USP28

Some cancer drugs cause severe side effects because they are not working accurately enough. Biochemists have now discovered why. The small protein ubiquitin is involved in almost every cellular process in our body: it orchestrates the stability and function of the vast majority of proteins. When it binds to other proteins, they are often released for degradation. However, this labelling can also be reversed by special enzymes. The enzyme USP28, for example, is known to stabilise proteins that are important for cell growth and division -- these can also play an important role in cancer growth. In order to reduce the stability of these proteins and thus inhibit cancer growth, inhibitors of USP28 have been developed. These inhibitors, which form the basis of many anti-cancer drugs currently in development, disrupt cell division by blocking the USP28 enzyme. The problem is that they often act not only against USP28 but also against USP25, a closely related enzyme that separates ubiquitin from other proteins and is considered a key protein of the immune system. Further development of USP28 inhibitors into therapeutics that can be used in the clinic is therefore very difficult because of the foreseeable side effects -- ranging from gastrointestinal problems to nerve damage and even autoimmune diseases. Risk of Confusion Between the Two Enzymes Researchers at the University of Würzburg (JMU) have now discovered why inhibitors not only target USP28, but also USP25: "Apparently, there is a high risk of confusion between USP28 and USP25," explains Caroline Kisker, Chair of Structural Biology at the Rudolf Virchow Centre in Würzburg and Vice President for Research and Young Scientists. "We have been able to show that the two enzymes are very similar or even identical in many areas, including precisely where the inhibitors act." As part of her research, the biochemist's team used X-ray crystallography to analyse the structure of USP28 in combination with the three inhibitors "AZ1," "Vismodegib" and "FT206" -- and thus determine the spatial binding site. Further biochemical experiments on USP25 showed that the sites where the inhibitors bind to USP28 and USP25 are identical. "The inhibitors are therefore unable to distinguish where they bind," says Kisker. "This explains the non-specific effect." Discovery Paves the Way for the Development of Precise Inhibitors The new scientific findings provide an important basis for the search for more specific drugs with fewer side effects. Their development is the next major goal of the Würzburg researchers. "Our structural biology data allows us to modify existing inhibitors so that they only work against either USP25 or USP28," says Kisker. "We also want to look for inhibitors that bind to less similar enzyme sites. This will give these molecules greater targeting precision." The research was funded by the German Research Foundation (DFG). The Rudolf-Virchow-Centre in Würzburg The Rudolf Virchow Centre (RVZ) for Integrative and Translational Imaging is an interdisciplinary research centre that focuses on the visualisation of elementary life processes -- from the sub-nano to the macro scale. As a central institution of the University of Würzburg, the centre is currently home to 13 translational research groups and around 100 researchers investigating the molecular causes of health and disease.

对有丝分裂秒表复合物的鉴定具有潜在的临床应用价值。一些癌症会保持活跃的有丝分裂秒表复合物，这使它们对通过靶向细胞分裂在癌症治疗中发挥着重要作用的抗有丝分裂药物敏感。这些药物目前正在临床使用或开发中。 每天，我们的细胞都在努力地增殖。细胞分裂是一个精确的过程，但有时这一过程会受到破坏，从而导致癌症等疾病的发生。有丝分裂是细胞周期中最重要的阶段之一。在这一阶段，细胞的 DNA经复制后产生两组相等的染色体，并分裂成两个基因完全相同的子细胞。 在一项新的研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员通过测量有丝分裂的持续时间，发现了一种防止潜在危险细胞增殖的分子机制。他们指出这种机制——有丝分裂秒表复合物（Mitotic Stopwatch Complex）会随着细胞分裂的时间推移而变得更强，从而导致异常细胞被清除以保护有机体。相关研究结果发表在2024年3月29日的Science期刊上，论文标题为“Control of cell proliferation by memories of mitosis”。 有丝分裂秒表复合物 正常情况下，当细胞分裂时，它会复制染色体，而且每个新的子细胞都会得到一个完美的染色体拷贝。但是，有时一个细胞可能会得到过多的染色体，而另一个细胞可能得不到足够的染色体，这种现象被称为“染色体错误分离（chromosome missegregation）”。 有丝分裂通常需要 30 分钟左右才能完成，但当细胞出现缺陷时，它们需要更多的时间来组织染色体并将其分离到子细胞中。这种延迟导致了这些作者所说的有丝分裂秒表复合物，即当细胞经历不寻常的、长时间的有丝分裂时形成的复合物。 论文共同通讯作者、加州大学圣地亚哥分校的Franz Meitinger教授解释道，“这种复合物不会在正常的有丝分裂过程中形成，只有在有丝分裂时间较长时才会形成。细胞中的这种缺陷不能被细胞直接识别，但细胞能测量的是它们在有丝分裂中花费的时间，它们利用这一信息来了解有丝分裂进行得如何。我们想了解这种分子机制如何保护有机体免受癌症产生的影响。” 有丝分裂开始 30 分钟后，这种复合物开始形成，而且在细胞退出较长时间的有丝分裂后，这种复合物在新的子细胞中开始活跃。这种激活会触发其他因子，从而永久性地抑制或杀死这些子细胞。 图片来自Science, 2024, doi:10.1126/science.add9528 论文共同作者、加州大学圣地亚哥分校的Hazrat Belal博士说，“你有一个信号在积累，当有丝分裂的时间足够长时，它会立即诱导细胞停滞或细胞死亡，但如果有丝分裂的时间适度延长，这条通路就会被部分激活，因此细胞仍然可以继续分裂，但如果细胞的有丝分裂时间再次适度延长，它就会停滞。” 人们已知道有丝分裂延长和细胞停滞之间存在联系，但不知道细胞如何“感知”有丝分裂延长以导致细胞停滞。这项新的研究阐明了这是如何起作用的。 有丝分裂秒表复合物由三种蛋白组成：p53结合蛋白1（p53-binding protein 1, 53BP1）、USP28和p53蛋白本身。这些蛋白只有在有丝分裂时间异常延长（超过 30 分钟）时才会相互作用。在这种漫长的有丝分裂过程中，形成的这种复合物越来越多。形成的这种复合物越多，结果就越强---这可能是细胞停滞或细胞死亡，具体取决于细胞类型。 p53 蛋白被称为肿瘤抑制因子，它能阻止潜在受损细胞的生长并防止其增殖。这些作者发现，一种名为 PLK1的激酶负责触发这种复合物的形成。PLK1 在正常的有丝分裂过程中是活跃的，但由于不明原因，只有在有丝分裂过程延长时才会诱导这种复合物的形成。 当这种复合物形成时，它可以稳定和激活肿瘤抑制因子 p53，然后使得它作为转录因子发挥作用。这一发现让人们对这些蛋白在有丝分裂延长期间的作用及其在清除可能致癌的潜在危险细胞方面的作用有了新的认识。 Meitinger 教授说，“当产生的少量这种复合物不足以阻止这些细胞时，这种复合物甚至会在子代细胞中保持稳定并不断积累。子代细胞可以记住祖母细胞有丝分裂适度延长的状态。” 虽然我们体内的每个细胞都有可能发生有丝分裂延迟，但这种情况在正常细胞中并不常见。有丝分裂延迟更有可能发生在受损的细胞中，而有丝分裂秒表复合物则有可能作为一种监视机制清除这些细胞。在癌细胞中，有丝分裂的时间往往更长，而且有缺陷：在这些细胞中，这种途径往往不活跃，因为它发生了突变，有缺陷的有丝分裂推动了癌症的产生。 细胞的命运 为了监测这些细胞通路，这些作者使用了活细胞成像技术，即在显微镜下对细胞进行为期三天的观察。他们通过引入有丝分裂抑制剂，暂时延长了有丝分裂阶段。几小时后，细胞进入有丝分裂延长状态，从而实际上“停留”在这一阶段。然后，他们移除这种抑制剂，让这些细胞继续分裂。 在接下来的三天里，这些作者对这些细胞进行观察，以确定它们的命运---是继续分裂、停止分裂还是死亡。通过这种方法，他们展示了细胞如何检测到延长的有丝分裂并随后启动细胞停滞或死亡。 Belal博士指出，实验中最具挑战性的部分是跟踪这些细胞，因为它们移动频繁，有时会超出显微镜的视野。每次实验至少需要分析160个细胞，而且必须进行多次实验才能确定有丝分裂秒表复合物机制及其在正常细胞和癌细胞类型中的功能。每个细胞都必须单独分析。这一细致的过程使得他们能够充分了解细胞在不同情况下如何对延长的有丝分裂做出反应。 这些作者使用一种名为CRISPR-Cas9的技术来关闭某些基因，然后研究其对p53蛋白的影响。他们发现，某些基因突变会阻止p53正常发挥作用。为了更好地理解这一点，他们如今正在研究构成有丝分裂秒表复合物的蛋白，看看它们在不同条件下是如何相互作用的。 对有丝分裂秒表复合物的鉴定具有潜在的临床应用价值。一些癌症会保持活跃的有丝分裂秒表复合物，这使它们对通过靶向细胞分裂在癌症治疗中发挥着重要作用的抗有丝分裂药物敏感。这些药物目前正在临床使用或开发中。 Meitinger教授说，“如果我们能确定单个癌症中有丝分裂秒表复合物的活性，我们或许就能预测这些癌症对抗有丝分裂药物治疗的反应。”这些作者希望他们的发现最终能够有助于治疗某些癌症。（生物谷 Bioon.com） 参考资料： Franz Meitinger et al. Control of cell proliferation by memories of mitosis. Science, 2024, doi:10.1126/science.add9528. Memories of mitosis: Molecular mechanism that detects defects during cell division could aid cancer treatmenthttps://phys.org/news/2024-03-memories-mitosis-molecular-mechanism-defects.html

导读：非小细胞肺癌（NSCLC）是全球死亡的主要原因。11月17日，中南大学湘雅医院孙仑泉、翁良共同通讯在期刊《Cell Reports》上在线发表题为“E3 ligase Trim35 inhibits LSD1 demethylase activity through K63-linked ubiquitination and enhances anti-tumor immunity in NSCLC”的研究论文，研究揭示了Trim35作为一个E3连接酶参与了LSD1 K63泛素化的调控，导致了对LSD1去甲基化酶活性的抑制。Trim35可以作为一个生物标志物评估LSD1的活性，并预测免疫检查点抑制疗法（ICB therapy）的预后。通过使用LSD1抑制剂，可以显著改善低表达Trim35的非小细胞肺癌的低免疫原性状态，暗示了一种有前途的免疫治疗耐药肺癌的治疗策略。https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01489-4研究背景 01 非小细胞肺癌（NSCLC）是全球死亡的主要原因。由于免疫系统在肿瘤发生和进展中发挥着关键作用，因此免疫检查点PD-1的阻断已经成为革命性的非小细胞肺癌治疗方法，并且对患者显示出长期益处。然而，只有大约30%的非小细胞肺癌患者可以从PD-1的阻断中受益，大多数患者对这种治疗没有反应，原因包括PD-L1表达不足、肿瘤细胞免疫原性低、T细胞功能失调，或是缺乏T细胞浸润肿瘤微环境。因此，迫切需要揭示PD-1阻断耐药的机制，以提高抗PD-1疗法的疗效。LSD1在多种癌症中促进肿瘤的增殖和进展，包括肺癌。已经有几种LSD1抑制剂在临床试验中用于癌症治疗的评估。尽管这些抑制剂，比如TCP或ORY-1001，显示出了一些有希望的效果，但是化合物的不良反应和临床反应的无关紧要导致了试验的失败，这可能是由于缺乏排除活性不高的LSD1的患者的标准所致。因此，发现能够准确识别具有高LSD1活性的患者的生物标志物可能会克服这些问题，并扩大LSD1抑制剂在癌症治疗中的应用。蛋白质活性通常受到翻译后修饰（PTM）的调控，其中包括泛素化，该过程由泛素激活酶（E1）、泛素连接酶（E2）和泛素连接酶酶（E3）构成的酶级联催化。已经报道了几种LSD1去泛素化酶，比如USP7、USP28和OTUD7B，据称它们可以调节LSD1的稳定性。然而，目前尚不清楚是否存在其他类型的泛素化修饰可以调节LSD1的活性或功能，而非蛋白质稳定性。因此，发现一个针对LSD1的新型E3连接酶可能会导致LSD1活性生物标志物的发现。三部件结构域（Trim）家族蛋白大多具有E3泛素连接酶活性，执行着各种细胞功能，如细胞内信号传导、先天免疫、转录、自噬和致癌过程。然而，大多数Trim蛋白的功能尚不清楚。研究发现 02 在研究中，研究人员确定了一个E3连接酶，Trim35，作为LSD1高活性的有效生物标志物，用于预测LSD1靶向治疗以及免疫治疗的预后。在机制上，Trim35通过介导LSD1赖氨酸位点422的K63泛素化来抑制LSD1的去甲基化酶活性。抑制LSD1活性有利于ERGIC1转录，随之而来的是自噬抑制和IFNGR1稳定，从而激活IFN-γ信号传导，导致MHC I类表达增加和对非小细胞肺癌细胞的免疫监视增强。此外，联合使用LSD1抑制剂和抗PD-1疗法可以显著清除具有低Trim35的免疫原性较差的肺癌。这些发现强烈表明Trim35是预测非小细胞肺癌免疫治疗结果的有希望的生物标志物。Trim35通过上调肿瘤免疫原性和T细胞浸润来抑制非小细胞肺癌的进展 03 为了研究Trim家族蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的参与情况，研究人员检查了来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的NSCLC队列中Trim蛋白的变异频率：https://www.cancer.gov/，发现Trim35基因的变异频率最高（19%）。在这些具有基因变异的患者中，大多数病例显示出Trim35的缺失或低表达。相比之下，大多数其他Trim家族基因在肺癌中是被放大或过表达的。此外，低Trim35表达与不良预后相关。为了研究Trim35在NSCLC中的作用，研究人员最初检查了其亚细胞定位，考虑到先前的报告指出主要为核内表达。在癌组织中，与相配对的邻近正常肺组织相比，核内Trim35表达较低。低核内Trim35表达与较差的总体生存率相关，但与肿瘤分期或转移无关。在核内Trim35表达较低的肺癌组织中检测到较少的CD8+T细胞浸润。体外实验表明，Trim35功能的增益或丧失显著减少或促进了肺癌细胞的生长和克隆形成。这些结果表明，Trim35可能通过直接抑制肺癌细胞的生长并调节肿瘤免疫微环境，在NSCLC中发挥肿瘤抑制基因的作用。为了模拟在NSCLC中Trim35的临床缺失，并进一步研究Trim35对肿瘤进展的影响，研究人员利用CRISPR-Cas9在小鼠肺癌LLC细胞中破坏了Trim35，并将其植入免疫缺陷小鼠（BALB/c裸鼠）和免疫competent小鼠（C57BL/6）。研究人员观察到在Trim35敲除（KO）小鼠和C57BL/6小鼠中促进的肿瘤进展。在过表达Trim35的A549细胞注射的裸鼠中，肿瘤生长和Ki67表达显著减少。与裸鼠相比，Trim35 KO显著增加了C57BL/6小鼠的肿瘤大小，这表明Trim35不仅在肿瘤增殖中发挥作用，而且在抗肿瘤免疫中也起着作用。为了验证发现，研究人员通过流式细胞术分析检查肿瘤微环境，并发现在Trim35-KO肿瘤中，肿瘤细胞上MHC-I类（小鼠中的H-2Kb）的表达和CD8+T细胞的浸润显著减少。Trim35对体外肺癌细胞中MHC-I类分子（人类中的HLA-ABC）表达的影响进一步验证。在体外观察到了Trim35介导的LLC-OVA癌细胞对活化OT-I CD8+T细胞的敏感性。此外，在临床肺癌样本中发现了Trim35表达与MHC-I水平之间的正相关关系。这些结果揭示了Trim35通过直接抑制生长和免疫调节的方式作为肿瘤抑制因子，这与低Trim35表达的NSCLC的临床特征密切相关。研究结果 04 综上所述，研究揭示了Trim35作为一个E3连接酶参与了LSD1 K63泛素化的调控，导致了对LSD1去甲基化酶活性的抑制。Trim35可以作为一个生物标志物评估LSD1的活性，并预测免疫检查点抑制疗法（ICB therapy）的预后。通过使用LSD1抑制剂，可以显著改善低表达Trim35的非小细胞肺癌的低免疫原性状态，暗示了一种有前途的免疫治疗耐药肺癌的治疗策略。参考资料：https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01489-4识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。