20-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine(Pfizer)

中文摘要目的   评价自制磷酸铝佐剂在不同储存条件下的稳定性，为该佐剂的储存和有效期设置提供数据支持。方法   选取连续3批产业化规模的自制磷酸铝佐剂，分别置于（5±3） ℃和（25±2） ℃储存。定期取样考察磷酸铝佐剂的主要评价指标（外观、pH值、铝含量、吸附率、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌性、细菌内毒素、砷盐、铁盐、硫酸盐、铵盐、重金属、磷铝摩尔比、零电荷点、粒径大小与分布）。结果   3批磷酸铝佐剂在2种温度下储存15个月后，外观、无菌性均合格，pH值在5.4~6.2之间，吸附率在93%~100%之间，铝含量在2.77~3.36 mg/mL之间，氯化钠含量在7.90~8.60 g/L之间，沉降上清分析在12~15 mL之间，细菌内毒素在0.5~3.0 内毒素单位/mg铝之间，磷铝摩尔比在0.82~1.13之间，累积分布达到10%、50%、90%时对应的粒径大小分别为1.75~2.53、2.87~3.98和4.94~6.90 μm，零电荷点在5.11~5.47之间，残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005%、重金属≤0.002%，佐剂各项主要评价指标均稳定且符合质量标准。结论   3批自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃和（25±2） ℃条件下保存15个月后稳定性良好，为磷酸铝佐剂储存条件及效期的制定提供了依据。正文佐剂是疫苗产品组成的一部分，佐剂的加入不仅有助于增强疫苗稳定性，还能增强其有效性。铝佐剂是人用疫苗中使用最广泛的无机佐剂，在减少抗原用量和接种次数、提高疫苗免疫持久性等方面显示出独特的优势。疫苗中常用的铝佐剂主要为氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。目前，磷酸铝佐剂已在如吸附白喉/破伤风类毒素疫苗、脑膜炎双球菌B疫苗Trumenba®、13价肺炎球菌多糖结合疫苗Prevnar 13®、20价肺炎球菌多糖结合疫苗Prevnar 20®等疫苗中应用。然而，铝佐剂的稳定性和有效性很大程度上会限制疫苗制剂的稳定性和免疫功效，需要对铝佐剂进行稳定性研究，科学制定其保存温度和效期。本研究依据《新原料药和制剂的稳定性试验》Q1A（R2）、《预防用含铝佐剂疫苗技术指导原则》等，对兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）生产的3批产业化规模磷酸铝佐剂（自制磷酸铝佐剂）进行稳定性研究，动态观察其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌性、细菌内毒素、砷盐、铁盐、重金属、硫酸盐、铵盐、磷铝摩尔比（P/Al）、零电荷点、粒径大小与分布等主要质控指标，评估其稳定性，为磷酸铝佐剂的储存条件及效期的制定提供依据。1材料与方法1.1主要试剂与仪器3批自制磷酸铝佐剂〔批号：试AP-202201001（简写为1）、试AP-202202002（2）、试AP-202203003（3），铝含量分别为2.99、2.85、3.23 mg/mL〕和佐剂-抗原作用（吸附率）测定用破伤风类毒素均由兰州公司菌苗四室提供。氯化钠、硝酸银、硫氰酸铵、硫酸铁铵、高锰酸钾、硝酸、乙二胺四乙酸二钠、三氧化二砷均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司。Mastersizer 3000粒度仪、Zetasizer Nano ZEN2600电位仪和MPT-2自动电位滴定仪均购自英国Malvern公司；sevenExcellence型pH计、S20型pH计和METTLER XS4002S电子天平均购自瑞士梅特勒-托利多公司；UV-2600型紫外-可见分光光度计购自日本岛津公司。1.2稳定性研究方案依据中国药典2020年版四部（药典四部）9402生物制品稳定性试验指导原则等要求，将3批自制磷酸铝佐剂每批分2组分别置于（5±3） ℃、（25±2） ℃储存，每间隔3个月取样检测，持续储存15个月。对不同温度、不同时间的样品进行主要评价指标检测及趋势分析。1.3主要评价指标测定参照药典四部通则3650氢氧化铝佐剂检定方法对自制磷酸铝佐剂进行下列质控项目检测。1.3.1 外观　目视检查，其外观应为白色或乳白色，半透明、黏稠乳状液，静置可形成分层。1.3.2 pH值　取混匀的自制磷酸铝佐剂10 mL，置烧杯中，室温放置，测定pH值。1.3.3 佐剂-抗原相互作用　佐剂-抗原的相互作用以佐剂对抗原的吸附率表达。（1）佐剂稀释：用生理盐水稀释自制磷酸铝佐剂至铝浓度1 mg/mL，即得供试品溶液。（2）佐剂吸附破伤风类毒素：取适量破伤风类毒素，加入0.85%氯化钠水溶液制成3 mL溶液；再加入供试品溶液约1 mL，使体系终体积为4 mL、铝终浓度0.25 mg/mL、蛋白终浓度100 μg/mL。室温吸附（2.5±0.1） h，期间每隔10 min用涡旋振荡仪振摇1次。吸附液置 2~8 ℃过夜。（3）吸附上清检测：将吸附液转移至离心管，10 000×g离心10 min，收集上清液，以Lowry法检测上清游离蛋白质含量，记录各管吸光度值并计算蛋白质含量，以各管上清液游离的蛋白质含量对应其蛋白质总量计算吸附率，计算公式如下：1.3.4 铝含量　用过量的乙二胺四乙酸二钠与供试品中的铝离子反应，再用锌滴定液滴定剩余的乙二胺四乙酸二钠。根据锌滴定液的消耗量，用下式计算供试品中的铝含量：式中V0、V1分别为空白试验及供试品消耗锌滴定液的体积，mL；c为锌滴定液的浓度，mol/L；V2 为供试品体积，mL；26.98为铝的相对原子质量。1.3.5 P/Al计算　依据药典四部通则3103磷测定法测定佐剂中磷含量，根据磷铝含量计算P/Al。1.3.6 氯化钠含量　量取供试品1.0 mL，加入0.1 mol/L硝酸银水溶液5 mL，混匀，加入8.0 mol/L硝酸10 mL，加热消化至溶液澄清。冷却至室温，加纯化水50 mL、8%硫酸铁铵指示液1 mL，用硫氰酸铵滴定液（0.05 mol/L）滴定至溶液呈淡棕红色，振摇后仍不褪色，即为终点。将滴定的结果用空白试验（可不消化）校正。计算公式：式中V0、VX分别为空白试验及供试品消耗硫氰酸铵滴定液的体积，mL；c为硫氰酸铵滴定液浓度，为0.05 mol/L乘以滴定液F值，mol/L；58.45为氯化钠的分子量。1.3.7 沉降上清分析　将供试品用生理盐水稀释至1 mg/mL，用涡旋振荡仪振摇至少30 s，取25 mL溶液静置24 h，记录沉淀体积，从总体积中减去即得上清液体积，应≤20 mL。1.3.8 无菌检查　采用药典四部通则1101无菌检查法中薄膜过滤法进行检查。1.3.9 细菌内毒素检查　依据药典四部通则1143细菌内毒素检查法中的浊度法，使用鲎试剂进行检查，单位为内毒素单位（endotoxin unit，EU）/mg铝。1.3.10 砷盐、铁盐、重金属、硫酸盐、铵盐检测　采用药典四部通则3650氢氧化铝佐剂检测方法依次检测。1.3.11 零电荷点　采用Zetasizer Nano ZEN2600电位仪和MPT-2自动电位滴定仪联合法检测自制磷酸铝佐剂的零电荷点：取一定体积的样品置于离心管中，离心、复悬，稀释至浓度为80~200 μg/mL，将样品注入样品池，用盐酸和氢氧化钠水溶液进行滴定测定零电荷点。1.3.12 粒径大小与分布　采用激光衍射法，使用Mastersizer 3000粒度仪进行测定。于样品分散器中加入超纯水，搅拌，扣除背景，加入自制磷酸铝佐剂使遮光度控制在7%~15%范围内，检测粒径大小与分布。2结果2.1（5±3） ℃储存的自制磷酸铝佐剂稳定性3批自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃放置15个月，其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌检查、细菌内毒素、P/Al、零电荷点及粒径大小与分布等参数在储存期内均无明显变化，均符合质量标准且趋势稳定，见图1、表1；残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、重金属≤0.002%、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005%，符合质量标准。2.2（25±2） ℃储存的自制磷酸铝佐剂稳定性3批自制磷酸铝佐剂在（25±2） ℃条件下放置15个月，其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌检查、细菌内毒素、P/Al、零电荷点及粒径大小与分布在储存期内均无明显变化，均符合质量标准且趋势稳定，见图2、表2；残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、重金属≤0.002%、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005% ，符合质量标准。3讨论铝佐剂被广泛应用于疫苗中以增强抗原的免疫原性，其质量和稳定性直接关系到疫苗的质量及稳定性。磷酸铝为羟基磷酸铝化合物，其表面的羟基在不同pH条件下会失去或获得质子，从而改变表面电荷。由于表面羟基被磷酸基取代的程度取决于反应物、沉淀条件及其零电荷点，而P/Al的变化会导致零电荷点值的变化，因此溶液环境的变化可导致铝佐剂表面磷酸盐的解吸或吸附，并伴随着表面电荷和抗原-佐剂相互作用的改变。市售磷酸铝佐剂的P/Al在0.7~1.2之间，零电荷点在4.5~6.5之间。在较高pH下，增加羟基浓度可以使羟基更有效地竞争铝周围的配位位点；在较低pH值下，沉淀更有利于Al-PO4键而不是Al-OH键的形成。由此产生的组分差异进一步导致聚集变化，从而影响佐剂颗粒大小。此外，佐剂表面不同基团的暴露也会导致蛋白质吸附的类型和能力差异。同样重要的是，抗原与佐剂的结合可以是几种相互作用机制的组合。抗原与铝佐剂的结合在很大程度上是通过非共价相互作用，包括静电、疏水、氢键和范德华相互作用，其中以静电吸附最为常见。一般来说，离子强度低、磷酸基团少、杂质少，有利于抗原吸附到铝佐剂表面，同时抗原与铝佐剂的稳态结合作用也受到抗原的等电点、铝佐剂的零电荷点、配方的pH值和离子强度的共同作用。测定佐剂-抗原的吸附率，有助于了解铝佐剂对抗原的吸附能力，以及在不同条件下（如不同pH值或离子强度）和长期储存下的吸附能力。佐剂-抗原吸附后不能进行高温灭菌或除菌过滤等常规除菌工艺，即磷酸铝佐剂自制备完成后应严格保持无菌状态。本研究参照国内外药典及相关文献，对自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃和（25±2） ℃放置15个月的主要评价指标进行了稳定性考察。研究结果表明，自制磷酸铝佐剂在2种温度下保存15个月的各项指标均未发生明显变化，且批间一致性良好，同时也证实了既定的无菌处理工艺及其保存容器可达到预期的无菌保障，且在储存期内容器和产品均无明显相关杂质析出，相容性较好。值得注意的是，3批佐剂pH值变化趋势稍有不同，第2和第3批佐剂的pH随着保存时间的延长都有缓慢下降的趋势，这与文献报道一致；第1批佐剂pH趋势略有不同，可能是由0点检测结果偏低造成：3个月时检测pH为6.2，往后节点pH变化也符合缓慢下降的趋势。检测系统误差也会影响pH测定，造成测定值在一定范围内波动。3批佐剂pH值在储存期内虽稍有变化，但均在标准范围内。本研究通过对佐剂稳定性的分析和综合评估，证明了自制磷酸铝佐剂在储存期内的安全性和有效性，为产品稳定性考察提供了有利数据支持。作者杜娇  洪文浩  许哲  姚钰  刘倩  冯潇  杨英英  周海飞  兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗四室， 甘肃省疫苗技术创新中心， 兰州 730046通信作者：周海飞，Email：haifeichow@163.com引用本文：杜娇, 洪文浩, 许哲, 等.自制磷酸铝佐剂稳定性研究 [J].国际生物制品学杂志, 2025, 48(1): 10-15.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240717-00050识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。