CFTR

Study to evaluate the safety and tolerability of KIT2014, an inhaled peptide therapy designed to enhance Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) function, act as a bronchodilator, and reduce inflammation KIT2014 is being developed as a CFTR enhancer, acting as an add-on treatment to existing CFTR modulators, targeting improved lung function and reduced inflammation in Cystic Fibrosis patients TURIN, Italy, Oct. 30, 2024 /PRNewswire/ -- Kither Biotech, a clinical-stage biotech company focused on innovative therapies for respiratory diseases, today announced the start of a Phase 1 clinical study of KIT2014, a novel inhaled peptide therapy for Cystic Fibrosis (CF). KIT2014 is designed as an add-on therapy to existing CFTR modulators and works by enhancing CFTR gating, promoting bronchodilation, and reducing inflammation through PDE3/4 inhibition. "The initiation of this Phase 1 study marks a significant step forward for Kither Biotech and the CF community," said Dr. Dimitrios Goundis, CEO of Kither Biotech. "KIT2014 addresses mucus obstruction, chronic inflammation, and bronchoconstriction-three critical challenges that affect CF patients even with current CFTR modulators. We are excited to begin assessing the potential of KIT2014 to improve treatment outcomes." About the KIT2014 Study This Phase 1 double-blind, placebo-controlled study will primarily evaluate the safety and tolerability of single and multiple doses of KIT2014 in healthy adult volunteers, followed by an assessment of pharmacokinetics. For more information, visit clinicaltrials.gov (NCT06659757). About Cystic Fibrosis Cystic fibrosis is a life-limiting genetic disease that affects approximately 130,000 people worldwide. It is caused by mutations in the CFTR gene, which lead to defective chloride ion transport across cell membranes, resulting in the buildup of thick, sticky mucus in the lungs. This mucus impairs mucociliary clearance, promotes chronic bacterial infections, and triggers persistent inflammation, leading to progressive lung damage. Unmet Medical Need for KIT2014 Despite significant advances from CFTR modulators, many CF patients continue to experience persistent inflammation and recurring infections, severely impacting lung function and overall health. Neutrophil-driven inflammation, marked by elevated levels of neutrophil elastase, remains a major contributor to lung damage in CF patients. KIT2014 addresses these issues with an innovative solution that directly targets this inflammation, reduces neutrophil activation, and provides an additional therapeutic benefit that complements existing CF treatments. KIT2014 has the potential to improve significantly long-term outcomes for CF patients. Mechanism of Action of KIT2014 KIT2014 is a peptide-based therapy designed to target these fundamental issues by acting on multiple pathways in CF lung disease. Delivered through inhalation, it allows direct targeting of the lungs. By inhibiting phosphodiesterase 3/4 (PDE3/4), it elevates cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels. In bronchial epithelial cells, this mechanism enhances CFTR gating and improves chloride ion transport, while in airway smooth muscle cells, it acts as a bronchodilator. Additionally, KIT2014 reduces neutrophil-driven inflammation through PDE3/4 inhibition. Together, these mechanisms position KIT2014 as a promising add-on to existing CFTR modulator therapies. About Kither Biotech Kither Biotech is a clinical-stage biotech company focused on developing innovative therapies for respiratory diseases. Kither Biotech's lead program, KIT2014, is an innovative inhaled peptide therapy aimed at enhancing CFTR function, providing bronchodilation, and reducing inflammation in CF patients. By targeting multiple pathways in CF lung disease, Kither Biotech is committed to addressing unmet medical needs and improving the quality of life for patients suffering from severe respiratory conditions. The company has successfully raised $26 million to date from investors including Claris Ventures, 2Invest, 3B Future Health, CDP Venture Capital, Italian Angels for Growth, Club degli Investitori, Ersel and ACE Venture. For more information, please visit and follow us on LinkedIn. SOURCE Kither Biotech WANT YOUR COMPANY'S NEWS FEATURED ON PRNEWSWIRE.COM? 440k+ Newsrooms & Influencers 9k+ Digital Media Outlets 270k+ Journalists Opted In GET STARTED

继今年3月，全球首款MASH新药——Resmetirom获FDA批准用于治疗伴有肝纤维化的成人MASH患者，填补了MASH药物的空白状态后，近段时间以来，国内MASH领域的“新药曝光度”有目共睹的在增加。  10月15日，微芯生物宣布，其研发的西格列他钠治疗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）的2期临床研究（CGZ203试验）摘要入选美国肝病研究学会年会（AASLD 2024），11月17日以口头报告形式公布。  10月18日，中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网公示，康弘药业1类THR-β新药KH629片获得临床试验默示许可，拟开发用于治疗成人非酒精性脂肪性肝炎。  为何沉寂40余年的MASH新药研究，短时间内俨然成为“流量”的代名词，成为众多药企争相入局的潜力市场，其背后又是怎样的底层逻辑使然？ 患病率高涨 MASH是临床需求愈发迫切 其实，与大多数肝脏慢性病不同，近年来非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的患病率不降反增，现阶段已取代乙肝成为我国最常见的慢性肝病。  资料显示，中国成年人中NAFLD患病率高达29.2%，10年内整体增长10%，中国MASH患病率约为2.4%～6.1%，我国NAFLD/MASH患者疾病负担极其沉重。据弗若斯特沙利文报告预计， 2030 年全球 MASH 患病人数将达到 4.9 亿人，全球MASH药物市场将达到 322 亿美元。  作为NAFLD中最严重的发展阶段，原理上MASH是一种与代谢紊乱相关的肝脏疾病，其特征是肝脏中脂肪的异常积累，伴随着炎症和肝细胞损伤，早年间被称为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。  40余年的相关研究下，人们对MASH的发病机制仍尚未完全明确，目前认为其乃是一种代谢应激性肝损伤，与多种因素相关，复杂的级联反应下的肝细胞损伤机制有以下几种，主要包括胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应和脂质代谢异常等多个环节。  在临床表现方面，MASH通常情况下起病隐匿且缓慢，且通常无症状，多于常规检查过程中无意发现，并且由于MASH通常情况下难以自发缓解，在早期无干预的情况下进展为肝纤维化的风险很高，大约有15%的患者会发展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。 临床药物缺乏 MASH传统治疗局限性大  在Resmetirom获FDA批准上市之前，全球尚无治疗 NAFLD/NASH 的靶向性药物，而由于MASH与肥胖、2 型糖尿病、高血压、血脂紊乱等疾病的密切相关性，目前普遍认为控制这些疾病可有效改善 NAFLD/NASH的代谢状态，从而延缓疾病进展。  因此，NAFLD以及MASH的治疗基础仍是生活方式的干预和饮食方案的优化，生活习惯的改善，尤其饮食的控制及锻炼减重等可减少肝脏脂肪沉积，有利于改善 MASH 的生化指标和肝组织学病变，相关研究显示，体重减轻 3% 即可改善 NAFLD患者脂肪肝病情程度，减重 7% 可改善肝脏炎症等组 织学指标，减重 10% 可逆转肝纤维化水平。  而在药物治疗方面，临床上主要针对抗胰岛素抵抗、抗氧化应激、降血脂、促进脂质代谢及保护肝细胞膜等对MASH进行治疗，如二甲双胍、维生素 E、熊去氧胆酸、FXR激动剂奥贝胆酸、肝损伤治疗药物等保肝药物的使用。  但同时，上述药物治疗方式的局限性也很大，一者药物的治疗剂量、有效性及安全性均尚不明确，有待进一步研究；二者，如奥贝胆酸等FXR激动剂的不良反应也极大限制了其在MASH领域的应用。  故现阶段的MASH临床治疗上，迫切需要一种副作用低、能逆转肝纤维化、患者顺应性佳的创新疗法。 四大方向 推动MASH机制逐渐清晰 就目前而言，通过对MASH的发病机制研究，目前已有多款靶点给予了MASH有效干预，是目前乃至未来MASH治疗的主要方向。从类型上来看主要分为代谢、消化、抗炎、抗纤维化四种方向：  代谢类：改善胰岛素敏感性、抑制脂肪生成各种酶、促进线粒体摄取脂肪酸等。 消化类：调控肝肠轴的循环、改善胆汁酸的循环与信号传导、改善肠道菌群的平衡等。 抗炎类：抑制炎症细胞聚集、阻断炎性信号传导、降低氧化作用和内质网应激反应、防止肝细胞凋亡等。 抗纤维化：针对肝脏中的星形细胞、减轻肝脏中胶原蛋白的沉积、增强纤维分解等。 而在这四种类型药物之下，又可以细分出不同的靶点选择，各靶点方向之下又存在不同的技术优势与产品差异。 数据来源：公开数据整理（点击查看大图） 据不完全统计，全球现有MASH在研疗法已突破350款。其中代谢类与消化类的数量最多，而前者主要机制集中于肝内，在逆转纤维化方面具有优势，而后者则是从肝外机制着手，在降低肝脏脂肪积累与纤维化进展方面优势明显，两者机制各有优劣，未来大概率会是协同合作的关系。  临床阶段方面，虽绝大多数创新疗法均集中在临床前阶段，但跨入临床阶段的产品依旧不少，其中以临床II期管线数量最多，共计108款；而进入临床III期产品则也有18款之多。 表1.MASH临床III期管线 药品名称 靶点 适应症最高阶段 原研单位 利莫纳班 rimonabant CB1 临床Ⅲ期 赛诺菲 依碳酸瑞格列净 remogliflozin etabonate SLC5A2 临床Ⅲ期 BHV Pharma Inc;格兰马克制药有限公司 沙格列扎镁 aroglitazar magnesium INS 临床Ⅲ期 Zydus Lifesciences Ltd 司美格鲁肽  semaglutide GLP-1R 临床Ⅲ期 丹麦诺和诺德公司 腺苷蛋氨酸 ademetionine Transferase 临床Ⅲ期 雅培制药 芦比前列酮 lubiprostone CFTR;ClC-2;PGE1 临床Ⅲ期 Sucampo Pharma LLC 佩玛贝特 pemafibrate PPAR-alpha 临床Ⅲ期 Kowa Co Ltd 塞拉德帕 seladelpar PPAR-delta 临床Ⅲ期 CymaBay Therapeutics Inc;强生创新制药 aramchol SCD1 临床Ⅲ期 Galmed Pharmaceuticals Ltd survodutide GLP-1R;GCGR 临床Ⅲ期 Zealand Pharma A/S;勃林格殷格翰 FXR314 NR1H4 临床Ⅲ期 Organovo Holdings inc 拉尼兰诺 lanifibranor PPAR-alpha;PPAR-delta;PPAR-gamma 临床Ⅲ期 Inventiva 可妥度肽 cotadutide GLP-1;GCGR 临床Ⅲ期 阿斯利康 瑟隆舍替selonsertib MAP3K5 临床Ⅲ期 美国吉利德科学公司 塞尼韦洛 cenicriviroc CCR2;CCR5 临床Ⅲ期 Tobira Therapeutics Inc;武田药品工业株式会社 ENB-106 / 临床Ⅲ期 上海轶诺药业有限公司 依鲁西夫明 efruxifermin FGF21 临床Ⅲ期 安进公司 norucholic acid / 临床Ⅲ期 德国霍克大药厂 数据来源：药智数据 三大靶点 引领MASH新药加速落地  就MASH在研药物靶点分布上而言，glp-1、FXR、THR-β、FGF19/21与PPAR是现阶段MASH最主要的在研药物类型。 数据来源：药智数据 从数量上来看，FXR激动剂、GLP1在研发热度上远超其他靶点，其在研数量也最多，目前均有超过30款相关疗法布局；其次是THR-β、FGF19/21与PPAR，分别有19、18与13款新药布局；其余靶点数量则相对较少，其临床阶段也相对靠后。  从趋势上来看，FXR激动剂虽然是MASH领域的老牌靶点之一，但由于靶点特殊作用机制，其在副作用上的局限性太大，直接影响了其在临床上的应用潜力。至少就现在而言，反而是glp-1与THR-β两种机制的MASH新药更受关注，未来也更容易占据头牌。 数据来源：药智数据 GLP-1  由于原理上GLP-1类似物能够有效改善糖脂代谢异常，因此GLP-1受体激动剂在糖尿病与减重适应症外，也被视为潜在的MASH治疗药物。 表2.GLP-1应用于MASH的创新疗法 药品名称 靶点 原研单位 适应症最高阶段 司美格鲁肽 semaglutide GLP-1R 丹麦诺和诺德公司 临床Ⅲ期 survodutide GLP-1R;GCGR Zealand Pharma A/S;勃林格殷格翰 临床Ⅲ期 可妥度肽 cotadutide GLP-1;GCGR 阿斯利康 临床Ⅲ期 替尔泊肽 tirzepatide GIPR;GLP-1R 礼来制药 临床Ⅱ期 RAY-1225 GLP-1;GIP 广东众生睿创生物科技有限公司 临床Ⅱ期 HEC-88473 FGF21;GLP-1R 东莞市东阳光生物药研发有限公司 临床Ⅱ期 派维度肽 pemvidutide GLP-1R;GCGR Altor BioScience Corp合作：Altimmune Inc 临床Ⅱ期 尤曲格鲁肽 utreglutide GLP-1R 印度太阳药业有限公司 临床Ⅱ期 巴度肽 bamadutide GLP-1R;GCGR 赛诺菲 临床Ⅱ期 依福培肽 efocipegtrutide GIPR;GLP-1R;GCGR 韩美药品株式会社 临床Ⅱ期 数据来源：药智数据 截止目前，随着人们对 GLP-1 的焦点由减肥向在抗 MASH转变之下，已有超30种GLP-1药物正在研究其治疗MASH的潜力，临床上推进较快的产品不少，较出名的产品有诺和诺德的司美格鲁肽、勃林格殷格翰的survodutide、阿斯利康的cotadutide、礼来制药的tirzepatide。  其中，Semaglutide与替尔泊肽作为GLP-1两大重磅产品，在关于MASH的治疗研究中均显示出减少肝脏脂肪积累、降低炎症水平的潜力，极大地振奋了行业对GLP-1作用于MASH的信心。  但与此同时，GLP-1在治疗MASH上的局限性也逐渐体现，即虽然在减少肝脏脂肪积累和纤维化方面的效果显著，但对逆转肝脏纤维化上却缺乏足够、全面、多维度的有效证据。这就导致GLP-1疗法单药治疗既无法完全满足现有的临床需求，也很难与其他疗法拉开差距。  对此，有关人士表示，GLP-1未来要想在MASH领域站稳脚跟，要么就逆转纤维化做出更多差异化成果，要么依靠肝外机制改善代谢紊乱的特点，与众多肝内机制的MASH疗法形成联动与互补，以协同策略解决MASH的临床需求。 Fxr（NR1H4） 作为曾经治疗MASH最重要的靶点，也是MASH早期阶段最主要的在研药物形式，FXR作为一种肠肝调节因子，不仅参与胆汁酸信号传导，调控胆汁酸合成和转运，还可以调节葡萄糖稳态、脂质和胆固醇代谢等其他生理功能以及抑制炎症，在MASH治疗上，目前已显示出一定的治疗效果。  截止目前，除已经宣布终止MASH适应症开发的奥贝胆酸外，领域内仍有超过30款Fxr激动剂涉及MASH适应症，其中Organovo的FXR314已进入了临床III期，是现阶段推进最快的Fxr激动剂；之后，还有10余款管线进入了临床II期，较受期待的有吉利德的cilofexor、诺华制药的nidufexor、东阳光药业HEC96719等。 表3.MASH中Fxr激动剂创新疗法 药品名称 靶点 原研单位 适应症最高阶段 奥贝胆酸 obeticholic acid NR1H4 Intercept Pharmaceuticals Inc 注册申请 FXR314 NR1H4 Organovo Holdings inc 临床Ⅲ期 昔洛法克索 cilofexor NR1H4 Phenex Pharmaceuticals AG;美国吉利德科学公司 临床Ⅱ期 尼度法克索 nidufexor NR1H4 诺华制药 临床Ⅱ期 HEC96719 NR1H4 广东东阳光药业股份有限公司 临床Ⅱ期 卓匹非索 tropifexor NR1H4 诺华制药 临床Ⅱ期 CS-0159 NR1H4 Van Andel Institute;中国科学院上海药物研究所;凯思凯迪（上海）医药科技有限公司 临床Ⅱ期 EDP-305 NR1H4 Enanta Pharmaceuticals Inc 临床Ⅱ期 TERN-101 NR1H4 上海拓臻生物科技有限公司;礼来制药 临床Ⅱ期 MET-642 NR1H4 Metacrine Inc 临床Ⅱ期 MET-409 NR1H4 Metacrine Inc 临床Ⅱ期 HPG1860 NR1H4 雅创医药技术（上海）有限公司 临床Ⅱ期 EYP-001 NR1H4 Poxel SA 临床Ⅱ期 数据来源：药智数据 而与此同时，虽然近年来Fxr激动剂领域用于MASH治疗的研究开发正在进入快速发展期，但临床获益有限，副作用严重等局限性也制约了其在临床上应用，最显著的例子就是奥贝胆酸，其2015年获FDA突破性疗法资格认定，是全球第一个进入临床3期的MASH候选产品，但最终仍因获益不确定性、副作用较大而折戟，经历多次被FDA否决后，最终无奈宣布终止其用于MASH领域的开发。  因此，对于Fxr激动剂整体而言，在保证创新疗法的有效性，研究机构未来更大的精力或将集中于创新疗法的不良反应的减少与安全性的提高上。  THR-β  THR-β是一种核激素受体，其主要在肝脏中高表达，能够调节脂代谢，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯和致动脉粥样硬化性脂蛋白，因此成为理论上MASH最具潜力的治疗靶点。  此外，THR-β还可以通过促进脂肪酸的分解和刺激线粒体的生物发生来减少脂肪毒性并改善肝功能，进而减少肝脏脂肪。这也是为何THR-β激动剂会具备调控多种肝脏代谢通路来治疗MASH的潜力的原因。其在MASH上的主要作用有以下5点：  调控脂肪合成 调控脂肪酸氧化作用 调控胆固醇代谢 调控线粒体功能 通过抑制TGF-β信号通路发挥抗炎和抗纤维化作用 2024年3月，Resmetirom成为首款获FDA批准上市的治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的新药，也是THR-β激动剂领域首款撞线的产品。 表4.MASH中THR-β激动剂创新疗法 药品名称 靶点 原研单位 适应症最高阶段 瑞司美替罗 resmetirom THRB Madrigal Pharmaceuticals Inc;罗氏制药 批准上市 VK-2809 THRB Ligand Pharmaceuticals Inc;Viking Therapeutics Inc 临床Ⅱ期 ASC41 THRB 歌礼制药有限公司;甘莱制药有限公司 临床Ⅱ期 TERN-501 THRB 上海拓臻生物科技有限公司 临床Ⅱ期 HSK-31679 THRB 海思科医药集团股份有限公司 临床Ⅱ期 ALG-055009 THRB Aligos Therapeutics Inc 临床Ⅰ期 ASC-43-F THRB;NR1H4 歌礼制药有限公司;甘莱制药有限公司 临床Ⅰ期 RJ-4287 THRB 南京奥利墨斯医药科技有限公司 临床Ⅰ期 Kylo-0603 THRB 厦门甘宝利生物医药有限公司 临床Ⅰ期 CS-060304 THRB 凯思凯迪（上海）医药科技有限公司 临床Ⅰ期 CS-060380 THRB 凯思凯迪（上海）医药科技有限公司 临床Ⅰ期 数据来源：药智数据 Resmetirom的成功获批一方面为MASH患者的治疗提供了新手段，同时另一方面也证明了THR-β激动剂路线的可行性。  也正是因此，THR-β激动剂成为全球MASH新药研发的主要集中方向，多款THR-β激动剂紧随其后，均表现出不俗的潜力，目前临床阶段进展较快的主要有四款，分别是Ligand的VK-2809、歌礼制药的ASC41、拓臻生物的TERN-501以及海思科的HSK-31679，均已进入了临床II期。  而更值得注意的是，THR-β激动剂也是目前国内MASH在研新药最集中的方向，处于领先地位（临床进度靠前）的创新疗法数量远高于其他几种类型。未来，不出意外的话，国内在该领域的突破大概率也将集中此，或许还有望领先于海外药企，成为MNC争夺的关键。 小结  纵观MASH领域40余年的发展历史，从致病机制的不断完善，到临床上的对症治疗出现，再到今年首款新药获批上市，MASH的新药研发充满坎坷。  但随着MASH新药研发的四大机制方向、10余款创新靶点的逐步落地，领域内似乎正在逐渐形成一个系统化、宏观化的研发格局，过程中不断有更多如GLP-1、THR-β等全新的疗法加入，至少目前看来俨然一副百废待兴，可大展拳脚的状态。  而对于国内药企而言，虽然某种程度上做不到如海外一般全赛道布局，但在个别如THR-β激动剂等潜力领域的优势却反而更大，或许这种强调聚焦的国内赛道模式，未来或许真能让中国企业站上国际舞台，成为MASH领域的龙头之一。 来源 | 博药（药智网获取授权转载） 撰稿 | 头孢 责任编辑 | 八角 声明：本文系药智网转载内容，图片、文字版权归原作者所有，转载目的在于传递更多信息，并不代表本平台观点。如涉及作品内容、版权和其它问题，请在本平台留言，我们将在第一时间删除。 商务合作 | 王存星 19922864877（同微信）  阅读原文，是受欢迎的文章哦

近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。上篇我们了解到基因治疗的背景和AAV生物学基本概念，接下来咱们继续深入剖析基因治疗递送载体AAV-载体开发。 rAAV的衣壳序列和基因组（包括启动子、外源基因、增强子和ITRs等），都在被深入研究。本篇将介绍rAAV的衣壳和基因组开发策略，以提高AAV的感染效率、组织特异性和治疗基因的表达效率。 AAV衣壳设计 衣壳设计是为不同临床应用开发定制rAAV的主要策略。它主要包括三种方法：鉴定自然存在的AAV变体、理性设计和定向进化（图1）。最近，AI辅助进化已成为rAAV衣壳设计的新工具。 图1 开发新型AAV变体的策略。a 可以从人类和小鼠等非人灵长类动物（NHP）组织中通过多轮PCR和高通量测序分离出自然存在的AAV变体。b 利用AAV生物学的知识进行合理设计，修改AAV衣壳中的相关氨基酸，以增强转导能力或逃避免疫监视。c 定向进化是一种工程方法，用于开发具有特定组织/细胞特异性的新型AAV变体，包括随机或特定的肽段插入、衣壳重组、易错PCR和饱和突变。d 通过计算机模拟方法利用已知的衣壳序列重建AAV衣壳氨基酸序列。通过对大量AAV变体转导样本数据集的学习，预测AAV基因组中特定序列与包装能力和组织靶向性之间的关系。 01 鉴定自然存在的AAV变体 在早期阶段，人体组织是发现新AAV的关键来源。从1965年到2004年，有限数量的AAV主要从人类临床样本中分离出来，随后被转化为载体并进行了测试。AAV9最初是从人类肝脏组织中发现的，但由于其能够穿越血脑屏障（BBB），且对大脑有强烈的嗜性，因此成为中枢神经系统（CNS）转导的常用载体。AAV7和AAV8是从恒河猴的心脏和淋巴结中分离出来的，对骨骼肌和肝脏有出色的嗜性。 研究表明，40-80%的人对已知的野生型AAV血清型有抗体，这强调了发现更多血清型AAV的必要性。研究人员已经在人类和非人灵长类动物之外的物种中筛选AAV血清型，以找到新的衣壳，避免人类AAV预存抗体的中和效应，但这些AAV在人类中的转导可能有限。因此，发现人类来源的AAV变体，并筛选转导效率高，具有特定组织嗜性的候选者已经成为一种常见的方法。AAVv66，一种通过长读长测序从人类样本中分离出来的AAV2变体，具有比AAV2更高的产量和CNS转导效率。这些发现表明，鉴定自然存在的AAV变体可以为改善组织特异性转导提供有价值的工具。虽然只有少数团队还在鉴定和评估自然衣壳变体作为基因治疗的潜在载体，但源自野生型AAV血清型的rAAV仍然是当前临床研究中的主要选择。 02 理性设计 理性设计方法涉及对rAAV衣壳的特定位点进行结构修改，需要对rAAV的结构和生物学有一定的理解，常用的三种关键方法包括：遗传突变、插入功能结构域以改善组织亲和力，以及化学修饰。有研究探索了特定氨基酸残基对rAAV转导效率的贡献，发现rAAV2衣壳表面的酪氨酸残基的磷酸化会导致它们在入核前被降解，而将这些残基修改为苯丙氨酸（Y444F/Y500F/Y730F）可以增加rAAV2在中枢神经系统中的基因递送效率。虽然rAAV2不能通过玻璃体内注射转导光感受器，但含有特定残基替换（Y272F/Y444F/Y500F/Y730F/T491V）的变体实现了高达25%的光感受器细胞感染。此外，改变表面暴露的残基可能实现组织去靶向，从而提高安全性。例如，在黑猩猩组织样本中发现了H527Y和R533S的替换，如果将这种替换引入至rAAV9衣壳，在新生小鼠和一种致命性儿科白质营养不良症小鼠模型中，当AAV的导入方式为静脉注射时，rAAV9在外周组织的感染更少。 另一种理性设计方法是将功能结构域引入rAAV衣壳的特定位点。一项研究通过插入人类黄体生成素受体（LH-R）的15个氨基酸结合域，成功地在卵巢癌细胞中实现了与HSPG无关的通过LH-R的转导。另一项研究通过在rAAV9衣壳中插入细胞穿透肽，成功鉴定出两种变体，它们能够在系统给药后穿越血脑屏障（BBB），并改善了中枢神经系统的感染。宿主免疫反应是rAAV能够诱导有效和长期转基因表达的主要障碍。结构研究表明，rAAV衣壳上的中和抗体（NAbs）识别位点可能是保守的。根据冷冻电子显微镜（cryo-EM）图像显示的rAAV1衣壳与三种小鼠单克隆抗体复合物的结构信息，工程化的rAAV变体能够逃避小鼠、非人灵长类动物和人类血清中的NAbs。将rAAV衣壳与生物素-聚乙二醇（PEG）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）结合可能有助于逃避NAbs，尽管这可能会改变rAAV的组织嗜性，降低感染效率。一项研究使用域交换技术从rAAV2和rAAV8生成了27个嵌合体衣壳，并证明了rAAV8的肝脏嗜性与第四环域相关。此外，在AAVrh10的可变区域VIII中插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）整合素结合基序，可提高心脏特异性感染效率并减少肝脏分布。 不改变rAAV衣壳氨基酸组成的化学修饰是衣壳工程的一个有前景的方法。对表面氨基酸的微小修改可以改变受体结合亲和力，从而影响感染和嗜性。一项研究使用带有亲电性琥珀酰亚胺丙酸功能团的聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺（PEG-NHS）与rAAV2衣壳上的赖氨酸残基交联，以逃避中和抗体（NAbs）。研究发现糖化的rAAV2与肝素和单克隆抗体A20的结合减少，导致其在肌肉中的转基因表达显著提高。一项研究将抗骨骼肌特异性蛋白CACNG1的抗体共价结合到rAAV9衣壳的可变区域，导致工程化的衣壳能够在小鼠肌管中特异性表达转基因，与未结合抗体的rAAV9相比，肝脏靶向性降低。同样，另一项研究工程化了一个rAAV9和rAAVrh74的混合衣壳，可以特异性结合在骨骼肌表达丰度较高的受体整合素αVβ（AVB6）。一个由此产生的变体，LICA1，在人类肌管和小鼠杜氏肌营养不良症（DMD）模型的骨骼肌中显示出更强的感染性。此外，还可以通过遗传密码扩展技术来实现对rAAV衣壳的化学修饰。遗传密码扩展技术允许研究者在蛋白质中特定位置引入非天然氨基酸（ncAAs），从而赋予蛋白质新的或改变其原有的功能。最近的一项研究使用了这种方法，通过工程化的正交原核tRNA/tRNA合成酶（正交意味着这些tRNA和tRNA合成酶对不会与宿主细胞中已有的tRNA和tRNA合成酶发生相互作用，从而避免了非目标氨基酸的掺入）插入单个ncAAs来工程化一类新的rAAV，称为Nε-AAVs。这些突变的Nε-AAVs成功地与功能分子结合。体内研究表明，在异种移植动物模型的目标细胞中，与Nε-AAVs结合的功能分子导致了高度特异性的摄取。另一项研究还表明，在AAV5衣壳的D374位置整合一个ncAA可以增强其在小鼠肺部的特异性感染。尽管取得了这些进展，但理性设计方法仍受到我们对rAAV结构和生物学不完全理解的限制。 03 定向进化 定向进化通过模仿自然进化的过程，人为设计的实验条件分离具有优势属性的衣壳变体，如更高的rAAV产量和感染效率、免疫逃逸或特定的细胞/组织嗜性。一种定向进化策略涉及诱导随机、无偏倚的突变，并对衣壳施加病毒适应性的选择压力。有研究通过使用易错PCR然后通过交错延伸以生成VP1-3的Cap突变体库，筛选对肝素亲和力发生改变且能实现免疫逃逸的变体。此外，基于DNA重组的方法，通过组合来自不同亲本AAV血清型的衣壳氨基酸序列，也被用来生成多样且广泛的随机嵌合体库。用这种技术构建的大量AAV变体在体外和体内都显示出广泛的细胞嗜性。饱和突变不同抗原印记也被用来工程化AAV8衍生的衣壳以逃避Nabs，改善肝脏嗜性。 在AAV衣壳上表面筛选随机肽段是定向进化的另一种方法。例如，基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）系统（图2）将短肽段插入到rAAV9衣壳上以改变其属性，已有研究用该方法成功获得了AAV-PHP.B。AAV-PHP.B在C57BL/6小鼠模型中表现出了优异的穿透血脑屏障（BBB）的能力，因此被广泛用于小鼠的中枢神经系统（CNS）研究。然而，后续的研究表明，AAV PHP.B的这种特性并没有在其它品系的小鼠和非人灵长类动物（NHPs）中得到相同的效果，这表明AAV PHP.B衣壳与宿主因素之间存在复杂的相互作用，而这些因素在不同物种之间可能存在差异。 图2  基于Cre从感染的靶细胞中恢复AAV衣壳序列。a  CREATE选择过程示意图。用PCR引入多样性（多色光谱垂直带）到一个衣壳基因片段（黄色），该片段被克隆到携带剩余衣壳基因（灰色）的rAAV基因组中，并用于生成病毒变体库，之后该库被注入Cre转基因动物体内，最后用PCR从Cre+细胞中选择性恢复衣壳序列。b  rAAV-Cap-in-cis-lox rAAV基因组。Cre颠倒了被lox71和lox66位点包围的聚腺苷酸（pA）序列。PCR引物（半箭头）被用来选择性扩增Cre重组序列。c  从两个Cre+或Cre-小鼠中恢复的衣壳库序列的Cre重组依赖性（顶部）和独立性（底部）扩增的PCR产物。d 示意图显示了Rep-AAP AAV辅助质粒内的AAV基因以及由cap基因编码的蛋白质。在cap基因中插入的终止密码子消除了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的表达。e 与用标准的AAV2/9 Rep-Cap辅助质粒+ rAAV-UBC-mCherry（中间）或AAV2/9 Rep-AAP + rAAV·UBC-mCherry质粒（底部）生产的病毒相比，使用分离的AAV2/9 Rep-AAP + rAAV-Cap-in-cis-lox质粒也能生成有DNase抗性的AAV载体基因组（vg）（顶部）（AAV基因组的DNase抗性是AAV在生产、纯化、储存和给药过程中过程中具有较高的稳定性的指标）。f 将7-mer衣壳库克隆到rAAV-∆Cap-in-cis载体中。g  AAV9表面模型显示了7-mer插入在氨基酸（aa）588和589（洋红色）之间的位置。黄色表示用PCR生成的库片段编码的位点（aa 450-592）。 随后，Voyager Therapeutics公司开发了一种名为TRACER（Tropism Redirection of AAV by Cell-type-specific Expression of RNA，通过细胞类型特异性表达RNA重新定向AAV的嗜性）的新型rAAV进化平台（图3）。这个平台的核心是基于RNA进行筛选，能快速发现穿透血脑屏障（BBB）并增强CNS嗜性的AAV衣壳。这一过程不需要转基因动物，因此可以用于多种物种，包括非人灵长类动物（NHPs）。一项在小鼠中的研究基于在rAAV9衣壳上展示的肽库，鉴定了十个优势变体，这些变体在系统给药后，大脑的转导效率比亲本rAAV9高了多达400倍。最近一个研究报道，VCAP-102，一种基于TRACER开发的rAAV9变体，在非人灵长类动物的不同大脑区域显示出比rAAV9高20-90倍的感染效率。对VCAP-102的迭代进化产生了新的衣壳变体，其BBB穿透性进一步提高了6-7倍。同样，基于TRACER开发的VCAP-100衍生物在非人灵长类动物中显示出比其亲本AAV5高六倍的大脑感染效率，而在的肝脏感染效率则降低了300倍，预示着更低的肝毒性。 图3 TRACER策略。（A）野生型AAV（顶部）和TRACER文库载体（底部）结构示意图。ITR，反向末端重复序列。Pro，启动子。虚线表示AAV内含子（顶部）或合成的CMV globin内含子（底部），实线代表次要（细线）和主要（粗线）衣壳转录本。底部显示了用于恢复2.8-kb衣壳文库扩增子的引物。（B）在TRACER平台中将CAG、SYN和GFAP启动子串联（左边）或单一启动子（右边）的活性。转基因被包装在AAV9衣壳中，并在HEK293T细胞或小鼠原脑细胞中进行测试（1E+5 vg/细胞，n = 3）。感染后48小时通过实时RT-PCR定量RNA。（C）肽展示文库的构建。在包含SYN或GFAP启动子的载体中，将由AQ、DG或DGT残基引导的随机序列引入至AAV9 VP1的特定位置。（D）体内选择过程示意图。（1）DNA文库用于生产病毒库，（2）将病毒文库通过静脉注射（i.v.）感染小鼠（1E+12 vg/只），（3）注射后28天从整个大脑中恢复大量RNA，（4）通过RT-PCR扩增编码肽库的衣壳片段，通过下一代测序（NGS）进行分析，然后克隆到TRACER载体中进行另一轮选择。（E）在注射SYN和GFAP启动子文库后28天，从三只小鼠中获得的RT-PCR产物示例（顶部和中间，分别）。底部：RT阴性对照。 DELIVER（Directed evolution of AAV capsids leveraging in vivo expression of transgene RNA, 定向进化AAV衣壳，利用体内表达的转基因RNA）策略是另一种开创性的方法（图4），该方法通过在体内筛选AAV衣壳变体，以实现对特定组织的高效递送。已经有研究者采用这种策略鉴定出一类含有RGD基序的衣壳，这些衣壳在小鼠和非人灵长类动物中通过静脉注射后，能够以更高的效率和选择性感染肌肉组织。进一步分析表明，目标细胞中表达的与RGD结合的整合素异二聚体与含有RGD基序的病毒变体有很强的相互作用。研究人员最近生成了一个嵌入RGD的7个氨基酸肽库，插入衣壳的可变区域VIII，并鉴定出一些新的AAV衣壳变体，其骨骼肌转导效率比基准衣壳增强了20多倍。 图4 DELIVER鉴定出一类含有RGD基序的肌肉趋向性AAV衣壳变体。（A）使用DELIVER生产病毒文库和选择衣壳变体的示意图。（B）使用含有ITR的质粒产生的rAAV滴度比较，这些质粒在CMV、CK8或MHCK7启动子的控制下表达AAV9衣壳编码序列。（C和D）在8周龄C57BL/6J小鼠的骨骼肌（C）和心脏（D）中，由CMV、CK8或MHCK7启动子控制表达的AAV9衣壳库mRNA的体内表达。病毒库感染方式为系统性注射，剂量为1E+12 vg/只小鼠。（E）图表显示在不同小鼠骨骼肌中，由MHCK7启动子表达的衣壳变体在DNA和mRNA水平上相对于病毒文库的富集情况。（F）在8周龄C57BL/6J小鼠肌肉中注射1E+12 vg病毒库后，经过第二轮基于转录本的选择，高度表达的衣壳变体中7个氨基酸的插入序列。每组中颜色相同的变体由同义密码子编码。变体的排序是基于每个变体在股四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、肱三头肌、腹肌、膈肌和心脏中的mRNA表达量之和。 定向进化是一个强大的工具，用于生成和识别具有特定属性的变体，虽然这些属性并不总是能够在灵长类动物中跨物种转化，如AAV-PHP.B在小鼠中显示出比AAV9更强的CNS感染，但在狨猴中则没有，这表明在衣壳工程中进行跨物种进化的必要性。然而，一项在多个物种中的顺序进化rAAV衣壳库的研究确定了rAAV.cc47作为一种强大的跨物种变体，与rAAV9相比，在非人灵长类动物的大脑和心脏中具有增强的感染能力。AAV2.7m8是一种AAV2变体，通过10个氨基酸的插入，在小鼠中通过玻璃体内注射能够强烈转导外层视网膜层，如光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞。使用ADVM-022（AAV.7m8-aflibercept）治疗糖尿病性黄斑水肿（DME）的II期临床试验（NCT04418427），接受高剂量【6.0 × 10^11病毒基因组（vgs）/眼】后16-36周内多名患者出现严重不良反应，包括难以治疗的眼内压降低，因此该临床试验暂停，这显示了工程化衣壳在该领域的转化挑战。 04 AI辅助设计 计算机辅助的rAAV工程是一种前沿的方法，它利用计算工具来辅助rAAV的设计和优化。各种研究已经从rAAV的进化谱系中探索了其多样的属性，并使用预测的祖先基因组重建来创造新的衣壳变体。有两项类似的研究通过合理设计或采用定向进化来计算建立祖先衣壳库。这两项研究都生成了具有更好的热稳定性的衣壳变体，热稳定性是血清型特征的一个指标，是显示临床应用潜力的生物学属性。在这些变体中，Anc80L65是一个有前途的载体，可用于内耳或眼睛相关疾病的基因治疗。 机器学习在生物医学研究中得到了广泛使用，包括医学图像分析、遗传学和药物发现。一项开创性的研究应用机器学习来理解rAAV2衣壳，从衣壳的适应度视角描述了单密码子替换，并使用机器学习来设计精确的多突变变体，这些变体基于它们对目标组织的影响。此外，深度学习已被用来多样化rAAV2衣壳变体，准确预测它们的活力。这种方法揭示了在衣壳之外工程化rAAV基因组的新可能性，这在未来的rAAV发展中具有创新应用潜力。 rAAV基因组设计 rAAV基因组由ITRs和转基因表达盒组成，后者包括感兴趣的基因和调控元件。rAAV基因组的设计策略包括修改ITRs或内含子，插入组织特异性启动子进行转录调控和/或使用可诱导表达系统，密码子优化，减少转基因cDNA的CpG基序，以及通过微小RNA（miRNA）介导的转录后调控重靶向等。这些元件各有其功能，它们各自和共同作用决定了转基因表达、细胞类型特异性、rAAV转导的安全性和持久性。 01 rAAV ITRs的设计 传统的rAAV携带单链载体基因组。其转导效率和速率取决于mRNA转录发生前载体DNA的第二链合成，这是限速步骤。为了提高转导效率，可采用突变其中一个ITR，生成具有双链载体基因组的自互补AAV（scAAV）的策略。scAAV可绕过dsDNA合成的限速步骤，更快、更高效地转导目标细胞。然而，使用scAAV有明显的局限性：较小的包装能力（scAAV为2.5 kb，而ssAAV为4.7 kb）以及由于转基因产物快速积累而导致的免疫反应风险的增加。 ITRs可以被改变，通过选择性地从两个相邻的ITRs中移除D序列，可以选择性地限制包装载体基因组的正链或负链。ITRs还包含CpG基序，可被toll 样受体（TLR）-9识别并诱发炎症反应。完全从ITRs中移除CpG并不会对治疗动物中载体基因组的拷贝数或转基因表达产生不利影响，然而，这会导致rAAV滴度的降低，并且尚不清楚是否能减少对rAAV的炎症反应。总的来说，ITRs可能是异质的，原因是ITRs天然容易发生突变，具有回文结构、高GC含量和二级结构。优化ITRs中的GC含量可能是一种潜在的改善rAAV属性的设计策略。 02 优化启动子 选择和优化转基因表达盒中的启动子可以满足特定的需求，如组织特异性和表达水平。常用的巨细胞病毒（CMV）或鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子可提供强大且广泛的基因表达，而组织特异性启动子如CK8或MHCK7则在肌肉中提供组织特异性的基因表达。组织特异性转基因表达对于实现低剂量下足够的转导效率和最小化脱靶效应至关重要。一项研究采用了携带内源性人类存活运动神经元1（SMN1）启动子的scAA9载体，以在神经元中特异性驱动SMN1的表达。这种方法显示了更好的安全性，显著降低了肝脏毒性，并在患有脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的SMNdelta7小鼠中增强了治疗效果。这一结果超越了使用CMV/CBA启动子被FDA批准的治疗方法Zolgensma的性能，从而强调了组织特异性启动子的优势。其它的调控元件，如添加上游增强子可以提高表达活性和特异性。许多增强子已被设计用于临床基因治疗载体中，目的是增加转基因表达，减少病毒剂量。另一项研究报告称，小鼠甲基-CpG结合蛋白-2启动子的一个片段在神经元中特异性地实现了强大的长期表达。 基于机器学习的多组学数据可以用于设计组织特异性启动子，使转基因活性在靶组织和非靶组织之间实现超过1000倍的动态增加。 03 转基因表达调控 转录调控：可以上调或下调感兴趣基因或蛋白的表达，以优化和微调所需的效果。四环素诱导系统是一种广泛使用的策略，用以实现特定水平的表达，虽然由于潜在的免疫原性问题，它不太可能被应用于人类。有研究开发了一种使用免疫抑制药物雷帕霉素来激活的反应性转录因子的系统，该系统最初由两个不同的rAAV递送，随后被优化成只需要一个rAAV就足够了。目前该系统已被用于对雷帕霉素处理的可诱导剂量-反应表达，以长期表达所需的转基因。重要的是，在没有给予雷帕霉素的情况下，转基因表达只有最小限度，表明这可能是一个特异且安全的调控系统。 转录后调控：一种策略是使用核糖开关（riboswitches），这是一类非编码RNA元件，主要存在于细菌mRNA的5'非编码区（5'UTR），但在真核生物mRNA的3'UTR及初始转录产物的内含子区段也有发现。核糖开关通常由两部分组成：适配体（aptamer）域和表达平台（expression platform）域。适配体域负责结合特定的小分子代谢物，即配体（ligand），而表达平台域则负责基因表达的调控。当特定分子（配体）结合适配体域时，会引起表达平台域的局部构象发生变化，从而打开或关闭下游基因的表达。核糖开关广泛存在于细菌中，它们在细菌的硫代谢、辅酶合成、氨基酸合成等基础代谢中发挥着非常重要的调控作用。迄今为止，已有20余类感应不同分子的核糖开关在细菌中被确认。目前核糖开关正被用来系统工程化哺乳动物基因表达调节器aptazymes，以改善其调控范围。使用核糖开关的优点包括与FDA批准的药物兼容、RNA的小尺寸，以及几乎没有免疫原性。重要的是，核糖开关序列非常短，这与rAAVs有限的包装能力相结合时尤为重要，使其成为调控rAAV基因治疗的强大系统。 非编码RNA是转基因调控中的多功能工具。将带有可切割的聚A信号（PAS）的RNA aptamers整合到转基因的5'-非翻译区（UTR）中，在没有小分子的情况下，PAS切割导致mRNA降解，从而沉默转基因表达；添加小分子时， mRNA的完整性得以维持，转基因可表达，可以将这种工具与可变剪接相结合，以更精确地控制基因表达。 一些调控系统需要外源性添加或共表达某些元件才能起作用。为了缓解这个问题，研究者们一直在追求使用药物诱导剪接作为基因表达调控的机制。这种方法涉及递送一个包含过早终止密码子的基因，以防止蛋白质的翻译。添加小分子剪接诱导剂有助于将一个特别设计的外显子包含到成熟转录本中，并排除终止密码子，从而使得感兴趣蛋白质的翻译成为可能。启动子的强度和诱导分子的剂量可精确激活目标基因的表达水平。然而，当前技术依赖于固有蛋白质周转机制来降低目标蛋白质的水平。 翻译后调控：调节感兴趣蛋白质半衰期的策略之一是使用蛋白质降解系统（degron），该系统允许对蛋白质的移除和恢复进行可逆和快速响应。一些研究已在体外建立degron系统，但在尝试将其转化为体内系统时发现存在较高的毒性。然而，通过优化已经生成了一些有前景的可应用于体内的系统，如在感兴趣蛋白质上结合一个SMASh (small-molecule–assisted shutoff) 标签，然后引入一种已经获批用于人类的小分子药物，以防止SMASh标签的分离，从而导致蛋白质的降解。结合可诱导表达系统、替代剪接策略和蛋白质降解方法，有可能实现对目标蛋白表达水平的精细控制。 04 优化转基因（转录后水平） 在表达盒优化中一个常见的方法是密码子优化，即使用计算机算法识别转基因中罕见或次优的密码子，并用更受偏好的密码子替换它们。研究已经证明，在小鼠模型中，对FVIII和人类囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）进行密码子优化后，其表达水平显著提高。此外，对Canavan病的致病基因，一种天冬氨酸酰酶（ASPA）的密码子进行优化，显著恢复了ASPA蛋白的表达，并在小鼠模型中挽救了致命的疾病表型。虽然密码子优化是提高rAAV递送的转基因表达的有效策略，但这种效果可能因特定的转基因和宿主生物而异。密码子优化方法可能会引入意外的免疫原性和毒性，以及损害其它特性，如嗜性。事实上，一项研究发现密码子优化在基于rAAV8的FIX Padua基因治疗中引入了大量CpG基序，这可能引发先天免疫反应。一项研究开发了一种新的基于循环神经网络的工具，该工具使用来自小鼠心肌细胞、神经元和肝细胞的数据，为特定细胞类型优化密码子使用，这种方法提高了蛋白表达水平并减少了CpG二核苷酸，为提高组织特异性基因治疗效率提供了希望。 05 修改其他顺式调控元件 在表达盒中修改其它顺式调控元件可以调节基因表达和特异性。例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）是一个约600 bp的RNA元件，通常添加在转基因下游。WPRE可以通过增加与转基因无关的mRNA转录量来提高体外和体内的转基因表达。有研究谨慎地报告了WPRE在小鼠中递送的慢病毒载体中潜在的致癌活性。然而，通过从原始WPRE中移除致癌序列，可以降低此类风险。 在转基因表达盒中包含内含子也可以改善动物中的基因表达。有研究表明内含子在体内可以将转基因表达提高40-100倍。然而，内含子对基因表达的影响可能是复杂的，取决于多种因素，如内含子的大小和位置以及特定的目标细胞。选择合适的polyA信号对于优化转基因表达和稳定性很重要【例如，β-球蛋白、SV40或牛生长激素（BGH）】。一项比较研究发现，修改后的SV40晚期polyA（135 bp）的较短版本在小鼠大脑中的转基因表达与BGH polyA（223 bp）相当。此外，包含Kozak序列可以进一步增强转基因表达。 确保仅限在目标组织中表达目的基因对于避免有毒性的过表达和免疫毒性至关重要。rAAV设计采用了细胞特异性启动子作为目标表达的主要策略，并进一步开发了微调策略，例如在3′-UTR中添加miRNA结合位点以抑制目标基因在表达互补miRNA的细胞中的表达。如在rAAV9中添加miR-122结合位点可以实现在中枢神经系统表达的同时减少靶向肝脏、心脏和骨骼肌。当rAAV携带外源转基因，或对患者体内发生无义突变的基因拷贝进行替代时，转基因产物可能被抗原呈递细胞（APCs）视为非自身抗原，然后APCs处理转基因产物，通过主要组织相容性复合体（MHC）进行提呈，启动免疫清除。减轻转基因免疫的一种策略是在rAAV的表达盒中结合APC特异性miRNA结合位点，如miR-142和miR-652，以抑制转基因在APCs的表达。结果显示，在小鼠中转基因特异性免疫反应减少，目标细胞中转基因表达持续。这种策略已在非人灵长类动物中转化，通过rAAV递送后，针对人类免疫缺陷病毒的NAbs得到了广泛持久的表达，突出了这种策略在临床转化中的潜力。 06 扩展rAAV包装能力 rAAV应用中的另一个重大挑战是递送超过其4.7 kb包装能力的转基因，如Leber先天性黑蒙症10型的中心体蛋白（CEP290）（约7.5 kb），或基于CRISPR的工具，如胞嘧啶碱基编辑器或先导编辑器2（超过5 kb）。为了克服这一障碍，可将大基因片段分成两部分，每部分都封装在rAAV衣壳中。这些分段的转基因被共同引入同一细胞，从而重组成全长基因和蛋白。这种重构可以在遗传信息流的不同阶段发生。在DNA水平上，可以通过rAAV ITRs、部分转基因序列或在两个rAAV基因组中都存在的优化的重组元件来促进载体间DNA重组。重叠序列可以在转录后通过特别设计的剪接信号被切除，产生成熟的全长mRNA，随后被翻译成所需的蛋白。在RNA水平上，通过每个转录本中存在的剪接供体和受体介导的两个单独载体的转录本之间的跨剪接，生成全长转录本和蛋白。在蛋白水平上，可以通过分裂型内含肽（分裂型内含肽是能够切除自身并连接附近蛋白片段的天然多肽）实现蛋白重构。 参考资料： 1.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/nbt.3440 2.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.omtm.2020.12.006. 3.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2021.08.028 4.     https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41392-024-01780-w 关于派真生物