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2023年，《Cell》杂志刊登了中国科学院动物研究所与北京基因组研究所科学家的一项重要研究。这项研究首次揭示了在细胞衰老过程中，由于表观遗传的失稳，内源性逆转录病毒（ERV）会被重新激活，并加剧衰老现象。研究详细阐述了衰老细胞中ERV的“程序性复活”，ERV的反转录产物激活了细胞固有的病毒防御机制，诱发炎症反应，同时触发了细胞的老化，还通过病毒颗粒传递衰老信号，影响到周围的年轻细胞。基于这些发现，科学家们提出了一种新的多维干预策略，通过阻断ERV的复活和传播来延缓衰老。这一研究不仅是病毒学领域的突破，也为表观遗传学的研究做出了重要贡献。 图 ERV如何被唤醒并导致衰老过程 来源：Liu X, Liu Z, Wu Z, et al. Resurrection of endogenous retroviruses during aging reinforces senescence[J]. Cell, 2023, 186(2): 287-304. e26. 内源性逆转录病毒形成的历史之谜 远古逆转录病毒在数百万年前入侵并整合进人类基因组的遗迹就是内源性逆转录病毒（ERV），堪称“古病毒化石”。逆转录病毒将其RNA基因组逆转录成双链DNA，并将这些新合成的DNA整合到宿主的基因组中。逆转录病毒的感染通常发生在宿主的体细胞中；但在某些情况下，逆转录病毒也可能感染宿主的种系细胞，这时，整合了两个长末端重复序列、的逆转录病毒DNA会作为宿主染色体的一部分，通过遗传传递给后代，从而形成了内源性逆转录病毒ERV。 图 逆转录病毒整合到生殖细胞的染色体中，形成内源性逆转录病毒  在漫长的历史中，经过突变和缺失等变异过程，这些被人类细胞俘获并转化为基因组中的“暗物质”，占据了大约8%的人类基因组序列，反映出逆转录病毒在人类生命的孕育和演化中的重要作用。新整合的ERV是宿主群体中的遗传新变异：大部分新的ERV插入都具有潜在的危害，通常会通过一种移除不利基因变异的自然选择过程——纯化选择被清除出宿主群体。而那些中性的逆转录病毒插入，其命运往往由随机遗传漂变所决定，可能积累破坏性的突变，最终导致它们的功能丧失或降解。如果ERV插入带来了有益的遗传变异，它们可能会通过正向选择被固定在宿主群体中，这个过程称为共同选择。 图 新的逆转录病毒插入的进化命运 来源：Zheng J, Wei Y, Han G Z. The diversity and evolution of retroviruses: perspectives from viral “fossils”[J]. Virologica sinica, 2022, 37(1): 11-18. 逆转录病毒的细胞入侵策略 逆转录病毒是如何从进入细胞到扎根细胞核的呢？2024年，《Annual Review of Virology》发表的一篇论文，以著名的逆转录病毒HIV-1为例对此进行了细致的介绍。 HIV-1 病毒有着独特的结构，它的中心是一个圆锥形的核心，包含两份RNA遗传物质，核心被双层脂质膜所包裹，膜上镶嵌着特殊的病毒蛋白gp120和gp41，外层还有MA病毒蛋白。当HIV-1靠近细胞时，它会先利用表面的gp120糖蛋白识别并粘附到细胞表面的CD4受体上，成功粘附后，gp120会改变形态，使gp41的一部分融合肽露出来，使病毒进一步与细胞表面的辅助受体CXCR4或CCR5结合。这种结合将触发一连串信号，使细胞内的肌动蛋白开始聚集，并在病毒入侵的地点形成密集的网络，有助于病毒与细胞膜的融合。 图 肌动蛋白细胞骨架对HIV-1 进入的作用 HIV-1在质膜融合后，病毒核心和MA蛋白被释放到细胞质中。进入细胞后，肌动蛋白网络会在病毒进入点附近解构，形成一个小孔，病毒核心便通过这个孔穿过细胞质。病毒核心在细胞质中解包，释放RNA基因组，由逆转录酶逆转录成双链DNA，进一步形成逆转录复合体（RTC）。RTC包含病毒DNA、逆转录酶和整合酶等关键蛋白。微管是细胞内的一种像道路一样的结构，由两种蛋白（α和β）组成，具有方向性，可以指导物质在细胞内运输。MA可以和细胞中的Kif4的蛋白质互动，帮助另一个蛋白质EB1定位到微管的正端，这是微管生长的部分。HIV-1可以模仿EB1的功能，吸引更多有助于微管稳定的蛋白如+TIP。病毒的另一个蛋白CA可以与微管上的蛋白（如MAP1和BicD2）结合，BicD2起到桥梁的作用，连接病毒核心和分子马达动力蛋白。通过BicD2的帮助，病毒核心可以利用动力蛋白在微管上进行逆行运输，从细胞边缘向细胞中心移动。病毒核心通过微管道路被运输到细胞核附近，利用细胞因子的帮助穿过核孔，最终进入细胞核内部。 图 HIV-1 沿微管定向逆行运输 HIV-1病毒把遗传物质送到细胞核是其复制过程中的一个关键步骤，但科学家们对于这一过程在非分裂细胞中是如何进行的有不同的看法。目前主要有三种模型来解释这一过程： 第一个模型认为，当HIV-1病毒通过细胞膜融合进入细胞后，它的外壳立即解体，病毒的遗传物质在细胞质中就已经开始转录成DNA。第二个模型则提出，病毒衣壳中的CA蛋白在细胞质中发生结构变化，导致衣壳部分破裂。但是，部分衣壳在到达核孔复合体（NPC）之前保持完整，并在那里完成拆卸。这个过程中，已经转录好的病毒DNA与助手蛋白一起通过核孔进入细胞核。最近的研究进展表明，病毒核心可以通过核孔复合体（NPC）进入细胞核，这在以前被认为是不可能的。第三个模型提出，完整的病毒核心带有未转录的病毒RNA，直接穿过核孔，进入细胞核后再完成逆转录和衣壳的脱落。逆转录病毒核心可能完整或几乎完整地进入细胞核，受到衣壳结构与核孔蛋白、其他核转运蛋白和核内蛋白的相互作用影响。液-液相分离现象在HIV-1早期感染过程中的核孔和细胞核内的功能也逐渐受到重视。 图 HIV-1 核进入细胞核的三种模型 来源：Osega C E, Bustos F J, Arriagada G. From Entry to the Nucleus: How Retroviruses Commute[J]. Annual Review of Virology, 2024, 11. 不同种类的逆转录病毒在早期感染阶段对细胞机制的依赖相似，但对细胞成分的具体利用方式有所不同。目前，对HIV-1以外的逆转录病毒如何调控微丝动力学，还需生物学家的进一步研究。研究者们还在探索病毒DNA如何在复杂环境中被运输到整合点，并在高密度的细胞环境中脱壳。深入地理解逆转录病毒感染细胞的策略、它们如何与细胞的伴侣蛋白结合，不仅能够提示新的抗逆转录病毒药物设计方法，还能促进对逆转录病毒感染的生物学机制的更好理解。 封面图来源：网络 版权声明/免责声明 本文为授权转载文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 为什么中国创新药企，缺少商业化能力？ 有救了！30分钟改善老花眼！箕星药业这次算是押中了 重要新政！生物制品分段生产试点工作启动 点击查看更多精彩！

中文摘要 蛋白质纳米颗粒作为抗原展示载体，与天然病原体大小相似，能够有效帮助抗原提高其稳定性和免疫原性。临床试验研究表明，蛋白质纳米颗粒可被应用于新型疫苗的开发。此文对蛋白质纳米颗粒疫苗的免疫学特性，以及蛋白质颗粒在疫苗研发中的应用进行综述，旨在为蛋白质纳米颗粒的进一步研究提供参考。 正文 接种疫苗是预防疾病感染最有效的方法之一，常见疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，但部分研发策略还存在问题，如重组亚单位疫苗虽然成分明确、安全性高，但往往因缺乏病原体相关分子模式而无法高效诱导APC成熟，需要佐剂提高免疫原性，激活机体适应性免疫应答。 随着纳米技术的发展，脂质体、微粒、无机和聚合物、蛋白质等均能够被制成纳米颗粒，高效递送药物或诊断试剂到靶点。纳米颗粒大小适宜、表面可修饰，可以增强疫苗抗原在机体内的渗透性和半衰期，提高递送率。目前基于纳米颗粒的靶向治疗与诊断被广泛应用，其中蛋白质纳米颗粒已能获取清晰的原子级晶体结构，且能够在结构和基因上被操纵。基于此，研究者提出了将亚单位疫苗的抗原分子结合在蛋白质纳米颗粒表面形成与病原体相似的多价分子模式，以实现对免疫系统的有效刺激，这成为新的疫苗研发策略。 1 蛋白质纳米颗粒疫苗的免疫学 1.1 免疫刺激 纳米颗粒疫苗能够增强淋巴运输、增加APC在淋巴结中的捕获以及通过多价受体交联增加抗原特异性B细胞的活化。蛋白质纳米颗粒疫苗中抗原能够自组装成寡聚的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP），具有良好的免疫原性，对于一些抗原无法自组装成纳米颗粒的亚单位疫苗，可通过将这些抗原附着到寡聚的蛋白纳米颗粒上来完成自组装。 纳米颗粒疫苗主要在次级淋巴器官中诱导适应性免疫应答，皮下或肌内注射后，通过淋巴引流或免疫细胞来介导疫苗抗原从注射部位到淋巴结（lymph node，LN）的运输。对于直接淋巴引流，疫苗颗粒的相对分子质量和尺寸至关重要。直径在10~200 nm范围内的纳米颗粒可通过淋巴管内皮细胞连接处直接扩散进入淋巴管向LN输送，最佳尺寸约为40 nm。小于10 nm的分子会扩散到血液中进行全身循环，较大的颗粒倾向于在注射部位附近积存，需要特化细胞如树突状细胞携带进入淋巴系统，大约24 h才能到达LN。因此，直径10~200 nm的蛋白质纳米颗粒能够快速进入淋巴结，刺激免疫系统。 1.2 免疫加强 在纳米颗粒表面密集展示抗原通常可以有效增加免疫原性，如肽抗原在体内因缺乏重复表位会被快速清除，导致体液应答较差，而在颗粒支架上多聚化时会产生强烈的抗原特异性抗体应答。蛋白质纳米颗粒还可以增加抗原的稳定性并保持所需的表位构象，如HIV包膜蛋白Env三聚体与自组装蛋白支架的融合已被成功应用于确保抗原折叠成正确的构象。纳米颗粒还可以作为多价抗原展示平台，以高度有序的方式在表面呈现抗原的多个拷贝，可以同时结合多个B细胞抗原受体，增加亲和力，从而诱导更强的B细胞活化。 预防性疫苗的有效性取决于能否产生持久的T细胞依赖的IgG抗体应答。APC对抗原的呈递取决于抗原相关的特异性，包括大小、形状、表面电荷、亲水性以及受体之间的相互作用。其中抗原的大小是影响APC有效吸收的重要因素，纳米颗粒具有带电荷、疏水或受体相互作用特性的大表面，这导致APC与抗原颗粒的相互作用比与可溶性蛋白质的相互作用更好。通过将抗原附着在纳米颗粒上，使疫苗增加到最佳尺寸范围，提高了APC的有效摄取，更多地呈递抗原以激活Th。 1.3 免疫靶向 蛋白质纳米颗粒还可以被应用于开发免疫逃逸病原体的疫苗，例如HIV、流感和疟疾等疫苗。部分病毒特异性抗体（一般多为非中和抗体）与病毒结合后，可通过其Fc段与某些表面表达FcR的细胞结合从而介导病毒进入这些细胞，从而增强了病毒感染性的过程，其中HIV和登革热病毒特异性抗体存在抗体依赖性增强作用。为了避免这一不良反应，研究者从抗原中分离出中和表位并将其构建于蛋白质纳米颗粒表面，可以增加抗原的呈递作用，从而产生强烈的中和性体液免疫应答。除了中和表位之外，在蛋白质纳米颗粒上引入T细胞表位还可激活细胞介导的免疫应答，通用CD4+ T细胞表位可以通过募集Th帮助建立针对抗原的体液应答，而CD8+ T细胞表位可以产生针对特定病原体的杀伤性T细胞。 2 蛋白质纳米颗粒疫苗的应用 蛋白质纳米颗粒在人体中有很好的安全性和有效性。病毒衣壳是目前研究最多的天然蛋白颗粒，例如HPV和HBV的VLP。研究表明，接种二价HPV疫苗1次即能提供有效、持久的免疫效果。目前已发现来自不同生物的天然蛋白质，例如铁蛋白、二氧四氢喋啶合酶（lumazine synthase，LS）等能够自组装成纳米颗粒。这些自组装的蛋白质纳米颗粒展示抗原分子的平台技术也逐渐成熟，在临床前研究中，蛋白质纳米颗粒可显著提高抗体对多种抗原，包括呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）融合前F蛋白、HIV-1的包膜蛋白、流感病毒血凝素（hemagglutinin， HA）和新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的刺突蛋白（spike protein，S）的中和效力或广度。目前展示病毒糖蛋白抗原的蛋白质纳米颗粒疫苗正在进行临床试验（NCT03186781、NCT04784767、NCT04645147）评估。此外，通过计算机设计的蛋白质纳米颗粒，具有强大的自组装优势和低免疫原性，也可以作为通用的多价抗原呈递平台。 2.1 VLP VLP是1种自组装系统，可在1种或多种病毒蛋白表达后自发形成病毒状颗粒，具有对称的二十面体或棒状结构，由于缺乏复制酶和编码病毒蛋白的核酸而无法复制。HPV疫苗如二价Cervarix、四价Gardasil-4和九价Gardasil-9，含有由主要衣壳蛋白L1自组装而成的L1-VLP，具有免疫原性并能够诱导高滴度的保护性中和抗体。中和抗体由VLP上的重复表位触发，这些表位可通过B细胞受体或Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）交联激活B细胞。此外，L1蛋白也富含Th表位。 从慢性HBV感染者的血浆中纯化获得的乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）， 可自组装成24~31 nm的纳米颗粒。重组乙型肝炎疫苗通过培养携带HBsAg基因的酵母细胞表达平台获得的HBsAg可自组装形成纳米颗粒。戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）也可以通过形成重组VLP提高免疫效果。由杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达HEV的衣壳蛋白，获得的HEV-VLP能够预防感染。此外研究者发现HE-VLP外表面的环结构域允许外源表位的插入，而不影响VLP的形成，被认为有可能作为抗原载体。 对下一代流感疫苗的需求一直是对新型VLP疫苗进行研究的最大驱动力之一。流感病毒的VLP是由基质蛋白M1支持的脂质双分子层上的HA和神经氨酸酶抗原自组装产生直径100~150 nm的非传染性颗粒，与天然的流感病毒类似。目前多项流感VLP疫苗的安全性与免疫原性临床研究（NCT01014806、NCT01072799、NCT00903552等）已完成。 2.2 铁蛋白 铁蛋白是1种铁储存蛋白，普遍存在于几乎所有的生物体，包括细菌、真菌、植物和动物。铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由4个螺旋束组成。它们自组装成1个八面体对称的球形结构蛋白质纳米笼，外径约为12 nm，内径约为8 nm，内部空腔提供了封闭环境隔绝铁和外部环境。铁蛋白自组装具有强大的热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒，能够在85 ℃以下保持稳定，并能在中性pH条件下耐受相当高水平的变性剂，非常适合携带和暴露免疫原。此外，由于铁蛋白由8个单位组成，每个单位均为三轴对称，因此它可以呈现三聚体抗原的支架。许多病毒的主要抗原以三聚体形式发挥作用，例如流感病毒的HA、SARS-CoV-2的S和呼吸道合胞病毒的F蛋白等。将这些抗原分子融合到铁蛋白上能够形成与天然结构相似的三聚体。Kanekiyo等将流感病毒HA与铁蛋白基因融合，获得了HA-铁蛋白纳米颗粒。在抗原性方面，使用这种流感纳米颗粒疫苗进行免疫接种引起的血凝抑制抗体滴度大约是灭活疫苗的11倍。此外，它引发了2个高度保守结构域的中和抗体应答，提高了流感病毒免疫的效力和广度。 铁蛋白纳米颗粒也被用于SARS-CoV-2疫苗的研究，研究者利用铁蛋白纳米颗粒展示多价SARS-CoV-2 S，与单独的S相比在免疫小鼠后会引发更强烈的中和抗体应答。研究者利用SpyTag/SpyCatcher系统将SARS-CoV-2的受体结合域（receptor binding domain，RBD）和七肽重复单位共价结合在铁蛋白纳米颗粒表面。与单体SARS-CoV-2疫苗相比，纳米颗粒疫苗能引起更强大的中和抗体和细胞免疫应答，能显著降低攻毒小鼠的病毒载量，在恒河猴中诱导了持续的中和抗体和细胞免疫应答。 研究团队采用SARS-CoV-2 S RBD与H7N9 HA的保守茎部区域HA2进行融合，并引入人铁蛋白，构建了可以同时抗SARS-CoV-2及流感病毒的疫苗。在小鼠体内验证该疫苗的免疫原性，发现其能够诱导针对多种SARS-CoV-2变异株的中和抗体。针对流感病毒的数据显示，该疫苗能诱导高水平的针对H7的抗体应答及较强的针对H3的抗体应答。在随后的攻毒实验中，发现疫苗对H7N9的致死性攻击有完全的保护，对H3N2的致病性攻击同样保护效果良好。 铁蛋白纳米颗粒引起免疫应答的潜力已被证明是针对多种病原体的，并且可以快速、低成本地生产。目前基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗已经进入了临床试验（NCT03186781、NCT04784767、NCT04645147等）。 2.3 LS LS存在于细菌、真菌和植物中，是参与核黄素生物合成的酶。LS因物种而异，由大小和亚基数不同的同源寡聚体组成，包括五聚体、十聚体和二十面体的六十聚体。所有LS单体的N端和C端都暴露在其表面并面向外，允许在2个不同的位置插入外源抗原序列，不会影响二十面体结构的形成。二十面体的LS也显示出强大的构象稳定性。以上特征使二十面体LS成为展示抗原的有吸引力的支架。Berguer等证实LS可在体外刺激小鼠的骨髓树突状细胞，上调共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ类抗原的水平，同时还证明LS能提高TLR4通路的mRNA、趋化因子和细胞因子的水平。 Jardine等采用嗜热菌Aquifex aeolicus的六十聚体LS作为抗原展示的纳米颗粒平台，构建了靶向HIV的gp120胞外结构域的免疫原eOD-GT6，能够强效刺激产生VRC01类中和抗体。相比之下，单体并不具有激活B细胞的活性，三聚体激活B细胞的效率和速度远不如形成六十聚体的纳米颗粒。Zhang等使用SpyTag/SpyCatcher系统将SARS-CoV-2的S三聚体在LS纳米颗粒上展示。他们对LS纳米颗粒进行了N-糖基化修饰，从而提高了蛋白质溶解度和表达。SARS-CoV-2 S的LS比单独的S能够引发更高的中和抗体应答，用0.08 µg的SARS-CoV-2 S-LS纳米颗粒进行小鼠疫苗接种可诱导与2.0 µg单独的S相似的中和抗体水平。 2.4 I53-50蛋白 研究者们基于天然蛋白质纳米颗粒的自组装能力，设计出许多具有自组装功能的蛋白质复合物。Bale等精确设计的自组装蛋白纳米颗粒I53-50由2种寡聚蛋白组成，包括三聚体I53-50 A和五聚体I53-50 B。分别表达和纯化这2个组分，并将其混合后可高效地组装成高度有序、均匀的二十面体颗粒，直径在24~40 nm。组装发生速度与病毒衣壳的组装速度相近，并且能够通过电荷互补性控制分子货物的包装。I53-50A能够保持抗原分子天然稳定的构象，这一特点使它在HIV、RSV、SARS-CoV-2的疫苗研究中得到了广泛的应用。 研究者利用I53-50成功展示了20个不同毒株稳定的SOSIP三聚体，SOSIP位点是通过引入连接gp120和gp41亚基的人工二硫键（SOS），以及gp41胞外域（IP）的异亮氨酸-脯氨酸突变（I559P）形成。免疫研究表明，与传统的单组分纳米颗粒系统相比，该三聚体可以提高抗体应答的质量，并且在具有顶点-近端中和表位的SOSIP三聚体时最有效。此外有研究在I53-50纳米颗粒外部呈现了RSV-F糖蛋白三聚体重复结构的免疫原DS-Cav1（融合前稳定的F抗原），在小鼠和非人灵长类动物实验中，20个DS-Cav1三聚体的全价纳米颗粒免疫原诱导的中和抗体应答是三聚体DS-Cav1的10倍。 Walls等在I53-50纳米颗粒中展示了60个SARS-CoV-2 S的RBD，在低剂量的情况下诱导的中和抗体滴度约是预融合稳定S的10倍。SARS-CoV-2 RBD纳米颗粒诱导的抗体靶向多个不同的表位，这表明它们可能不容易逃避突变，并表现出比人恢复期血清更低的结合中和率，这可能会降低发生疫苗相关的呼吸道疾病的风险。目前研究者已启动了GMP生产工作，以推进SARS-CoV-2-RBD纳米颗粒疫苗进入临床。这些结果推动了I53-50纳米颗粒作为疫苗载体的持续开发。 3 蛋白质纳米颗粒疫苗的构建策略 蛋白质纳米颗粒可以通过其组成蛋白的异体以重组形式获得，这种能力有助于通过合理的设计，赋予蛋白质纳米颗粒有用的、非天然的功能。基于分子组装机制允许纳米颗粒蛋白和抗原分别在各自最佳的表达系统中产生，以保持其天然的构象。为了有效地呈递和与细胞受体的相互作用，抗原保持其结构稳定性和构象是至关重要的。同时抗原可能会干扰纳米颗粒亚基间相互作用，阻碍其组装成纳米颗粒。目前有3种方法可以用来整合病毒抗原与纳米颗粒蛋白：基因融合、化学偶联以及SpyTag/SpyCatcher系统。 基因融合可以使抗原与纳米颗粒蛋白整合，表达后纳米颗粒蛋白的自组装导致抗原多价展示。但基因融合可能造成纳米颗粒蛋白亚基和/或抗原的不当折叠，导致支架组装抑制或抗原活性丧失。需要合适的设计以维持抗原与纳米颗粒的构象稳定，例如在抗原与纳米颗粒分子之间插入柔性的Linker，以保证2个组分的正确折叠。 SpyCatcher/SpyTag系统是一种快速稳定的不可逆肽-蛋白质连接方法，由化脓性链球菌纤连蛋白结合蛋白的胶原蛋白黏附素结构域改造而来，含有13个氨基酸的SpyTag和含有138个氨基酸的SpyCatcher。SpyTag中的天冬氨酸能和SpyCatcher上的赖氨酸在相邻的谷氨酸催化下自发反应生成异肽共价键。将SpyTag和SpyCatcher分别偶联纳米颗粒蛋白和抗原分子，表达纯化后，在体外混合得到展示多价抗原的纳米颗粒。 化学偶联使用交联剂与蛋白质氨基酸残基的侧链相互作用，实现抗原分子与纳米颗粒蛋白亚基的连接。最常见的反应是通过交联剂的 N-羟基琥珀酰亚胺臂对蛋白质纳米颗粒上的赖氨酸或N末端的氨基进行酰化，然后通过交联剂的马来酰亚胺臂烷基化抗原上的半胱氨酸。由于半胱氨酸在蛋白质表面很少见，因此通常可以通过点诱变引入单个暴露的半胱氨酸。化学偶联的VLP包括噬菌体Qβ和烟草花叶病毒，已进入多项临床试验，包括用于2型糖尿病患者的IL-1β疫苗和用于戒烟的尼古丁疫苗。蛋白质纳米颗粒表面存在多个赖氨酸，导致偶联产物的异质性。同时引入反应性半胱氨酸可能干扰抗原中预先存在的二硫键的形成。 4 总结与展望 在过去10年中，蛋白质纳米颗粒作为抗原展示的载体被广泛应用于疫苗的研发，特别是对SARS-CoV-2疫苗的研究，引起了研究者对蛋白质纳米颗粒平台的极大兴趣。蛋白质纳米颗粒作为抗原的展示平台在疫苗研发中拥有巨大的潜力，它们可应用于多种病原体，能够显著提高抗原的免疫原性和稳定性，引发持久的保护作用。同时拥有重组蛋白的优势，能够快速、低成本生产。 使用蛋白质纳米颗粒作为抗原的载体，也存在潜在的针对载体的抗体应答风险，同时引入的SpyCatcher/SpyTag蛋白也是外源性蛋白，在体内可能产生免疫原性。已知的自组装蛋白质纳米颗粒的数量是有限的，可通过计算设计具有原子级精度和可控组装的蛋白质纳米颗粒。此外，蛋白质纳米颗粒疫苗的临床研究数据不足，限制了其在人体的应用。总之，开发基于蛋白质纳米颗粒的疫苗具有广阔的前景，但也必将面临相关的挑战，需要更多的临床数据进一步证明蛋白质纳米颗粒在新型疫苗开发中的实用意义。 作者 张欣明综述  李媛媛审校 国药中生生物技术研究院有限公司疫苗研发课题组(一)， 北京  101111 通信作者：李媛媛， Email：lily13102@163.com 引用本文：张欣明, 李媛媛. 蛋白质纳米颗粒在疫苗研发中的应用 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 238-244.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230705-00058 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：慢病毒载体在基因修饰细胞疗法的兴起中发挥了关键作用，特别是T细胞疗法。Tisagenlecleucel（Kymriah）、Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）以及最近上市的Bexucabtagene autoleucel（Tecartus）是现在商业化分发的T细胞疗法的例子，它们在成功获得EMA和FDA批准用于治疗血液癌症后，已经上市。这三种疗法都依赖于逆转录病毒载体将治疗性嵌合抗原受体（CAR）转导到T淋巴细胞中。尽管这些创新代表了充满希望的新治疗途径，但在使它们成为医疗护理中随时可用的工具方面仍存在重大障碍。本文回顾了慢病毒（LV）载体和T细胞治疗的生物学原理以及生物加工。还讨论了临床和工程的成功、不足和未来的机会。开发符合良好生产规范（GMP）的仪器、技术和协议将在LV工程化T细胞疗法的发展中发挥重要作用。 1.引言 病毒是由蛋白质外壳保护的核酸组成的传染性生物。这些微生物不能自我复制，而是依赖于它们感染的细胞，通过劫持宿主的复制机制来产生更多自己的副本。病毒通常与疾病相关，但遗传工程师重新利用了它们的生物学特性，利用它们自然的能力来修改或补充宿主细胞的遗传密码，生产出一类称为病毒载体的新的基因传递工具。伽马逆转录病毒（GRV）和慢病毒（LV）载体来源于逆转录病毒科的包膜RNA病毒，由于它们能够将遗传物质整合到宿主细胞基因组中并稳定表达外源基因，因此它们在研究和临床中得到了广泛应用，特别适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是迄今为止最成功的免疫疗法类型，也是唯一上市的基于T细胞的疗法。为了生产CAR T细胞，T淋巴细胞被遗传修饰以表达CAR受体，赋予它们识别和摧毁癌细胞的能力。CAR T细胞疗法在治疗血液癌症方面显示出了有希望的结果，特别是CD19阳性B细胞恶性肿瘤，三种产品Tisagenlecleucel（Kymriah）、Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和最近上市的Bexucabtagene Autoleucel（Tecartus）获得了市场授权。这些疗法的载体和细胞元素的生物加工很少同时考虑，也不一定由同一制造商生产。生物技术和制药行业越来越多地参与T细胞工程疗法和赞助临床测试，证明了这一治疗领域的快速发展。在这篇综述中，我们将介绍用于基因修饰T细胞疗法的LV载体的基本生物学原理和生物加工，以及最近的临床和工程进展。 2.慢病毒载体 2.1.生物学原理 逆转录病毒载体的两个主要类别是GRV和LV载体。两者之间的主要区别在于GRV载体只能感染分裂的细胞，而LV载体也可以感染静止的细胞。慢病毒载体已经在多种临床前应用中用于治疗遗传性疾病，如B型血友病和黄斑变性，通过体内传递。慢病毒载体也用于体外转导细胞以用于治疗应用，最先进的临床应用是CAR T细胞疗法。本综述将重点讨论LV载体在T细胞疗法开发和制造中的使用和应用。慢病毒载体来源于逆转录病毒科的病毒，最常见的是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），并已用于研究和治疗应用。还开发了使用不同来源病毒的变体LV，如猴免疫缺陷病毒（SIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）或马传染性贫血病毒（EIAV）。LV是通过依赖逆转录病毒将其遗传物质整合到宿主细胞基因组中的自然能力，有效修饰真核细胞的手段。LV可以被修改以携带高达10 kb的基因，并稳定转导感兴趣的基因，通常被称为“表达盒”。LV基因组编码三个结构基因，在野生型病毒和工程载体中发挥相同功能。这三个基因是群特异性抗原（gag）、聚合酶（pol）和包膜（env）。gag基因编码病毒的结构蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白。这些蛋白是蛋白质骨架的一部分，作为病毒RNA基因组的保护层。pol序列编码病毒复制周期所必需的酶功能。这包括蛋白酶，它将HIV未成熟蛋白切割成成熟的功能性蛋白；逆转录酶（RT），将病毒基因组单链RNA（ssRNA）逆转录成双链DNA（dsDNA）；整合酶，它切割宿主基因组DNA以整合病毒dsDNA。env序列编码包膜蛋白，负责HIV细胞进入和通过与目标受体的相互作用来确定嗜性。包膜蛋白复合体是由env编码的两种蛋白gp120和gp41形成的异二聚体。Gp120和gp41通过从包膜膜突出的域与它们的靶标受体CD4、CCR5和CXCR4相互作用。此外，HIV基因组编码调节元件Tat和Rev和辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu。虽然调节元件对HIV复制是必需的，但辅助蛋白增强病毒复制，并与体内的致病性相关。最后，HIV基因组编码参与如核输出、包装和基因表达等功能的基本序列。Rev-Response Element（RRE）与Rev相互作用，允许在病毒复制期间未剪接和单剪接HIV RNA的核输出。HIV DNA基因组由两个在病毒RNA逆转录过程中产生的长末端重复（LTR）序列所包围，对病毒基因组整合到宿主细胞DNA和病毒基因组表达至关重要。LV是通过将逆转录病毒基因组的组件组合成重组质粒DNA（pDNA）而开发的。然后可以将pDNA转染到生产细胞系中。为了增加可以包装到载体中的遗传有效载荷，抑制复制，并限制致病性，同时保留功能，对LV基因组进行了修改。第一代LV与野生型病毒基因组最为相似。为了限制创建复制能力慢病毒（RCLs）的风险，病毒基因被装载到三个单独的质粒上。该系统由包含结构gag基因和调节蛋白的包装质粒组成——包含gp160或其他替代病毒包膜的糖蛋白的包膜质粒，以修改嗜性（例如，VSV-G）——以及包含两个HIV LTRs的转移质粒。包装和env质粒不包含LTR序列和ψ包装序列，而是被巨细胞病毒（CMV）启动子所取代，以进一步防止RCLs的形成。第二代LV生产系统从包装质粒中去除了辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu，因为这些与疾病进展、致病性和通过人类社区的传播相关，但对病毒功能如逆转录、整合或成熟不是必需的。第三代也是最新的LV生产系统修改了转移质粒的5' HIV LTR序列，并用强大的病毒启动子（如CMV或Rous肉瘤病毒（RSV）启动子）替换，允许从系统中去除tat，并进一步防止RCLs的形成。最后，Rev元素从包装质粒中移除，并装载到一个新的调节质粒上，形成了一个四质粒系统，增加了对RCL形成的安全性。所有三代LV载体及其相应的质粒系统已在图1中总结。 图1. 三代LV质粒系统。每一代LV载体都展示了其生产所需的质粒构建以及每个质粒所携带的基因。 2.2.LV生物加工 LV载体生物加工可以分为两个主要阶段，即上游加工（USP）和下游加工（DSP）。病毒载体的USP指的是病毒颗粒产生的步骤。这是通过将DNA转移到包装细胞中实现的，这些细胞被用作载体工厂。在工艺开发阶段，这通常是在2D细胞培养中完成的，并扩大到生物反应器生产，用于临床和商业生产。所使用的细胞是永生化细胞系，最受欢迎的是人胚肾细胞系HEK293T。HEK293T是一种贴壁细胞系，这在扩大规模时涉及挑战，因为大多数大规模生物反应器都适用于悬浮细胞培养。一些替代方案，如固定床生物反应器，已被提出作为有效扩大规模的解决方案。或者，为了解决这个问题，也尝试开发HEK293T细胞的悬浮变体。病毒载体生物加工从扩增生产细胞系开始，例如HEK293T细胞。然后，细胞被质粒DNA（pDNA）转染以转移LV颗粒生产所需的基因。随着它们的成熟，LV载体从生产细胞膜上出芽并释放到细胞培养基中。因此，与腺相关病毒（AAV）载体等其他非包膜载体不同，不需要细胞裂解步骤来释放颗粒。生产出的载体的DSP在收获生产细胞培养上清后开始。这种产品高度异质，包含大量的工艺和产品相关杂质。澄清步骤是为了去除聚集体和细胞碎片等大杂质，可以通过过滤或离心实现。为了在后期去除污染的核酸，这一步可能包括核酸酶消化。捕获步骤旨在保留和浓缩LV颗粒，并进一步去除工艺和产品相关杂质。可能添加中间纯化步骤以交换LV缓冲液、浓缩产品或去除特定杂质。然后是抛光步骤，以去除剩余的杂质，这些杂质通常由于与LV载体的物理性质相似而最难从最终产品中分离。捕获和抛光步骤可以通过多种下游加工技术的组合来实现，可能包括超离心、超滤/透析（UF/DF）、切向流过滤（TFF）、液相色谱或无菌过滤。最后一步或填充完成步骤包括LV载体的最终配方，可能包括缓冲液交换、无菌过滤、冷冻保存或添加辅料。大规模LV生物加工的一个例子在图2中展示。 图2. 用于GMP级LV载体生产的端到端上游和下游生物加工示例。这个图描述了Oxford Biomedica（英国牛津）为其GMP级慢病毒载体生产而申请专利的生物加工过程，该过程使用了他们悬浮适应的、无血清的HEK293T生产细胞系。这个过程包括一个依赖于丁酸钠的可诱导质粒系统。每批产品都单独冷冻保存和储存，直到生产出足够的材料，然后合并、过滤和浓缩以进行最终配方。 3.基因修饰T细胞疗法  3.1.生物学原理  T淋巴细胞在免疫中的一个作用是检测和摧毁被有害病原体感染的细胞。在感染期间，T细胞可以在呈递特定传染病原的免疫原部分，称为抗原时，检测到外来病原体。这种激活是通过T细胞受体（TCR）介导的，由CD3受体和CD4或CD8共受体组成。CD4共受体由辅助T细胞在与抗原呈递细胞相互作用时使用，以激活它们的细胞因子释放功能，这促进了其他免疫细胞的招募和激活，而CD8共受体由细胞毒性T细胞用来激活它们的细胞杀伤功能。其他共受体，包括OX40、CD28和4-1BB，增强了细胞功能，如增殖、细胞因子产生和细胞存活。一旦激活，T细胞将开始快速分裂，产生促炎因子并激活其细胞毒性功能以摧毁感染细胞。当感染解决后，由克隆扩展产生的激活T细胞群将变得筋疲力尽、衰老，并最终经历凋亡。这个过程只留下一小部分持久的记忆细胞，能够检测到相同的抗原并经历快速的克隆扩展，随后分化以产生强大和特定的适应性免疫反应。 在胸腺中的成熟过程中，识别自身肽段的T细胞被移除，以防止自身免疫反应。癌症细胞中存在的遗传和表观遗传修饰导致细胞功能如代谢、增殖、DNA修复、凋亡、运动和附着的失调。免疫系统有能力检测到这些因素中的一些，并利用其杀伤功能来根除癌细胞。肿瘤微环境（TME）的修饰也可以是免疫系统的潜在靶标，因为TME的特征与健康周围组织明显不同。被吸引到TME并渗入肿瘤的淋巴细胞被称为肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。这些免疫细胞的存在与癌症患者的更好预后和缓解机会相关，它们已在临床上用于自体细胞治疗。然而，癌细胞源自受损或突变的健康细胞，因此对免疫系统来说可能很难检测。 嵌合抗原受体或CAR是一种能够结合目标抗原的工程TCR。CAR可以被引入T淋巴细胞中，以产生具有检测特定抗原能力的CAR T细胞。CAR由人类IgG抗体的单链可变片段（scFv）组成。已经开发了三代CAR：第一代是与CD3信号结合的scFv片段，以促进CAR T细胞的细胞毒性活性。第二代还包含一个CD28信号，以促进目标结合后的细胞增殖和细胞因子产生。第三代CAR增加了4-1BB和OX40区域，以促进细胞存活并延长CAR T细胞体内的持久性。最近开发了第四代，并包含特定的细胞因子信号，使CAR T细胞对TME的免疫抑制效应产生抗性，并进一步提高它们体内的寿命。 3.2.T细胞疗法生物加工 两种主要的方法已经从T细胞过继疗法中出现，依赖于两种不同的来源材料。异体方法依赖于来自“通用”来源的细胞，采取一种一刀切的策略。自体方法依赖于直接从患者体内获取的细胞，用于个性化医疗类型的治疗。所有商业上可用的T细胞过继疗法都依赖于自体原则，因为异体方法由于HLA分型和干细胞技术的早期发展而被证明难以开发。 对于大多数商业上可用或在临床开发中的CAR T细胞疗法来说，细胞是通过白细胞分离术或白细胞分离术从患者的外周血单个核细胞(PBMCs)中分离出来的。这种材料包含大量免疫细胞，包括B细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞。第一个制造步骤是从PBMCs中分离出T细胞亚群，这可以通过磁性珠选择或选择性扩增来完成。磁性选择是指将磁性珠与抗体结合，这些抗体与目标T细胞群体结合，当通过磁性柱时可以分离出来。对于CAR T细胞的开发，可以使用抗CD3或抗CD4和抗CD8抗体的组合来选择T淋巴细胞。选择后，细胞通常在培养基中休息数小时。然后可以使用含有CAR盒的病毒载体转导细胞。这一步允许将CAR基因引入细胞，以产生完全功能的CAR T细胞。病毒转导的替代方法是转染。T细胞可以通过化学转染，使用聚乙烯亚胺(PEI)等转染化学试剂，或通过电穿孔，使用电流在细胞膜上形成孔隙，使pDNA进入细胞来进行转染。这些方法需要大量的pDNA，因为它们是在扩增阶段的末端进行的，涉及更多的细胞数量，因此在治疗应用中使用有限。 在生产用于治疗应用的CAR T细胞时，可以通过四种主要类型的遗传物质转移来实现基因传递：将基因稳定整合到宿主T细胞基因组DNA中；非整合的瞬时转移，转基因DNA作为环状体存在；病毒载体介导的转导；和非病毒转导。为了达到治疗患者所需的细胞治疗剂量，细胞在培养中被保留并允许扩增。为了刺激T细胞扩增，使用与单克隆抗体结合的珠子激活细胞，这些抗体针对CD3和CD28 T细胞受体。激活后的细胞可以在生物反应器中培养，这提供了在封闭系统中扩增细胞的可能性，中等规模，并在整个过程中进行采样和监测，以控制产品质量。 CAR T细胞疗法的开发面临一些挑战，包括细胞扩增不良、体内寿命短以及治疗患者的重大副作用。获得足够的目标T细胞以提供功能性治疗是主要挑战之一。用于临床前药物开发的材料通常来自健康捐赠者，而临床使用的材料来自接受过包括化疗、放疗、免疫疗法或所有这些组合的严酷治疗方案的晚期癌症患者。因此，临床使用的材料质量较差，变异性较高。最后，从处于危急状态的患者中采样免疫细胞将对他们的健康和生存机会产生重大影响。因此，有效的细胞扩增技术对于将CAR T细胞疗法从“实验室到床边”至关重要。 尽管取得了很大成功，但CAR T细胞疗法已被证明存在重大安全挑战。这是因为CAR T细胞可能触发称为细胞因子释放综合征(CRS)或“细胞因子风暴”的免疫反应级联反应。CRS是由T细胞的组成性过度激活引起的，导致大量促炎因子的释放，激活更多免疫细胞进入正反馈循环。CRS症状包括高烧、癫痫发作、器官衰竭、低血压和全身性炎症反应，可能导致死亡。 4.LV载体技术在T细胞工程中的应用  4.1.引言  LV载体是体外研究和开发的成熟技术，最近它们在临床应用中越来越受欢迎。事实上，LV临床应用的安全性和有效性已经为许多临床试验所证明，一些产品已经获得市场授权。图3描述了生产商业上可用的自体疗法所用的制造过程。然而，需要解决CRS、神经毒性和总体成本等挑战，以使T细胞过继疗法成为一种广泛可及的治疗。开发符合良好生产规范(GMP)的仪器、技术和技术对于LV工程化T细胞疗法的开发至关重要。在本节中，我们将介绍LV载体技术在T细胞工程中的一些应用。以下讨论了目前可用的CAR T细胞疗法、旨在将LV应用整合到T细胞工程中的技术、基于LV的T细胞疗法开发研究和开发工具、使用LV修饰的供体T细胞的异体方法以及CAR T细胞疗法的替代品。 图3. 病毒载体和自体CAR T细胞疗法生物加工。 病毒载体生物加工始于生产细胞系的扩增，例如HEK293T细胞。然后，细胞通过质粒DNA (pDNA) 载体进行转染。转染后，从细胞上清中收获产生的病毒颗粒。澄清步骤是为了去除大的杂质，如聚集体和细胞碎片；这一步骤可能包括核酸酶消化步骤。捕获步骤旨在保留慢病毒(LV)颗粒并进一步去除杂质。抛光步骤去除与LV载体物理性质相似的杂质。填充-完成步骤包括LV载体的最终配方。 自体CAR T细胞生物加工从通过白细胞分离术或白细胞分离术从患者中分离外周血单个核细胞(PBMCs)开始。为了从PBMCs中分离T淋巴细胞，可以引入使用抗体偶联磁性珠的富集步骤。使用抗CD3/CD28抗体偶联珠激活T细胞。激活后，使用慢病毒载体转导细胞，CAR治疗基因整合到目标T细胞基因组中，以产生完全功能的CAR T细胞。然后，在培养中扩增激活的T细胞，以达到治疗输注所需的细胞数量。然后收获细胞材料，并在-120°C下进行冷冻保存。然后将材料运回诊所，通过静脉输注给患者。 4.2.商业上可用的基因修饰T细胞疗法 在获得市场授权的三种CAR T细胞疗法中，brexucabtagene autoleucel (Tecartus, Kite Pharma Inc., Los Angeles, CA, USA) 和 axicabtagene ciloleucel (Yescarta, Kite Pharma Inc.) 都使用GRV载体进行转导，而 tisagenlecleucel (Kymriah®, Novartis International AG, Basel Switzerland) 使用慢病毒载体进行转导。Brexucabtagene autoleucel 和 axicabtagene ciloleucel 都使用相同的病毒载体在MSCV启动子的控制下转导转基因有效载荷。Tisagenlecleucel 使用独特的LV载体，并且转基因在EF-1a启动子的控制下。尽管目前正在对其他采用T细胞疗法的基因转移技术进行临床评估，但还没有获得市场授权，这表明逆转录病毒载体作为细胞治疗应用的基因转移工具的重要性。所有EMA和FDA批准的疗法已在表1中列出。当前的自体CAR T细胞疗法协议已建立，并在图3中展示。这种自体方法代表了商业产品的可行选择，但需要进一步改进以满足全球需求。由于成本和生产能力，目前商业上可用的LV工程化T细胞疗法仅被视为对常规化疗、放疗和免疫治疗无反应或复发的患者第二、第三或第四线治疗选择。必须同时考虑改进生产LV载体和T细胞工程所需的生物工艺和技术，以改善患者获取。为解决流程瓶颈、增强功能性和提高LV工程化T细胞疗法的安全性，已提出最近进展。 细胞和基因治疗所涉及的物流包括患者材料的采购、生产、运输、调理和药品的储存，被视为使细胞和基因治疗成为一种可行治疗解决方案的主要瓶颈之一。目前在美国进行的22天生物工艺对包括欧盟在内的其他市场构成了重大挑战，因为在收到治疗之前，患者需要两次跨越大西洋运输他们的细胞，这突显了当前自体T细胞疗法方法所面临的物流问题。为缓解这一问题，诺华公司正在增加在法国和瑞士的生产能力。 欧洲药品管理局(EMA)优先药品计划(PRIME)和美国联邦食品药品监督管理局(FDA)突破性疗法认定已开发出来，以促进在临床前研究中显示出对当前护理标准有显著改进的药品的市场批准。这三种疗法都从这种加速评估中受益，因为这些疗法对B细胞恶性肿瘤显示出高疗效，并满足了未满足的临床需求。 Tisagenlecleucel在2018年获得了FDA和EMA的批准，用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)。T淋巴细胞通过慢病毒载体进行修饰，以转导抗CD19 CAR，然后修饰后的细胞再输回患者体内。第二阶段的临床研究仍在进行中(ELIANA, NCT02435849)，结果已公布，并计划在2022年11月完成。第三阶段(BELINDA, NCT03570892)目前正在进行，但由于成功的加速批准状态，tisagenlecleucel可以在完成之前商业化。来自抗CD19 CAR T细胞方法的令人鼓舞的结果导致增加了努力以标准化实验开发协议并预测临床要求。 4.3.限制、安全性和有效性 尽管CAR T细胞疗法在治疗血液癌症方面取得了初步的临床成功，但安全性问题和提高实体肿瘤的疗效仍然是需要解决的障碍。除了将慢病毒基因分离到单独的质粒DNA构建中以避免RCL生成外，还对慢病毒载体进行了几项修改以提高安全性。一种减轻CAR T细胞输注后不良反应发展的解决方案是包含含有“自杀基因”的转基因。“自杀基因”允许通过添加一种特定化学试剂来选择性杀死CAR T细胞，这种试剂对未修饰的细胞本身无毒。这项技术已进展到临床前和临床阶段。例如，针对多发性骨髓瘤(MM)的抗SLAMF7疗法包含了一个二聚化结构域与caspase-9结构域自杀基因的融合，以减轻非靶向激活的风险，因为SLAMF7在包括NK细胞在内的健康白细胞上表达。作者已在体外和体内显示出疗效，并且通过添加二聚化剂AP1903 (利米杜西)可以消除修饰的细胞。 CAR T细胞制造的另一个相关风险是其他细胞类型与转基因的转导。单个白血病B细胞的转导导致了接受抗CD19 CAR T细胞疗法tisagenlecleucel (Kymriah)治疗的患者中耐药转基因克隆的发展。这导致了在制造过程中由于CAR治疗基因的顺式整合而掩盖了目标CD19表位。尽管这是一个罕见的事件（当时治疗的369名患者中有1名），但使用具有广泛嗜性的整合载体可能代表一个严重的安全问题。用于这种疗法的载体使用了VSV-G包膜蛋白进行假型化，这赋予了载体广泛的嗜性。建议工程化更具体的嵌合包膜蛋白作为一种解决这个问题的方法。基于麻疹包膜的嵌合蛋白能够靶向仅在T细胞上存在的CD3受体。在人源化小鼠模型中的体内数据显示了这种载体的特异性，甚至允许体内基因传递以产生功能性CAR T细胞转导。尽管需要更多的工作，但这种方法可以解决体外转导期间潜在的非靶向转导问题。 已经报道了开发不表达CD19抗原的耐药淋巴瘤B细胞，导致CAR T细胞治疗患者复发的情况。为了解决耐药癌症的发展，提出了转基因工程。已经在体外测试了将两到三个CAR构建体引入每个工程细胞，并正在进行临床研究，以防止对CAR疗法产生耐药性的出现，取得了令人鼓舞的结果。 CAR表达水平被证明影响临床结果。仔细选择和设计驱动CAR基因表达的启动子，可以提高CAR表达。CAR转基因的不同组成部分，如跨膜和铰链结构域，也显示出影响CAR表达。优化嵌合受体内细胞和外细胞结构域设计的努力正在进行中。 尽管在治疗血液癌症方面取得了初步成功，CAR T细胞疗法在治疗实体肿瘤方面遇到了障碍，并且成功率有限。实体肿瘤的物理特性以及肿瘤微环境(TME)限制了CAR T细胞有效接触和杀死癌细胞的能力。经常引用的障碍包括细胞穿透肿瘤床的困难、肿瘤内恶劣的生理条件以及癌细胞产生的免疫抑制调节蛋白。这些障碍在血液癌症中不存在，因为它们不形成实体肿瘤癌症类型中看到的大肿瘤床，从而解释了抗CD19 CAR疗法所遇到的成功。最后，为了解决遇到的局限性和安全问题，已经提出了LV和RV载体的替代品。电穿孔就是这样一种替代品，它包括通过细胞传递电流引入pDNA。电流暂时在细胞中生成孔隙，并将带负电荷的mRNA通过细胞悬浮液并进入细胞。由于这种基因转移技术的非整合性质，可以提高安全性，因为随着mRNA的降解和通过细胞分裂的稀释，转基因的表达将逐渐减少。 尽管这些技术提供了安全优势，但长期疗效仍需要在人类试验中得到证明。 4.4.开发基于LV的CAR T细胞疗法研究工具 除了作为将CAR转基因转移到T细胞中的有效和安全工具外，LV载体还被用于开发体内和体外模型。开发体外和体内模型的一个重要部分是开发表达CAR T细胞疗法靶向的肿瘤相关抗原(TAA)的靶细胞。由于患者材料是稀缺资源，并且在伦理上不能在每个研究和开发研究中使用，因此永生化细胞系已成为测试CAR T细胞在临床前研究中性能的流行癌症模型。LV载体已被用于快速修改永生化细胞系，以获得稳定的靶TAA表达，并使用修饰的细胞开发体外杀伤测定，这对于证明疗法的效力和特异性至关重要。然后可以将相同的靶细胞系重新利用并移植，以在体内产生肿瘤模型，以研究疗法的安全性和有效性。小鼠模型在CAR T细胞疗法的体内测试中发挥了重要作用，并用于测试治疗效果和安全性的不同方面。小鼠模型可以分为四类：同系免疫能力，人类异种移植，免疫能力转基因和人源化转基因。所有这些模型都注入了人类或小鼠癌细胞系，以测试CAR T细胞，并且对于理解肿瘤发展和全身对疗法的免疫反应至关重要。提供证据表明在临床前阶段开发的疗法既安全又有效，也是进入人体临床阶段的先决条件。 4.5.开发整合LV的T细胞生物工艺仪器 自体CAR T细胞疗法已被证明是有效的；然而，仍有许多挑战需要解决。生物反应器制造商一直在设计符合GMP生产要求的平台，包括在封闭系统中进行特定适应性改造，以适应T细胞生物加工，例如德国哥廷根Sartorius的ambr 250，美国马萨诸塞州剑桥Aastrom Biosciences的Replicell™系统，瑞士巴塞尔Lonza的Cocoon，以及美国科罗拉多州Lakewood Terumo BCT的Quantum细胞扩增系统。这些系统中最受欢迎的是德国Bergisch Gladbach Miltenyi的CliniMACS Prodigy生物反应器平台。它是一种一次性、完全封闭且符合GMP的T细胞工程解决方案。这个生物反应器有一个培养室，包括一个用于介质交换和配方的离心机，并且可以在较低级别的洁净室环境中操作。该平台包括病毒载体应用线，允许T细胞疗法制造商将LV转导完全整合到生产过程中。它适合自体方法，因为规模仅适应于每个仪器生产单一剂量。尽管这种解决方案不允许规模化生产，但它代表了有希望的规模化解决方案，并且可以用于分散模型，其中剂量更接近或在临床现场生产。这项技术已在I期临床试验现场使用，研究了一种针对非霍奇金B细胞淋巴瘤的双重抗CD19抗CD20 CAR T细胞疗法。14天的生产过程完全整合了使用LV载体转导抗CD19/CD20 CAR基因。在治疗的8名患者中，所有治疗剂量都通过了释放标准，超过了输注所需的细胞数量，并成功给药。这些技术可以提供提高产品质量和生产灵活性的解决方案，并且还可以降低生产成本、物流复杂性和产品变异性。 4.6.使用LV载体的CAR T细胞异体方法 自体CAR T细胞疗法已被证明是当前治疗应用的有效策略。起始细胞材料直接来自患者，减少了与移植物抗宿主病(GvHD)相关的风险。此外，材料的自体性质不会导致产生抗HLA供体特异性抗体(DSAs)，这可能限制了整个器官移植和异体T细胞的剂量数量和体内持久性。尽管自体T细胞疗法已被证明更容易开发，但主要限制使这种方法难以扩大规模，以减少生产时间和成本。起始材料的变异性加上低细胞扩增潜力使得在自体T细胞扩增期间难以实现治疗剂量。这是由于从接受多条治疗线的患者中获取的材料的性质，这些患者在接受细胞疗法之前已经符合条件。此外，材料的自体性质意味着每个剂量都特定于每个患者，这排除了任何大规模生产选项，只留下了定制的规模化选项。由于所有这些限制，人们越来越关注一种一刀切模型中的异体方法。在这种情况下，材料将来自通用来源，如基因修饰的供体T细胞、脐带血(UCB)、胎盘、永生化细胞系或诱导多能干细胞(iPSC)衍生的T细胞，为大规模生产打开了可能性。目前，只有基因修饰的供体T细胞和永生化细胞系方法已经进展到临床阶段，因为干细胞衍生的方法仍需要进一步的临床前优化。 2015年，在伦敦大奥蒙德街医院对两名儿童进行了首次异体CAR T细胞疗法的概念验证人体测试。该技术结合了使用抗CD52血清疗法的淋巴细胞清除，然后在CAR T细胞输注之前使用UCART19技术。使用慢病毒载体引入抗CD19 CAR治疗基因，并使用转录激活因子样效应核酸酶（TALEN），这是一种基因编辑工具，用于敲除供体T细胞中的CD52和TCR基因，以避免淋巴细胞清除和避免GvHD。该研究结果显示，在异体CAR T细胞输注后，两名患者在输注后28天实现了分子缓解。UCART19由Cellectis独家授权给Servier，Servier赞助了两项I期临床试验，分别于2016年开始，2020年完成。共有7名儿童和14名成人患有B细胞急性淋巴细胞性白血病。两项试验的发表结果显示，最常见的副作用是CRS（91%）和神经毒性（38%），导致两例治疗相关死亡。总体存活率为55%，无进展生存率为27%。在UCART190初步成功的基础上，Cellectis、Allogene和Servier开始研究使用TCR和CD52 KO CAR T细胞以及抗CD52重组抗体治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。异体CAR T细胞（ALLO-501）的给药是在患者自己的免疫细胞使用氟达拉滨、环磷酰胺和重组抗CD52抗体（ALLO-647）进行淋巴细胞清除后进行的。这项技术目前正在22名患者（NCT03939026）的I期、单臂、开放标签试验中进行研究。2020年在美国临床肿瘤学会上提出的初步数据显示，ALLO-501和ALLO-647在19名患者中有12名（63%）产生了客观反应率（ORR），其中37%的有反应患者完全反应（CR）。 尽管异体T细胞供体方法显示出有希望的结果，但仍然需要更多的步骤来敲除或抵消可能引起GvHD的免疫原性T细胞生物学特征。将LV载体技术整合到最先进的异体CAR T细胞疗法生物工艺中，进一步证明了这种方法在T细胞工程中基因转移的相关性。如果正在进行的临床试验获得市场批准，对临床级LV载体的需求和全球供应的压力将进一步增加。这突显了改进工艺和技术以增加T细胞工程LV载体的生产和质量的必要性。 4.7.稳定生产慢病毒载体以满足载体需求增长 为了满足全球需求，已投入努力改进当前的LV生物加工协议，并开发技术以增加生产。大型制药公司一直在投资研究和开发旨在解决瓶颈的技术。一个主要限制是使用HEK293T细胞系生产的LV载体的规模。尽管这种HEK293T粘附细胞与质粒DNA LV系统的瞬时转染可以实现高滴度，但这种细胞系的粘附性质代表了传统规模扩大解决方案（如搅拌罐生物反应器生产）的障碍。近年来，人们尝试解决这种生产方法提出的几个瓶颈。已建议使用专用包装细胞系稳定生产LV载体，作为减少瞬时生产模型中需要大量GMP级质粒DNA的成本的潜在解决方案。在稳定包装细胞系（PCL）中，LV生产所需的病毒基因被稳定地转导到PCL基因组中。可以选择高滴度产生克隆进行载体生产。这种方法已经显示出一些令人鼓舞的结果，尽管与瞬时转染相比滴度仍然较低是一个主要障碍。除了稳定的PCL外，还建议开发HEK 293T细胞的悬浮变体作为替代方案。最近，Chen等人（2020年）在他们的细胞系中结合了悬浮和稳定方面，使用单一稳定转染构建体产生与瞬时转染系统相当的LV滴度。这项技术在搅拌罐生物反应器中进行了测试，提供了扩大生产的潜力；CAR T细胞疗法被引用为潜在应用之一。这项技术最初由意大利米兰的Telethon基因治疗研究所（TIGET）和美国旧金山的Cell Genesys开发，并在罕见疾病战略联盟下转让给GlaxoSmithKline，并获得了专利（专利号PCT/EP2016/078336），概述了未来商业化的潜力。 4.8.针对CAR T细胞疗法应用的专用慢病毒技术 除了提高LV载体的全球生产能力外，为CAR T细胞应用开发专用LV颗粒还可以改善疗法生物加工和生物功能。当使用LV载体进行基因传递时，激活T细胞对于实现高效率的转导至关重要。T细胞的激活还利用了免疫细胞在对抗原反应时自然克隆扩增的能力。T淋巴细胞的这种生物学特性被用来从通过白细胞分离术获得的初始样本中产生足够数量的细胞以治疗患者。这个过程通常使用与抗CD3和抗CD28抗体结合的磁性或聚合物珠子进行，如表2所示。LentiSTIM和RetroSTIM技术（专利号PCT/GB2016/050537）已经开发出来，结合了CAR T细胞的转导和激活。在LV载体从生产细胞出芽时，一些细胞蛋白被携带在病毒包膜上[144]。这种LentiSTIM颗粒是在表达抗CD3和抗CD28膜结合有丝分裂原的细胞系中产生的，随后在LV包膜从生产细胞膜出芽时出现在LV包膜上。同样的方法也被用来在LV包膜上表达生物素基团，以改善下游纯化。这项技术通过减少所需的试剂和工艺步骤以及提高载体纯度，简化了CAR T细胞的生产。 4.9.使用慢病毒技术替代CAR T细胞疗法的方法 TCR T细胞疗法是针对恶性肿瘤的CAR转导T细胞的替代品。这种疗法不是依赖于嵌合抗原受体，而是依赖于修改过的T细胞受体。T细胞被设计为表达具有特定亲和力针对目标抗原的TCR，这种疗法的生产过程与CAR T细胞疗法相同。TCR T细胞的主要优势是，工程化受体使用与未修饰T细胞相同的激活和免疫途径，从而降低了CRS和神经毒性的风险。Adaptimmune Therapeutics, PLC是特定肽增强亲和力受体（SPEAR）技术的拥有者，目前正在赞助或授权几项临床试验，用于治疗实体瘤癌症。SPEAR T细胞包含优化的TCR，并使用编码TCR转基因的慢病毒载体进行生产。首个完成的II期试验是由GlaxoSmithKline赞助的“重定向自体T细胞治疗晚期骨髓瘤”试验（NCT01352286），在第42天有20/25名患者（80%）达到客观反应率（ORR），1年后有11/25名患者（44%）。SPEAR T细胞也在Adaptimmune赞助的II期SPEARAD 1（NCT04044768）和2（NCT04408898）试验中进行临床测试，研究ADP-A2M4疗法治疗滑膜肉瘤、黏液性脂肪肉瘤和头颈癌。重新定向用于通用细胞因子介导杀伤或TRUCKs是另一种替代CAR的受体类型。有时被称为第四代CAR T细胞，TRUCKs已经开发出来，通过细胞因子释放改善CAR T细胞在实体瘤中的效力。当CAR与其目标抗原结合时，基因修饰的T细胞会释放特定的细胞因子，从而抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用。TRUCKs目前正在进行临床研究，并可以提供改善实体瘤中CAR活性的答案。例如，针对转移性结直肠癌的抗EGFR-IL12-CART目前正在进行测试（NCT03542799）。已经开发了特定的慢病毒技术，使用单一慢病毒构建体转导所有生产完全功能的TRUCK所需的元素，进一步提高了这类基于T细胞的免疫疗法的吸引力。 除了嵌合抗原受体的替代品外，还考虑了新的T细胞亚群作为新的潜在治疗细胞。在新的候选细胞中，γδ T细胞、自然杀伤T（NKT）和调节性T（Treg）细胞被建议作为细胞过继治疗和慢病毒技术的有前景的替代细胞类型。γδ T细胞占CD3+ T细胞群体的1-10%。它们是一种高度保守的免疫细胞类型，已经显示出对过继T细胞治疗应用的吸引力。这些包括它们强大的移植物抗肿瘤（GVT）活性以及与异体移植的低GVHD潜力。一项追踪108名癌症患者在接受HSCT后长达3个月的免疫剖面的研究显示，高水平的γδ T细胞与显著更高的总生存率和无复发生存率相关。已经发布和开发了使用慢病毒载体培养和转导γδ T细胞的协议和专利，以包括未来生产的适应性，如无血清培养基培养。一些研究已经进展到I期测试，例如IN8BIO Inc.技术NC200临床试验研究使用慢病毒修饰的γδ T细胞靶向成人胶质母细胞瘤（GBM）。不变自然杀伤T细胞或iNKT细胞也被认为是CAR T细胞治疗的有前景的T细胞亚群。与γδ T细胞一样，它们是T细胞的罕见亚群，占循环PBMCs的不到1%。它们在免疫调节中发挥重要作用，并且已经显示出强大的抗肿瘤活性。iNKT的一个显著优势是能够在不引起GVHD的情况下移植它们，使它们成为“现成”应用的强有力候选者。iNKT细胞已在多项临床试验中使用，包括针对神经母细胞瘤等实体瘤的疗法。使用GRV载体将抗GD2 CAR构建体转导到iNKT细胞中，以靶向神经母细胞瘤。临床前数据对显示体内有效性且无显著毒性，这导致了临床阶段的进展。正在进行的I期临床研究调查CAR iNKTs称为GINAKIT细胞（NCT03294954）与抗体疗法联合治疗复发或难治性高危神经母细胞瘤在1至21岁患者中的有效性。iNKTs也在针对血液癌症的测试中，例如，针对复发、难治、高危B细胞肿瘤的抗CD19 CAR-iNKT疗法目前正在I期试验中（NCT04814004）。 调节性T细胞或Tregs是CD4阳性T细胞的一个亚群，其主要作用是控制免疫反应。与执行促炎功能不同，Tregs对其他免疫细胞类型具有抑制作用，控制对外国病原体的免疫反应并预防自身免疫疾病。Tregs已被建议用于新的有前景的治疗应用，并扩展了过继T细胞治疗的范围，超越了肿瘤学。由于它们自然抑制免疫反应的能力，这些细胞特别适合治疗自身免疫疾病和预防移植物受者的GvHD。首个人体Treg临床试验测试Sangamo CAR Treg产品TX200-KT02已获批准进行I/IIa期（2019-001730-34）。Tregs使用慢病毒载体转导，以表达针对受体的HLA A*2的CAR受体，并预防患有终末期肾病（ESRD）患者的免疫介导的同种异体移植排斥反应。 5.结论  慢病毒载体在基因修饰T细胞治疗的发展中发挥了重要作用。这些逆转录病毒载体代表了一种安全有效的基因转移工具，已经应用于CAR-T细胞疗法近期进展到市场所需的许多开发步骤。慢病毒载体不仅直接应用于CAR治疗基因的转移，还用于开发体外和体内测试所需的靶细胞。慢病毒载体在T细胞治疗发展中的重要性不仅体现在它们整合到T细胞治疗协议中，还体现在用于其制造的仪器设计中。疗法通过后期临床试验的进展和监管机构设立的快速通道计划的准入，以及生物技术和制药行业的积极参与，预示着T细胞治疗在肿瘤治疗武器库中的未来重要性。尽管已经提出了基因转移的替代品，但慢病毒和γ-逆转录病毒载体目前是基因修饰T细胞治疗制造最先进的方法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。