The investigators propose to conduct a clinical trial of neoadjuvant treatment utilizing chemotherapy formulations with favorable toxicity profiles: weekly doxorubicin, PPX and capecitabine. It is expected this combination will at least maintain the efficacy of a traditional chemotherapy regimen but will be associated with less toxicity, particularly nausea, vomiting and alopecia. In order to accomplish this the investigators have designed a chemotherapy regimen whose components (or administration schedule) are associated with minimal or no alopecia and are also considered to have low emetogenic potential.
In an attempt to improve the efficacy of the regimen the investigators plan to study an alternate schedule of cyclophosphamide and methotrexate administration (metronomic chemotherapy) which appears to inhibit angiogenesis and therefore enhance the activity of conventional cytotoxic chemotherapy administered concurrently.
In this trial the investigators aim to determine the clinical and pathologic response rate of 12 weeks of doxorubicin followed by 4 cycles of PPX and capecitabine. Metronomic chemotherapy with cyclophosphamide and methotrexate will be administered during the 24 weeks of chemotherapy.

开始日期2009-02-01

申办/合作机构

University of Southern California

[+1]

NCT00763750 / Completed临床2期IIT

BrUOG-Brain-223-A Phase II Study of PPX (CT-2103), Temozolomide, and Concurrent Radiation for Newly Diagnosed Brain Tumors (CTI # CT2103) Principal Investigator: Howard Safran, M.D.

The purpose of this study is to determine the antitumor activity of PPX in combination with temozolomide and radiation for patients with newly diagnosed brain tumors.

开始日期2008-10-01

申办/合作机构

Rhode Island Hospital

[+1]

NCT00660218 / Completed临床1/2期IIT

A Phase I/II Study of Radiation Therapy, Paclitaxel Poliglumex and Cetuximab in Advanced Head and Neck Cancer

This study involves two phases. Phase I of this study is designed to find out the maximum dose of paclitaxel poliglumex which can be safely given to subjects when combined with cetuximab and radiotherapy in head and neck cancer. Once the maximum safe dose of paclitaxel poliglumex is found, Phase II of the study will continue to find out whether the addition of paclitaxel poliglumex increases tumor response and survival compared to treatment with cetuximab and radiotherapy alone.
An additional 20 patients have been added, to balance data. These patients must be HPV negative.

开始日期2008-03-01

申办/合作机构

SUNY Upstate Medical University

[+1]

100 项与 Paclitaxel Poliglumex 相关的临床结果

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2024-04-01·The ocular surface

A PEDF peptide mimetic effectively relieves dry eye in a diabetic murine model by restoring corneal nerve, barrier, and lacrimal gland function

Article

作者: Zhang, Xiaomin ; Barnstable, Colin James ; Zhao, Shaozhen ; Tombran-Tink, Joyce ; Li, Xiaorong ; Chen, Shuangping

PURPOSE:

The study investigated effectiveness of a novel PEDF peptide mimetic to alleviate dry eye-like pathologies in a Type I diabetic mouse model established using streptozotocin.

METHODS:

Mice were treated topically for 3-6 weeks with Ppx (a 17-mer PEDF mimetic) 2x/day or vehicle. Corneal sensitivity, tear film, epithelial and endothelial injury were measured using Cochet-Bonnet esthesiometer, phenol red cotton thread wetting, fluorescein sodium staining, and ZO1 expression, respectively. Inflammatory and parasympathetic nerve markers and activation of the MAPK/JNK pathways in the lacrimal glands were measured.

RESULTS:

Diabetic mice exhibited features of dry eye including reduced corneal sensation and tear secretion and increased corneal epithelium injury, nerve degeneration, and edema. Ppx reversed these pathologies and restored ZO1 expression and morphological integrity of the endothelium. Upregulation of IL-1β and TNFα, increased activation of P-38, JNK, and ERK, and higher levels of M3ACHR in diabetic lacrimal glands were also reversed by the peptide treatment.

CONCLUSION:

The study demonstrates that topical application of a synthetic PEDF mimetic effectively alleviates diabetes-induced dry eye by restoring corneal sensitivity, tear secretion, and endothelial barrier and lacrimal gland function. These findings have significant implications for the potential treatment of dry eye using a cost-effective and reproducible approach with minimal invasiveness and no obvious side effects.

2024-02-01·International immunopharmacology

Pramipexole protects against diabetic neuropathy: Effect on oxidative stress, TLR4/IRAK-1/TRAF-6/NF-κB and downstream inflammatory mediators

Article

作者: Helmy, Sahar A ; Eisa, Nada H ; El-Kashef, Dalia H ; El-Sherbiny, Mohamed ; Elsherbiny, Nehal M

BACKGROUND:

Diabetic neuropathy (DN) is a serious microvascular complication and a major cause of morbidity and mortality in diabetes mellitus. It is characterized by neurodegeneration of terminal sensory nerve fibers with subsequent pain, loss of sensation, and paresthesia, thus compromising the quality of life of diabetic patients. It is considered the leading cause of non-traumatic amputations worldwide, reflecting the insufficiency of current therapies. Pramipexole (PPX) is a dopamine receptor agonist used for the treatment of Parkinson's disease. The current study aims to investigate the potential neuroprotective effect of PPX in an experimental model of DN.

METHODS:

Sprague Dawley rats were randomly assigned into five groups: normal control, Normal + PPX (1 mg/kg) group, STZ control, STZ + PPX (0.25 and 1 mg/kg/day for eight weeks). The neuroprotective effect of PPX in rats was evaluated in terms of sciatic nerve histological alterations, oxidative stress, and protein expression of TLR4/MyD88/IRAK-1/TRAF-6/NF-κB axis and downstream inflammatory mediators.

RESULTS:

PPX administration ameliorated histopathological signs of neuronal inflammation and apoptosis. Additionally, PPX attenuated STZ-induced sciatic nerve oxidative stress and downregulated neural tissue expression of TLR4, MyD88, IRAK-1, TRAF-6, NF-κB and downstream mediators (TNF-α, IL-1β and ICAM-1).

CONCLUSION:

Collectively, the current study sheds light on PPX as a potential protective medication to alleviate neuropathy progression in diabetic patients. PPX neuroprotective effect can be attributed to modulating TLR4/ MyD88/IRAK-1/TRAF-6/ NF-κB axis signaling in nerve tissues with subsequent attenuation of oxidative stress and inflammation.

2024-01-01·Comparative biochemistry and physiology. Toxicology & pharmacology : CBP

Biochemical and teratogenic effects of a mixture of pyriproxyfen and glyphosate

Article

作者: da Silva, Josefa Gerlane ; Dos Santos Azevedo, Angélica Sabrina ; de Azevedo, Rafael David Souto ; de Oliveira Silva, Maria Regina ; de Almeida, Sinara Monica Vitalino ; Dos Santos, Jéssica Celerino ; de Sá Leitão Câmara de Araújo, Marina

The mixture of agrochemicals can be made to improve pest control or accidentally. In this way, the effects on non-target organisms are a critical aspect of the environment and heath. Thus, this work aimed to show how a mixture of pyriproxyfen, and glyphosate can impair biochemical routes and embryonic development. Zebrafish embryos 0-72 hpf were exposed to 0.001-1 μg/mL of pyriproxyfen, glyphosate, and a mixture of both pesticides. The ADMETox was evaluated in silico. The FET-test was used to estimate teratogenic effects. The biochemical effects were estimated using AChE, SOD, and CAT as parameters. ROS generation was estimated using 30 μM H₂DCF-DA and 5 μM DHE. The ADMETox reveals that intestinal absorption and P-glycoprotein are the main sites for PPx and Gly adsorption. The distribution parameters were diverse. PPx + Gly at 0.1 μg/mL leads to 50 % of lethality and at 1 μg/mL 100 % of lethality. PPx + Gly leads to a 22 % of lack of somite formation at 1 μg/mL. The heart rate was reduced by >10 % in all concentrations tested. The AChE has a decrease with IC₂₀ 19.6 μM and IC₅₀ 261.5 μM. SOD showed a reduction of 28 % to PPx and CAT was reduced by 58 % to PPx + Gly and Gly at 1 μg/mL. Glyphosate does not increase unspecific ROS generation. The superoxide generation was 2× higher in the PPx + Gly at 1 μg/mL. Summarily, was observed that the mixture of PPx + Gly potentiated the toxic effects. This finding suggests a possible synergism between the PPx and Gly even at lower concentrations.

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2023-07-27

·Science Daily

Self-healing plastic becomes biodegradable

Chemists develop mineral plastics with numerous positive properties from sustainable basic building blocks and, together with biologists, demonstrate the material's excellent microbiological degradability. Imagine a plastic like this: harder than common plastics, non-flammable, and even with self-healing properties. But that is not all! It can be produced at room temperature in water, which is very energy-efficient and does not require toxic solvents. Before hardening, you can shape the plastic in any way you want -- like chewing gum. By adding water, it can also be converted back to its "chewing gum" form at any time, reshaped and thus recycled as often as desired. Is that impossible? No, it is not! In 2016, the research team around Konstanz chemist Helmut Cölfen presented just such a material -- a mineral plastic. However, even though the plastic, with its novel manufacturing process and outstanding material properties, has since attracted great interest from industry, it still had a crucial shortcoming from the Konstanz chemists' point of view: due to its chemical composition, it was difficult to biodegrade. A new ingredient for greater environmental compatibility "Previously, we used polyacrylic acid to produce our mineral plastic. Chemically, this acid has the same backbone as polyethylene, which is known to cause major problems in the environment because it is hardly biodegradable," explains Cölfen. The research team led by Cölfen and Ilesha Avasthi, a postdoc in Cölfen's lab, therefore set to work looking for an alternative basic building block to develop an environmentally compatible mineral plastic that retains the intriguing properties of the original material. And they found what they were looking for. In their current publication in the journal Small Methods, the Konstanz chemists present the next generation of their mineral plastic. Instead of petroleum-based ingredients such as polyacrylic acid, they now use polyglutamic acid. This natural biopolymer is readily available in large quantities and can even be obtained sustainably, for example from biotechnological production using microorganisms. A variety of microorganisms that already exist in the environment can degrade polyglutamic acid. "Our new mineral plastic has the same positive properties as the previous one, but has the decisive advantage that its basic building block -- polyglutamic acid -- can be produced with the help of microorganisms and is completely biodegradable," says Helmut Cölfen. Support from biologists In order to prove that this biodegradability also applies to the new mineral plastic itself and not just to its individual components, the chemists enlisted the support of David Schleheck and postdoc Harry Lerner from the Department of Biology at the University of Konstanz. "Helmut Cölfen has created a new type of mineral plastic in his laboratory, and our task now was to make it disappear again with the help of microorganisms," says Schleheck with a smile. In degradation experiments, the biologists were able to show that microorganisms found in forest soils, for example, began metabolizing the mineral plastic after just a few days. After only 32 days, the microorganisms had completely degraded the plastic. So the researchers have actually succeeded in making the mineral plastic with all its positive material properties now also sustainable and biodegradable.

2023-01-12

·行舟Drug

分享 | 抗体偶联药物中连接技术研究进展

点击上方的行舟Drug ▲ 添加关注癌症是危害人类生命健康的头号杀手[1]。传统治疗包括手术、化疗和放疗等方式，但这些方法通常在杀死癌细胞的同时对正常细胞产生毒副作用。免疫疗法是一种重要的癌症治疗手段，通常利用人体自身的免疫机制来对抗癌细胞，由于其高靶向性和副作用小的独特优势，是早期病灶较小的癌症患者的优选治疗方案。但针对晚期实体瘤来说，免疫疗法效果有限，需要联合其他方法共同抗击癌细胞[2]。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）是一种化疗和免疫治疗相结合的药物新形式，比化疗更精准，比免疫治疗更高效。ADC是将细胞毒性药物（payload）与抗体（antibody）通过连接子（linker）偶联形成药物，既有抗体的高靶向性，又有化学药物的强杀伤力。连接子是 ADC 的关键部件之一，是抗体与细胞毒性药物连接的桥梁，对 ADC的抗癌作用至关重要，见图1。图1. 抗体偶联药物（ADC）中连接子的枢纽作用A：连接子与药物连接过程；B：连接子与抗体连接过程笔者结合近10年来在ADC领域的最新研究进展，从ADC的连接技术着手，对连接子与细胞毒性药物的偶联方式、连接子结构，以及连接子与抗体的定点偶联策略进行总结，并对ADC中连接子给药物带来的影响进行了回顾。连接子与细胞毒性药物连接ADC中连接子与药物连接的方式主要分为可裂解和不可裂解两种形式｡可裂解连接子主要为敏感性的化学键,可以根据身体内环境的特异性化学物种(如谷胱甘肽,酸碱性等)或酶浓度不同,促进连接子与药物裂解,主要通过腙键､二硫键､多肽的形式连接｡不可裂解连接子没有可触发裂解的内置化学键,需要在癌细胞中将抗体通过蛋白质水解机制变成氨基酸,进而释放带有连接子和氨基酸片段的细胞毒性药物,主要通过硫醚的形式连接[4]｡腙键连接(酸裂解)腙键对pH值的变化比较敏感,可在酸性环境中裂解｡其特点是在血液环境中(pH值≈7.3~7.5)稳定,而在癌细胞内溶酶体环境中(pH值≈4.5~5.0)裂解率约为97%[5]｡这种在血液与胞内环境的pH值差异,为抗体偶联药物选择性释放细胞毒性药物提供了机会｡HAMANN 等[6]开发出4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(4-(acetylphenoxy) butanoic acid,AcBut)连接子,一边利用羧基与抗体的赖氨酸残基形成酰胺键,另一边利用羰基与细胞毒性药物形成腙键,将抗体与小分子药物连接｡形成的ADC在癌细胞的溶酶体中水解释放细胞毒性药物, 见图2｡图2. 连接子与细胞毒性药物通过腙键连接和裂解过程使用此技术上市的ADC包括gemtuzumab ozogamicin和inotuzumab ozogamicin｡对于inotuzumab ozogamicin 的体内分析表明,腙键以每日6%的速率在血液循环中发生水解[7]｡但是对于其他通过腙键连接的ADC研究表明,尽管在pH值为7.4的缓冲液中具有很高的稳定性,但是在人体分离的血浆中仅需要两日就会有50%的细胞毒性药物被释放[7]｡与其他连接子相比,稳定性变化较大,极易造成脱靶效应,因此这种连接子技术的应用受到了很大的限制,主要在早期的ADC开发中使用。二硫键连接(还原环境裂解)二硫键可以被含巯基的小分子(谷胱甘肽GSH､半胱氨酸Cys)还原裂解｡二硫键的特点是在胞外体液环境中(巯基小分子浓度约为0.05mmol·L-1)相对稳定,在胞内环境中(巯基小分子浓度约为0.5~10mmol·L-1､癌细胞中巯基小分子量约为血液环境中的104倍)更容易裂解[8]｡这种小分子浓度差异,为ADC的选择性释放创造了机会｡WIDDISON等[9]开发出N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(N-Succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butannate,SPDB)连接子,通过与抗体的赖氨酸残基形成酰胺键,再与细胞毒性药物经过硫醇-二硫化物交换形成二硫键,将抗体与细胞毒性药物进行连接｡形成的偶联体在溶酶体中降解后,进而在细胞质中通过还原切断二硫键,释放细胞毒性药物, 见图｡为了继续提高二硫键在循环系统中的稳定性,通过在二硫键的两端引入取代基,增加二硫键的空间位阻效应,从而降低二硫键在血液中提前断裂的风险｡常见的改造方式包括在靠近二硫键的一端引入一个甲基或两个甲基,见图3B｡在此基础上THORPE 等[10]开发出4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代) 甲苯(4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene,SMPT)连接子,见图3C,OJIMA 等[11]开发出N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate, SPP)连接子,见图3D,已成功应用到ADC的设计中｡上市的ADC gemtuzumab ozogamicin和inotuzumab ozogamicin中,二硫键与腙键被同时应用到细胞毒性药物卡奇霉素(calicheamicins)的连接上｡但在目前正在开发的大多数药物中,美登素(maytansine)是二硫键主要连接的细胞毒性分子｡多肽连接(酶裂解)多肽链作为连接子可被溶酶体中的蛋白酶裂解｡蛋白酶在血液中活性低,不能将多肽连接子裂解,在血液循环中稳定｡而当抗体偶联药物进入癌细胞后,蛋白酶含量和活性增加可以使多肽链连接子裂解,释放细胞毒性药物, 从而实现细胞毒性药物在癌细胞中靶向释放的功能｡DUBOWCHIK 等[12]开发了马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(maleimido-caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl, mc-vc-PABC)连接子,一端与抗体的半胱氨酸残基通过迈克尔加成反应连接,另一端与细胞毒性药物通过酰胺键连接｡形成的ADC经过初始的酶促裂解将多肽链部分水解掉后,再经组织蛋白酶B(cathepsin B)催化裂解释放细胞毒性药物, 见图4A｡图4. 连接子与细胞毒性药物通过多肽连接和裂解过程A：通过mc-vc-PABC的连接与裂解过程；B：通过mc-va的连接；C：通过mc-vc的连接；D：通mc-GGFG的连接已开发的马来酰亚胺-己酰基-缬氨酸-丙氨酸(maleimido-caproyl-valinealaine, mc-va) 连接子(图4B)[13]､马来酰亚胺基丁酸-缬氨酸-瓜氨酸(maleimidobutanoic acid-valine-citrulline, mb-vc)连接子(图4C)[14]､甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(glycine-glycine-phenylalanine-glycine, GGFG)连接子(图4D)[15], 都具有相似的连接和裂解方式｡使用此技术上市的ADC包括brentuximab vedotin､polatuzumab vedotinpiiq､ enfortumab vedotin､trastuzumab deruxtecan｡有数据证明,通过肽链连接的ADC比链状小分子连接的ADC在人类循环系统中的稳定性要高一百倍[16]｡其中缬氨酸-瓜氨酸(vc)与其他二肽相比还具有更高的血浆稳定性和组织蛋白酶B催化裂解的选择性,是上市药物中最主要的连接方式,荣昌生物制药公司使用mc-vc-PABC连接子将靶向人类表皮生长因子受体2(HER2)的抗体与甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E, MMAE)结合,成功研发出维迪西妥单抗,用于治疗局部晚期或转移性胃癌,成为我国首个获批的抗体偶联药物｡硫醚连接(不可裂解)不可裂解连接子连接的ADC被吞噬进入细胞后,通过溶酶体途径,在癌细胞体内将ADC的整个抗体域进行酶促降解,从而释放具有连接子和氨基酸残基(来源于抗体)的细胞毒性药物,对癌细胞进行杀伤,通常采用硫醚和酰胺结构进行连接｡YOSHITAKE等[17]开发了N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧酸酯(N-Succinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)连接子,一端与抗体的赖氨酸残基通过酰胺键连接,另一端与细胞毒性药物通过迈克尔加成反应连接,形成ADC, 见图5｡图5. 连接子与细胞毒性药物通过硫醚连接和裂解过程不可裂解连接的方式与可裂解方式对细胞毒性药物的选择和ADC的作用过程有较大差异(以上市药物trastuzumab emtansine为例),优势在于:不可裂解连接子具有更好的稳定性;劣势在于:(1)能发挥作用的ADC对细胞毒性药物要求严苛,需要筛选出能在氨基酸残基和连接子存在下发挥作用的药物;(2)胞内降解后,多数释放出的细胞毒性药物水溶性较好,但脂溶性较差,因此不利于从死亡的癌细胞跨膜进入下一个癌细胞中发挥“旁观者效应”[18]｡连接子的发展方向随着ADC的发展,第三代ADC在原有连接子基础上,还针对不同类型的细胞毒性药物对连接子结构进行了进一步改进｡例如上市药物中使用的连接子多为非水溶性的连接子,通过引入聚乙二醇(PEG)提高连接子水溶性是新一代连接子技术的重要研发方向[2]｡CARDILLO等[19]将多肽连接的连接子中插入PEG形成了cross-linker 2A (CL-2A)连接子,连接子与抗体的半胱氨酸残基通过迈克尔加成反应连接,另一端在N,N-二环己基碳酸二亚胺或4-二甲基胺吡啶(N,N-dicyclohexyl carbodiimide/ 4- (dimethylamino) pyridine, DCC/DMAP)的存在下介导碳酸盐键的形成连接细胞毒性药物,见图6A｡图6. 通过聚乙二醇改造的连接子与细胞毒性药物连接和裂解过程A：通过CL-2A的连接与裂解过程；B：通过mp-PEG8-va-PABC的连接与裂解过程TIBERGHIEN等[20]开发出马来酰亚胺基丙酰基-聚乙二醇-缬氨酸-丙氨酸-对氨基苄氧基羰基(maleimidopropionyl-polyethylene-glycol8-valinealaine- p-aminobenzyloxy carbonyl, mp-PEG8-va-PABC)连接子(图6B)用于抗体和细胞毒性药物之间的连接｡在已经上市的ADC中,sacituzumab govitecan就是使用CL-2A连接子将抗体sacituzumab和细胞毒性药物SN-38连接起来,靶向TROP-2抗体,用于治疗三阴性乳腺癌[21]｡连接子与抗体偶联不同的细胞毒性药物可以选择不同的连接子来增加药物的稳定性和疗效。但只优化连接子与细胞毒性药物的偶联端，所形成的ADC多为药物抗体比率（DAR）和连接子与抗体氨基酸连接位点是不确定的药物，导致ADC的药物活性等参数也是不确定的。通过选择性偶联将抗体与连接子结合，合成均质的ADC，也是连接子研究的重要方向，主要包括化学方法和酶法对于抗体氨基酸和糖类部分的修饰。与天然氨基酸的随机结合赖氨酸残基具有很高的天然丰度（7.2%）和表面可及性，是ADC研究初期经常选择的偶联位点。免疫球蛋白G1（IgG1）约包含85个赖氨酸残基，其中可进行化学修饰的赖氨酸残基在40个以上[22]。尽管可以通过药物的化学计量和反应条件来获得DAR均匀的ADC，但是药物的结合位点通常很难控制。而且赖氨酸残基分布在抗体的整个表面，它们的修饰会阻碍抗原识别，从而限制ADC的靶向性识别。尽管存在这些缺点，但由于修饰连接操作简单，第一代ADC如sgemtuzumab ozogamicin，和第二代ADC如trastuzumab emtansine和inotuzumab ozogamicin依然使用赖氨酸进行抗体的连接。目前已经开发了一系列赖氨酸残基选择性试剂，比较常用的如N-羟基琥珀酰亚胺酯（N-hydroxy succinimide, NHS）（图7A）[23]。图7. 抗体偶联药物中抗体的天然氨基酸作为连接子与抗体结合位点A：通过NHS与抗体上的赖氨酸残基随机结合实现连接子与抗体偶联；B：抗体中链间二硫键全部还原或部分还原，从而形成均质或异质的ADC；C：通过N-取代马来酰亚胺与抗体上的半胱氨酸残基随机结合实现连接子与抗体偶联半胱氨酸残基由于有较低的自然丰度（3.3%）和较高的亲核性，为抗体与连接子的高选择性结合提供了最佳位点。抗体可以通过四个链间二硫键还原，释放出8 个巯基反应位点[24]。含亲电试剂的连接子可与8 个位点选择性结合，获得均匀性较高和安全性较高的ADC（图7B），如trastuzumab deruxtecan等第三代上市药物[25]均采用该种连接方式。但考虑到细胞毒性药物的疏水性问题，DAR为8 并不适合大多数偶联药物[26]。为了获得平均DAR为2~4的ADC，可通过部分还原再氧化实现（图7B）[27]，但最终ADC分子的异质化仍然不可避免。目前有多种针对半胱氨酸残基具有选择性的偶联试剂可供选择，其中N-取代马来酰亚胺最为常用（图7C）。引入反应性半胱氨酸实现选择性偶联为了获得DAR为2~4且具有相同结合位点的ADC，通过基因工程的手段，将反应性半胱氨酸引入到抗体的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）功能区，并进行药物的连接，称为THIOMABTM技术。JUNUTULA等[28]应用该技术，在抗体中引入与半胱氨酸或谷胱甘肽结合成为二硫键的反应性半胱氨酸，再通过全部还原和部分氧化的方法，将非抗体本身的半胱氨酸残基保留，最后与mc-Val-Cit-PABC-MMAE连接（图8），可产生高度均一的ADC，理论DAR为2，实际DAR为1.6。图8. THIOMABTM技术用于构建抗体偶联药物自THIOMABTM技术问世以来，已经开发出了多种引入半胱氨酸改造的ADC。这些ADC中有几个现已进入临床试验阶段。例如，Immunogen公司的IMGN632通过引入的反应性半胱氨酸残基将anti-CD123抗体与新型的DNA烷基化亚胺药物奥瑞他汀F（MonoMethylauristatin F，MMAF）选择性结合在一起[29]。目前，I/II 期临床试验正在进行中，用于治疗急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病。这种方法具有许多优点：（1）形成的ADC 具有确定的附着位点和药物化学计量；（2）所有天然抗体的二硫键将被保留，不会影响抗体的生物学性能；（3）与DAR值不确定的、连接子与抗体连接位点不确定的ADC相比，具有更好的安全性和清除速率。通过二硫键改造实现选择性偶联除了THIOMABTM技术，还可以通过对抗体原有二硫键改造，来获得具有相同DAR值和结合位点的ADC。IgG1抗体中的四个链间二硫键经过还原可释放出4个成对的半胱氨酸残基，进一步通过双反应性试剂将二硫键重构，同时安装适合连接子偶联的位点。BADESCU等[30]将具有PEG24-Val-Cit-PABC-MMAE的双砜试剂作为双反应性的半胱氨酸交联剂对抗体进行改造，获得DAR为4的ADC（图9A）；SCHUMACHER 等[31]将新一代的烯基双取代马来酰亚胺（next-generationmaleimides, NGMs）作为双反应性的半胱氨酸交联剂，并在亚胺端接入端炔，进一步与叠氮化物通过Click反应获得DAR为4的ADC（图9B）。使用此种方法形成的ADC在人白蛋白环境中5d内保持了很好的稳定性，且在小鼠体内实验中证明，其抗癌效果比上市的trastuzumab emtansine更好[30]。图9. 二硫键改造技术用于构建抗体偶联药物A：通过双砜试剂实现偶联；B：通过NGMs实现偶联；Click：点击化学运用二硫键改造技术设计的ADC也已经进入了临床试验。例如，OBIPharma公司开发的ADC OBI-999，选择性靶向在15种上皮癌中表达的Globo H抗原，并通过改造后的二硫键将DNA烷基化亚胺药物甲基澳瑞他汀E与抗体结合，目前正在进行I/II期临床试验，用于治疗胰腺癌、胃癌、结肠癌等实体瘤[32]。引入非天然氨基酸实现选择性偶联除了对抗体中已知氨基酸的修饰之外，还可以通过遗传密码子扩展技术（genetic code expansion, GCE）将非天然氨基酸(non-canonical amino acids, ncAA)整合到抗体的蛋白质序列中[33]，从而对抗体的结合位点进行特异性修饰，产生具有确定结合位点和均匀DAR的抗体偶联药物。由于抗体中引入非天然氨基酸可能会带来免疫原性风险，因此非天然氨基酸的选择对于ADC的构建非常关键。一般来讲，非天然氨基酸必须为天然氨基酸结构的类似物，同时也应具有易与连接子结合的活性位点，如羰基和叠氮等官能团，便于进一步的连接[34,35]。KULARATNE等[36]将乙酰基苯丙氨酸（p-acetyl-phenylalanine, p-AcF）氨基酸部分对称地整合到抗体的两个重链中，另一端通过构建酮肟键与连接子偶联，以产生具有DAR为2的均质ADC（图10A）。ZIMMERMAN 等[37]将对叠氮甲基苯丙氨酸(p-azidomethylphenylalanine, p-AMF)整合到抗体的重链中，另一端通过Click反应与二苯基环辛炔(DBCO)-PEG4-MMAF偶联，获得DAR为2的ADC (图10B)。与类似的异质ADC相比，通过引入非天然氨基酸技术连接生成的ADC显示出更长的循环半衰期，更佳的功效和安全性[38]。图10. 引入非天然氨基酸用于构建抗体偶联药物A：通过引入p-AcF实现偶联；B：通过引入p-AMF实现偶联通过引入非天然氨基酸的方式生成的ADC已经有多个进入临床试验。如AmbrX公司开发的ADC ARX788，通过非天然氨基酸将奥瑞他汀F与选择性靶向HER2的抗体结合，目前正处于I期临床试验中，用于治疗乳腺癌和胃癌[39,40]。通过对抗体C/N端的修饰实现选择性偶联抗体C/N端的修饰是指通过对抗体的C/N端进行处理，产生和连接子特异性偶联的活性位点。抗体的N端与抗原结合区接近，需要保证修饰后的抗体不影响与抗原结合的能力；抗体的C端位于抗原结合区的远端，对抗体与抗原的特异性识别影响较小，具有更好的适用性[41]。抗体N端修饰是通过将N端氨基酸的氨基转化为醛或酮官能团来合成ADC 的策略。ImmunoGen公司使用高碘酸钠将N 端的丝氨酸选择性氧化，生成醛官能团，再与连接子通过肟键连接，获得DAR 为2 的ADC（图11A），该连接不会阻碍抗体与抗原的结合，保证了ADC 靶向识别目标抗原的能力[42]。图11. 抗体的C/N端修饰技术用于构建抗体偶联药物抗体C端修饰是通过在C端整合一段肽序列来合成ADC的策略。ZHANG等[43]首先在抗体的C末端引入7个肽序列（LCYPWVY），之后用DBCO-PEGBiotin与肽序列中的半胱氨酸选择性结合，获得了产率约为90％的单个细胞毒性药物的ADC（图11B）。测试结果表明，抗体对抗原结合亲和力不受影响，并且产物在生理条件下可以保持超过4d的稳定性。另外由于构建连接子中的二苯并环辛基-四乙酰甘露糖胺（DBCO）及衍生试剂具有易得性,使该方法具有很好的通用性，可以快速有效地合成ADC。酶法修饰抗体的氨基酸单克隆抗体具有蛋白类大分子的复杂结构特征，在Fab和可结晶段（fragment crystallizable，Fc）都存在糖链。尽管糖链仅占抗体的3%，但糖链结构却发挥着维持空间构象、稳定抗体结构的作用。抗体中的糖链均以“双天线”的结构存在，且几乎所有IgG的Fc段都至少含有两个天冬氨酸-297（N-297）糖链[44]。MINDT 等[45]在用荧光探针与抗体偶联的研究中发现，在N-糖链存在的情况下抗体与荧光团的结合率相较于无N-糖链明显降低。因此，连接子与抗体连接过程中首先需要去掉N297位的糖链，进而暴露出可被连接子连接的谷氨酸-295（Q-295）位点。常用的酶切除糖链的方法包括肽糖苷酶F（peptide-N-glycosidase F，PNGase F）和肽糖苷酶A（peptide-NglycosidaseA，PNGase A）[46]。去除糖链的抗体可以通过谷氨酰胺转移酶（transglutaminase，TG）选择性的将谷氨酸的γ-酰胺基团与含有伯胺的化合物形成异肽链，用于抗体与连接子的选择性偶联[47]。LHOSPICE 等[48]改进传统切除糖链方法，采用N297Q 突变过程，在去除糖链的同时产生四个谷氨酸残基（Q295、Q297）。进一步使用TG酶催化，将一端含有伯氨基团，另一端含有叠氮基团的连接子与抗体结合，最后与DBCO-VC-Spacer-MMAE通过点击化学反应构建均质的ADC（图12）。酶法催化效率非常高，构建ADC的DAR为4。图12. TG酶催化技术用于构建抗体偶联药物TG：谷氨酰胺转移酶；GlcNAc：乙酰氨基葡萄糖；Fuc：岩藻糖；Man：甘露糖；Gal：半乳糖使用这种方法合成的ADC与上市药物brentuximab vedotin 相比[32]：（1）体外试验中具有相同的EC50水平；（2）小鼠实验中表现出更高的癌细胞吸收能力和更强的稳定性，最大耐受剂量是本妥昔单抗（brentuximab）的三倍。7对抗体中糖基的修饰单克隆抗体中的糖基化虽对抗体的修饰起到阻碍作用，但是由于其高度的异质性，也可以作为连接子于抗体特异性结合的位点。因此可以通过对IgG中天冬氨酸297位点（N297）的糖基进行修饰[49]，从而获得与连接子具有反应性的基团。连接子与糖基位点偶联具有很大的优势：（1）在空间上与发生抗体-抗原识别的互补决定区域相距较远，对抗体与抗原的特异性结合的影响较小；（2）抗体的糖基化位点少，避免了抗体被大量修饰；（3）糖类物质在化学上与抗体的多肽骨架不同，可以进行位点的特异性结合[23]。O’SHANNESSY 等[50]开发了一种通过高碘酸钠（NaIO4）将单糖末端的顺式二醇氧化成醛的方法，促进了对抗体上糖基进行修饰的研究。ZHOU等[51]在此基础上设计了一种方法，用半乳糖转移酶和唾液酸转移酶对抗体N297位点上的自身糖基进行酶修饰，使得寡糖末端引入唾液酸基团，进一步使用高碘酸钠将唾液酸残基氧化产生醛基，最后通过肟键将连接子-药物与修饰后的糖基连接，构建DAR为1.6的ADC，表现出良好的体外和体内抗癌活性。GEEL等[52]开发出GlycoConnect技术，首先利用糖苷内切酶将抗体N297位点的寡糖链切割从而暴露出N-乙酰- 葡糖胺结构（N-acetylglucosamine,GlcNAC）。进一步通过糖基转移酶的催化将含有叠氮化物的GlcNAC类似物N-乙酰-半乳糖胺（N-acetylgalactosamine, GalNAc）连接到GlcNAC末端。最后将修饰的抗体与含有BCN或者DBCO的连接子-药物通过SPAAC反应偶联构建DAR为2的ADC。GlycoConnect技术对单克隆具有广泛的适用性，对于合成均质高效的ADC具有很好的应用前景。小结从Paul Ehrlich提出“魔法子弹”的概念开始，到如今多种化学生物学新技术的引入，ADC经过120年的发展已成为今天医药领域不可或缺的重要成员之一。连接子作为抗体偶联体药物中的重要桥梁，在药物更新换代过程中扮演了重要的角色：一方面，在药物端，连接子种类逐渐丰富，可以针对不同癌症的生理特点选择最适合的连接子，保持了ADC在血液运输中的稳定性和胞内释放中的最佳活性；另一方面，在抗体端，在传统赖氨酸和半胱氨酸的基础上，继续开发出具有选择性结合的连接位点，为ADC的均质化提供了重要保证。除了ADC本身结构的优化和改进，我国在紧跟世界先进连接技术的同时，还应将更多的精力投入到新的抗原靶点的选择和开发。虽然HER2、CD22、CD30等靶点较为成熟，研发风险低，但竞争相对激烈，研发拥挤。布局ADC的企业可以另辟蹊径，在TF、c-Met、Claudin等新兴的抗原靶点上有所作为。此外，ADC的分子量较大，生产工艺复杂，进入人体后容易发生自身免疫排斥反应。针对这些弊端，目前一种新型的偶联药物进入人们的视线——多肽药物偶联物(peptide drug conjugate , PDC)，它通过连接技术将小分子寡肽和细胞毒性药物结合，降低了分子量，简化了合成和纯化过程，有效地降低了大规模生产的成本，是靶向治疗的又一个热门研究方向，目前已有melflufen、CT2103等药物进入临床研究。在ADC蓬勃发展的时代，应该多角度全方位地对ADC的靶点，抗体，细胞毒性药物连接技术等持续进行优化和改进，才能最终实现“魔法子弹”终极目标。参考文献：详见《中国新药与临床杂志》2022年来源：《中国新药与临床杂志》2022年凡默谷公众号. 抗体偶联药物中连接技术研究进展，2022.作者：李云峰，辛杰，李静，常宏宏，高文超太原理工大学生物医学工程学院山东第一医科大学附属肥城医院/肥城市人民医院山西天宏达安医药科技有限公司摘要：随着抗体修饰技术和选择性偶联技术的发展，抗体偶联药物（ADC）已成为癌症靶向治疗的重要药物之一。连接子是ADC的关键部件之一，连接细胞毒性药物和抗体。连接子与细胞毒性药物的连接方式主要通过腙键、二硫键、多肽和硫醚连接。通过引入反应性的半胱氨酸、改造二硫键、引入非天然氨基酸、修饰抗体C/N端、酶对抗体和抗体糖基对抗体进行改造，实现连接子与抗体的选择性连接。连接技术的发展已成为ADC更新换代和蓬勃发展的关键因素。文章信息源于公众号小白学药，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

抗体药物偶联物免疫疗法细胞疗法

2022-09-16

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抗体偶联药物中连接技术研究进展

点击上方的行舟Drug ▲ 添加关注抗体偶联药物中连接技术研究进展来源《中国新药与临床杂志》 2022年作者李云峰，辛杰，李静，常宏宏，高文超太原理工大学生物医学工程学院山东第一医科大学附属肥城医院/肥城市人民医院山西天宏达安医药科技有限公司摘要随着抗体修饰技术和选择性偶联技术的发展，抗体偶联药物(ADC）已成为癌症靶向治疗的重要药物之一。连接子是ADC 的关键部件之一，连接细胞毒性药物和抗体。连接子与细胞毒性药物的连接方式主要通过腙键、二硫键、多肽和硫醚连接。通过引入反应性的半胱氨酸、改造二硫键、引入非天然氨基酸、修饰抗体C/N 端、酶对抗体和抗体糖基对抗体进行改造，实现连接子与抗体的选择性连接。连接技术的发展已成为ADC 更新换代和蓬勃发展的关键因素。关键词抗肿瘤药；抗体偶联药物；免疫轭合物；位点特异性_正文_癌症是危害人类生命健康的头号杀手[1]。传统治疗包括手术、化疗和放疗等方式，但这些方法通常在杀死癌细胞的同时对正常细胞产生毒副作用。免疫疗法是一种重要的癌症治疗手段，通常利用人体自身的免疫机制来对抗癌细胞，由于其高靶向性和副作用小的独特优势，是早期病灶较小的癌症患者的优选治疗方案。但针对晚期实体瘤来说，免疫疗法效果有限，需要联合其他方法共同抗击癌细胞[2]。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）是一种化疗和免疫治疗相结合的药物新形式，比化疗更精准，比免疫治疗更高效。ADC 是将细胞毒性药物（payload）与抗体（antibody）通过连接子（linker）偶联形成药物，既有抗体的高靶向性，又有化学药物的强杀伤力。连接子是 ADC 的关键部件之一，是抗体与细胞毒性药物连接的桥梁，对ADC 的抗癌作用至关重要，见图1。笔者结合近10 年来在ADC 领域的最新研究进展，从ADC 的连接技术着手，对连接子与细胞毒性药物的偶联方式、连接子结构，以及连接子与抗体的定点偶联策略进行总结，并对ADC 中连接子给药物带来的影响进行了回顾。连接子与细胞毒性药物连接ADC 中连接子与药物连接的方式主要分为可裂解和不可裂解两种形式｡可裂解连接子主要为敏感性的化学键,可以根据身体内环境的特异性化学物种(如谷胱甘肽,酸碱性等)或酶浓度不同,促进连接子与药物裂解,主要通过腙键､二硫键､多肽的形式连接｡不可裂解连接子没有可触发裂解的内置化学键,需要在癌细胞中将抗体通过蛋白质水解机制变成氨基酸,进而释放带有连接子和氨基酸片段的细胞毒性药物,主要通过硫醚的形式连接[4]｡1. 腙键连接(酸裂解) 腙键对pH 值的变化比较敏感,可在酸性环境中裂解｡其特点是在血液环境中(pH 值≈7.3~7.5)稳定,而在癌细胞内溶酶体环境中(pH 值≈4.5~5.0)裂解率约为97%[5]｡这种在血液与胞内环境的pH 值差异,为抗体偶联药物选择性释放细胞毒性药物提供了机会｡HAMANN 等[6]开发出4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(4-(acetylphenoxy) butanoic acid,AcBut)连接子,一边利用羧基与抗体的赖氨酸残基形成酰胺键,另一边利用羰基与细胞毒性药物形成腙键,将抗体与小分子药物连接｡形成的ADC 在癌细胞的溶酶体中水解释放细胞毒性药物, 见图2｡使用此技术上市的 ADC 包括gemtuzumab ozogamicin 和inotuzumab ozogamicin｡对于inotuzumab ozogamicin 的体内分析表明,腙键以每日6%的速率在血液循环中发生水解[7]｡但是对于其他通过腙键连接的ADC 研究表明,尽管在pH 值为7.4 的缓冲液中具有很高的稳定性,但是在人体分离的血浆中仅需要两日就会有50%的细胞毒性药物被释放[7]｡与其他连接子相比,稳定性变化较大,极易造成脱靶效应,因此这种连接子技术的应用受到了很大的限制,主要在早期的ADC 开发中使用｡2 二硫键连接(还原环境裂解)二硫键可以被含巯基的小分子(谷胱甘肽GSH､半胱氨酸Cys)还原裂解｡二硫键的特点是在胞外体液环境中(巯基小分子浓度约为0.05 mmol·L-1)相对稳定,在胞内环境中(巯基小分子浓度约为0.5 ~10mmol·L-1､癌细胞中巯基小分子量约为血液环境中的104 倍)更容易裂解[8]｡这种小分子浓度差异,为ADC 的选择性释放创造了机会｡WIDDISON 等[9]开发出N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代) 丁酸酯(N-Succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butannate,SPDB)连接子,通过与抗体的赖氨酸残基形成酰胺键,再与细胞毒性药物经过硫醇-二硫化物交换形成二硫键,将抗体与细胞毒性药物进行连接｡形成的偶联体在溶酶体中降解后,进而在细胞质中通过还原切断二硫键,释放细胞毒性药物, 见图3A｡为了继续提高二硫键在循环系统中的稳定性,通过在二硫键的两端引入取代基,增加二硫键的空间位阻效应,从而降低二硫键在血液中提前断裂的风险｡常见的改造方式包括在靠近二硫键的一端引入一个甲基或两个甲基,见图3B｡在此基础上THORPE 等[10]开发出4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代) 甲苯(4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio) toluene,SMPT)连接子,见图3C,OJIMA 等[11]开发出N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate, SPP)连接子,见图3D,已成功应用到ADC 的设计中｡上市的ADC gemtuzumab ozogamicin 和inotuzumab ozogamicin 中,二硫键与腙键被同时应用到细胞毒性药物卡奇霉素(calicheamicins)的连接上｡但在目前正在开发的大多数药物中,美登素(maytansine)是二硫键主要连接的细胞毒性分子｡3 多肽连接(酶裂解)多肽链作为连接子可被溶酶体中的蛋白酶裂解｡蛋白酶在血液中活性低,不能将多肽连接子裂解,在血液循环中稳定｡而当抗体偶联药物进入癌细胞后,蛋白酶含量和活性增加可以使多肽链连接子裂解,释放细胞毒性药物, 从而实现细胞毒性药物在癌细胞中靶向释放的功能｡DUBOWCHIK 等[12]开发了马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(maleimido-caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl, mc-vc-PABC)连接子,一端与抗体的半胱氨酸残基通过迈克尔加成反应连接,另一端与细胞毒性药物通过酰胺键连接｡形成的ADC 经过初始的酶促裂解将多肽链部分水解掉后,再经组织蛋白酶B (cathepsin B)催化裂解释放细胞毒性药物, 见图4A｡已开发的马来酰亚胺-己酰基-缬氨酸-丙氨酸(maleimido -caproyl-valinealaine, mc-va) 连接子( 图4B)[13]､马来酰亚胺基丁酸-缬氨酸-瓜氨酸(maleimidobutanoic acid-valine-citrulline, mb-vc)连接子(图4C)[14]､甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(glycine-glycine-phenylalanine-glycine, GGFG)连接子(图4D)[15], 都具有相似的连接和裂解方式｡使用此技术上市的 ADC 包括brentuximab vedotin､polatuzumab vedotinpiiq､ enfortumab vedotin､trastuzumab deruxtecan｡有数据证明,通过肽链连接的ADC 比链状小分子连接的ADC 在人类循环系统中的稳定性要高一百倍[16]｡其中缬氨酸-瓜氨酸(vc)与其他二肽相比还具有更高的血浆稳定性和组织蛋白酶B 催化裂解的选择性,是上市药物中最主要的连接方式,荣昌生物制药公司使用mc-vc-PABC 连接子将靶向人类表皮生长因子受体2(HER2)的抗体与甲基澳瑞他汀E (monomethyl auristatin E, MMAE)结合,成功研发出维迪西妥单抗,用于治疗局部晚期或转移性胃癌,成为我国首个获批的抗体偶联药物｡4 硫醚连接(不可裂解) 不可裂解连接子连接的ADC 被吞噬进入细胞后,通过溶酶体途径,在癌细胞体内将ADC 的整个抗体域进行酶促降解,从而释放具有连接子和氨基酸残基(来源于抗体)的细胞毒性药物,对癌细胞进行杀伤,通常采用硫醚和酰胺结构进行连接｡YOSHITAKE 等[17]开发了N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧酸酯(N-Succinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)连接子,一端与抗体的赖氨酸残基通过酰胺键连接,另一端与细胞毒性药物通过迈克尔加成反应连接,形成ADC, 见图5｡不可裂解连接的方式与可裂解方式对细胞毒性药物的选择和ADC 的作用过程有较大差异(以上市药物trastuzumab emtansine 为例),优势在于:不可裂解连接子具有更好的稳定性;劣势在于:(1)能发挥作用的ADC 对细胞毒性药物要求严苛,需要筛选出能在氨基酸残基和连接子存在下发挥作用的药物;(2)胞内降解后,多数释放出的细胞毒性药物水溶性较好,但脂溶性较差,因此不利于从死亡的癌细胞跨膜进入下一个癌细胞中发挥“旁观者效应”[18]｡5 连接子的发展方向随着ADC 的发展,第三代ADC 在原有连接子基础上,还针对不同类型的细胞毒性药物对连接子结构进行了进一步改进｡例如上市药物中使用的连接子多为非水溶性的连接子,通过引入聚乙二醇(PEG)提高连接子水溶性是新一代连接子技术的重要研发方向[2]｡CARDILLO 等[19]将多肽连接的连接子中插入PEG 形成了cross-linker 2A (CL-2A)连接子,连接子与抗体的半胱氨酸残基通过迈克尔加成反应连接,另一端在N,N-二环己基碳酸二亚胺或4-二甲基胺吡啶(N,N-dicyclohexyl carbodiimide/ 4- (dimethylamino) pyridine, DCC/DMAP)的存在下介导碳酸盐键的形成连接细胞毒性药物,见图6A｡TIBERGHIEN 等[20]开发出马来酰亚胺基丙酰基-聚乙二醇-缬氨酸-丙氨酸-对氨基苄氧基羰基(maleimidopropionyl -polyethylene-glycol8-valinealaine- p-aminobenzyloxy carbonyl, mp-PEG8-va-PABC)连接子(图6B)用于抗体和细胞毒性药物之间的连接｡在已经上市的ADC 中,sacituzumab govitecan 就是使用CL-2A 连接子将抗体sacituzumab 和细胞毒性药物SN-38 连接起来,靶向TROP-2 抗体,用于治疗三阴性乳腺癌[21]｡内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明【来源：凡默谷公众号】。连接子与抗体偶联不同的细胞毒性药物可以选择不同的连接子来增加药物的稳定性和疗效。但只优化连接子与细胞毒性药物的偶联端，所形成的ADC 多为药物抗体比率（DAR）和连接子与抗体氨基酸连接位点是不确定的药物，导致ADC 的药物活性等参数也是不确定的。通过选择性偶联将抗体与连接子结合，合成均质的ADC，也是连接子研究的重要方向，主要包括化学方法和酶法对于抗体氨基酸和糖类部分的修饰。1 与天然氨基酸的随机结合赖氨酸残基具有很高的天然丰度（7.2%）和表面可及性，是ADC 研究初期经常选择的偶联位点。免疫球蛋白G1（IgG1）约包含85 个赖氨酸残基，其中可进行化学修饰的赖氨酸残基在40 个以上[22]。尽管可以通过药物的化学计量和反应条件来获得DAR 均匀的ADC，但是药物的结合位点通常很难控制。而且赖氨酸残基分布在抗体的整个表面，它们的修饰会阻碍抗原识别，从而限制ADC 的靶向性识别。尽管存在这些缺点，但由于修饰连接操作简单，第一代ADC 如sgemtuzumab ozogamicin，和第二代ADC 如trastuzumab emtansine 和inotuzumab ozogamicin 依然使用赖氨酸进行抗体的连接。目前已经开发了一系列赖氨酸残基选择性试剂，比较常用的如N-羟基琥珀酰亚胺酯（N-hydroxy succinimide, NHS）（图7A）[23]。半胱氨酸残基由于有较低的自然丰度（3.3%）和较高的亲核性，为抗体与连接子的高选择性结合提供了最佳位点。抗体可以通过四个链间二硫键还原，释放出8 个巯基反应位点[24]。含亲电试剂的连接子可与8 个位点选择性结合，获得均匀性较高和安全性较高的ADC（图7B），如trastuzumab deruxtecan 等第三代上市药物[25]均采用该种连接方式。但考虑到细胞毒性药物的疏水性问题，DAR 为8 并不适合大多数偶联药物[26]。为了获得平均DAR 为2~4 的ADC，可通过部分还原再氧化实现（图7B）[27]，但最终ADC 分子的异质化仍然不可避免。目前有多种针对半胱氨酸残基具有选择性的偶联试剂可供选择，其中N-取代马来酰亚胺最为常用（图7C）。2 引入反应性半胱氨酸实现选择性偶联为了获得DAR 为2~4 且具有相同结合位点的ADC，通过基因工程的手段，将反应性半胱氨酸引入到抗体的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）功能区，并进行药物的连接，称为THIOMABTM 技术。JUNUTULA 等[28]应用该技术，在抗体中引入与半胱氨酸或谷胱甘肽结合成为二硫键的反应性半胱氨酸，再通过全部还原和部分氧化的方法，将非抗体本身的半胱氨酸残基保留，最后与mc-Val-Cit-PABC-MMAE 连接（图8），可产生高度均一的ADC，理论DAR 为2，实际DAR 为1.6。自 THIOMABTM 技术问世以来，已经开发出了多种引入半胱氨酸改造的ADC。这些ADC 中有几个现已进入临床试验阶段。例如，Immunogen 公司的IMGN632 通过引入的反应性半胱氨酸残基将anti-CD123 抗体与新型的DNA 烷基化亚胺药物奥瑞他汀F（MonoMethylauristatin F，MMAF）选择性结合在一起[29]。目前，I/II 期临床试验正在进行中，用于治疗急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病。这种方法具有许多优点：（1）形成的ADC 具有确定的附着位点和药物化学计量；（2）所有天然抗体的二硫键将被保留，不会影响抗体的生物学性能；（3）与DAR 值不确定的、连接子与抗体连接位点不确定的ADC 相比，具有更好的安全性和清除速率。3 通过二硫键改造实现选择性偶联除了THIOMABTM 技术，还可以通过对抗体原有二硫键改造，来获得具有相同DAR 值和结合位点的ADC。IgG1 抗体中的四个链间二硫键经过还原可释放出4 个成对的半胱氨酸残基，进一步通过双反应性试剂将二硫键重构，同时安装适合连接子偶联的位点。BADESCU 等[30]将具有PEG24-Val-Cit-PABC-MMAE 的双砜试剂作为双反应性的半胱氨酸交联剂对抗体进行改造，获得DAR 为4 的ADC（图9A）；SCHUMACHER 等[31]将新一代的烯基双取代马来酰亚胺（next-generationmaleimides, NGMs）作为双反应性的半胱氨酸交联剂，并在亚胺端接入端炔，进一步与叠氮化物通过Click 反应获得DAR 为4 的ADC（图9B）。使用此种方法形成的ADC 在人白蛋白环境中5 d 内保持了很好的稳定性，且在小鼠体内实验中证明，其抗癌效果比上市的trastuzumab emtansine 更好[30]。运用二硫键改造技术设计的ADC 也已经进入了临床试验。例如，OBIPharma 公司开发的ADC OBI-999，选择性靶向在15 种上皮癌中表达的Globo H抗原，并通过改造后的二硫键将DNA 烷基化亚胺药物甲基澳瑞他汀E 与抗体结合，目前正在进行I/II 期临床试验，用于治疗胰腺癌、胃癌、结肠癌等实体瘤[32]。4 引入非天然氨基酸实现选择性偶联除了对抗体中已知氨基酸的修饰之外，还可以通过遗传密码子扩展技术（genetic code expansion, GCE）将非天然氨基酸(non-canonical amino acids, ncAA)整合到抗体的蛋白质序列中[33]，从而对抗体的结合位点进行特异性修饰，产生具有确定结合位点和均匀DAR 的抗体偶联药物。由于抗体中引入非天然氨基酸可能会带来免疫原性风险，因此非天然氨基酸的选择对于ADC 的构建非常关键。一般来讲，非天然氨基酸必须为天然氨基酸结构的类似物，同时也应具有易与连接子结合的活性位点，如羰基和叠氮等官能团，便于进一步的连接[34,35]。KULARATNE 等[36]将乙酰基苯丙氨酸（p-acetyl-phenylalanine, p-AcF）氨基酸部分对称地整合到抗体的两个重链中，另一端通过构建酮肟键与连接子偶联，以产生具有DAR 为2 的均质ADC（图10A）。ZIMMERMAN 等[37]将对叠氮甲基苯丙氨酸(p-azidomethylphenylalanine, p-AMF)整合到抗体的重链中，另一端通过Click 反应与二苯基环辛炔(DBCO)-PEG4-MMAF 偶联，获得DAR 为2 的ADC (图10B)。与类似的异质ADC 相比，通过引入非天然氨基酸技术连接生成的ADC 显示出更长的循环半衰期，更佳的功效和安全性[38]。通过引入非天然氨基酸的方式生成的ADC 已经有多个进入临床试验。如AmbrX 公司开发的ADC ARX788，通过非天然氨基酸将奥瑞他汀 F 与选择性靶向HER2 的抗体结合，目前正处于I 期临床试验中，用于治疗乳腺癌和胃癌[39,40]。5 通过对抗体C/N 端的修饰实现选择性偶联抗体C/N 端的修饰是指通过对抗体的C/N 端进行处理，产生和连接子特异性偶联的活性位点。抗体的N 端与抗原结合区接近，需要保证修饰后的抗体不影响与抗原结合的能力；抗体的C 端位于抗原结合区的远端，对抗体与抗原的特异性识别影响较小，具有更好的适用性[41]。抗体 N 端修饰是通过将N 端氨基酸的氨基转化为醛或酮官能团来合成ADC 的策略。ImmunoGen 公司使用高碘酸钠将N 端的丝氨酸选择性氧化，生成醛官能团，再与连接子通过肟键连接，获得DAR 为2 的ADC（图11A），该连接不会阻碍抗体与抗原的结合，保证了ADC 靶向识别目标抗原的能力[42]。抗体 C 端修饰是通过在C 端整合一段肽序列来合成ADC 的策略。ZHANG等[43]首先在抗体的C 末端引入7 个肽序列（LCYPWVY），之后用DBCO-PEGBiotin与肽序列中的半胱氨酸选择性结合，获得了产率约为90％的单个细胞毒性药物的ADC（图11B）。测试结果表明，抗体对抗原结合亲和力不受影响，并且产物在生理条件下可以保持超过4 d 的稳定性。另外由于构建连接子中的二苯并环辛基-四乙酰甘露糖胺（DBCO）及衍生试剂具有易得性,使该方法具有很好的通用性，可以快速有效地合成ADC。6 酶法修饰抗体的氨基酸单克隆抗体具有蛋白类大分子的复杂结构特征，在Fab 和可结晶段（fragment crystallizable，Fc）都存在糖链。尽管糖链仅占抗体的3%，但糖链结构却发挥着维持空间构象、稳定抗体结构的作用。抗体中的糖链均以“双天线”的结构存在，且几乎所有IgG 的Fc 段都至少含有两个天冬氨酸-297（N-297）糖链[44]。MINDT 等[45]在用荧光探针与抗体偶联的研究中发现，在N-糖链存在的情况下抗体与荧光团的结合率相较于无N-糖链明显降低。因此，连接子与抗体连接过程中首先需要去掉N297 位的糖链，进而暴露出可被连接子连接的谷氨酸-295（Q-295）位点。常用的酶切除糖链的方法包括肽糖苷酶F（peptide-N-glycosidase F，PNGase F）和肽糖苷酶A（peptide-NglycosidaseA，PNGase A）[46]。去除糖链的抗体可以通过谷氨酰胺转移酶（transglutaminase，TG）选择性的将谷氨酸的γ-酰胺基团与含有伯胺的化合物形成异肽链，用于抗体与连接子的选择性偶联[47]。LHOSPICE 等[48]改进传统切除糖链方法，采用N297Q 突变过程，在去除糖链的同时产生四个谷氨酸残基（Q295、Q297）。进一步使用TG酶催化，将一端含有伯氨基团，另一端含有叠氮基团的连接子与抗体结合，最后与DBCO-VC-Spacer-MMAE 通过点击化学反应构建均质的ADC（图12）。酶法催化效率非常高，构建ADC 的DAR 为4。使用这种方法合成的 ADC 与上市药物brentuximab vedotin 相比[32]：（1）体外试验中具有相同的EC50 水平；（2）小鼠实验中表现出更高的癌细胞吸收能力和更强的稳定性，最大耐受剂量是本妥昔单抗（brentuximab）的三倍。7 对抗体中糖基的修饰单克隆抗体中的糖基化虽对抗体的修饰起到阻碍作用，但是由于其高度的异质性，也可以作为连接子于抗体特异性结合的位点。因此可以通过对IgG 中天冬氨酸297 位点（N297）的糖基进行修饰[49]，从而获得与连接子具有反应性的基团。连接子与糖基位点偶联具有很大的优势：（1）在空间上与发生抗体-抗原识别的互补决定区域相距较远，对抗体与抗原的特异性结合的影响较小；（2）抗体的糖基化位点少，避免了抗体被大量修饰；（3）糖类物质在化学上与抗体的多肽骨架不同，可以进行位点的特异性结合[23]。O’SHANNESSY 等[50]开发了一种通过高碘酸钠（NaIO4）将单糖末端的顺式二醇氧化成醛的方法，促进了对抗体上糖基进行修饰的研究。ZHOU 等[51]在此基础上设计了一种方法，用半乳糖转移酶和唾液酸转移酶对抗体N297 位点上的自身糖基进行酶修饰，使得寡糖末端引入唾液酸基团，进一步使用高碘酸钠将唾液酸残基氧化产生醛基，最后通过肟键将连接子-药物与修饰后的糖基连接，构建DAR 为1.6 的ADC，表现出良好的体外和体内抗癌活性。GEEL 等[52]开发出GlycoConnect 技术，首先利用糖苷内切酶将抗体N297位点的寡糖链切割从而暴露出N-乙酰- 葡糖胺结构（N-acetylglucosamine,GlcNAC）。进一步通过糖基转移酶的催化将含有叠氮化物的GlcNAC 类似物N-乙酰-半乳糖胺（N-acetylgalactosamine, GalNAc）连接到GlcNAC 末端。最后将修饰的抗体与含有BCN 或者DBCO 的连接子-药物通过SPAAC 反应偶联构建DAR 为2 的ADC。GlycoConnect 技术对单克隆具有广泛的适用性，对于合成均质高效的ADC 具有很好的应用前景。小结从Paul Ehrlich 提出“魔法子弹”的概念开始，到如今多种化学生物学新技术的引入，ADC 经过120 年的发展已成为今天医药领域不可或缺的重要成员之一。连接子作为抗体偶联体药物中的重要桥梁，在药物更新换代过程中扮演了重要的角色：一方面，在药物端，连接子种类逐渐丰富，可以针对不同癌症的生理特点选择最适合的连接子，保持了ADC 在血液运输中的稳定性和胞内释放中的最佳活性；另一方面，在抗体端，在传统赖氨酸和半胱氨酸的基础上，继续开发出具有选择性结合的连接位点，为ADC 的均质化提供了重要保证。除了 ADC 本身结构的优化和改进，我国在紧跟世界先进连接技术的同时，还应将更多的精力投入到新的抗原靶点的选择和开发。虽然HER2、CD22、CD30 等靶点较为成熟，研发风险低，但竞争相对激烈，研发拥挤。布局ADC的企业可以另辟蹊径，在TF、c-Met、Claudin 等新兴的抗原靶点上有所作为。此外，ADC 的分子量较大，生产工艺复杂，进入人体后容易发生自身免疫排斥反应。针对这些弊端，目前一种新型的偶联药物进入人们的视线——多肽药物偶联物(peptide drug conjugate , PDC)，它通过连接技术将小分子寡肽和细胞毒性药物结合，降低了分子量，简化了合成和纯化过程，有效地降低了大规模生产的成本，是靶向治疗的又一个热门研究方向，目前已有melflufen、CT2103 等药物进入临床研究。在ADC 蓬勃发展的时代，应该多角度全方位地对ADC 的靶点，抗体，细胞毒性药物连接技术等持续进行优化和改进，才能最终实现“魔法子弹”终极目标。参考文献详见《中国新药与临床杂志》 2022年文章信息源于中国新药与临床杂志，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

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适应症	最高研发状态	国家/地区	公司	日期
Brenner瘤	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
卵巢子宫内膜样癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
输卵管透明细胞腺癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
粘液腺癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
卵巢透明细胞腺癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
卵巢混合上皮癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
卵巢黏液性腺癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
卵巢浆液性腺癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
原发性腹膜浆液性腺癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21
尿路上皮癌	临床3期	美国	National Cancer Institute	2005-03-21

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研究	分期	人群特征	评价人数	分组	结果	评价	发布日期


NCT00108745 (CTgov)	临床3期	粘液腺癌 \| 输卵管透明细胞腺癌 \| 卵巢混合上皮癌 ... 更多	1,157	Quality-of-Life Assessment+Paclitaxel Poliglumex (Arm I (Paclitaxel Poliglumex))	廠鹽鏇襯鑰獵蓋餘醖淵(鹹襯範鏇齋糧簾獵鬱遞) = 築製衊窪壓艱遞鹽觸壓壓糧築顧獵遞遞築積鹹 (積遞廠築觸餘淵範簾網, 餘鬱簾簾築獵艱獵構衊 ~ 觸憲鹹餘糧壓淵獵鏇衊) 更多	-	2021-04-01
				Quality-of-Life Assessment+paclitaxel (Arm II (Paclitaxel))	廠鹽鏇襯鑰獵蓋餘醖淵(鹹襯範鏇齋糧簾獵鬱遞) = 淵壓遞窪艱鏇襯夢繭鑰壓糧築顧獵遞遞築積鹹 (積遞廠築觸餘淵範簾網, 鹽餘顧繭構獵蓋齋繭窪 ~ 鬱鑰憲簾鏇糧願鹽蓋選) 更多
NCT00352690 (CTgov)	临床2期	非小细胞肺癌 III期	10	External beam radiation therapy+Carboplatin+Paclitaxel poliglumex (Cohort 1 (First 12 Eligible Patients))	鑰窪鹹築築廠積壓夢憲(淵餘壓網鹹廠齋廠積衊) = 夢窪網願願鹹淵鬱壓餘窪鹽鏇襯積鬱窪願範齋 (鏇獵艱製襯觸襯獵淵鹹, 構鏇鏇夢糧觸獵構餘壓 ~ 蓋廠餘齋遞襯衊艱衊窪) 更多	-	2015-05-27
				External beam radiation therapy+Carboplatin+Paclitaxel poliglumex (Cohort 2 (Remaining Patients))	淵膚築蓋築獵繭積廠窪(淵衊淵衊願築壓簾製膚) = 構網襯築繭製築艱糧憲範餘憲廠壓獵觸鑰積膚 (襯廠夢膚鏇艱簾繭鑰繭, 鹽構鬱願艱衊齋獵繭構 ~ 衊獵獵選膚觸餘鏇淵製) 更多
NCT01402063 (Pubmed \| Am J Clin Oncol)	临床2期	高级别胶质瘤	25	Paclitaxel poliglumex	衊製膚積壓製衊獵齋糧(遞艱窪窪齋廠築餘淵鹽) = Hematologic toxicity lasted up to 5 months suggesting a drug interaction between PPX and temozolomide 廠鏇製製顧壓憲遞夢齋 (襯鏇膚壓築網膚網夢築 ) 更多	-	2014-10-01
NCT00763750 (BrUOG-Brain-223, CTgov)	临床2期	脑癌	25	TMZ+PPX	鬱簾醖構襯鬱鬱齋顧餘(窪簾鹽鬱夢壓選膚製夢) = 襯夢襯壓網衊鏇壓壓衊鏇衊廠繭糧憲觸艱築鬱 (膚憲鬱鹹選衊夢壓遞蓋, 選蓋廠鑰製醖蓋夢築鏇 ~ 獵衊積襯繭簾壓襯醖製) 更多	-	2013-12-16
ASCO2012	临床1/2期	头颈部肿瘤	14	Radiation therapy	鹽夢構襯糧淵顧夢襯淵(蓋蓋觸觸獵壓網鏇餘淵) = 廠製積餘膚鏇範網衊獵憲廠夢築製鏇衊蓋顧願 (衊醖淵膚糧廠襯醖顧糧 )	-	2012-05-20
ASCO2011	临床2期	非小细胞肺癌	29	CT-2103	膚製顧膚鑰餘鏇廠鑰壓(餘製夢觸願願構膚鑰鹹) = 淵憲襯蓋夢壓夢蓋鹹繭製膚簾繭壓鹽製憲糧鏇 (蓋壓壓選鹽鬱鹽範簾餘 ) 更多	不佳	2011-05-20
ASCO2011	临床2期	高级别胶质瘤	25	Paclitaxel poliglumex (PPX)	觸淵夢遞艱艱鏇選衊範(積艱鏇膚襯鹹製範艱艱) = 獵壓淵構鹹糧衊壓鑰選糧膚築繭醖範膚蓋襯憲 (壓糧顧鏇願窪鬱鏇製簾 ) 更多	-	2011-05-20
				Temozolamide (TMZ)	觸淵夢遞艱艱鏇選衊範(積艱鏇膚襯鹹製範艱艱) = 廠鏇廠餘齋鹹觸醖鹽鹹糧膚築繭醖範膚蓋襯憲 (壓糧顧鏇願窪鬱鏇製簾 ) 更多
NCT00054197 (Pubmed \| J Thorac Oncol)	临床3期	晚期非小细胞肺癌	-	Paclitaxel Poliglumex (PPX)	襯艱鑰構蓋願壓淵醖膚(選製餘獵觸選膚築夢繭) = 鹹鏇壓鬱糧蓋鑰遞築鏇選夢襯齋觸艱齋鹹構夢 (鹹遞築遞繭構壓醖夢鹹 ) 更多	-	2008-07-01
				Gemcitabine or Vinorelbine	襯艱鑰構蓋願壓淵醖膚(選製餘獵觸選膚築夢繭) = 獵選觸願壓簾範膚蓋艱選夢襯齋觸艱齋鹹構夢 (鹹遞築遞繭構壓醖夢鹹 ) 更多
NCT00551733 (Pubmed \| J Thorac Oncol)	临床3期	晚期非小细胞肺癌一线	400	Paclitaxel poliglumex (PPX) + carboplatin	醖觸淵選構憲鏇願鬱範(築廠願製構製願醖構網) = 觸淵夢廠憲願艱艱鑰膚淵構壓醖蓋繭鹹蓋醖築 (範憲獵醖選鹽繭衊築鑰 ) 更多	-	2008-06-01
				Paclitaxel + carboplatin	醖觸淵選構憲鏇願鬱範(築廠願製構製願醖構網) = 齋網衊窪糧鏇廠艱醖醖淵構壓醖蓋繭鹹蓋醖築 (範憲獵醖選鹽繭衊築鑰 ) 更多
ASCO2008	临床2期	转移性乳腺癌	48	Paclitaxel polyglumex (PPX) + Capecitabine (C)	窪蓋遞齋蓋構糧艱憲淵(糧鹽艱壓繭夢願廠窪壓) = 蓋壓積鏇構製簾築襯簾襯夢顧鏇獵繭願淵選築 (壓網遞簾鏇廠觸選範範, 76–97) 更多	积极	2008-05-20