cysteine protease

摘要:抗体-药物偶联物（ADCs）是由单克隆抗体（mAb）与小分子药物结合而成的复杂分子。抗体可以特异性地将细胞毒性剂引导至病变细胞，同时避免对健康组织造成伤害，从而显著提高治疗指数。本章描述了ADCs的多个方面，从ADCs的最初构想到关键发展、缺点以及目前有多种分子被批准用于治疗的情况。之后，我们将关注ADCs的关键组成部分，并描述用于ADCs的mAbs的特殊要求、作为ADC弹头应用的不同类型药物，以及连接mAb与药物的不同类别的连接子。此外，还将回顾用于将小分子连接到mAbs的偶联技术。文中包括了来自临床以及临床前开发和早期研究的多个例子，以说明每个部分描述的不同概念和分子机制。 1.ADCs简介 尽管过去几十年取得了巨大进步，但癌症治疗仍然是一个艰巨的任务。尤其是肿瘤的极大异质性以及开发能够选择性针对癌细胞而不影响健康组织的药物治疗是一个主要挑战。例如，传统化疗利用了大多数癌细胞快速分裂和增殖的事实。因此，干扰细胞分裂（有丝分裂）的细胞毒性化疗药物通常会导致肿瘤退缩。然而，一些正常的细胞类型，如骨髓或消化道中的细胞，也在快速分裂，因此对抗有丝分裂药物敏感，最终导致化疗期间观察到的常见副作用。因此，开发新癌症疗法的一个主要挑战是提高药物的治疗指数（TI）。TI反映了引起有益治疗效果的药物剂量与引起毒性的剂量之间的比率（图1）。换句话说，药物的TI不足意味着这种化合物无法在不引起不可接受的毒性的情况下根除肿瘤。专注于提高TI的下一代癌症疗法开发的学科是靶向癌症疗法领域。靶向癌症疗法是精准医疗的基石，旨在通过干扰肿瘤进展中涉及的特定分子靶标来阻断癌症的生长和扩散。在这个学科中，正在采用多种方法更具体地针对病变组织。例如，信号传导抑制剂干扰不适当的细胞信号传导，基因调节剂允许修改蛋白质表达水平，免疫疗法，抗体-药物偶联物（ADCs）等等。在本章中，我们希望关注ADCs（图2），它们结合了单克隆抗体的优越选择性和一些细胞毒性剂的高效力。ADCs的基本概念相当简单（图3）。前提是一个抗原，可以在分子基础上区分癌细胞和健康细胞。例如，这可能是在肿瘤细胞中高度上调的特定细胞表面受体。针对这种抗原的抗体可以作为高效细胞毒性剂的靶向载体。为了形成ADC，细胞毒性剂需要通过连接子与抗体共价连接，该连接子在循环中稳定，以避免过早释放毒素。在患者中给予ADC后，它遍布全身，一旦接近肿瘤，就会与细胞表面的抗原结合。然后，抗体-抗原复合物被细胞内化，并通过内源性细胞内运输途径定向到溶酶体。到达溶酶体后，ADC被降解，从而释放其有毒有效载荷。游离毒素然后可以结合其细胞内靶标，从而诱导凋亡并杀死癌细胞。在某些情况下，毒素可以离开癌细胞并作用于相邻的，理想情况下也是癌细胞。这个过程称为旁观者效应，其程度取决于应用的连接子和药物。另一方面，健康细胞主要被保留，因为抗体应该只与表达抗原的癌细胞结合并传递毒素。 图 1 治疗指数 (TI) 及其通过 ADC 改善的情况。治疗指数的特征是超过最大剂量会出现毒性（最大耐受剂量，MTD）和达到治疗效果所需的最低剂量（最小有效剂量，MED）。ADC 通过结合目标特异性单克隆抗体和强效有效载荷，同时增加 MTD 并降低 MED，从而最终提高治疗指数。 图2 ADC 的模块化设计和关键参数。ADC 由单克隆抗体、有效载荷和连接子组成。抗体作为偶联的有毒有效载荷的载体，介导特异性抗原结合以及长的血清半衰期。连接子确保在血清中具有高稳定性，但在细胞内有效释放有效载荷。 图3 ADC 作用模式的图解概览。当与癌症特异性表面受体（浅蓝色）结合后，产生的 ADC-受体复合物被内化并运输到内质网。虽然受体循环可以使 ADC 返回到表面，但预期的途径是内质体成熟为溶酶体。随后的溶酶体降解导致药物（红色）的释放，根据所使用的毒素类别，通过不同机制诱导细胞死亡：微管抑制剂与微管结合，DNA 损伤药物扩散到细胞核以诱导 DNA 损伤。根据连接子和药物的类型，细胞内释放的药物可以离开目标细胞并对相邻细胞也起作用（旁观者效应）。 2.ADC发展的里程碑 历史上，ADC的概念起源于Paul Ehrlich在1900年左右进行的工作（图4）。他设想了一种药物，像“魔法子弹”一样只伤害病变组织，同时保留健康细胞。Ehrlich在开发了一种选择性杀死引起昏睡病的寄生虫锥虫的染料后，能够证明他的概念。此外，Paul Ehrlich也是抗体发现的先驱之一，因此为ADC发展奠定了一些基石。然而，在20世纪初引入“魔法子弹”概念后，直到1980年代ADC的发展才缓慢推进。这主要归因于难以生产选择性抗体，因此几乎不可能获得大量特定抗体，可以作为ADC的基础。这一点在Georges Köhler和César Milstein在1975年报告他们的杂交瘤技术后发生了变化。从这一点开始，单克隆抗体的可用性不再是问题，为治疗性抗体以及ADC铺平了道路。Muromonab-CD3（OKT3®）是第一种治疗性单克隆抗体，于1986年被食品药品监督管理局（FDA）批准为免疫抑制药物。然而，由于Muromonab-CD3是一种小鼠抗体，其治疗应用与较高的免疫原性风险相关。因此，患者在接受治疗一段时间后通常会发展出抗药物抗体（ADAs），使他们对这种药物产生抗性。然而，重组DNA技术允许生产嵌合体，以及在后期，人源化抗体，从而可以大幅减少免疫原性问题。这些技术进步最终导致了第一种mAb（利妥昔单抗）在1997年被批准用于治疗癌症。利妥昔单抗是一种嵌合抗体，与大多数B细胞淋巴瘤表面表达的CD20结合。由于抗体是ADC的一个组成部分，抗体领域的技术进步也意味着ADC领域的进步，上述里程碑对ADC的发展做出了重大贡献。 图4 从 1900 年首次构想到 7 种获批 ADC 的 ADC 发展里程碑。 除了抗体，ADC的另一个重要组成部分显然是附着在其上的细胞毒性有效载荷。一些最早研究的ADCs包含了众所周知的具有极高效力的化疗药物，如甲氨蝶呤、阿霉素或长春碱。这些药物通过本章稍后将详细讨论的不同连接子类型和偶联技术与抗体偶联。然而，在小鼠中进行的人体肿瘤异种移植研究中，第一代偶联物的体内评估显示出比相应的未偶联药物更优越的抗肿瘤活性。受到这些数据的鼓舞，启动了两项临床I期试验，使用基于小鼠KS1/4抗体与甲氨蝶呤偶联的ADC。不幸的是，在这些研究中未能观察到令人信服的治疗效果，最终导致这些研究的终止。失败的一个原因归因于对小鼠mAb产生ADAs，导致ADC的快速清除。更成功的是抗体阿霉素偶联物BR-96-Dox，它进入了治疗转移性乳腺癌的II期临床试验。然而，这种偶联物也没有显示出显著的治疗效果，因此停止了进一步的开发。第一代偶联物的缺乏成功抑制了对ADCs的初步兴奋，虽然在1990年代FDA批准了七种mAbs，但第一个ADC的批准却迟迟未来。最终，随着gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)在2000年获得FDA批准用于治疗急性髓细胞性白血病（AML），第一个ADC获得了FDA的批准。gemtuzumab ozogamicin的基础是gemtuzumab，这是一种针对髓系细胞表达的跨膜受体CD33的人源化IgG4型抗体。作为细胞毒性有效载荷的是calicheamicin，一种高效的DNA损伤剂。不幸的是，由于缺乏对患者的益处，gemtuzumab ozogamicin在2010年被撤出市场。尽管如此，它是ADC发展史上的一个里程碑，最终，由于推荐剂量降低和不同的剂量计划导致风险-效益比改善，gemtuzumab ozogamicin在2017年重新获得批准。ADC作为治疗药物的真正突破随着2011年brentuximab vedotin (Adcetris®)和2013年trastuzumab emtansine (Kadcyla®)的批准而来。这两种ADC为整个领域带来了全新的动力，导致许多不同公司的开发活动，新技术的兴起和多项人类临床试验。我们将在本章中回顾这些下一代技术和发展。对ADCs来说，2019年尤其令人兴奋，因为随着brentuximab vedotin和trastuzumab emtansine的批准，最终有三项晚期临床试验成功结束，并获得三项ADC的批准。今天市场上总共有七种ADC（这里列出了国际非专利名称(INN)，随后是商品名，批准年份和公司）：gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®, 2001/2017, Pfizer/Wyeth)，brentuximab vedotin (Adcetris®, 2011, Seattle Genetics/Millennium)，trastuzumab emtansine (Kadcyla®, 2013, Genentech/Roche)，inotuzumab ozogamicin (Besponsa®, 2017, Pfizer/Wyeth)，polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®, 2019, Genentech/Roche)，enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®, 2019, Astellas/Seattle Genetics)，和trastuzumab deruxtecan (Enhertu®, 2019, Daiichi Sankyo/AstraZeneca)。这些ADCs的关键参数在表1中描述，接下来的部分将引用其中的一些。 表 1 2020 年初获批用于治疗的 ADC 的关键参数 3.ADCs使用的靶标和抗体 ADC的设计是一项跨学科的努力，因为它们由大型生物技术生产的生物分子和化学合成的高效小分子药物组成。这两种实体分别生产，然后结合成一个高度复杂的混合分子。因此，从设计各个组成部分到最终生产偶联物的整个ADC开发过程伴随着巨大的技术挑战。第一道障碍是确定适合ADC方法的靶标。该靶标应允许通过肿瘤特异性靶标过表达或通过其他机制（如肿瘤细胞上突变蛋白变体的专有呈现）来区分癌细胞和健康组织。它也应该对抗体可接近，这基本上限制了空间到细胞外靶标。此外，靶标在ADC结合后的快速内化对于达到细胞内细胞毒性剂的关键浓度很重要。一个符合这些标准的靶标示例是CD30。CD30是激活的T和B细胞呈现的受体，在癌细胞上表现出高、均匀的表达，在正常组织中表达低，并且在抗体结合后迅速内化。针对CD30的单克隆抗体是brentuximab vedotin (Adcetris®)的基础，这是一种用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的ADC。相反，并非每个ADC靶标都必须满足所有这些标准。trastuzumab emtansine (Kadcyla®)的靶标HER2在乳腺癌组织中表达水平高，并且在抗体结合后迅速内化。然而，它也在其他组织中表达，如皮肤、心脏、胃肠道（GI）、呼吸、生殖和泌尿道。尽管如此，ADC仍然具有良好的耐受性，因为健康细胞上的HER2表达量远低于癌细胞。抗体是ADC的第二个关键组成部分，因为它代表了整个分子的靶向和药代动力学（PK）的主要决定因素。因此，mAb应该具有高亲和力和选择性地结合其靶标，以确保细胞毒性弹头被传递到正确的细胞。然而，抗体不仅与抗原结合，还与多种Fc受体进行额外的多种相互作用。特别重要的是与新生儿Fc受体（FcRn）的结合，使抗体受到一种称为FcRn循环的机制的影响。这个过程导致抗体的半衰期显著改善，除了高分子量外，也是抗体非凡长血清半衰期的主要原因之一。考虑到小分子细胞毒性剂通常只表现出几个小时的半衰期，对于ADCs来说，保持FcRn结合是非常理想的，因为与抗体的结合可以将毒素的半衰期延长到几天甚至几周。因此，必须特别注意不要通过例如细胞毒性剂的偶联来损害mAb-FcRn相互作用。一些工程方法甚至旨在增强FcRn相互作用，以进一步改善抗体的PK特性。除了FcRn受体外，还存在许多其他Fc受体类别，它们负责Fc效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。尽管这些机制通常有助于mAbs的治疗效果，但与这些受体的相互作用可能对ADC方法不利。这些次要免疫功能的参与可能会意外地减少偶联物在肿瘤中的定位或增加健康细胞对表达Fc受体的ADC的摄取。因此，用于gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)的mAb属于IgG4亚类，没有ADCC或CDC活性，而通常用于治疗性抗体的免疫活性IgG1亚类。因此，使用效应沉默的抗体亚类可能是一个有效的策略，或者进行旨在避免上述问题的抗体工程。 4.ADC细胞毒性有效载荷 ADC最终产生治疗效果的元素是偶联的细胞毒性剂，通常被称为“有效载荷”或“弹头”。到目前为止，已有多种分子类别在ADC环境中证明是成功的，还有更多具有巨大潜力的分子正在研究中。今天用作ADC有效载荷的一些毒素，如美登素、奥瑞他汀和卡利霉素，是因为它们极高的效力而被发现，这使它们成为可能的新抗癌药物的非常吸引人的选择。然而，这些毒素的治疗指数不利，实现抗癌效果所需的剂量伴随着严重的毒性，最终排除了它们作为独立抗癌药物的进一步开发。然而，随着ADC的出现，这些毒素的治疗应用经历了复兴。今天正在开发的大多数ADC携带细胞毒性有效载荷，但值得一提的是，最近的方法也利用了其他药物，如免疫刺激性有效载荷或抗生素。在接下来的部分中，我们将关注不同类别的细胞毒性ADC有效载荷，并仔细看看已经作为目前批准的ADC组成部分取得最终成功的有效载荷。 美登素是一种从非洲灌木美登斯树皮中分离出来的安莎霉素大环内酯。它是一种非常强效的抗有丝分裂药物，通过抑制微管聚合从而在G2/M阶段阻止细胞周期，最终通过凋亡导致细胞死亡。美登素及其衍生物，美登素类，在低皮摩尔浓度范围内对不同的癌细胞系显示出强烈的体外活性。这些化合物最常见的剂量限制性毒性是神经毒性、呕吐和恶心。然而，最初分离的美登素结构并不适合与抗体共价连接。因此，必须开发允许与mAb偶联的衍生物。这些活动中产生的一个化合物是DM1（图5），最终用于曲妥珠单抗emtansine（Kadcyla®）的有效载荷。有趣的是，将DM1作为ADC组成部分使用，将其最大耐受剂量（MTD）至少提高了一倍，证实了将细胞毒性剂纳入ADC可以改善治疗指数的概念。 图 5 DM1 的化学结构，DM1 是曲妥珠单抗艾美汀（trastuzumab emtansine）所使用的有效载荷。 奥瑞他汀是肽基分子，其中第一个描述的这类剂，多拉司他丁10，是从海蛞蝓Dolabella auricularia中分离出来的。奥瑞他汀抑制微管聚合并抑制依赖于微管的鸟苷-50-三磷酸（GTP）水解。这导致有丝分裂受到干扰，最终导致细胞周期在G2/M阶段停止，最终导致细胞死亡。奥瑞他汀最常见的剂量限制性毒性是周围神经病变（PN）、疲劳、恶心和腹泻。 今天，主要使用两种多拉司他丁10类似物，即单甲基奥瑞他汀E（MMAE）（图6）和单甲基奥瑞他汀F（MMAF）作为ADC有效载荷。然而，到目前为止，只有含有MMAE作为活性药物的ADC被批准用于治疗，即brentuximab vedotin (Adcetris®)、polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®)和enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®)。 图 6 单甲基奥瑞他汀 E（MMAE）的化学结构，它是 Brentuximab Vedotin、Polatuzumab Vedotin 和 Enfortumab Vedotin 中的细胞毒性成分。 卡利霉素是含有内炔的抗癌抗生素，具有特殊的结构元素，如甲基三硫化物基团和糖基化的羟基氨基糖。它们最初是从Micromonospora echinospora calichensis中分离出来的，显示出非凡的高抗肿瘤活性。例如，卡利霉素γ1I在小鼠肿瘤中显示出抗肿瘤活性，剂量低至0.5-1.5 μg/kg。卡利霉素构成gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)和inotuzumab ozogamicin (Besponsa®)的有效载荷（图7），其中它通过酸敏感连接子与mAb共价连接。它是一种非常强效的DNA损伤剂，与DNA次要沟中的特定区域结合，在那里它诱导双链断裂，最终导致凋亡和细胞死亡。卡利霉素最常见的剂量限制性毒性包括血小板减少症和中性粒细胞减少症。 图7 在临床上批准的 ADC 药物吉妥珠单抗奥扎米星（gemtuzumab ozogamicin）和伊诺珠单抗奥扎米星（inotuzumab ozogamicin）中发现的卡利切阿霉素（calicheamicin）的化学结构。 喜树碱是一种五环喹啉酮碱，最初从亚洲树喜树中分离出来。它抑制DNA拓扑异构酶I，从而有效阻止S期的DNA复制，最终导致肿瘤细胞的凋亡细胞死亡。然而，最初的化合物因水溶性差和在生理条件下其内酯转化为无活性的羧酸形式而受到影响。因此，进行了许多旨在改善喜树碱特性的活动。这些努力导致了拓扑替康和伊立替康的开发，它们已被FDA批准为抗癌药物。喜树碱的另一个重要衍生物是取代的exatecan Dxd（图8），它是用于曲妥珠单抗deruxtecan (Enhertu®)的有效载荷。在喜树碱治疗期间观察到的最严重的副作用包括中性粒细胞减少症和白细胞减少症。 图 8 已批准的 ADC 药物曲妥珠单抗德鲁替康（trastuzumab deruxtecan）中 Dxd 的化学结构。 5.ADC连接子 根据“抗体-药物偶联物”这个术语，ADC的主要成分是药物和抗体。然而，要将这两种实体偶联起来，需要一个连接子，将mAb与药物（图9）连接起来。仔细选择这种连接子，同时考虑mAb和有效载荷，对于最终ADC的效力和安全性至关重要。在血液中，连接子应尽可能稳定，以防止过早释放有效载荷，否则可能导致系统性非靶向毒性。但是一旦ADC到达目标细胞，有效载荷必须在不受到连接子的阻碍下活跃。此外，连接子的长度和化学性质可以对ADC的药代动力学和药效动力学产生强烈影响。 图9 ADC 连接子的图解说明。ADC 连接子通过共价键将细胞毒性有效载荷与抗体连接起来，通常与有效载荷一起合成，形成结合的连接子-有效载荷结构。所有连接子都携带一个反应性基团，使其能够与抗体偶联。许多连接子还包含一个切割位点，这允许在目标细胞内改善有效载荷的释放。一些切割机制需要一个额外的自消除模块，以确保有效载荷的无痕释放。 用于ADC的连接子主要分为不可切割和可切割两类。不可切割连接子在循环和细胞中都稳定，而可切割连接子设计为在目标细胞内被特定的细胞内机制降解。下面描述的连接子的示意图在图10中描述。 图 10 常用 ADC 连接子概览。ADC 连接子可以分为两类：不可切割（上部）和可切割（下部）连接子。通过可切割连接子从 ADC 中释放的有效载荷仍然与用于连接子-有效载荷连接的氨基酸相连。可切割连接子通过酶或化学环境降解。卡特普辛 B 连接子包含肽序列（例如，缬氨酸-瓜氨酸），而葡萄糖醛酸酶连接子包含葡萄糖醛酸。两者都与自消除的 PABC 模块结合，这使得药物可以无痕释放。酸敏感连接子和二硫键连接子分别通过酸性和还原条件降解。 使用不可切割连接子的ADC的释放依赖于抗体被完全蛋白水解降解为其组成的氨基酸。因此，最终释放的药物代谢物仍然连接到它们最初偶联的连接子和氨基酸（例如，赖氨酸或半胱氨酸）。这种修饰可能会干扰细胞毒性药物的活性，因此不可切割连接子只与作为氨基酸加合物仍然活跃的药物结合。此外，由于氨基酸的电荷，这些加合物相当亲水，导致膜透性降低，从而降低了旁观者活性。另一方面，不可切割连接子在循环中非常稳定，从而降低了意外药物释放的风险。一个带有不可切割连接子的ADC的突出例子是曲妥珠单抗emtansine (Kadcyla®)。在这里，弹头通过不可切割的硫醚键连接到mAb，产生DM1-赖氨酸加合物作为最终释放的活性药物。 可切割连接子旨在在肿瘤部位特异性释放药物，最好只在癌细胞内。理想情况下，这种释放是无痕的，使药物没有任何残留的取代基，如连接子或氨基酸的部分，这在许多情况下也有助于改善旁观者效应。典型的切割机制通常利用循环和细胞内区间不同的因素，主要是化学环境或特定的细胞内酶。 一类依赖于化学环境变化触发的切割的连接子是含有腙键的连接子系统。这些连接子被设计为在血液的中性pH下稳定，但在酸性环境中水解。正如前面已经描述的，ADCs的内化通常导致运输到内涵体和溶酶体区间。这些区间呈现出越来越酸性的环境（pH < 5），最终触发药物的释放。尽管这种类型的连接子已与非特异性药物释放相关联，但成功的应用证明了其功能性。实际上，gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)和inotuzumab ozogamicin (Besponsa®)都依赖于pH敏感的腙键连接子。 含有二硫键的连接子是另一类化学可切割的连接子。这些连接子的好处在于，细胞内区间通常比血液中更具还原性。细胞内区间的还原环境是由谷胱甘肽（1-10 mM）和还原酶的浓度升高创造的，与循环相比（< 5 μM）。值得注意的是，作为对实体瘤中发现的低氧水平的响应，这些效应在癌细胞中可能更加明显。因此，含有二硫键的连接子主要在肿瘤细胞的细胞内空间释放药物。通过在二硫键旁边引入空间位阻取代基，可以微调这些连接子的稳定性，以进一步防止过早的药物释放。 肽连接子旨在通过选择性酶促切割释放药物。由于血液中的蛋白水解活性较低，这些连接子在循环中可以非常稳定，而它们在内化后被溶酶体蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶切割。一个经常应用的肽连接子包括二肽基序缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit），在溶酶体中迅速水解。它最初是为半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶B的有选择性切割而设计的，但已显示药物释放也可以由其他蛋白酶触发。进一步成功应用的肽基序是Val-Ala或Gly-Gly-Phe-Gly；后者用于曲妥珠单抗deruxtecan (Enhertu®)。这类连接子-药物经常应用的一个是由Val-Cit肽通过自毁性的对氨基苯甲氧羰基（PABC）间隔物连接到药物MMAE。已经显示取代基可以大幅降低MMAE的效力。因此，已经做出了很多努力来开发这种允许无痕释放MMAE的连接子系统：Val-Cit的蛋白水解切割创造了一个PABC-MMAE中间体，随后PABC部分的自毁，从而释放未修饰的药物。然后MMAE可以在相同细胞内活跃，或者扩散到邻近细胞并引起旁观者效应。这种连接子-药物是brentuximab vedotin (Adcetris®)、polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®)和enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®)的一部分。 β-葡萄糖醛酸酶可切割连接子代表了另一类酶可切割连接子。β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中大量存在，但也在一些肿瘤中过表达。它选择性地水解带有β-葡萄糖醛酸作为核心单元的连接子的糖苷键，从而触发自毁机制，确保未修饰的有效载荷的释放。有趣的是，由于β-葡萄糖醛酸作为不可分割的一部分，这些连接子更亲水，并允许部署通常会影响ADC的生物物理性质的异常疏水药物。 除了确保药物释放的切割位点外，还开发了额外的连接子组件以产生具有改进属性的ADC。特别是，追求了亲水连接子的概念，类似于β-葡萄糖醛酸连接子，作为可溶性增强剂掩盖有效载荷的疏水性。为此，将非带电聚合物（例如，基于多聚乙醛或聚乙二醇）或带负电的基团（例如，磺酸盐）整合到连接子结构中。有趣的是，这些修饰对ADC稳定性产生积极影响，允许更高的细胞毒素载荷，并导致具有改进的药代动力学和改进的治疗指数的ADC。 6.ADC生成的偶联技术 虽然ADC的三个部分——抗体、连接子和细胞毒性有效载荷——决定了最终偶联物的关键属性，但同样重要的参数是这些组件的组装方式。连接子和有效载荷是通过化学合成产生的，要么作为直接偶联到mAb的联合连接子-有效载荷结构，要么作为在ADC生成期间依次组装的单独组件。 在这两种情况下，都需要将小分子偶联到mAb上，而不影响其有利属性，这是一个主要的技术挑战。在ADC生成过程中需要控制的主要参数是每个抗体偶联的连接子-药物数量，称为药物-抗体比率（DAR），以及结构附着在抗体表面的位点（偶联位点）。这两个参数可以决定性地影响ADC的几个属性，包括其稳定性和药代动力学行为，最终也影响其毒性和效力概况。一方面，用于ADC的弹头大多是疏水性的，DAR的增加可以显著改变整体疏水性，并严重干扰最终偶联物的蛋白稳定性。另一方面，根据其效力，需要一定量的药物，以达到足够活跃的ADC。然而，不仅DAR，而且偶联位点和化学也严重影响这些参数。例如，一些研究表明，某些位点对具有挑战性的有效载荷表现出优越的耐受性，并通过在抗体表面提供有利的微环境和空间屏蔽，比其他位点产生更稳定的偶联物。因此，找到连接子、药物和mAb的有利组合以及合适的DAR、偶联策略和偶联位点对于开发高效安全的治疗药物至关重要。以下，我们将回顾ADC生成的最成熟的偶联策略，并描述一些目前正在开发中的技术。图11提供了这些技术的图形概述。 图11 用于 ADC 生成的偶联技术。传统方法依赖于非工程化抗体的表面赖氨酸或铰链半胱氨酸的修饰，但通常会产生相当异质的产品（除了使用耗尽半胱氨酸偶联的偶联物）。为了增加 ADC 的均质性，已经开发了几种位点特异性偶联策略。重组抗体工程允许引入半胱氨酸（“硫代抗体”）或作为连接子-有效载荷附着位点的非天然氨基酸。同样，遗传引入的肽标签可以通过不同的酶进行修饰，例如，Sortase A、甲酰甘氨酸生成酶或微生物转谷氨酰胺酶（MTG）。相比之下，最近的方法旨在对非工程化的天然单克隆抗体进行位点特异性偶联。通过预定位赖氨酸反应基团可以实现区域选择性赖氨酸偶联。此外，去除 mAb 糖蛋白允许 MTG 介导的偶联，而重塑的糖蛋白本身可以作为附着位点。 抗体是携带大量化学基团的大分子，这使得以目标化的方式偶联连接子-药物变得困难。根据预期的偶联化学，连接子-药物在化学合成期间就需要装备所需的化学基团和结构。传统上，偶联是使用经典的蛋白质化学方法进行的，这些方法针对赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链——这些氨基酸自然存在于每一个mAb中。赖氨酸残基在mAb表面大量存在，至少有40个可供偶联。对于赖氨酸偶联，连接子通常配备有N-羟基琥珀酰亚胺酯，与赖氨酸的ε-氨基集团反应形成稳定的酰胺键。遵循这种方法生产的几种ADC（例如，gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)）已经上市，证明了这是一种可行的策略，可以产生有效的分子。然而，由于分布在整个mAb表面的可接近赖氨酸残基数量众多，这种方法产生了含有不同DAR和附着位点的大量ADC物种的异质混合物。这些物种在几个方面（例如，效力、毒性、聚集和稳定性）具有不同的特征。此外，可接近的赖氨酸理论上甚至可以位于mAb的功能区域，偶联可能会影响关键属性，如对目标的亲和力或mAb特异性受体。 与针对赖氨酸残基不同，连接子-有效载荷通常偶联到mAb的半胱氨酸残基。半胱氨酸比赖氨酸少得多，通常不易于偶联，大大减少了理论上的偶联位点数量。实际上，IgG类型的mAbs包含32个保守的半胱氨酸，形成每个12个结构域内特征性二硫键以及连接mAb链的铰链区域的4个键。传统的半胱氨酸偶联，如基于马来酰亚胺的Michael加成，针对的是半胱氨酸侧链的硫醇基，当硫醇基被二硫键困住时不具反应性。因此，与mAb半胱氨酸的偶联需要二硫键还原，以产生与马来酰亚胺功能化连接子偶联的反应性硫醇。有趣的是，温和的还原条件允许仅还原IgGs的铰链间二硫键，从而将偶联位点数量限制为8个。尽管这个过程部分去除了共价链间连接，但最终的ADC通过非共价相互作用足够稳定。几种半胱氨酸偶联ADC的批准，如brentuximab vedotin (Adcetris®)，以及正在进行的几项临床研究证实了这一过程产生的ADC的完整性和效力。 尽管针对半胱氨酸的偶联位点数量减少导致比赖氨酸偶联更少的异质ADC，但产品通常仍然是由于预期的DAR在大多数情况下低于8，因此仍然是随机混合物。Trastuzumab deruxtecan (Enhertu®)是一个例外，它通过完全装载所有链间半胱氨酸来生产，产生DAR接近8的均匀偶联物。此外，由于天然半胱氨酸在mAb内固定位置，因此没有偶联位点的选择。然而，几项出版物表明，偶联位点可以对ADC稳定性和体内特性产生巨大影响，链间半胱氨酸不一定是最佳选择。因此，已经开发了几种下一代偶联技术，允许将连接子-药物精确地附着到选定位置，从而产生量身定制的均匀ADC。 一种经常应用的位点特异性技术也基于半胱氨酸，但这种情况下半胱氨酸是通过重组工程放置到mAb一级结构中的。表达后，这些mAbs（通常称为“硫醇mAb”）在预期位置将工程化半胱氨酸作为mAb序列的一部分。不幸的是，表达介质中的硫醇基化合物与这些工程化半胱氨酸形成二硫键，从而阻止了直接偶联。为了去除这些硫醇帽并启用偶联，mAbs必须被还原，这不仅去除了帽子，也打开了链间二硫键。因此，在随后的步骤中，链间二硫键被重新氧化，留下工程化半胱氨酸作为唯一的游离硫醇。然后，这种预处理的mAbs与例如马来酰亚胺连接子-有效载荷偶联，这些连接子-有效载荷专门与工程化半胱氨酸残基反应。 与链间和工程化半胱氨酸的偶联通常使用马来酰亚胺功能化连接子进行。然而，几项研究表明，在马来酰亚胺偶联期间形成的硫代琥珀酰亚胺键可能因经历逆Michael加成或其他硫醇交换反应而遭受不稳定性，导致连接子-有效载荷过早释放。这种不稳定性的程度强烈依赖于偶联位点的微环境。因此，大量工作投入到寻找工程化半胱氨酸的完美位置。几个确定的位置不仅允许生产均匀的ADC，而且在偶联物稳定性和药代动力学行为方面也带来了额外的有利属性。作为替代方案，已经描述了几种稳定马来酰亚胺衍生偶联物的策略以及允许形成更稳定产品的替代硫醇化学。 除了与工程化半胱氨酸的偶联外，还存在多种位点特异性ADC生成技术，其中几种依赖于形成键的酶。一个突出的例子是细菌酶微生物转谷氨酰胺酶（MTG），它自然催化谷氨酸和赖氨酸残基之间形成异肽键。尽管IgG抗体在其一级结构中有几个谷氨酸和赖氨酸残基，但通常没有这些被MTG修饰。然而，已经开发了允许高效和位点特异性MTG驱动的ADC生成的策略。最常用的策略依赖于两个原则之一：首先，可以通过重组技术将包含谷氨酸残基的某些肽标签（例如，LLQG）插入到抗体序列中。这些标签随后可以被MTG识别，MTG专门将连接子-有效载荷偶联到肽标签谷氨酸。其次，通过酶促裂解或基因工程从297位点（欧盟编号）去除保守的IgG N-糖蛋白（要么通过酶促裂解或基因工程），暴露相邻的谷氨酸Q295。一旦去除糖蛋白，这个残基就成为一个非常好的MTG底物。在这两种情况下，连接子必须配备有主要氨基集团，将其标记为酶的底物。这两种策略都已成功应用于生产具有良好体内特性的均匀ADC。 与去除保守的N-糖蛋白用于MTG偶联不同，它们本身可以作为连接子-药物附着位点。为此，现有的糖蛋白可以通过化学氧化进行修饰，以允许随后的连接子-药物偶联。或者，糖蛋白可以在重组mAb表达期间通过代谢工程或翻译后使用糖蛋白修饰酶进行重塑。这两种方法最终都产生带有糖蛋白衍生结构的mAbs，这些结构配备了反应性基团。这些基团作为特定连接子-药物偶联的锚点。通常选择的反应性基团来自不断增长的生物正交化学工具箱。ADC的常见选择是叠氮基团，它们可以与紧张的炔烃在无铜点击化学中轻松反应。因此，功能化有这种炔烃的连接子-药物与引入到mAb糖蛋白的叠氮锚点特异性反应。 其他基于引入非天然氨基酸（UAA）的位点特异性ADC生成技术。这些氨基酸不是自然编码的蛋白质氨基酸的一部分，因此不会出现在蛋白质中。然而，扩展遗传密码允许在重组mAb表达期间精确地将UAA并入选定位置。这通常是通过使用一组特定的工程tRNA和tRNA合成酶以及合适的正交表达系统来实现的。与前述重塑的糖蛋白类似，UAA可以配备生物正交反应性基团（例如，叠氮基团），作为连接子-药物的附着位点。 除了描述的技术外，还开发了多种位点特异性ADC生成策略。例如，几种方法依赖于修饰mAbs的酶，这些酶要么在翻译过程中要么在翻译后进行。与MTG类似，这些酶（例如，Sortase A、甲酰甘氨酸生成酶或磷酸泛酰转移酶）识别必须在表达前工程化到mAb序列中特定的氨基酸序列。就像其他描述的方法一样，这些过程可以生成在体外和体内都具有优异特性的ADC。然而，大多数位点特异性生成技术要求操纵mAb序列或糖蛋白。尽管这不一定是主要问题，但它确实存在某些风险（例如，免疫原性），并且需要工程化mAb序列，从而排除了已经批准的具有既定GMP生产过程的抗体。因此，一些研究小组正在寻找允许在不需要序列或糖蛋白修饰的情况下与天然mAb进行位点特异性偶联的方法。例如，一种技术利用亲和肽预先定位胺反应性基团到特定的赖氨酸残基，从而限制在这些位置的偶联。其他研究小组在半胱氨酸偶联期间重新桥接铰链半胱氨酸残基，或工程化MTG变体，允许在不需要肽标签或去除mAb糖蛋白的情况下偶联天然mAb。 总结，有大量不同的ADC生产偶联策略可用，并且正在开发更多技术。目前批准的ADC是通过经典的半胱氨酸或赖氨酸偶联方法生产的，这些方法大多产生异质产品。多个临床前研究表明，位点特异性偶联方法定制的ADC具有更优越的行为，并且其中一些ADC目前正在临床试验中进行研究。然而，将临床前数据转化为有益的治疗效应仍有待证明。偶联策略的选择取决于几个因素，包括连接子、药物和预期的DAR。因此，每种偶联技术都有其各自的优缺点，并且必须考虑多个因素来为每个ADC单独选择合适的偶联策略。 要点信息 ADC由单克隆抗体、连接子和细胞毒性有效载荷组成。 抗体特异性和药物效力的结合导致治疗指数的提高。 目标抗原需要对癌细胞具有特异性，并且在ADC结合后通常发生内化。 抗体介导对目标抗原的高特异性有利的药代动力学。 大多数ADC有效载荷是微管抑制剂或DNA损伤剂。 连接mAb与药物的连接子可以是不可切割的或可切割的。 可切割连接子在目标细胞内通过化学或酶促机制降解以释放药物。 目前批准的ADC是通过经典偶联方法生产的，这些方法大多产生异质产品。 几种最近开发的位点特异性偶联技术能够生成均匀的ADC。 下章预告：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引用本文 尹茂山,王寅,李峥,王士奇,尹华静,笪红远*,叶旋*.非酒精性脂肪性肝炎新药研发的回顾与思考[J].中国食品药品监管,2024(7):26-35. 非酒精性脂肪性肝炎新药研发的回顾与思考 Review and Reflection on the Development of New Drugs for Non-Alcoholic Steatohepatitis 尹茂山 国家药品监督管理局药品审评中心 YIN Mao-shan Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 王寅 国家药品监督管理局药品审评中心 WANG Yin Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 李峥 国家药品监督管理局药品审评中心 LI Zheng Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 王士奇 国家药品监督管理局药品审评中心 WANG Shi-qi Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 尹华静 国家药品监督管理局药品审评中心 YIN Hua-jing Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 笪红远* 国家药品监督管理局药品审评中心 DA Hong-yuan* Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 叶旋* 国家药品监督管理局药品审评中心 YE Xuan* Centre for Drug Evaluation, National Medical Products Administration 摘  要 / Abstract 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为我国第一大慢性肝病。在NAFLD 的各种表型中，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）极有可能发展为包括肝硬化、肝癌在内的终末期肝病，导致由肝脏坏死引起的死亡率增加，这也是欧美等发达国家和地区采用肝移植术进行治疗的主要原因。目前NASH 的治疗仍处在联合用药治疗的阶段，尚存在严重未满足的临床需求，除美国批准新药Resmetirom 外，国内外再无其他NASH 新药上市。NASH 新药的成药性及其评价标准始终是最受关注的内容。本文通过分析NASH 新药研发状况，反映出非临床药效学研究的支持性不足以及临床研究达不到终点评价指标对新药成药性的影响，也提示着非临床药效学研究结果是否支持用于NASH 临床试验、临床试验研究能否达到评价终点是促进NASH 新药开发进程的关键节点。 Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has become the most prevalent chronic liver disease in China. Among the various phenotypes of NAFLD, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is highly likely to develop into end-stage liver diseases, including cirrhosis and liver cancer, leading to increased mortality. This is also the main cause of liver transplantation in developed countries or region in Europe and America. At present, the treatment of NASH remains in the form of combination therapy, and there are serious unmet clinical needs for targeted new drugs. Apart from the approval of the new drug Resmetirom in the United States, no other NASH new drugs are on the market domestically or internationally. The medicinal properties and evaluation criteria of NASH new drugs have always been of significant concern. The lack of support for nonclinical pharmacodynamics research and the impact of clinical trials not meeting endpoint evaluation indicators on the druggability of new drugs are reflected in the development status of NASH new drugs. This also suggests that whether nonclinical pharmacodynamics research results support the use of NASH clinical trials and whether clinical trials can achieve evaluation endpoints are key factors in promoting the development process of NASH new drugs. 关 键 词 / Key words 非酒精性脂肪性肝病；非酒精性脂肪性肝炎；有效性；成药性；回顾与思考 non-alcoholic fatty liver disease; non-alcoholic steatohepatitis; efficacy; druggability; review and reflection 据全球肝脏研究所预计，2030 年全球将有3.57 亿人的生活受到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的影响[1]。十年来，国内外针对NASH 的新药研发和申请数量持续增加，国内2018 年至今申请数目超过60 项、涉及靶点近30 个。据ClinicalTrial统计[2]，截至2023 年初，全球有1200 余项与非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）/NASH 相关的临床研究，但是NASH 新药几乎难以有完整的临床研究，所有NASH 的药物研发几乎都以失败告终，主要原因归结为NASH复杂的发病机制以及诊断障碍给相关药物临床研究带来的极大挑战。自2018 年开始，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）和国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA） 相继发布了NASH 药物临床开发的技术指导原则，其中欧洲肝脏研究协会（European Association for the Study of the Liver，EASL）年会和美国肝病研究学会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）年会已成为NASH 新药研发的风向标。 01 关于Resmetirom 2024 年3 月14 日FDA 批准口服药Resmetirom（以下简称RES） 上市， 用于治疗肝纤维化处于中度阶段（F2~F3 期）的NASH 患者，这是FDA 批准的第1 个用于治疗NAFLD 的药物。RES 属于甲状腺激素受体β（thyroid hormone receptors β，THRβ）选择性激动剂，在降低脂肪肝恶化率的同时，可以降低低密度胆固醇、甘油三酯和脂蛋白a[Lipoprotein（a），Lp（a）]水平，其获批适应症具体为：联合饮食和运动，用于治疗患有中重度肝纤维化的非肝硬化NASH或代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）成人患者[3]。 1.1 临床试验研究重点 RES 的获批是NASH 治疗领域的一个重大突破，主要是基于MAESTRO-NASH 的一项关键Ⅲ 期临床试验。该试验于2019 年3 月启动，是全球首个在NASH 患者中达到FDA 提出的“两个主要终点”（NASH 缓解和纤维化改善）的多中心、双盲、随机、安慰剂对照的Ⅲ期临床研究[4]。研究结果显示，RES80mg 和100mg 剂量组患者的症状缓解水平和肝脏纤维化改善水平更高，达到非酒精性脂肪性肝病活动评分（NAFLD activity score，NAS）下降的主要终点。其中，在NASH 缓解且纤维化不恶化的主要终点方面，100mg 剂量组、80mg 低剂量组及安慰剂对照组发生率分别为30%、26%和10% ；在纤维化改善≥ 1 级且NAS 不恶化的主要疗效终点方面，三组的发生率依次为26%、24% 和14% ；在次要终点低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）变化幅度方面，三组分别为-16%、-12% 和1%。 1.2 非临床药效学研究 在RES 早期开发中， 开展了基于小鼠DIO-NASH 模型的药效学研究，该模型系高脂、高果糖、高胆固醇模型， 在诱导31 周后行肝穿刺和组织病理分析，确认肝纤维化为F2 期及以上的小鼠造模成功， 给药8 周（经口，3mg/kg，每天1 次）后检测了小鼠的血生化及肝生化指标，并取肝脏进行病理分析，检测NAS 及纤维化评分。结果显示，模型组血浆总胆固醇（total cholesterol，TC）、肝脏TC 及甘油三酯（triglyceride，TG）显著升高，而RES 可明显改善血浆TC、TG 指标以及肝脏TC和总脂量，大致与上述的临床药效数据相吻合。肝脏病理切片的HE 染色、天狼猩红染色结果提示，模型+RES 组的平均NAS 下降为1.6，提示RES 能显著改善该模型中与肝脂肪变性相关的病理指标；但在该模型中未见RES 对动物肝纤维化的明显改善[5]。 其他研究者对一系列啮齿NASH 动物模型进行筛选， 确认使用高脂饲料（ high-fat diet，HFD）联合CCl4 诱导的肝脂肪变性及纤维化与NASH 临床症状相关性程度较高， 故选择小鼠HFD-CCl4 NASH 模型开展了RES 的非临床药效研究，探索了该模型（HFD+CCl4） 在NASH 新药临床药效预测中的效率[6]。肝脏组织病理学研究显示，仅奥贝胆酸（obeticholic acid，OCA）和RES 展示了明显的改善NASH 药效，两者对NAS 及肝纤维都有显著的改善， 具体为：① NAS 平均下降>2 分，基本消除了脂肪变性，对炎症反应及肝细胞气球化也有改善。②纤维化平均下降约1 分，且该变化具有统计学意义（P＜0.05）；组织病理分析进一步确认RES 和OCA 的抗纤维化药效主要与改善肝脏中隔膜性纤维化相关。此外，血生化指标检测结果显示，RES 可显著降低血清TG、TC、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL） 及高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平，本试验中的非临床研究结果与该化合物在Ⅰ期临床试验中观察到的结果相吻合。 02 NASH 新药探索 2.1 对NASH 的认识 NAFLD 是一种代谢综合征相关的肝脏疾病，与肥胖、胰岛素抵抗、Ⅱ 型糖尿病、高脂血症、高血压等相关， 在组织学上将NAFLD 分为单纯性脂肪肝、NASH 及NASH 相关的肝纤维化、肝硬化[7]。NASH 是NAFLD 进展中的重要环节，可导致肝纤维化、肝硬化，严重者可诱发肝细胞癌。 在2020 年和2023 年，NAFLD和NASH 分别被建议更名为代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）和代谢相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH），而后采用涵盖脂肪变性的各种病因的总体术语“代谢功能障碍相关脂肪变性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）”。NAFLD 和NASH 更名的过程是临床对该病认识不断深入的过程，胰岛素抵抗和脂肪组织功能障碍（如伴有炎症、纤维化和干细胞异常的“脂肪病”）与肝脏疾病的严重程度以及肥胖引起的严重心血管和代谢并发症的发展密切相关，更名强调了代谢相关因素在脂肪肝发病中的作用，符合现代疾病谱的变化，有助于推动内分泌、营养、心血管等多学科参与脂肪肝治疗的合作，也推动着NASH临床试验的纳排标准和治疗终点的进一步科学化完善[8]。 2.2 新药临床研究终点 在新药研发中， 临床结局的改善是评价药物疗效的硬终点，也是药物治疗的重要目标。NAFLD 和NASH 药物临床研究的重要临床结局系肝脏相关死亡率和全因死亡率，其中全因死亡率是包括NAFLD 和NASH 在内的许多可能致死性、慢性疾病治疗方法临床研究的关键性终点评估指标[9-10]。但鉴于NASH疾病发展缓慢等特点，相关新药研发面临巨大挑战。例如，早期NASH 患者需有10~15 年观察期，这使得以临床结局的改善作为新药研发的终点存在可操作性差的问题。FDA、EMA 逐渐认识到在NASH 新药研究中合理使用替代治疗终点的迫切性，但同时替代治疗终点如何定义及其反映临床结局和（或）获益的程度多少也成为了新的挑战。 2018 年之后，FDA、EMA和NMPA 相继发布NASH 药物临床开发的技术指导原则，明确提出了可将组织学改善作为NASH 药物研发的替代治疗终点。NASH 的组织病理特征表现包括大泡性脂肪变性、肝细胞气球样变、散在小叶性炎症和凋亡小体以及Mallory-Denk 小体等。目前，美国NASH 临床研究网络提出的NAS 评分系统，因其对NASH 疾病程度分类更细而被作为组织学评价的标准广泛应用于NASH 临床试验和药物研究中， 是目前被大众认可的NAFLD/NASH 病理评价体系[11]。为了加快新药审批过程，2018 年FDA 发布的《NASH 伴肝纤维化治疗药物的研发指南（草案）》（Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis with Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment） [12]中提出，对于中度或桥接纤维化的NASH（F2~F3 期），可以将肝组织学改善作为临床治疗终点；2019 年AASLD 和EASL 发表的《NAFLD 临床试验终点的联合研讨会报告》（Report on the AASLD/EASL Joint Workshop on Clinical Trial Endpoints in NAFLD） [13]中指出，也可将组织病理学改善作为NASH 新药研究的替代终点指标。此外，对于代偿期NASH相关肝硬化的临床试验，仍建议继续以临床结局的改善作为终点指标， 同时组织学的改善也是Ⅱ / Ⅲ期临床研究重要治疗终点之一。 NMPA 于2019 年发布《非酒精性脂肪性肝炎治疗药物临床试验指导原则（试行）》[14]，其中对于NASH 新药研发的后期探索阶段，推荐以组织学改善作为主要疗效指标时：“① NASH改善， 同时纤维化无恶化；或者，②肝组织纤维化改善1 分及以上， 同时NASH 无恶化；或者， ③ NASH 改善同时肝组织纤维化改善1 分及以上。NASH改善定义为NAS 评分至少降低2 分，其中气球样变至少降低1分，脂肪变评分不增加。”在确证性临床试验阶段，对于无肝硬化的NASH 患者，目前可接受的肝组织病理学替代终点包括脂肪性肝炎和（或）纤维化的改善，推荐：“① NASH 缓解同时，纤维化无恶化；或者，②肝组织纤维化改善1 分及以上，同时NASH无恶化；或者，③ NASH 缓解同时肝组织纤维化改善1 分及以上。NASH 缓解定义为NAS 评分中炎症评分为0~1 分，气球样变评分为0 分，脂肪变评分不增加。” 当然，组织学的改善可以作为NASH 新药研究替代终点的主要依据是既往研究中组织学与预后的关系[15]。现阶段，NASH新药研发仍需要进一步研究来证明临床获益，以及对于临床结局的改善， 如FDA 和NMPA 在NASH 新药研发方面均强调，若基于组织学疗效终点的新药获得加速审批，还需在上市后开展Ⅳ期临床结局的研究以验证疗效，进而获得全面上市批准[16-17]。 03 NASH 新药研发 目前， 针对NASH 适应症，药品研发企业、科研院所等始终不懈投入努力，在众多潜在治疗靶点上探索开发可用于治疗NASH 的新药。 3.1 NASH 新药在研靶点 目前， 治疗NASH 的热门研究靶点包括胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1） 受体、法尼醇X 受体（Farnesoid X Receptor，FXR）、胰高血糖素受体（glucagon receptor，GCGR）、THR-β、成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activate dreceptors，PPARs）等。从靶点来看，治疗NASH 的药物研发可根据作用机制大致分为以下几类。 （1）脂质代谢调节剂。这类药物主要作用于脂质代谢相关靶点，通过调节脂质代谢来减少肝脏中的脂肪积累，包括PPARα/δ激动剂、THRβ 受体激动剂、乙酰辅酶A 羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase，ACC）抑制剂、血管生成素样蛋白3（angiopoietin-like 3，ANGPTL3） 抑制剂、FGF21 类似物等。 （2）胰岛素敏感性改善剂。胰岛素抵抗是NASH 发病的关键因素之一，改善胰岛素敏感性的药物能够间接减轻肝脏中的炎症和纤维化。作用于葡萄糖代谢相关靶点的药物包括PPARα/δ 激动剂、GLP-1 类似物、果糖酶抑制剂、钠- 葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-dependent glucose transporters 2 ，SGLT-2） 抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）增敏剂等，这类药物可通过改善胰岛素敏感性、降低血糖来发挥药效。目前在研药物包括GLP-1类似物或受体激动剂如利拉鲁肽、司美格鲁肽等。 （3）抗炎药物。针对特定炎症途径的药物可直接减轻肝脏炎症。炎症靶点包括凋亡信号调节激酶1（Apoptosis Signal-regulating Kinase 1，ASK1）、Toll 样受体-4（Toll-like receptor，TLR-4）、趋化因子受体2/5（Chemokine Receptor，CCR2/5）、半胱氨酸蛋白酶（caspase）、含铜胺氧化酶3（amine oxidase copper-containing3，AOC3）、NKT 细胞（natural killer T cell）等。 （4） 抗纤维化药物。随着NASH 的进展， 肝脏发生纤维化，进而可能发展为肝硬化。针对纤维化靶点的在研药物主要有赖氨酰氧化酶相关蛋白2（Lysyl oxidase related protein 2，LOXL2）抗体、半乳糖凝集素-3（Galectin-3，Gal-3） 抑制剂、FGF21 类似物等。 此外，肠道微生物调节剂、胆汁酸代谢调节剂等也可能通过改变肠道微生物组成或调节胆汁酸代谢来改善NASH。 3.2 国内临床许可的项目类别 截至2024 年4 月， 近5 年国内已批准针对NASH 适应症开展临床试验的项目近60 项，其中包括国内外同步申报开发项目近40 项，以及仅在我国开发项目19 项。这些项目涉及了全球同适应症在研的热门靶点， 根据研究项目数量由多到少进行排序， 主要包括FXR、GLP-1R 相关靶点（ 包括GLP-1R、GLP-1R/GCGR、GLP-1R/GIP/GCGR）、THRβ、PPARs（ 包括PPARα、PPARα/β 和PPARγ/α/δ）、FGFRs（ 包括FGFRs、FGFR1、KLB/FGFRs）， 以及CCR5/CCR2、HSD17B13、FGF21、ACLY、SGLT-2/SGLT-1、DGAT1/D GAT2、PDE2A、KLB、ACC1/ACC2、AOC3、JNK/p38MAPK、DGAT1、IKK 等靶点。 多数注册申报NASH 适应症的品种按照新增适应症路径开发，如在原开发降糖、减重、降脂等适应症项目的基础上，新增NASH 适应症；部分项目选择NASH 适应症作为首次申报适应症。这其中也包括部分全球同步开发项目，即在已有国外初步临床数据的情况下，申请国内同步开发NASH 适应症。 3.3 未许可临床试验的原因分析 在RES 获批之前，FDA、EMA 以及NMPA 均未批准任何一款针对NASH 的药物上市，有大量NASH 候选药物研发失败。除存在不能接受的安全性问题外，国内NASH 适应症新药临床试验申请（investigational new drug，IND）更多是因非临床有效性证据不支持开展NASH 临床研究而导致其未获得许可。此前，国外多项NASH 新药研发项目也大多因临床无效而停止，如Gilead Sciences 开发的LOXL2单抗Simtuzumab 和ASK1 抑制剂Selonsertib，Galectin Therapeutics 开发的Gal-3 抑制剂Belapectin，Novartis 开发的Caspase 抑制剂Emricasan，Genfit 开发的PPARα/δ 激动剂Elafibranor 等。有效性未达到评价终点是多数在研药物在临床试验阶段研发受挫的最主要原因。综合全球NASH 适应症项目研发的经验教训来看，监管机构将与临床重点评价指标关联的非临床有效性证据作为临床许可与否的关键因素是十分必要的。 04 对国内研发NASH 新药的思考 4.1 新靶点药物研发的现状与挑战 从创新药的研发思路看，可大致分为原创新药研发思路（First in Class）与跟随研发策略（Fast Follow）。药物创新受制于药学、医学等基础研究水平，跟随策略的新药研发思路可能利于短期经济获益，但长期看存在诸多弊端。 NASH 新药的开发，国内鲜有领先的“First in class”新药，研究者在探索未经验证的新靶点时，往往对于早期研究（如非临床研究）重视程度不够，仅根据监管机构注册申请最低要求开展研究，无法为产品提供支持研发决策的全链条证据。同时，在面对专利约束的挑战时，采用受试物结构修饰的方式来规避专利风险，也面临药效降低、药代动力学- 药效动力学（PK/PD）不佳或毒性潜力更大暴露等严重风险。因此，原创研究与跟随研究在非临床研究方面的策略存在明显的差异，一味地进行“思路借鉴、试验方案参考”等跟随试验设计，或采用仿制药的策略、桥接思路开展原创新药的研发，都将导致新药的非临床评价不足，风险认识不足，难以实现新药全面的风险评估和新药高质量发展。 4.2 重视非临床药效学评价的意义 结合RES 的非临床研发实践， 比如：有资料研究其在HFD+CCl4 小鼠模型中表现出对肝组织学的明显改善作用，具体表现为NAS 评分的降低、肝纤维化的降低， 同时对于代谢紊乱也可见明显的改善作用。HFD+CCl4 小鼠模型不出现肝硬化，该有效性结果与OCA 的一项临床试验（REGENERATE）[18]相契合，OCA 的临床应用也被限定为治疗由于NASH 导致的硬化前肝纤维化。这个模型的药效结果与REGENERATE 的结果一致，而且还成功地预测了RES在另一项临床试验（MAESTRONASH）[4] 的结果。基于此，笔者认为，非临床体内药效学研究数据与NASH 有较强的临床相关性。在研究者早期开展的小鼠DIO-NASH 模型药效研究中，仅大致模拟了对脂肪代谢的影响，未见对动物肝纤维化的明显改善作用，也提示了在选择开展非临床研究来探索临床有效性潜力时，应当筛选出与拟申请适应症疾病病理生理过程更相关的动物模型，以期获得更好的临床预测性。 从新药的早期开发来看，也需要发掘并验证拟开发产品的有效性潜力。针对NASH 适应症，建议在非临床研究中提示目标产品是否具有组织学改善纤维化或缓解肝纤维化进展的潜力，并在控制纤维化进展的前提下，结合对代谢紊乱的纠正（如降低肝脂肪、降血糖）等多重潜在获益进行综合评价，以期更好地提升后期研发的信心。 4.3 以终为始，解决未被满足的临床需求 NASH 的疾病负担日益增加，而目前有效治疗药物极为有限，存在严重未被满足的临床需求。 以终为始是指基于对NASH疾病的认知了解，针对临床治疗NASH 所需要解决的核心问题和关键问题，从临床需求治疗目标作为开发的起点，从延缓、阻止甚至逆转疾病进展的角度改善临床结局，包括降低肝硬化及其并发症的发生率，降低肝移植的需求，降低肝细胞癌，提高存活率和改善生活质量等。由于硬终点临床结局的观察时间过长，无法满足迫切的临床需求，尤其是对于无肝硬化的NASH 患者，建议在新药早期概念验证阶段可采取无创的评估策略，如磁共振质子密度脂肪分数（MRI-PDFF）和磁共振弹性成像（MRE）等影像学检查，结合肝脏疾病特异性的代谢指标（如血清学指标）变化等共同评价肝脂肪含量、炎症和纤维化程度；在后期探索及确证性临床研究阶段，新药疗效终点的评价在于NASH 及纤维化组织学特征的改善，同时需要长期随访来评价组织学替代终点与硬终点改变的一致性或相关性。而对于合并肝硬化的NASH 患者，相关药物研发需将临床结局、组织学及无创指标共同纳入疗效终点进行评估。 4.4 关于NASH 的IND思考 非临床有效性和安全性都是评价NASH 新药IND 的关键。其中，NASH 作为一种需要患者长期用药的疾病，其非临床安全性评价需特别关注药物的心脏毒性、神经毒性、生殖毒性及致癌风险，且安全性观察需有足够的暴露量和暴露时间。此外，还需要考虑NASH 疾病进程的异质性和复杂性， 并根据NASH 疾病的发病机制及病理生理过程进行综合评估，所选择的动物模型应能准确反映临床病理进程，且对后续临床试验的有效性和安全性评估具有提示意义。NASH 发病机制及病理生理变化复杂，目前尚无法在一种动物模型中完全模拟疾病的临床病理进程，一般通过结合NASH 适应症临床拟定人群特征来对不同机制的病理模型进行选择，常用的NASH 动物模型[19] 包括饮食因素诱导的HFD和高脂饮食/ 西方饮食（WD/FD）模型，以及多因素（基因、饮食、化学、机械）诱导的HFD+CCL4、ALIOS/AMLN、ApoE-/-+WD、FATZO+HFD+FD 及MUPuPA+HFD 模型等，这些动物模型均涵盖肥胖、胰岛素抵抗、TG升高、AST/ALT 升高、组织学改变（脂肪变性、肝脏炎症、气球样变、纤维化）等多种病理生理特征。 非临床药效学研究的目的为预测新药对临床拟用适应症的有效性，阐明药物的作用特点，是支持新药临床试验方案设计的重要参考依据，故NASH 新药非临床药效评价需要进行纤维化控制/改善、代谢紊乱的纠正等多重潜在获益的综合评价，其中模型动物给药结束后的组织病理学检查和NAS 评分所占权重较大，以期提示在研新药潜在临床获益情况及是否支持开展人体临床试验研究。 05 结    语 NASH 领域在研药物涉及的靶点众多，有单药单靶点和（或）多靶点，也有针对不同靶点的药物联合开发。目前， 国内尚无NASH 的新药上市申请（NDA），国内注册的NASH 新药总体数量呈增长趋势，但仍存在临床试验监管机构无法掌握临床试验的真实情况和研发阻力、无法为临床开发提供更多的指导等问题。RES 的获批使得THRβ 激动剂靶点的成药性潜力得到了证实，业界开始聚焦于THR-β 激动剂靶点，目前国内针对THR-β 激动剂靶点的NASH 药物尚处在临床前或Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究阶段，仍面临许多未知的困难，需逐步探索对应的有效解决方案。 从非临床药效研究预测临床有效性的角度看，NASH 新药在早期研发中应重视药效学探索研究评价和成药性分析，动物体内药效学研究设计应该充分考虑NASH 的疾病特点以及所处的研发阶段指标，强调有效性与临床终点评价指标的关联性；同时，非临床有效性研究数据应结合长期用药的非临床发现的毒性潜力，将获益风险平衡的理念贯穿全过程。 NASH 新药有效性终点标准明确且趋同，即NASH 临床研究肝脏组织病理学改善作为硬终点，而临床试验设计的重点关键问题就是研究人群和主要终点。2024年4 月，EMA 发布策略文件[20]，表示将考虑向基于使用中间终点来开发NASH 治疗方法的申办人授予有条件批准，以缓解对这些产品的严重未得到满足的临床需求。但是，EMA 同时表示，基于这些中间终点来获得新化合物的早期有条件批准（CMA），只有在仍然存在未满足的需求、可以得出临床获益大于风险且申请人可以提供全面的上市后数据的情况下，这一策略才可接受。这提示着EMA 虽然有意缓解未被满足的临床需求，但对于调整评价策略的态度依然是审慎的。 值得期待的是，在临床前早期开发阶段，类器官和器官芯片等技术的应用已成为新药早期评价的新方向， 在NASH 等病理生理机制复杂的适应症中可能具有预测更准确的优势。评价指标正在尝试从目前的肝活检“金指标”向探索性终点发展，即基于无创标志物的终点（考虑以影像学、血清学、NASH 肝纤维化无创模型等作为药效学指标），以期减少临床试验实施难度，探索可靠性强、一致性好的无创标记物来作为疗效的替代终点以反映临床获益情况，且目前在国外已获得国际主要药品监管机构的允许，可在早期临床概念验证阶段使用，这些都为NASH 新药的成药性提供了支持和保障。 第一作者简介 尹茂山，硕士，国家药品监督管理局药品审评中心，审评员。专业方向：新药药理毒理专业技术审评 通讯作者简介 叶旋，博士，国家药品监督管理局药品审评中心，主任药师，主审审评员。专业方向：新药药理毒理专业技术审评 笪红远，博士，国家药品监督管理局药品审评中心，二级教授，高级审评员。专业方向：新药药理毒理专业技术审评 【参考文献】略  药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 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摘要：在自然和临床样本中检测病毒是研究和诊断中的一个复杂问题。存在不同的病毒分离和鉴定方法，包括PCR、CRISPR/Cas技术、NGS、免疫分析和基于细胞的检测。随着基因工程方法的发展，利用细胞培养的方法已成为有用且信息丰富的手段。分子生物学方法可以提高细胞培养对特定病毒的敏感性和特异性，并可用于生成报告基因细胞系。这些细胞系在病毒感染后表达特定的报告蛋白（例如，GFP、荧光素酶和CAT），可以在实验室环境中被检测。基因组编辑和合成生物学方法的发展为设计细胞培养中的病毒报告系统提供了新的视角。本综述旨在描述病毒学方法的一般情况以及目前存在的基于细胞的方法的开发实例。 1.引言 病毒是人类群体中许多疾病的病因，其中一些疾病可能导致流行病和大流行。为了防止这类事件，需要从患者和自然样本中快速检测出分离的病原体，以及研究分离物的属性。目前，有几种病毒检测方法。与PCR、CRISPR/Cas技术、NGS（下一代测序）、免疫分析和基于细胞的检测方法相关的检测方法（表1）。所有这些方法都有优点和局限性，必须用于解决特定问题，以便全面研究病毒。有些方法只允许检测病毒核酸或蛋白质，而其他方法允许检测活病毒颗粒，并且可以用来确定感染的剂量和时间以及生命周期的机制。最广泛使用的病毒检测方法是基于病毒基因组材料的扩增。除了基于PCR的检测外，还有基于扩增的其他方法（例如，SDA—链置换扩增，NASBA—基于核酸序列的扩增，3SR—自我维持序列复制，以及LAMP—环介导的等温扩增）。这些方法不仅可以在研究中应用，也可以在临床检测中应用。这些方法允许直接检测病毒DNA，但在病毒RNA的情况下，PCR之前必须进行反转录。基于PCR的方法由于扩增而足够敏感，允许检测样本中的少量分子。然而，一些作者指出，基于PCR的方法在检测某些病毒（如人类肠道病毒）方面的灵敏度低于基于细胞的方法。此外，使用基于PCR的方法可能与假阳性结果有关。此外，基于PCR的方法只允许检测病毒基因组而不是活病毒。然而，目前正在开发与下一代测序相关的改进病毒检测方法。这些方法主要被用来检测纯化和浓缩的病毒（即来自细胞培养），使用这种方法在临床样本中检测病毒的问题是病毒与宿主基因组的比例不足。为了解决这个问题，通过详细比较现代方法来纯化和富集临床材料中的病毒颗粒，设计了一种可以有效增加病毒基因组相对于宿主基因组数量的方法。这导致测序样品准备成本的降低以及随后生物信息学分析的改进。CRISPR-Dx病毒检测方法基于导向性内切酶：CRISPR相关蛋白（Cas）。这种方法使用Cas13家族的蛋白质，它们对RNA表现出“附带的”，非特异性的切割活性。考虑到这种效果，建立了一种名为SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告解锁）的方法。这种具有高灵敏度的核酸检测工具涉及病毒基因组材料的扩增和Cas13蛋白间接切割荧光标记的RNA探针，允许样本中病毒材料的定量。这种方法的灵敏度来自于即使是生物材料中微量的病毒核酸也经过重组酶聚合酶扩增（RPA），对于RNA病毒检测，还有一个额外的反转录步骤。然后使用DNA依赖性RNA聚合酶T7将放大的病毒DNA副本转换回RNA。此后，使用gRNA，Cas13蛋白识别病毒核苷酸序列，导致标记的核苷酸的附带切割，从而允许定量确定样本中的病毒含量。这个方向系统正在不断发展，以提高其灵敏度并改善登革热病毒或寨卡病毒（ZIKV）的检测。另一种流行的病毒检测方法是使用基于抗原的检测。这种方法既可以在研究中使用，也可以在临床诊断中使用。使用针对病毒的抗体的标准方法包括病毒中和试验、血凝抑制、补体固定和间接免疫荧光。这些方法仅用于诊断已知病毒，其衣壳结构已被研究。使用终点稀释分析评估病毒滴度是基于细胞培养上清的血凝试验。然而，正如观察到的流感病毒由于病毒基因组编码血凝素的序列中突变的快速积累导致氨基酸替代，使用这种方法研究病毒的抗原特性是复杂的。这种方法应用的一个问题是病毒在标准细胞系中的复制能力较差，例如MDCK细胞。也许这种检测将随着新敏感系的使用而得到改进。在这方面，使用基于检测病毒核蛋白的基于抗原的检测来改进病毒循环的监测将有助于测量临床样本中的病毒滴度。已经为IgG（免疫球蛋白G）和IgM（免疫球蛋白M）蛋白开发了这种技术，允许监测人群中的疾病。在与黄病毒相关的疾病的情况下，IgM通常在疾病表现后的几天内产生，并且通常可以在几个月内检测到。然而，在黄病毒感染的情况下，抗体的交叉反应是可能的。此外，IgG在IgM抗体发展后的几天内被检测到，并且可以检测到几个月。使用这种方法，已经提供了许多病毒的检测方法，例如ZIKV和戊型肝炎病毒。有一组使用细胞培养检测活病毒的方法。这些方法的斑点检测始于1950年。与细胞培养相关的病毒检测方法已经开发出来，并显示出巨大的潜力，因为它们提供了许多优点。使用这些方法，不仅可以确定病毒颗粒的存在，还可以表征病毒属性，这在开发新病毒引起的疾病的治疗方法时极为重要。此外，从细胞培养中获得的病毒颗粒可以通过电子显微镜进行研究，以检查病毒形态。所有使用细胞培养识别和研究病毒的方法可以分为两类。第一种方法利用病毒感染的细胞病变效应（CPE），这意味着细胞在病毒释放后死亡，可以在显微镜下检测和定量。然而，基于CPE的方法繁琐且灵敏度低，无法检测非细胞病变性病毒。可以使用不同的细胞系进行病毒检测，例如NSK、MDCK、UMNSAH/DF1、BS-C-1、Vero、A549、HEK293或HeLa细胞，它们可以作为培养和检测具有不同效率和特异性的病毒的基质。第二种方法与产生报告细胞系有关，其中特定细胞被修改以在病毒感染时产生报告蛋白。这种报告器的特性应该非常特定于病毒，以允许研究人员特别检测感兴趣的病毒。在病毒感染的情况下，病毒蛋白识别报告结构作为病毒基因组或具有特定切割位点的嵌合蛋白，从而产生可量化的信号，研究人员可以检测到。根据它们的基因组结构和生命周期，不同病毒的检测有不同的原理。一些RNA病毒的载体中的病毒结构的转激活可以通过病毒感染、蛋白质的切割和病毒蛋白酶释放报告器来发生，具有核复制周期的负链RNA病毒可以被minigenome模拟病毒检测。 总之，基于细胞的方法是当前可用的病毒检测和表征方法的重要类别之一。这些策略都有优缺点，这些在本节中进行了描述，但主要的区别特征是，基于细胞的方法可以用来分离和研究活的病毒颗粒；然而，在应用这些方法时存在一个问题，与细胞培养中的低敏感性（病毒进入细胞的能力）和许可性（病毒在细胞中复制的能力）有关。由于细胞系的这两个属性共同促进了细胞方法的发展，除非报告中提到了具体差异，否则它们通常可以统称为“灵敏度”。为了解决这个问题，正在开发新的方法。细胞系对特定病毒的敏感性取决于病毒附着在细胞膜受体上以及与细胞抗病毒反应相关的宿主基因。现代分子生物学方法已经允许开发遗传修饰的细胞，这些细胞增加了病毒的产生。本综述旨在描述一般的病毒学方法和今天使用的基于细胞的方法的具体发展示例。 2.CPE检测和敏感细胞系 为了提高活病毒颗粒研究方法的灵敏度，正在开发提高细胞培养灵敏度的技术。为了研究病毒的生物学特性，例如决定它们宿主物种特异性和增殖率的因素，以及产生活病毒颗粒，需要允许病毒传播的细胞系。病毒的一个基本特性是其进入细胞并产生病毒后代的能力。病毒复制后是宿主细胞的形态和生化变化，最终导致细胞破坏。根据病毒种类，这些变化有几种形式，例如合胞体形成、细胞变圆或细胞溶解。这种可见的细胞变化通常称为细胞病变效应。基于这一特性，开发了许多病毒感染性测定方法（例如，组织培养感染剂量（TCID50）、半数致死剂量（LD50）、痘和斑点测定），以及其他生物/化学测定方法（例如，检测血吸附、血凝和总蛋白）和通过电子显微镜直接计数病毒颗粒。在病毒研究技术的发展中，胚鸡卵（ECE）方法是细胞基础病毒研究技术的替代品。对于一些病毒，ECE仍然经常用于病毒分离。尽管ECE可以支持各种流感病毒分离株的生长，但它们有几个限制，这些限制与胚胎中连续繁殖可能导致血凝素糖蛋白的改变有关，这导致产生与原始分离株不同的卵适应病毒。研究通过血凝试验比较这两种方法，比较不同的细胞系，并使用关于CPE和TCID50/mL的信息。注意到低致病性禽流感病毒在所有细胞系中的复制效率都低于胚胎。然而，作者强调，使用MDCK、CEK和CEF等细胞系可以节省时间和资源，因为它允许处理更多的样本量，尽管病毒复制效率较低，但可能仍然有益。现在，使用CPE作为主要工具之一的细胞方法也已经应用于其他类型的病毒。例如，这种方法被用来研究与天花病毒在系统发育上密切相关的马铃薯痘病毒。使用这种方法可以区分马铃薯痘病毒和密切相关的鼠疫和牛痘病毒，因为它们在细胞病变效应上的差异。此外，基于细胞的方法也被用来研究几种ZIKV分离株之间的差异。在这些研究中，Vero细胞系上的细胞病变效应被用来估计感染滴度，作为研究病毒株的一种方法。发现两种寨卡病毒分离株，NR-50244和NR-50241，可以有效感染HEK293细胞，这很快导致明显的CPE和细胞普遍溶解。现代方法不仅可以寻找特定的细胞系，还可以确定观察到的效应背后的机制，这与不同的细胞受体有关。因此，进行了系统研究ZIKV对各种细胞系的趋向性等研究。ZIKV已被证明对来自不同组织（如肌肉、胎盘和肝脏）的七种以上细胞系具有趋向性。广泛的趋向性可以通过潜在的ZIKV受体在各种器官中的广泛分布来解释。以前曾显示，在人类上皮细胞系中，这种病毒积极复制，导致IFN-β（干扰素β）的抗病毒效应。这些研究报告了一系列有用的细胞系，用于在病毒学实验室中培养ZIKV。从所有上述方法中，我们可以得出结论，基于CPE的策略在不同病毒的研究中广泛使用。然而，这些方法通常耗时，选择一种对特定类型的病毒敏感且理想选择性的细胞系并不总是容易的。此外，提高细胞培养的灵敏度对于开发使用报告器结构检测病毒颗粒的方法很重要，这将有助于改进基于细胞的技术。这个问题可以通过两种方式解决。可以增加细胞培养对特定感兴趣病毒的灵敏度，或者创建一种对所有病毒高度敏感的细胞系，以解决与检测来自患者样本的未知病毒代理有关的问题。这个话题仍然相关，因为有时需要使用几种标准细胞系来检测病毒。如果不使用病毒特异性细胞系，则应使用多个细胞系进行病毒检测。例如，在涉及从16个样本中分离呼吸道病毒的实验中，包括流感样本，3个样本仅在Mv1 Lu细胞中显示CPE；3个仅在MDCK细胞中显示CPE；其余样本在两个细胞系中都显示CPE。已经有许多增加细胞培养对某些病毒的敏感性和许可性的示例。获得的细胞系MDCK-SIAT1对人类流感病毒的敏感性高于对禽流感病毒的敏感性。增加参与细胞表面受体合成的酶表达的方法是有希望的，以创建对不同病毒敏感的细胞系。例如，目前还没有适当的系统来传播诺如病毒（HuNoV）。尽管如此，已知HuNoV与位于细胞膜中的组织血型抗原受体相互作用。这些受体的成熟是一个多阶段过程。然而，有证据表明特定的糖基转移酶等酶参与了这些途径。因此，这些酶的过度表达可能会增加细胞培养对诺如病毒的灵敏度。 在另一项与流感病毒有关的研究中，通过对人呼吸道跨膜蛋白酶（TMPRSS2或MSPL）的过度表达来修改MDCK细胞系。在没有胰蛋白酶的情况下，这些细胞支持了基于致病性禽流感病毒的三种重组疫苗的生长。以下作为示例的研究与细胞系对广泛dsDNA基因组病毒—单纯疱疹病毒（HSV）的增加许可性有关。最早生产的敏感细胞系之一用于HSV检测。为了细胞转染，产生了包含病毒反激活蛋白VP16（称为α-TIF或Vmw65）与Moloney白血病病毒的长末端重复（LTR）序列的构建物。VP16的产生使细胞对HSV更敏感，并增加了病毒产量200倍，这适用于CPE测定。为了创建用于病毒学研究的报告器细胞系，需要增加细胞对病毒的敏感性和病毒基因组在细胞中的复制率。解决了这个问题，就可以生成高分辨率的报告器细胞系，并增加疫苗株的生产。已经证明，使用RNA干扰，减少与免疫反应相关的哺乳动物细胞中某些基因的活性，可以增加EV71（脊髓灰质炎病毒和肠病毒71）的增长高达80倍。发现通过使用CRISPR基因编辑技术敲除EP300（组蛋白乙酰转移酶p300）和ZNF205（锌指蛋白205）等基因，可以增加病毒颗粒的产量。类似的研究描述了通过敲除单个Vero细胞宿主基因实现轮状病毒增长18倍的增加。通过敲除BST-2（骨髓基质抗原2）基因，阻断病毒从细胞中的释放，获得了有希望的结果。一些具有脂质包膜的病毒，如MHV68（小鼠γ疱疹病毒68）、猪流行性腹泻病毒、流感病毒和牛痘病毒的释放，在BST-2基因敲除的动物细胞系中显著增加。这项研究的结果显示，这种方法可以增加许多病毒的生产。许多病毒的复制与细胞破坏有关。例如，腺病毒科的成员通过p53非依赖机制启动细胞死亡。在这方面，增加细胞培养的灵敏度的一个有趣的方法是生成抗凋亡的细胞培养。凋亡是一个多组分机制，涉及半胱氨酸蛋白酶或AIF1（同种异体炎症因子1）在半胱氨酸蛋白酶非依赖途径中。敲除所有这些基因是必要的，以抑制这种机制。这个问题通过CRISPR/Cas9技术解决了，其中使用了几个sgRNA，导致这些基因从HEK293T细胞系中移除。进一步的分析表明，携带促凋亡蛋白的病毒颗粒比在标准细胞系中更有效地产生。可以得出结论，细胞培养后的病毒分离和CPE测定是生物样本中病毒鉴定最常用的方法，提高细胞培养灵敏度的现代方法非常有希望。然而，值得讨论的是这种方法目前存在的不足。基于CPE的斑点形成单位（PFUs）的定量是量化不同病毒水平的广泛方法，但这种方法是费力的；例如，大多数病毒家族需要长时间的复制（长达一周），细胞培养在特定条件下进行（湿度、介质的pH值）。此外，病毒的培养需要在处理病原体时采取某些安全预防措施。此外，大多数标准病毒检测协议包括在感染后几天的细胞固定免疫染色。此外，这种方法基于使用合适的细胞系和应用其他病毒检测方法，例如使用抗体检测病毒。由于样本中病毒颗粒计数通常很低，抗原检测抗体并不总是可用的，隔离和生产病毒颗粒需要多次尝试，并且需要开发对病毒感染具有增加灵敏度的细胞系。因此，这种方法不提供快速结果。此外，一些病毒（即拉沙病毒）显示出非常低的PFU值，因此CPE方法的应用无用。即使在广泛的细胞系中相对容易生长的病毒也可能耗时且昂贵。 3.报告器细胞系 为了使基于细胞培养的方法更简单、更具信息性和更方便，已经开发了报告器细胞系。报告器细胞系包括在病毒感染后产生报告蛋白的特定细胞。报告器应对感兴趣的病毒非常特定，以允许研究人员检测特定病毒。病毒感染后，病毒蛋白识别报告构建物作为病毒基因组或嵌合蛋白，并产生可检测的信号。报告器细胞系对病毒学研究和疫苗制造非常有用。尽管基于报告器的方法可能需要生长活病原体病毒，因此限于具有特定生物安全级别的实验室，但它们易于扩大规模，比标准病毒学方法劳动强度小，从而大大增加了传染性病毒的检测。这种方法导致了快速、客观的病毒定量研究，包括评估病毒滴度、抗病毒敏感性和中和滴度。使用报告器细胞系与传统基于活病毒的方法相比具有几个相当大的优势。首先，该方法比其他基于活病毒的方法更快。在这种方法中，不需要耗时的培养和免疫染色技术，结果可以在12-48小时内获得。另一个优势是报告器细胞系可以检测少量感染的细胞。例如，显示水痘-带状疱疹病毒荧光素酶活性的报告器细胞系可用于检测每个样本少于10个感染的细胞。报告构建物的关键特征是报告基因。荧光蛋白和酶如β-半乳糖苷酶或荧光素酶可以作为报告基因。值得注意的是，根据它们的基因组结构和生命周期，用于检测不同病毒家族的报告活性的研究中使用了各种元素。在宿主核中复制的负链RNA病毒（正黏病毒，丝状病毒）已使用称为minigenome的构建物进行检测。具有（+）RNA基因组的病毒（阿尔法病毒或丙型肝炎病毒）的报告系统也涉及可以被病毒蛋白识别的minigenome构建物。然而，这组病毒使用了不同的方法。一些具有RNA（+）基因组的病毒（黄病毒和小肠病毒）编码一个包含结构和非结构蛋白的大多肽。这个多肽通过宿主和病毒蛋白酶进一步加工成单个蛋白。当报告器在病毒蛋白酶切割肽的特定位点时被激活，可以检测到病毒感染。逆转录病毒和具有DNA基因组的病毒（疱疹病毒）可以通过带有病毒启动子调节的报告构建物的质粒稳定细胞转染来检测。报告盒的转录是由病毒进入启动的。下面，我们将考虑一些目前在病毒学中用于检测不同病毒家族的报告器细胞系的发展。这些研究可以为基于先前表征的属于同一类别的病毒的报告构建物组装方法的相似性，为新型病毒的检测系统的发展提供基础。 3.1.用于ssRNA(-)基因组病毒检测的报告器细胞系 3.1.1.正黏病毒科，流感病毒 流感A和B是广泛传播的病毒，负责人类年度流行病，并与巨大的经济损失有关。流感根据其神经氨酸酶和血凝素类型分为不同的亚型和株。在生物样本中准确和快速地检测这些病毒对于病毒感染诊断和疫苗制造至关重要。报告器细胞系概念首次应用于流感病毒。几年后，李等人为流感A和B病毒开发了报告盒。流感病毒激活的报告器细胞系技术用于研究包括生成一个可以在病毒复制响应中产生任何信号的报告系统。流感A和B病毒的基因组分为八个片段。在感染期间，病毒聚合酶复合体的蛋白和NP核蛋白参与产生RNA(+)链和病毒基因组复制。为了激活这些过程，需要顺式作用元素，这些元素是非翻译的保守区域，在基因组流感病毒RNA序列的末端（50 -和30 -UTR）。用于细胞中的流感病毒A的报告构建物包含位于NP基因组片段的50 -和30 -UTR之间的荧光素酶或GFP（绿色荧光蛋白）编码区域。该构建物克隆到质粒DNA（pDNA）中，并由聚合酶I启动子和终止子元件驱动，生成RNA在50 -或30 -末端没有额外的核苷酸。线性化的pDNA整合到宿主细胞基因组中（图1）。这个构建物在感染期间模仿病毒基因组片段，报告基因表达是使用病毒聚合酶复合体实现的。通过类似方法生成了流感B病毒的报告系统。从HEK293T、BHK-21和MDCK细胞中获得了报告器细胞系。使用一组呼吸道病毒，评估了报告蛋白的激活特异性。特异性诱导很高，流感A和B病毒之间有轻微的交叉激活。尽管在报告器细胞系和MDCK细胞中确定的TCID50相似，但报告器细胞系在获得结果的时间减少（从六天到两天）、增强的客观性和减少繁琐的实验程序方面有明显的优势。这些报告器细胞系已成功用于抗体中和和抗病毒敏感性实验。 图1. 用于ssRNA（-）基因组病毒检测的分子报告器系统。报告器系统的原理基于不带有帽子和polyA尾的mRNA的产生。这样的RNA模仿病毒基因组。核糖酶水解RNA或RNA聚合酶I启动子。这个转录物模仿（-）病毒RNA，允许它使用病毒蛋白进行复制。报告蛋白的转录发生在以这种方式获得的（+）RNA上。3.1.2.丝状病毒科，埃博拉病毒 埃博拉病毒是一种丝状病毒，它在中非广泛传播，并在西非和欧洲出现。埃博拉病毒感染以急性发热为特征，死亡率约为50%。如前所述，分子方法非常有用，但结果不允许检测感染性病毒。这使得评估特定病毒分离株的致病性并预测对埃博拉病毒研究非常重要的爆发变得困难。标准基于细胞的方法在埃博拉病毒研究中也存在限制，包括在获得结果之前的14天期限。所有这些特征是开发报告器细胞系的关键先决条件。基于负义minigenome的埃博拉病毒检测的报告器细胞系得到了发展，该minigenome由细胞RNA聚合酶II转录的组成型巨细胞病毒（CMV）启动子调控（图1）。添加锤头核糖酶（对应于核糖酶A的一些修改）使mRNA模仿埃博拉病毒基因组。因此，目标转录物没有帽子或聚腺苷酸化。因此，组装了一个由以下顺序排列的功能组件组成的嵌合minigenome：最小病毒启动子、埃博拉病毒RNA的50-UTR、绿色荧光蛋白序列和病毒RNA的30-UTR。该构建物两侧是两个核糖酶。构建的盒式结构通过PiggiBac转座子整合到VERO-E6细胞系基因组中。minigenome的转录由病毒复制复合体介导，产生报告蛋白。该系统对不同种类的埃博拉病毒有效，不与密切相关的马尔堡病毒发生交叉反应。将这种基于细胞的方法与用于病毒定量的免疫荧光测定法进行比较，表明它们具有相同的效率。此外，测试了临床样本，该测定法在报告细胞中产生了阳性结果。 3.2.用于ssRNA(+)基因组病毒检测的报告器细胞系 3.2.1.甲病毒科，阿尔法病毒 阿尔法病毒亚科包括辛德比斯病毒，它会导致人类严重发热。病毒的非分段基因组由两个功能区域组成。多聚蛋白的直接翻译，随后被病毒蛋白酶进一步加工，从ssRNA(+)的第一部分开始。这些蛋白对晚期蛋白的转录和病毒基因组的复制是必需的。晚期或结构蛋白由ssRNA(-)转录的亚基因组RNA编码。辛德比斯病毒基因组的cDNA克隆是报告器细胞系发展的第一步。报告构建物基于辛德比斯病毒亚基因组RNA的cDNA。报告盒在Rous肉瘤病毒长末端重复（LTR）启动子的控制下，克隆到质粒中，可以在细胞中恒定表达。这个转录物模仿ssRNA(+)，由晚期启动子和萤火虫荧光素酶ORF组成，两侧是病毒顺式作用元素（图2）。当细胞被病毒感染时，产生识别顺式元素的非结构病毒蛋白，合成ssRNA(-)。这个RNA是合成亚基因组RNA的模板。这些过程模仿病毒生命周期阶段。荧光素酶的翻译从人工亚基因组RNA的晚期启动子开始。表达这个报告盒的质粒转移到BHK细胞中，并获得了对G418有抵抗力的稳定转化体。在辛德比斯病毒复制水平高的情况下，报告蛋白活性在长达4小时的时间内被检测到。此外，应注意，荧光素酶测定与CPE测定等效且同样敏感。然而，在感染后26小时检测到荧光素酶活性时，没有观察到CPE。尽管辛德比斯病毒不被认为是严重的人类病原体，其他与阿尔法病毒更密切相关的病毒（东部/西部马脑炎病毒）和更远亲的病毒（风疹病毒）是重要的病原体，并且对于检测这些病原体，开发特定和准确的技术非常感兴趣。报告系统方案基于这些病毒从亚基因组(+)RNA合成结构蛋白作为病毒复制产物的能力。在第一阶段，细胞中会产生模仿病毒(+)RNA的mRNA。在感染期间，(+)RNA被病毒蛋白识别并复制形成(-)RNA副本。在下一步中，这个(-)RNA作为亚基因组(+)RNA转录的模板链；晚期启动子被病毒蛋白激活，可以合成报告蛋白。 图 2. 针对具有亚基因组RNA检测的正义单链RNA病毒的分子报告系统。 3.2.2.甲病毒科，风疹病毒 风疹是一种严重的传染性病毒感染。尽管这种病毒引起的疾病在儿童和成人中大多是轻微的，但在怀孕期间，它可能导致死产或胎儿畸形。因此，当怀疑感染风疹时，需要准确诊断。目前，风疹病原体的诊断基于血清学方法和逆转录PCR（RT-PCR）和基于PCR的方法。然而，由于风疹病毒在细胞培养中没有明显的细胞病变效应，因此在细胞培养中分离活病毒进行进一步研究是一种非常费力的方法。因此，这种病毒的检测方法基于风疹病毒和肠道病毒（例如，柯萨奇病毒，回声病毒的成员）的共感染10天，有明显的CPE。当这些病毒共同培养时，由于风疹病毒诱导的干扰素的产生，细胞病变效应和肠道病毒的复制会减少，这表明宿主细胞中存在这种病原体。已经开发了一种具有特定报告器的风疹病毒细胞系，以便于使用基于细胞的方法进行研究，而无需添加辅助病毒。与其他甲病毒一样，风疹病毒基因组由ssRNA(+)组成，分为两部分。第一部分编码病毒RNA复制所需的早期蛋白，第二部分编码病毒粒子的结构蛋白。报告构建物基于基因工程亚基因组RNA（图2）。这个RNA在非结构蛋白领域有一个600 bp的缺失，以防止在没有野生型病毒的情况下合成报告器。结构蛋白区域被完全替换为报告蛋白（氯霉素乙酰转移酶（CAT）或绿色荧光蛋白（GFP））。ssRNA(-)转录成亚基因组RNA已经在体外合成，并通过转染到VERO细胞系。报告蛋白表达仅在对特定病毒感染有反应时发生。这种方法已经证明对实验室株和临床样本中的病毒都敏感。 3.2.3.黄病毒科，丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒（HCV）引起严重的急性或慢性肝损伤。HCV感染发展为慢性肝炎，与肝细胞癌高度相关。估计有7100万人患有慢性丙型肝炎病毒感染。丙型肝炎在临床样本中使用基于PCR和免疫学方法进行检测，提供足够的诊断精度。然而，为了研究活病毒的性质，需要基于持续细胞系的方法。由于丙型肝炎病毒在标准细胞培养中难以复制，因此开发了基于基因工程构建物和细胞系的各种方法，模拟不同的病毒生命周期阶段。其中一种方法是通过细胞系中的报告盒来响应病毒进入和感染。此外，有必要为HCV研究和抗病毒药物开发研究开发一种新的基于细胞的方法。许多基于HCV的报告系统基于特定的病毒蛋白酶活性。病毒基因组是一个翻译成多聚蛋白的序列。为了处理成熟的病毒蛋白，多聚蛋白被病毒和细胞蛋白酶切割。下面提供了为丙型肝炎病毒开发的双报告系统的描述。由人巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的报告构建物由绿色荧光蛋白（GFP）组成，与分泌型碱性磷酸酶（SEAP）通过HCV NS3/4A蛋白酶的NS4A/B连接位点相连。将开发的报告系统传递到肝癌Huh-7细胞和来自Huh-7细胞的Ava5细胞中，使用慢病毒转导。几周后，选择稳定转化体。在病毒感染期间，病毒表达HCV NS3/4A蛋白酶，并将报告蛋白分开，这些蛋白被检测到（图3）。通过荧光检测、磷酸酶活性分析和西方印迹分析确认了这两种蛋白的存在。在其他研究中，SEAP基因被荧光素酶基因替换。 图3. 用于带有基因组多聚蛋白检测的ssRNA(+)基因组病毒的分子报告器系统。报告器系统基于特定病毒蛋白酶在处理原始病毒多聚蛋白以产生最终蛋白中的蛋白酶切割。报告蛋白在病毒蛋白酶的切割位点与病毒蛋白结合，并在感染后释放。 另一种基于细胞的报告器方法涉及构建一个模仿病毒基因组的minigenome，该基因组被NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)识别，这是抗病毒治疗的共同靶标。报告构建物受CMV启动子控制。报告系统模仿病毒ssRNA(-)，由带有IRES序列的50病毒UTR、30病毒UTR和由核糖酶用于从宿主细胞合成的mRNA切割的反义方向的荧光素酶组成（图4）。在HCV感染期间，NS5B RNA聚合酶识别minigenome构建物中的未加工区域并合成ssRNA(+)，以IRES依赖的方式翻译成荧光素酶蛋白。该系统已转移到BHK-21和Ava5细胞中，并用于评估RdRp活性和研究RdRp抑制剂的有效性。因此，HCV报告细胞系可以成为研究HCV性质和寻找HCV治疗新化合物的有用工具。 图4. 模仿用于丙型肝炎病毒(HCV)检测的基因组的分子报告器系统。携带报告构建物所有元素的mRNA转录后，末端片段被核糖酶自我掐断。这样的mRNA模仿(-)RNA病毒基因组。病毒蛋白在感染期间识别此RNA并复制它。在(+)RNA链上，有一个用于报告蛋白合成的内部核糖体进入位点。 3.2.4.黄病毒科，黄病毒 登革病毒(DENV)和寨卡病毒ZIKV是人类病原体，能够引起大规模爆发。登革病毒感染的机制尚未完全了解。研究ZIKV和DENV感染对细胞过程的影响是必要的，以预测疾病的严重程度并开发针对性和有效的治疗方法。对这些感染的实验室研究存在与其他病毒家族相似的限制。通常使用免疫分析或基于扩增的方法检测DENV感染的细胞反应。例如，已经开发了一种用于感染细胞培养中DENV的免疫染色程序。然而，由于DENV蛋白不在细胞表面暴露，因此需要前固定和渗透细胞以准确检测病毒感染；因此，这种方法不允许观察活细胞中的感染。同样，识别细胞中ZIKV感染的基本方法依赖于带有固定和渗透的免疫染色程序。使用基于扩增的方法和测序的限制与其他病毒相同，不允许我们使用活病毒进行研究。为了实时观察DENV感染，开发了一种基于病毒蛋白酶活性的报告构建物的Vero细胞系。报告系统与丙型肝炎病毒的蛋白酶诱导报告盒高度相似（图3）；然而，报告蛋白通过NS3病毒丝氨酸蛋白酶识别位点与病毒蛋白NS4B的部分连接。所得到的细胞系被四种DENV血清型感染。检测到GFP表达，从而相应地检测到病毒感染的开始。因此，可以使用此报告器在不破坏细胞的情况下检测DENV感染。然而，这种方法存在一个问题：报告细胞系中编码的NS4B片段据报道会影响细胞功能（例如，抑制I型IFN信号）。已经使用了类似的方法来研究ZIKV感染。病毒NS4B蛋白编码序列和病毒蛋白酶切割位点与绿色荧光蛋白在组成型启动子的控制下克隆在同一开放阅读框中。肝细胞癌（Huh7细胞系）和腺癌细胞（A549细胞系）通过表达报告器的慢病毒颗粒进行转导。在生产寨卡病毒的感染细胞中，病毒蛋白酶NS2B和NS3与其切割位点相互作用，可以使用荧光显微镜检测GFP的表达。所描述的报告系统可以检测ZIKV的非洲和亚洲株，但相同的构建物不会被DENV激活。这个系统对ZIKV感染的研究非常重要。 3.2.5.小核糖核酸病毒科，肠病毒 肠病毒是包括许多种类病毒的属，如柯萨奇A和B病毒、回声病毒（肠病毒A和B）、脊髓灰质炎病毒（肠病毒C）和肠病毒68或72。这些病毒是人类病毒病原体中最普遍的。肠病毒是许多严重人类疾病的原因，如无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、心包炎和手足口病(HFMD)。水环境被肠病毒污染是肠病毒传播的主要原因，因为这种病毒在水中非常稳定，并且感染剂量低。肠病毒感染的大规模爆发使得有必要开发一个快速可靠的病毒监测系统。 传统的肠病毒检测和定量方法基于细胞培养中CPE的观察。然而，这种类型的测定非常费力，不能产生快速结果；因此，它不适用于常规应用。依赖逆转录PCR的分子方法对于检测病毒基因组等价物来说更加快速和准确。这种方法的限制在于它被认为是对病毒传染性能力的间接评估。 基于细胞的报告系统的发展代表了快速实验程序和揭示病毒性质及病毒感染细节的研究之间的折衷。肠病毒以及其他带有ssRNA(+)基因组的病毒产生特定蛋白酶，这些蛋白酶对成熟病毒蛋白的处理是必需的。其中之一是高度选择性和高效性的蛋白酶2A(2Apro)。因此，肠病毒的报告构建物基于使用这种蛋白酶特异性切割融合蛋白（图3）。该系统通过荧光共振能量转移(FRET)使用受体荧光蛋白EYFP(增强型黄色荧光蛋白)和供体ECFP(增强型青色荧光蛋白)之间的相互作用，它们由包含2Apro切割位点的短肽序列连接。编码供体和受体蛋白的盒式结构由组成型真核启动子驱动，克隆到表达质粒中。BGMK细胞转染了构建的表达报告系统的质粒，并获得了对G418有抵抗力的稳定转化体。在肠病毒感染期间，2Apro被表达并切割了其自身的特定位点。此后，两种荧光蛋白之间的相互作用被破坏，导致ECFP荧光强度增加。因此，可以在感染后大约7.5小时内检测到少量的病毒病原体。 所得到的报告细胞系对三种肠病毒感染显示ECFP荧光，并且不被不产生2Apro的甲型肝炎病毒(HAV)激活。据推测，这样的报告系统可以用于研究基于抗蛋白酶活性的抗病毒药物的开发。 3.3.用于逆转录病毒检测的报告细胞系 Retroviridae，慢病毒 慢病毒属的主要传染性病原体是牛免疫缺陷病毒（BIV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV会导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。AIDS会导致免疫系统逐渐功能障碍，并引发严重的感染和多器官功能障碍。BIV是一种与HIV在关键遗传和结构特征上相似的慢病毒。此外，BIV还是感染牛免疫系统功能障碍相关病理过程的原因。 确定病毒库中感染性颗粒的数量对于研究病毒生命周期阶段、开发病毒药物疗法以及在病毒基因组中寻找突变至关重要。可以从病毒的终点稀释中确定HIV库的定量滴度，但这些检测对于大量样本来说非常费力。因此，进行了专注于报告细胞系开发的研究。 在HIV研究中，细胞对HIV的敏感性是由细胞表面存在CD4（分化群4）受体所赋予的。第一条HIV报告细胞系是在20世纪80年代末开发的，基于转染的淋巴细胞系中的转录激活。CAT报告基因在HIV-1的LTR启动子的控制下克隆，并且可以被HIV Tat转录激活因子诱导（图5）。这些报告细胞被HIV激活，并且在较小程度上被人类T细胞白血病病毒4型和猴免疫缺陷病毒（SIV）激活。报告细胞系没有被马传染性贫血病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型，或单纯疱疹病毒1（HSV1）激活。另一种携带β-半乳糖苷酶基因的细胞系，作为HIV检测的报告基因，依赖于HeLa细胞。同样的方法被用来从人胶质母细胞瘤和猕猴乳腺肿瘤中产生HIV报告细胞系。此后，由HIV LTR驱动的GFP被用来生成改良的HeLa CD4细胞，用于检测HIV-1感染。 图5. 用于逆转录病毒和双链DNA基因组病毒检测的分子报告器系统。在未感染的细胞中，病毒启动子没有mRNA合成。当细胞感染发生后，病毒蛋白存在下开始转录和翻译报告蛋白。 然而，基于HIV LTR的报告系统有一些缺点。首先，这种系统在没有Tat的情况下表现出一定的基础表达水平。第二，它可能被细胞转录因子、细胞因子、增殖素甚至病毒包膜蛋白非特异性激活。有人提出，通过使用另一种调控蛋白Rev作为转录激活因子，可以解决这些问题。产生了一个新的含有GFP的构建物。使用荧光蛋白报告系统的优点在于其简单性，以及使用广泛可用的仪器检测和感染活细胞的能力。虽然GFP荧光信号在甲醛固定下是稳定的，但它也可以在未固定的活细胞中轻易检测到。GFP检测可以使用常规荧光显微镜和荧光素滤光片组合进行。此外，表达GFP报告蛋白的活细胞可以通过常规流式细胞术进行计数和排序。 基于RT-PCR的BIV检测方法已经推出。虽然这种病毒检测方法敏感且快速，但不能用于评估感染性病毒滴度，这是该方法的一个相当大的局限性。因此，采用了与HIV相同的方法来生产BIV的报告细胞系。报告细胞系基于可以被BIV感染的牛、犬和兔组织培养。CAT基因被用作报告基因，由BIV的LTR启动子驱动。在可检测到CAT基因基础表达的牛和犬细胞系中，细胞因子在LTR表达中起作用。然而，感染导致表达增加（50至80倍）。牛白血病病毒或牛合胞体病毒仅导致表达增加2至3倍。在BIV报告细胞系的进一步开发中，研究人员转而使用GFP作为报告基因，仍然由BIV LTR驱动。所得到的细胞系作为与BIV非常密切相关的病毒Jembrana病病毒的报告线发挥作用，但不是牛泡沫病毒的报告器。 目前正在使用基于细胞系的方法研究的另一种逆转录病毒是猿泡沫病毒（SFV）。基于BHK-21细胞构建了SFV的报告细胞系。获得了由SFV LTR驱动的β-半乳糖苷酶基因的报告细胞系。在这项研究中，使用了几种SFV菌株作为实验室适应菌株，并且还使用了来自两只黑猩猩、两只大猩猩和一只猕猴的血液中的天然菌株。在感染自体菌株后72小时内启动报告基因表达。另一种SFV菌株获得了相同的结果。细胞被证明是量化不同菌株的有效工具。作者表明，不同SFV菌株的复制速率在不同细胞中是不同的。 3.4.双链DNA基因组病毒 3.4.1.疱疹病毒科，单纯疱疹病毒 HSV-1型和2型感染在全球普遍存在。由疱疹病毒感染引起的发病率是一个重要问题。HSV感染可以引起一系列疾病，并改变感染者的免疫状态。此外，免疫功能低下的患者（AIDS患者、器官移植受者、白血病患者）的HSV感染会导致严重疾病。尽管HSV在哺乳动物细胞培养中繁殖良好，但由于必须对感染细胞进行免疫染色以识别抗原，因此病毒感染的检测是一个繁琐的过程，以便进行准确诊断。使用这种方法，在大多数情况下，可以在24至48小时内获得结果。在1990年代初开发了一种报告细胞系，允许更快地检测这种病毒。双链DNA病毒的报告系统与逆转录病毒的报告构建物类似（图5）。在这个盒式结构中，大肠杆菌LacZ基因被用作报告基因，克隆在HSV ICP6（HSV核糖核苷酸还原酶大亚基）启动子的控制下，进入一个表达真核载体。然后，使用设计好的报告构建物和携带新霉素抗性基因的质粒转化BHK细胞。为了获得稳定的报告细胞系，BHK细胞在含有选择性抗生素的培养基中培养。这种涉及病毒启动子的报告系统的便利性在于，HSV ICP6启动子在未感染的细胞中没有被激活，HSV的激活非常具体；因此，在同一培养物中容易区分感染和未感染的细胞。使用所描述的报告系统，通过β-半乳糖苷酶活性在接种后几小时内（最多6小时）发生感染检测。使用这种报告细胞系进行病毒检测的有效性与在病毒学研究中使用的标凈基于细胞的方法相当，例如斑点分析。两种类型的HSV都激活了所开发的报告盒，而其他Herpesviridae成员（人巨细胞病毒（HCMV）、带状疱疹病毒（VZV））的非特异性激活则没有发生。因此，指示细胞系可以为在细胞培养中快速观察HSV感染提供有用的方法。 3.4.2.疱疹病毒科，γ-疱疹病毒 最重要的γ-疱疹病毒种类之一是与卡波西肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV或人疱疹病毒8（HHV8））。这种病毒可以引起卡波西肉瘤，这是一种经常在AIDS患者中发展的癌症。通过基于细胞的方法研究病毒生命周期特征的一个障碍与病毒在大多数细胞系中难以培养的事实有关。因此，使用诸如确定病毒滴度这样的标准方法具有挑战性。因此，报告细胞系的开发基于至少在低水平上允许的细胞（HEK293T细胞、永生化内皮细胞、一些癌细胞系等。）。如前所述，基于PCR或基于ELISA的基因组等价物测量的分子生物学方法不能反映病毒的传染性能力。 用于指示细胞系开发的方法是使用以下方法。HH8基因组编码主要调节剂Rta，它激活一系列宿主和病毒启动子，并调节病毒生命周期中裂解程序的激活。Rta调节的启动子之一是多聚腺苷酸化核（PAN）RNA的细胞启动子。这个启动子片段可以被野生型病毒激活，并且lacZ基因被克隆到报告质粒中。然后，稳定转染HEK293T细胞。研究表明，HHV8病毒感染激活了报告盒，并且β-半乳糖苷酶活性水平是病毒剂量依赖性的。 3.4.3.疱疹病毒科，水痘-带状疱疹病毒 水痘-带状疱疹病毒（VZV）是水痘的原因，可能由于初次感染或感染细胞中病毒的再激活而出现严重并发症。可用的、快速的、针对性强的方法允许检测VZV是耗时和费力的，这使得开发针对性的病毒治疗和耐药菌株鉴定变得复杂。 基于病毒启动子特异性激活的VZV报告细胞系已经开发出来。测试了几个VZV启动子序列，最好的序列被证明是ORF9启动子，因为它具有特异性、强烈的激活。荧光素酶基因位于ORF9启动子的下游。质粒组装后，MeWo细胞和BSC40细胞被转染，并使用G418筛选稳定转化体。所获得的细胞克隆之一被用于进一步研究，因为它在对VZV的反应中显示出高荧光素酶活性，并且在没有VZV的情况下背景活性水平低。此外，在感染细胞和未感染细胞与报告盒共培养的情况下，报告器被激活。为了检测非特异性报告器再激活，细胞系被HCMV、人疱疹病毒6（Z29）和人疱疹病毒7（SB）感染。在所有这些情况下，都没有发现荧光素酶活性。然而，HSV1感染的指示细胞激活了荧光素酶活性，与VZV感染后24小时观察到的水平相似。然而，HSV1感染的细胞在感染后48小时表现出强烈的细胞病变效应；因此，荧光素酶活性降低，这使得区分HSV1感染和VZV感染变得可行。 4.结论  病毒检测方法包括一系列分子和细胞方法。基于细胞的方法在病毒学研究中占有相当大的部分。任何用于病毒检测的细胞系都必须具有灵敏度特征，这指的是易感性和许可性。通常，灵敏度是细胞被少量病毒独立于物种感染的能力。在实验室中，可以通过敲除细胞抗病毒反应基因或通过简单地在实验室收藏的不同培养物中选择敏感细胞系来实现许可性。易感性是细胞系被特定病毒种类感染的属性。在实验室中，可以通过增加病毒结合细胞受体的表达来增加易感性。改善这两个属性可以使细胞系成为病毒分离和研究的便捷工具。传统上，病毒感染的研究是基于CPE的基础上进行的，但这种方法并不适用于每种病毒，在这种情况下需要额外的耗时研究。这个问题已经通过使用携带分子传感器系统的细胞系来解决，这些系统允许通过存在容易检测的报告蛋白来检测感染性病毒代理。这种方法可以用于定量研究，作为CPE方法的更快的类似物。通过整合分子技术来提高分子报告器构建的灵敏度，可以实现病毒学中基于细胞方法的优化。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。