剂氟西汀重磅上市，但氟西汀可以作用到外周SERT，对心血管系统，消化系统起到抑制效果，并且其起效慢，服用早期甚至加剧抑郁行为，诱发自杀等极端行为，存在广泛副作用。因此，寻找新的抗抑郁靶点并设计快速抗抑郁药物具有重大意义。中缝背核（Dorsal Raphe Nucleus，DRN）是中枢神经系统中最主要的5-HT神经元核团，也是5-HT的主要来源。抑郁患者服用氟西汀这类SERT抑制剂时，5-HT浓度确实可以升高，但主要激活突触前神经的5-HT1A自受体（5-HT1ARauto），DRN中5-HT1A自受体过度活跃会强烈抑制5-HT的重合成，降低5羟色胺能神经元放电频率，加剧抑郁样行为。SERT可以通过其C末端基序与DRN中的神经元型一氧化氮合酶（Neuronal Nitric Oxide Synthase，nNOS）的PDZ蛋白结构域结合。南京医科大学周其冈等研究团队发现，在小鼠的DRN中观察到nNOS和SERT高度共定位，该复合物在海马区（HPC）、前额皮层（PFC）等脑区却没有富集，透射电镜结果显示HPC、PFC中5-HT能神经元突触前部分缺乏nNOS，表明nNOS-SERT复合物在DRN中高度特异性表达。在抑郁症模型(Chronic mild stress,CMS)小鼠中，nNOS表达和活性与正常小鼠无明显区别，但nNOS-SERT复合物是富集的，提示该复合物与抑郁的联系。他们选择性敲除了DRN的5-HT能神经元中的nNOS，发现细胞膜表面的SERT显著增加。通过悬尾实验（Tail suspension test, TST）、强迫游泳实验 (Forced Swimming Test,FST)、旷场实验(open field test,OFT)发现nNOS敲除鼠表现出抗抑郁样行为。进一步，他们从自建文库中筛选出能够增强nNOS-SERT互作的Sakura-6和Sakura-8，分子对接提示Sakura-6可能作为nNOS的PDZ结构域和SERT的C末端之间相互作用的增强子，诱导了小鼠的抑郁样行为。通过突变nNOS底物催化位点使其丧失催化酶活性，发现并不影响nNOS-SERT复合物的形成，nNOS突变体过表达小鼠也会表现出抑郁样行为，说明nNOS 对 SERT 的抑制作用不依赖于nNOS的催化活性。因此，破坏nNOS的PDZ和SERT的C端互作或许就可以对抑郁产生治疗效果。SERT的15个C-末端氨基酸（SERT-15C，TPTEIPCGDIRMNAV）介导了其与nNOS的相互作用，于是他们截取了SERT-15C，并在其N端融合穿膜肽Tat，合成了名为Tat-SERT-15C的肽。Tat-SERT-15C给药2小时后细胞表面的 SERT 显著增加，且剂量依赖性地减少nNOS-SERT复合物，DRN 中细胞间5-HT 浓度显著降低，并产生类似抗抑郁药的作用。5-HT1AR 的选择性激动剂8-OH-DPAT 显著阻断 Tat-SERT-15C 诱导的抗抑郁样作用，5-HT1AR拮抗剂Way-100635使5-HT1A自受体失活诱发抗抑郁样作用，表明 SERT-nNOS 相互作用最终通过 DRN 的5-HT1A自受体来调节抑郁。接着他们检测了Tat-SERT-15C对DRN中5-羟色胺能神经元放电活性的影响，利用光遗传技术记录DRN中5-HT能神经元电生理活动，Tat-SERT-15C给药2h后提升了5-HT能神经元的放电频率。作者利用DREADDs技术（designer receptors exclusively activated by designer drugs，只由特定药物激活的受体）沉默了5-HT能神经元，这抵消了Tat-SERT-15C治疗的小鼠所表现出的抗抑郁样行为。说明了Tat-SERT-15C 对抗抑郁行为的影响依赖于5-HT能神经元的放电活性。他们还发现与氟西汀不同的是，Tat-SERT-15C减少了DRN中5-HT浓度，但增加vHPC和mPFC中5-HT浓度，逆转了 CMS 小鼠的5-HT自受体激活和5-HT能神经元放电活性削弱。并且Tat-SERT-15C仅在DRN中发挥作用，且不影响其他神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺。证明了特异性阻断nNOS-SERT相互作用以治疗抑郁症具有独特机制、更高的安全性和可行性。最后，他们尝试设计新型nNOS-SERT互作抑制剂。在分析SERT的C末端结合nNOS的PDZ结构域的化学机制后，设计合成了一系列二肽分子，筛选出ZZL-7作为先导化合物，Ac-Ala-Val-OH 的化学结构可以紧密结合在 nNOS PDZ 结构域的αB螺旋和βB折叠之间的沟槽中。对ZZL-7进行了体内和体外的药效评价，ZZL-7降低了nNOS-SERT复合物水平，并且给药2h后5-HT能神经元放电频率显著增加，具有快速抗抑郁样行为的良好效果。此外，ZZL-7药效至少可以持续24h，具有良好透膜性，易通过血脑屏障，对小鼠正常活动、记忆、认知能力无明显影响，也不会诱发小鼠攻击性行为、成瘾行为和异常脑电波。上述结果表明ZZL-7具有被开发成为新一代快速起效的抗抑郁药物的潜力。参考文献1. Sun, Nan et al. “Design of fast-onset antidepressant by dissociating SERT from nNOS in the DRN.” Science vol. 378,6618 (2022): 390-398.2. Chanrion, B et al. “Physical interaction between the serotonin transporter and neuronal nitric oxide synthase underlies reciprocal modulation of their activity.” PNAS vol. 104,19 (2007): 8119-24.

，在这个研究中，研究人员使用超大虚拟分子库与分子对接试验筛选出5-HT2AR的配体，并且在此基础上对先导化合物进行了一系列的结构改造和优化，得到了特异性良好的靶向5-HT2AR的部分激动剂。 随着生活节奏变快，现代人面临的压力与日俱增。与此同时，抑郁症也成为困扰现代人的一类精神疾病。 抑郁症的反复发作史是自杀的一大诱因，但是传统治疗抑郁症的药物，例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂SSRIs等，却有着治愈率低、复发率高、副作用大等缺点。因此开发高效、毒副作用小的抗抑郁药刻不容缓。 5-HT2AR是5-羟色胺受体的一员，它与5-HT2BR，5-HT2CR共同构成了5-HT2受体的一个次家族。5-HT2AR是潜在的治疗抑郁症等精神类疾病的靶点，不过目前大部分5-HT2AR的激动剂如LSD、裸盖菇素（迷幻蘑菇）、二甲基色胺（DMT）等都有致幻风险。因此，开发安全低毒副作用的5-HT2AR激动剂是研发治疗抑郁症的一个重要方向。 虚拟分子库在药物开发早期、筛选配体具有重要作用。研究人员可以跳过繁琐的合成步骤，就能通过虚拟分子库中数量众多、结构多样的分子，筛选出合适的激动剂或者抑制剂。 近日，杜克大学医学中心的William C. Wetsel团队、加利福尼亚大学旧金山分校的John J. Irwin和Brian K. Shoichet团队、北卡罗来纳大学教堂山分校的Bryan L. Roth团队、斯坦福大学的Georgios Skiniotis团队以及耶鲁大学的Jonathan A. Ellman团队合作，在《自然》期刊上发表了有关抗抑郁药的重要研究成果。 他们将目光聚焦于四氢吡啶（THP）骨架，构建了含有7500万含有该骨架分子的虚拟化合物库，并从中筛选出了2个特异性靶向5-HT2AR的部分激动剂[1]。 值得注意的是，这两个化合物均没有已知5-HT2AR激动剂的致幻性，并且在小鼠模型上，它们能以1/40的剂量达到目前已上市抑郁症药物的效果。 论文首页截图 为了构建含有THP分子骨架的虚拟分子库，研究人员将已合成的THP衍生物和与其适配的功能基团导入虚拟分子库生成系统，通过添加诸如手性、物理性质等限制条件，生成一个具有7500万个衍生物的虚拟分子库。 接下来研究人员通过分子对接实验，希望可以筛选出5-HT2AR的配体。由于缺乏5-HT2AR的晶体结构，他们以5-HT2BR-LSD的晶体结构为模板，构建了1000个同源模型。 通过评估这些模型对已知5-HT2AR配体的富集能力，以及是否可以和LSD在关键位点产生相互作用，就可以筛选出最合适的5-HT2AR的晶体模型。研究人员使用该模型，在分子对接实验中，从7500万个分子中筛选出若干了先导化合物。 分子对接实验示意图 紧接着，研究人员通过化学合成获取了其中17个结构，在配体结合试验中，筛选出4个能够与5-HT2AR，5-HT2BR和5-HT2CR结合且产生抑制或者激动效果的分子。并且对接试验显示，这些新配体能与受体在保守位点形成相互作用。 合成的17个候选分子以及四个配体 研究人员在此基础上对先导化合物就行了一系列的衍生化，并进行了构效关系的分析。由此筛选出两个5-HT2AR的部分激动剂，(R)-69和(R)-70，它们对5-HT2AR的EC50分别为41nM和110nM。 值得一提的是，这两个分子对5-HT2BR的EC50分别是5-HT2AR的4.6倍和6.4倍，对5-HT2CR的EC50分别是5-HT2AR的29倍和51倍，对其他45个相关蛋白也未表现出结合，因此可以避免脱靶效应。 在之后的β-抑制蛋白募集实验中，(R)-69和(R)-70均未表现出激动作用。由此，研究人员得出结论，与LSD等已知5-HT2AR激动剂脱靶效应高，更偏好激活下游β-抑制蛋白通路不同，(R)-69和(R)-70是针对5-HT2AR的特异性部分激动剂，而且偏好激活下游G蛋白通路。 (R)-69和(R)-70的结构 接下来，研究人员使用冷冻电镜确定了5-HT2AR-(R)-69的结构，发现(R)-69与5-HT2AR在Asp155形成关键盐桥，Phe340与(R)-69氮杂吲哚形成了堆积作用。此外，还有Val156、Val235、Trp336、Phe339等和(R)-69形成疏水作用。 5-HT2AR-(R)-69的结构 在进行了一系列的体外测试之后，研究人员开始在小鼠模型上探索(R)-69和(R)-70治疗抑郁类精神疾病的可能性。在药代动力学测试中，(R)-69和(R)-70均能透过血脑屏障进入中枢神经系统。 接着研究人员对(R)-69和(R)-70进行了致幻性测试。实验结果表明，在1-3mg/kg的剂量下，(R)-69和(R)-70只会导致非常轻微的头部抽搐反应（HTRs，是小鼠在摄取5-HT2AR激动剂如LSD之后产生幻觉的指标），并且还能抑制由LSD导致的HRTs。除此之外，这两个分子还能抑制LSD引起的超运动状态。 以上实验表明(R)-69和(R)-70在使用剂量下不具有致幻性。 给药30分钟之后的头部抽搐反应 接下来，研究人员使用先天习得性无助小鼠模型VMAT2-HET测试了(R)-69和(R)-70抗抑郁效果。 他们使用已上市的抗抑郁药丙米嗪、氟西汀、瑞波西汀和安非他酮作为阳性对照。在给药30分钟后，1mg/kg的(R)-69或0.5-1mg/kg的(R)-70均能逆转VMAT2-HET小鼠精神运动迟缓和甜味偏好变低等类抑郁行为，让模式小鼠的这些指标恢复至野生型小鼠的水平，达到了与氟西汀相同的效果，而且效果可以持续24小时。 随后，研究人员在后天习得性无助小鼠模型上测试了(R)-70的抗抑郁效果。 他们使用电击足部休克（FS）使正常小鼠发展出类抑郁症状，然后测试了(R)-70的效果。结果证明1mg/kg的(R)-70能在给药之后立刻（第0天）提高FS小鼠对甜味的偏好，逆转抑郁症状，且效果持续到第3天，而氯胺酮直到给药后的第一天才有显著效果。 在这个实验中，研究人员还对小鼠进行了悬尾试验。(R)-70也展现出比裸盖菇素和氯胺酮更好的抗抑郁效果，在第0天(R)-70就显著减少FS小鼠抑郁不动的时间，并且持续至第14天。而裸盖菇素和氯胺酮分别是在第1天和第4天才开始发挥作用的，并且持续时间短于(R)-70。 此外，在抗焦虑测试中，(R)-70能增加FS小鼠在开臂区域停留的时间，证明它也具有抗焦虑效果。 FS小鼠的糖水偏好实验（上）和悬尾试验（下） 总的来说，在这个研究中，研究人员使用超大虚拟分子库与分子对接试验筛选出5-HT2AR的配体，并且在此基础上对先导化合物进行了一系列的结构改造和优化，得到了特异性良好的靶向5-HT2AR的部分激动剂。 这两个化合物在小鼠身上具有长效的抗抑郁、抗焦虑的效果，并且致幻风险很低，是非常有潜力的治疗抑郁症等精神类疾病的候选分子。更重要的是，这个研究为之后配体筛选、新药研发等提供了新思路和平台。 需要指出的是，尽管在本篇文章中，筛选出的两个化合物在小鼠模型中均展现出良好的且持久的抗抑郁效果，但其对于已经产生抗药性的抑郁症患者、严重焦虑患者、以及其他精神类病的治疗效果，还需要更多的实验和探索。 参考文献 【1】Kaplan AL, Confair DN, Kim K, et al. Bespoke library docking for 5-HT2A receptor agonists with antidepressant activity. Nature. 2022;10.1038/s41586-022-05258-z.