HER2 x Tubulin

▎药明康德内容团队报道 10月24日，海和药物和三生制药共同宣布，三生制药子公司沈阳三生获得海和药物子公司诺迈西医药旗下产品紫杉醇口服溶液的独家商业化权利（中国大陆及中国香港地区）。根据协议，沈阳三生将向诺迈西医药支付包括首付款，以及研发及销售里程碑付款。诺迈西医药将继续负责已开展的3期临床试验及产品后续的开发、临床及注册等工作。 紫杉醇是一种生物碱类化合物，具有显著的抗癌活性，能够通过干扰肿瘤细胞的有丝分裂和阻止其生长来发挥作用。临床上，紫杉醇被广泛用于胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的治疗。 紫杉醇口服溶液（研发代号：RMX3001/DHP107）由韩国大化制药基于脂质自乳化药物递送技术开发而成，已获得韩国食品与药品监督局（MFDS）上市批准，用于晚期或转移性或局部复发性胃癌二线治疗。海和药物自韩国大化制药获得了紫杉醇口服溶液在中国及泰国的研发、生产及销售权利。 今年9月25日，海和药物和韩国大化制药共同宣布，双方合作开发的紫杉醇口服溶液2024年9月19日获得中国国家药监局（NMPA）批准上市，适用于一线含氟尿嘧啶类方案治疗期间或治疗后出现疾病进展的晚期胃癌患者的治疗。 一项在中国国内进行的开放、随机平行对照、非劣效设计、多中心3期研究显示，紫杉醇口服溶液在经一线治疗后的不可手术切除、复发或转移性晚期胃癌患者中，疗效优于紫杉醇注射液，中位总生存时间延长了2.59个月，且整体安全耐受。现阶段，该药作为一线化疗（既往未接受系统化疗）治疗复发性或转移性HER2阴性乳腺癌适应症的国际多中心3期临床研究也在顺利进行中。 据海和药物公开资料介绍，此前紫杉醇的上市剂型均为注射剂，需经配制后在医院经静脉滴注给药，患者需频繁返院，且会有注射部位不良反应；口服剂型的紫杉醇药物给患者带来口服便捷的同时，提高了临床疗效，降低脱发、外周神经病变、疲乏和过敏反应等不良反应的发生率，显著提高患者的生活质量。 参考资料： [1] 海和药物与三生制药就紫杉醇口服溶液达成合作. Retrieved Oct 24, 2024, from https://mp.weixin.qq.com/s/ynmNXl1VxlxBCsNsVVL-IQ 本文由药明康德内容团队根据公开资料整理编辑，欢迎个人转发至朋友圈。转发授权及其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。

摘要 抗体-药物偶联物(ADC)兼具单克隆抗体的精准靶向性和药物高效杀伤的优势，显示出巨大的临床治疗价值。ADC药物的有效载荷是决定ADC药物疗效的关键因素，受到了业界的高度重视。理想的ADC有效载荷应具有足够的毒性、低免疫原性、高稳定性、功能基团可修饰等特点。常见的ADC有效载荷包括微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂，其中微管蛋白抑制剂占临床开发中的ADC药物的一半以上。但由于传统ADC有效载荷在临床上存在疗效不足、易产生获得性耐药等局限性，因此，靶点多样、副作用小、高效新型有效载荷正在被开发。本文综述了近年来传统和新型 ADC 有效载荷的研究进展，主要集中在构效关系研究、共晶结构和设计策略等方面，并进一步探讨了 ADC 有效载荷的未来研究方向，旨在为开发高效、低毒、稳定、不易产生耐药性的新型 ADC 有效载荷提供有价值的参考和未来发展方向。 1. 背景 尽管免疫疗法和细胞疗法最近取得了进展，但化疗仍然是癌症治疗中最常用的策略。然而，由于治疗指数低，传统化疗药物尽管对癌细胞表现出强大的细胞毒性，但往往对健康组织表现出毒性作用，这大大限制了它们的临床疗效。因此，开发高效、系统毒性有限的癌症治疗药物输送系统可能是解决该问题的有效策略。因此，一个新概念——抗体-药物偶联物 (ADC)已被构想和开发 (图1)。ADC通常由针对肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体和若干个有效载荷通过适当的连接子组成，ADC兼具单克隆抗体(mAb)的高靶向性和有效载荷在肿瘤组织中的高效性。由于ADC副作用较小、治疗应用范围较广、治疗指数较高，近年来已成为肿瘤学领域发展最快的药物之一。 图1. ADC的关键结构和作用机制。 (A) ADC的一般作用机制；(B) DNA抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(C) 剪接抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(D) 微管蛋白抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(E) PROTAC分子作为ADC有效载荷的作用机制；(F) Bcl-xL抑制剂和蛋白酶体抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(G) NAMPT抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(H) NIR-PIT ADC的作用机制。 ADC药物的概念最早由德国诺贝尔奖获得者保罗·埃尔利希于1913年提出，但直到1975年，杂交瘤技术的发展开始用于生产单克隆抗体，才真正开启了ADC药物的开发时代。在日益成熟的技术推动下，ADC药物经历了三代创新(图 2)：第一代ADC药物主要以传统化疗药物如甲氨蝶呤、长春花碱、阿霉素等作为细胞毒性有效载荷，但由于对癌细胞的细胞毒性不足、肿瘤选择性不强、靶细胞蓄积率低，这些第一代ADC药物的疗效甚至比其母体有效载荷更差，导致临床失败。随后，新型高细胞毒性化合物引起了人们的浓厚兴趣，这些化合物的药效比第一代 ADC中使用的传统化疗药物高出 100-1000 倍。当它们作为单一药物用于杀死肿瘤时，它们往往具有难以忍受的副作用。例如，微管蛋白抑制剂美登素对肿瘤细胞表现出极强的抗增殖活性。然而，它的毒副作用，如神经毒性和胃肠道反应，也很严重。因此，它未被批准作为单一药物用于癌症治疗。有趣的是，这些高细胞毒性化合物是 ADC 的理想有效载荷。细胞骨架的主要成分由α-和β-微管蛋白组成，微管蛋白抑制剂可以通过破坏细胞骨架结构和干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。因此，与正常细胞相比，分裂速度更快的肿瘤细胞对微管蛋白抑制剂更敏感。大多数第二代 ADC 使用明显更有效的微管蛋白抑制剂作为有效载荷。不幸的是，虽然微管蛋白抑制剂对活跃分裂的肿瘤细胞非常有效，但对静止的癌细胞效果要差得多。为了潜在地克服这一限制，大多数第三代 ADC 选择了可以靶向整个细胞周期的 DNA 损伤剂作为细胞毒性载荷，DNA 损伤剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合和交联来破坏 DNA 结构，从而杀死肿瘤细胞，代表性的 DNA 损伤载荷包括烯二炔、拓扑异构酶 I 抑制剂和吡咯并苯二氮卓类 (PBD)。目前，已有 15 种 ADC药物获批，大量 ADC 药物正在临床试验中(表1)，其有效载荷主要来源于天然物质，其中微管蛋白抑制剂占一半以上。 图 2. ADC 有效载荷开发过程中的里程碑。 尽管 ADC 已经历经三代，但当前的有效载荷仍然存在临床局限性，例如严重的副作用和耐药性的产生。开发更有效的 ADC 有效载荷(最好具有更好的治疗指数)的医疗需求仍然强烈未得到满足，因此，正在设计其他新型 ADC有效载荷，包括 RNA 抑制剂、Bcl-xL 抑制剂、NAMPT 抑制剂和卡马菲星(carmaphycins)。此外，使用免疫调节剂作为有效载荷的免疫 ADC 因其在肿瘤免疫治疗中的关键作用而引起了广泛关注。除了使用单个简单分子作为有效载荷外，还出现了几种使用更复杂有效载荷设计 ADC 的新策略，例如，PROTAC 或光敏剂已被用作 ADC 有效载荷，并且还开发了将多个有效载荷(每个有效载荷具有不同的靶标)整合到单个抗体中的方法，这些突破性的策略可以带来下一代 ADC。 本文从 ADC 有效载荷的重要性和主要特性出发，从晶体结构、ADC 有效载荷与靶标之间的结构-活性关系(structureeactivity relationships, SAR)等方面，综述了各种传统 ADC 有效载荷的发现和主要结构改造。此外，本文还将总结各种基于新药物靶标和创新设计策略的新型 ADC 有效载荷。最后，针对当前有效载荷的局限性，讨论了未来 ADC 有效载荷的主要研究方向，以期为未来设计具有理想特性的新型 ADC 有效载荷提供参考。 2. ADC有效载荷的重要性和特点 ADC药物进入血液循环后，与肿瘤细胞表面的靶抗原受体结合，新形成的ADC-抗原复合物内化后被溶酶体降解，释放出有效载荷，诱导肿瘤细胞死亡(图1)。因此，有效载荷是ADC设计的重要组成部分，有效载荷的活性和理化性质对ADC药物的抗肿瘤疗效有直接的影响，有效载荷的作用机制是决定ADC性能的重要因素(如不良反应)。此外，ADC有效载荷的其他一些特性，如细胞毒性、免疫原性、制备和流通过程中的储存稳定性、水溶性、可改性性等也很重要。 理想的有效载荷应具备以下特点： 第一，它们应该具有足够高的细胞毒性。肿瘤特异性抗原非常有限，尤其是在实体肿瘤中。此外，由于单克隆抗体的渗透性低、内化活性差，能够通过抗体抗原结合内吞到肿瘤细胞中的 ADC 有效载荷数量非常少； 第二，ADC药物要具有足够低的免疫原性。蛋白质药物存在诱导免疫原性的风险，这可能会对ADC疗效产生负面影响，甚至导致接受治疗的患者死亡。虽然目前ADC多采用人源或人源化单克隆抗体和小分子药物，但与治疗性单克隆抗体相比，仍有可能增加免疫原性的风险。为了解决这个问题，一些毒性很大的药物是从植物、动物或微生物中提取的，确保药物在人体内的免疫原性小到可以忽略不计，使用分子较小的药物也是降低免疫原性风险的一种方法； 第三，ADC药物要具有较高的稳定性。由于抗体在循环中的半衰期较长，ADC 应在血液循环中保持稳定，避免释放或分解。有效载荷还应在细胞质和溶酶体中保持稳定，在低 pH 条件下不会发生明显降解； 第四，ADC 有效载荷应具有可修改的功能基团，而不会显著影响其效力。有效载荷必须具有可修改的功能基团或可与单克隆抗体结合的位点，必须仔细选择修改的位点以保留母体药物的效力。更重要的是，当使用不可切割的连接子时，即使在抗体降解后，有效载荷也必须保持其效力； 第五，ADC 有效载荷应具有旁观者杀伤效应。一些 ADC 药物被内化并释放出小的、不带电的、可渗透的膜疏水性分子，这些分子通过细胞膜扩散并杀死邻近抗原表达阴性的肿瘤细胞。这一过程被称为“旁观者杀伤效应”，对抗原表达不均匀的肿瘤细胞具有重要意义。一般而言，促进癌细胞旁观者杀伤效应的有效载荷更适合于靶抗原表达较低或异质性的癌症。要构建具有旁观者效应的ADC药物，其结构必须满足连接子可被切割，以及有效载荷可穿透细胞膜的条件。膜穿透性好的疏水性分子具有很强的旁观者杀伤效应，但这也可能使得药物容易被健康组织吸收，导致严重的全身毒性。因此，两者之间的平衡对于ADC的研发非常重要； 第六，ADC有效载荷应具有适当的水溶性。有效载荷必须具有适当的水溶性以有利于与抗体偶联，并确保偶联物在生理条件下具有足够的溶解性。当过多的疏水性有效载荷与抗体结合时，产生的 ADC 往往会聚集并变得不稳定。此外，有效载荷的亲水性会影响母体 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 第七，有效载荷的靶点应该是细胞内的，因为大多数 ADC 需要进入肿瘤细胞才能释放其有效载荷。许多来自微生物、植物和动物的有效载荷具有膜靶向性，例如那些主要通过阻断离子通道或破坏凝血起作用的神经元上的有效载荷，不适合用作 ADC 有效载荷的亲水性会影响亲本 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 上述 7 种 ADC 有效载荷特性中，高效力、低免疫原性、药物制剂和血液循环中的稳定性、可修饰的功能基团是 ADC 有效载荷选择时必须考虑的重要因素，而适当的水溶性或旁观者杀伤效应等特性虽然一般不是那么重要，但对 ADC 的有效性也有着重要影响。基于这些特性，总结了现有 ADC有效载荷的有效性，包括靶向微管蛋白/DNA/RNA 的有效载荷、免疫 ADC 有效载荷、新型的潜在 ADC 有效载荷以及在各种新策略指导下用于 ADC 药物设计有效载荷。通过分析各种有效载荷与蛋白的结合方式及其相应的 SAR，希望阐明结构如何决定其生物活性和特性，并为未来产生更多新型ADC有效载荷提供有价值的参考。 3. ADC 的各种有效载荷 3.1. 微管靶向有效载荷 微管是真核细胞中细胞骨架的重要组成部分，是由平行于圆柱轴的α、β微管蛋白异二聚体组成的动态极性聚合物。微管在维持细胞形态、信号转导、细胞器运输、细胞运动、细胞分裂、有丝分裂等多种细胞功能中起着重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。微管蛋白是微管的组成成分，微管蛋白抑制剂通过与微管蛋白结合，干扰微管的动态结合，使细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。由于微管蛋白抑制剂能破坏有丝分裂纺锤体，起到抗有丝分裂的作用，因此对快速分裂的癌细胞的毒性比大多数生长缓慢的正常细胞更强，成为广受欢迎的 ADC 有效载荷。其中，微管蛋白聚合促进剂，如奥瑞他汀化合物 MMAE 和MMAF，作用于α、β蛋白的β亚基微管蛋白二聚体不能与微管蛋白聚合酶结合，导致微管生长不受调控。而微管蛋白聚合抑制剂，如美登素化合物DM1和DM4，则通过抑制成熟微管的形成，阻止微管蛋白二聚体的聚合，该类微管蛋白抑制剂是目前临床上许多ADC药物中最为常见的第二代有效载荷，并已被多个团队作为先导化合物进行结构改造，进一步改善该类ADC有效载荷的理化性质，使其更适合ADC药物的开发。 3.1.1. 美登素类化合物(Maytansinoids) 美登素(Maytansine) (1) (图 3A)最初从非洲灌木Maytenus ovatus的树皮中分离得到，是一类苯并安息香酸内酯类抗生素，能与微管蛋白结合，抑制微管的组装。在体外细胞活性测定中，其IC50落入皮摩尔(pM)范围，显示出其强大的抑制肿瘤细胞增殖能力，在其他实验中也表现出良好的稳定性和溶解性。但由于其治疗窗口较窄，且由于缺乏选择性而产生神经毒性和胃肠道反应等毒副作用，临床上已禁止直接用于人类治疗。然而，美登素的高细胞毒性完全符合 ADC 有效载荷的要求，使美登素成为 ADC 有效载荷的有力候选者。由于美登素没有反应性官能团，因此它不能与抗体结合。美登素类化合物的结构-活性研究已确定 C3 N-酰基-N-甲基-l-丙氨酰酯侧链、C4–C5 环氧部分、C9 甲醇官能团以及共轭 C11 和 C13 双键的位置是活性的关键要素，这使得苯环和N-酰基成为可化学修饰的实体。用3-甲基二硫丙基取代美登素中的N-乙酰基，可以得到含二硫键的美登素衍生物DM1 (2)(图3A)。DM4 (3)是在DM1二硫键周围加两个甲基得到的。衍生的 DM1 和 DM4带有甲硫基丙酰基，可以通过二硫键与连接子偶联。DM1 和 DM4 是临床实际应用中最常用的两种美登素类 ADC 有效载荷，例如Trastuzumab-SMCC-DM1 就是第一个获批上市的基于美登素衍生物的 ADC 药物。目前，20% 在开发的 ADC 使用美登素衍生物作为有效载荷。 图 3. 美登木素化合物的设计和 SAR 分析。 (A) 美登木素化合物1- 5的化学结构；(B) 美登木素 (1) 与微管蛋白复合的结合模式；(C) 化合物5与微管蛋白复合的结合模式。 2014年，Michel O. Steinmetz 团队研究了美登素及其与微管的作用，发现在β-微管蛋白上，美登素类与微管蛋白有三个关键的相互作用点(图 3B)，包括美登素 1 位羰基与β -微管蛋白残基Asn102 和 Lys105 之间的氢键；1 位羟基/羰基氧与β -微管蛋白 Val181 之间的氢键；以及配体 6a 位甲基与β -微管蛋白残基 Asn101、Asn102、Val182、Phe404 和 Tyr408 形成的口袋之间的疏水相互作用-微管蛋白，这些保守的微管蛋白相互作用点构成了共同的药效团。美登素是最常用的ADC有效载荷，但其合成、中间非对映体产物的分离纯化都很困难。同时，它是多药耐药蛋白1(MDR1)的底物，MDR1是一种转运蛋白，可以降低一些抗体-美登素样偶联物的效力。因此杨金良团队探索了L-DM1-SMe(C3位甲基-L构型DM1)、D-DM1-SMe(C3位甲基-D构型DM1)和β微管蛋白，发现L-DM1-SMe酯基中的羰基氧原子和C3侧链尾部的硫甲基分别与9位羟基和苯环形成较强的分子内相互作用，有助于结合亲和力的增强；而D-DM1-SMe的C3侧链则向相反方向摆动，无法形成分子内相互作用，解释了C3位甲基手性影响抗癌活性的详细机制。该研究为设计下一代具有新型骨架的美登素结合位点抑制剂，改善合成策略，降低MDR1介导的耐药性提供了基础。 美登醇(4)(图3A)最初是通过化学去除疣状Putterlickia verrucose提取物C3位置羟基上的酰基得到的。其对微管蛋白聚合的抑制活性弱于美坦辛，说明美坦辛和美坦素的C3位酯部分对生物活性和细胞通透性起重要作用。酯部分的羰基氧原子与9位的羟基形成强烈的分子内相互作用，固定了生物活性构象。美丹辛醇被认为是一种有价值的先导化合物，通过C3位羟基的酰化，可以很容易地制备出具有不同酯侧链的各种天然和半合成的美坦素类化合物。Daniele Passarella研究组通过对美登醇(4) 进行酰化反应，得到了一个新的美登素化合物5，该化合物具有较强的抑制微管组装能力，对A549 细胞的 IC50为 0.07-1.2 nmol/L，晶体结构 (图 3C) 表明美登素的结合对微管蛋白的整体构象没有影响，美登素化合物在 C1–O 和 Val181 的主链氮原子之间以及 C24-O 和 Lys105 和 Asn102 的侧链之间形成氢键。此外，美登素化合物5通过它们的C9-OH基团与Gly100的主链羰基形成氢键。在所研究的美登木素类化合物中，在 C3 位置引入的所有修饰都指向溶剂，不会干扰美登木素位点的封闭环境。因此，酰化增强了美登木素的全部生物活性，并且在 C3 位置引入的修饰不会干扰化合物与微管蛋白二聚体的结合状态、亲和力或有效性。Regeneron 的团队通过改变环上侧链的长度以及由一级胺和二级胺连接的连接子，研究了N -甲基丙氨酸中氮取代的影响，使用美登素化合物6作为有效载荷获得了 EGFRvIII 靶向 ADC，IC50对于 HEK293、U251 和 MMT 细胞系，浓度为 0.3-0.4 nmol/L，在 U251/EGFRvIII 和 MMT/EGFRvIII 小鼠模型中实现肿瘤消退。 3.1.2. 奥瑞他汀(Auristatin) 多拉司他汀10 (Dolastatin 10) (7) 于1987 年从Dolabella auricularia中分离得到，对多种癌细胞有较强的抗增殖活性，能强烈抑制微管组装，导致细胞周期停滞和细胞凋亡，是一种很有前途的抗癌药物(图 4-1A)。其水溶性合成类似物称为奥瑞他汀，其中应用最广泛的是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)(8)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)(9)。它们各自含有一个功能性手柄，能够进行后续结合，进一步提高体内疗效。MMAE由4种氨基酸组成：单甲基缬氨酸(MeVal)、缬氨酸(Val)、多拉索林(Dil)和多拉普罗林(Dap)，以及羧基端胺基去甲麻黄碱。在MMAF中，单甲基缬氨酸的C端被苯丙氨酸取代，其细胞活性显著降低。Andrea E. Prota团队发现与 MMAE 相比，MMAF 对游离微管蛋白的结合亲和力增加了近 5 倍，这主要是由于β1 微管蛋白亚基上的关键 Arg278 残基通过有序水分子暴露于 MMAF。研究还表明，将长春花结构域延伸到肽位的详细结构相互作用不仅在功能上因抑制核苷酸交换而不同，而且还表明肽位抗有丝分裂剂如何比长春花生物碱具有更高的效力，该分析可能为 MMAF 的细胞活性降低的原因提供结构解释。 图 4-1.奥瑞他汀类似物的设计和 SAR 分析。 ( A)奥瑞他汀类似物  7-10、21-24 的化学结构；( B )化合物10与微管蛋白的复合物结合模式。 杨金良团队通过对长春花结构域中MMAE与微管蛋白结合域的结构研究，定义了一个必需的药效基团，该药效基团由两个疏水区I和II以及两个与Asp179β和Asn329α相互作用的氢键区域组成，为合理设计高特异性、强亲和力、高效的ADC有效载荷奠定了基础。2020年，Christopher J. O Donnell 团队设计合成了一个具有N端修饰的奥瑞他汀类似物10 (IC50 =0.2 nmol/L)，并首次通过更高分辨率的奥瑞他汀晶体结构实现了对其结合模式的详细研究，晶体结构显示化合物10的N端二甲基很好地贴合在受体口袋中，并不影响分子的整体结合亲和力(图 4-1B)。此外，还鉴定出关键的极性相互作用，包括末端质子化氨基与位于 T5 环上的Asp β 197 和 Phe α 351 氨基羰基之间的氢键网络、N-2 缬氨酸与 Asn α 329 之间的双焦点相互作用以及化合物10中 Tyr β 224 主链酰胺与 Dap 和 Doe 末端羰基之间的关键氢键相互作用。后者氢键网络使 Tyr β 224中的芳香环与 GDP 的核碱基发生π堆积相互作用，从而防止其从β-微管蛋白，GDP 的捕获被认为是奥瑞他汀发挥其干扰微管蛋白作用的关键机制。此外，所有分析的类似物在其功能相关的微管蛋白结合状态下在 Val-Dil 酰胺键处均具有顺式构型，而在溶液中该键仅处于反式构型。这揭示了奥瑞他汀的首选结合模式，并为基于结构的药物设计提供了有价值的工具。 图4-2. 奥瑞他汀类似物的化学结构11-20。 大多数奥瑞他汀类似物研究都集中在 C 端或 N 端修饰上： ·在 C 端修饰中，Doronina 等人描述了 MMAF 类似物11和12，其中苯丙氨酸的羧酸被四唑和膦酸酯取代。化合物11对H3396 细胞的IC50为 6.0 nmol/L，化合物12对 HCT116 细胞的IC50为 0.09 nmol/L。化合物11和12(游离酸类型)都已用于通过VC-linker与抗 CD70 的 H1F6 抗体结合形成活性ADC，其效力与 MMAF 作为有效载荷的效力相似(IC50=4-10 nmol/L)(图4-2B)。Pettit 等设计了C 端芳香族磷酸酯和喹啉修饰的奥瑞他汀类似物13-15 ，对 MCF-7 细胞的 IC50分别为0.81、0.19 和 6.35 nmol/L。其中，化合物13具有良好的水溶性(>236 mg/mL)，两个喹啉类似物14和15表现出良好的活性，化合物14 的活性明显高于其他类似物(图 4-2A)。Lerchen 等进一步说明了奥瑞他汀C 端结合域允许的修饰程度，通过在 C 端添加取代基，获得了对 768O 细胞有效的奥瑞他汀类似物16-18，IC50分别为 0.5、1.2 和 1.2 nmol/L(图 4-2B)。 ·对于 N 端修饰，Satomaa 等证明，丙醇和叠氮化物衍生物19和20尽管存在亲水侧链，但仍保持了相当大的细胞效力，19和20对 SKOV3 细胞的 IC50分别为 1.0 nmol/L 和 <1.0 nmol/L 。它们的叠氮化物和炔烃可用于后续的环化反应，形成更复杂的亲水“糖交联剂”，能够与各种抗体(赖氨酸、半胱氨酸、聚糖和转谷氨酰胺酶结合物)结合。在此基础上，制备了曲妥珠单抗和 EGFR1 ADC，其体内表现良好，效力为 1.5-10 mg/kg (DAR = 3)(图4-2A)；Doronina通过将对氨基苯甲酸取代N端氨基酸而获得奥瑞他汀类似物21 ，在 Karpas 299 细胞中显示 IC50为0.12 nmol/L，含有有效载荷21的 ADC在剂量为 1 mg/kg 时缩小了 Karpas 299 人 ALCL 异种移植模型中的肿瘤体积。然而，这种 ADC 不如相关的 VC-MMAE ADC 有效(图 4-1A)；2020 年，Svetlana O. Doronina 团队设计了一系列烷基-MMAF 类似物，以研究开发具有可调膜通透性、活性和对外排泵抗性的奥瑞他汀的可能性。MMAF 在 N 端耐受大量取代基的能力提供了一种方便的方法来调节游离药物的疏水性，而不会显着影响细胞活性，他们选择了 C1 至 C12的支链和非支链脂肪族基团作为取代基，并生成了 MMAF N-烷基衍生物22，该系列衍生物的细胞毒性随烷基链长的增加而增大，取代基的空间体积和疏水性的增加均不导致活性的下降。 新型类似物结合了MMAE和MMAF的特点：高效、旁观者活性、克服MDR，这些发现进一步拓展了奥瑞他汀作为ADC载荷的作用。Agensys最近将叠氮基引入P2和P4亚基，得到化合物23 ，在MOLM13细胞中的IC50为0.057 nmol/L，由于P2或P4位点作为ADC药物的结合位点，这为下一代奥瑞他汀衍生物提供了新的方向。Luke R. Odell教授团队开发出一种奥瑞他汀衍生物阿扎他汀(azastatin) (24)，其细胞毒性(IC50=0.13-3.0 nmol/L)高于 MMAE(IC50=0.47–6.5 nmol/L)，这表明 N-二甲胺基团增加了化合物的效力。此外，该衍生物含有中心胺侧链抗体结合位点，适合用于 ADC 开发。 3.1.3. 艾日布林(Eribulin) 聚醚大环内酯类天然产物 Halichondrin B (25) 最初从 Halichondraria Okadai 等分离得到，已被证明具有良好的抗增殖活性 (图 5A)。其结构简化的新型非紫杉烷全合成类似物甲磺酸艾日布林 (26) 是一种具有抗有丝分裂作用的微管动力学抑制剂，已于 2010 年获批用于治疗局部晚期和转移性乳腺癌 (MBC)患者。Michel O. Steinmetz 团队通过晶体结构发现艾日布林与微管蛋白的结合位点是由 β-微管蛋白的螺旋 H1、H6、H7、环 H6–H7、S3–H3 (T3) 和 S5–H5 (T5) 的疏水和极性残基形成的(图 5B)。此外，艾日布林的“笼状”结构与鸟苷酸的核糖部分接触。在微管蛋白-艾日布林复合物中，配体缠绕在Tyr224的侧链上。当艾日布林与微管中两个纵向排列的微管蛋白二聚体结合时，相邻微管蛋白二聚体的α-微管蛋白的S9链、H10螺旋和T7环将与艾日布林分子主体发生碰撞。这些结果表明，艾日布林在高浓度下可将微管蛋白二聚体隔离到组装不完全的微管蛋白-艾日布林复合物中，在低浓度下干扰微管末端原丝的延伸，从而破坏微管稳定性或抑制微管动力学。 图 5. 艾日布林类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 艾日布林类似物25-27的化学结构；(B) 艾日布林26与微管蛋白复合的结合模式。 艾日布林在肿瘤生物学中具有很强的抗有丝分裂活性，因此有望作为ADC载荷。Earl F. Albone团队通过在C-35伯胺基团上添加连接子，设计了一种以艾日布林为载荷的ADC，对卵巢癌细胞IGBOV1有很强的作用(IC50为20 pmol/L)。在非小细胞肺癌细胞NCI-H2110异种移植模型中，5 mg/kg ADC剂量可诱导肿瘤完全消除，提示微管靶向药物艾日布林可作为ADC载荷。此外，早在2011年，Sridhar Narayan实验室合成并评价了几种具有中性C32侧链的第二代艾日布林类似物，这些侧链修饰的艾日布林类似物对U-251和SF-295细胞的抑制作用明显强于艾日布林。通过在C32侧链引入低碱性胺或增加艾日布林的亲脂性，得到的化合物27在体内外对多种异种移植肿瘤有抑制作用，具有口服生物利用价值，可增加在脑脊液中的暴露量，可能为治疗脑肿瘤等更多种人类癌症提供候选药物(图 5B)。 3.1.4. 微管溶素(Tubulysins) Tubulysins (28) 是 Hofle 等从粘菌培养基中分离出的一种天然抗有丝分裂肽(图 6)，它是一种由N-甲基-D-哌可酸(Mep)、利索莱恩(L-Ile)、微管蛋白(Tuv)和微管丙氨酸(Tup)组成的线性四肽，又称微管溶素Tut(Tut)，能抑制微管蛋白的聚合，诱导细胞凋亡，对癌细胞包括耐多药KB-V1细胞有较强的抗增殖活性(IC50 = 0.08 nmol/L)，在抗癌药物研发中具有良好的前景。2018年，KC Nicolaou团队合成了高效微管溶素类似物29和30，IC50对于HEK293T 细胞，浓度分别为 6 和 3 pmol/L。2021 年，该团队使用 T2R-TTL 对化合物30进行了晶体学研究，发现化合物30与 Vinca 结构域结合，在核苷酸结合位点附近的β和α微管蛋白分子界面口袋内形成细长的构象，其中分子的苯基氨基甲酸酯部分位于α2-微管蛋白亚基氨基酸残基 L248 的疏水袋上(图 6B)。根据该组合模式，设计了一种血浆稳定性好、对NCI-N87小鼠肿瘤模型疗效显著的ADC，在肿瘤靶向治疗研究中具有潜力。 图 6. 微管溶菌素类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 微管溶菌素类似物28-34的化学结构；(B) 化合物30与微管蛋白的复合物的结合模式。 对微管溶素的 SAR 研究证明了微管溶素中关键残基修饰的可行性： ·在 N 端，Mep 残基的 6 元环可以有效地被 5 元无环残基N-甲基-D-脯氨酸、N -甲基肌氨酸和N, N-二甲基-D-丙氨酸取代，在大多数情况下活性损失最小； ·Tuv 部分的C11-乙酰基修饰会对活性产生显著影响：乙酰基水解成二级醇将导致活性损失高达 1000 倍，但它可以容忍各种各样的变化，尤其是对N、O-缩醛发生改变； ·相反，Tup 残基是常见的可修饰给药结合位点； ·C13 上的取代基不耐受变化，将异丙基替换为环己基或芳基(苯基和对甲氧基苯基)将导致活性丧失； ·羧酸端是常见的结合位点，因此经常被修饰。 为了克服微管溶素 C-11 乙酸酯水解引起的不稳定性，Patrick J. Burke63设计了一种 C-11 烷氧基类似物31，它表现出与微管溶素 M 相似的生物活性，且显著提高了血浆稳定性(图 6A)。Chakrapani Subramanyam鉴定出一种有效的微管溶素类似物32，该类似物含有α-甲基叔胺，所得ADC在体内和体外均表现出良好的药效。程恒制备了一种含氨基甲酸酯的微管溶素类似物33，其氨基甲酸酯基团在体内稳定，对OVCAR3和N87细胞的IC50分别为0.20和0.23 nmol/L，化合物33与抗meso抗体偶联形成的ADC，0.01 μmol/L可诱导肿瘤生长明显延缓。微管溶素衍生物34含有不可水解的 N 取代基的 tubuvaline (Tuv)，在 HT-29 细胞中的 IC50 < 0.28 nmol/L，也具有作为 ADC 有效载荷的潜力。 3.1.5. 隐藻素(Cryptophycin) Cryptophycin 是由蓝藻产生的天然大环多肽，具有 16 元环，它含有两个羟基酸(A 和 D 单元)和两个氨基酸(B 和 C 单元)。Cryptophycin 不可逆地抑制有丝分裂期间的β-微管蛋白聚合，这可导致细胞周期阻滞在 G2/M 期并激活凋亡途径，从而在体外产生皮摩尔(pM)抗增殖能力。第一个合成并评估的 cryptophycin 类似物 cryptophycin-1 (35) 对 KB 细胞的 IC50为 4.58 pmol/L，对 LoVo 细胞的 IC50 为 7.63 pmol/L (图 7)，但由于大环内酯类化合物在血液循环中不稳定，其体内抗肿瘤活性并不显著。经过进一步的结构修饰，得到了C单元β-丙氨酸的α位上比cryptophycin-1多一个甲基的cryptophycin-52 (36)，增加了空间位阻，明显提高了体内稳定性。极低浓度的cryptophycin-52 (36)在有丝分裂过程中抑制细胞增殖(IC50=11 pmol/L)，而微管长度和质量没有明显变化。cryptophycin-52 (36)与微管蛋白的结合非常紧密，cryptophycin-52 (36)-微管蛋白复合物对微管的结合率非常高 (Kd=47 nmol/L)。虽然 cryptophycin-52 有效，但由于剂量依赖性毒性，它在 II 期临床试验中被终止，使用该化合物作为 ADC 的有效载荷可能会降低其毒性。最近，Paul T. Wingfield 团队在微管蛋白二聚体界面上确定了 cryptophycin-52 (36)及其母体化合物 cryptophycin-1 (35)的结合位点，该位点与美登素部分重叠 (图 7B)，α-微管蛋白和β-微管蛋白的构象均发生了变化，尤其是在螺旋H8和H10中。α、β单体之间以及cryptophycin-52(36)结合和cryptophycin-1结合微管蛋白之间存在显著差异。然后，分析了cryptophycin上合适的位点：在单元A中，对位取代的苯基比邻位取代或间位取代的类似物更有效，对位取代的苯基可作为偶联位点；单元B对细微的修饰比较敏感，比如苯环上的5-氟取代；单元C中，C6位的苄基或异丙基等大取代基会大大降低其活性；而单元D修饰后活性变化不大，单元D中的异丁基可作为偶联位点，单元D的异丁基共轭位点可能优于单元A。该分析为后续以cryptophycin为载荷的ADC设计寻找合适的共轭位点提供了参考。 图 7. 隐藻素类似物的设计和 SAR 分析。 (A)隐藻素类似物35-40的化学结构；(B)隐藻素-52 ( 36 ) 与微管蛋白复合的结合模式。 cryptophycin-52 (36)的类似物37 (IC50 = 33 pmol/L) 是一种非常有前途的临床候选药物，已由 Eli Lilly 公司获得专利(图 7A)。 隐藻素-52 中单元 A 的芳香环可以在不显著影响其生物活性的情况下进行原位修饰，这些修饰被 Sanofi-Aventis 用作抗体偶联的偶联位点。隐藻素-52-氯醇化合物，如隐藻素-55 (38)，在体内的生物活性提高了 100-1000 倍。隐藻素-55 甘氨酸 (39)在体外表现出最高的细胞活性，隐藻素-55 甘氨酸通过可切割的连接子与靶向 HER2 受体的曲妥珠单抗偶联，所得 ADC 对 SK-BR3 细胞表现出纳摩尔活性。 基因泰克将隐藻素-52 中的苯转化为苄胺，获得化合物40，适合通过氨基甲酸酯键连接。杨金良团队将 cryptophycin-52 的前体药物 CR55(在生理条件下可转化为 cryptophycin-52)与曲妥珠单抗偶联，在 HER2 阳性肿瘤细胞株中其 IC50为低纳摩尔水平(0.58-1.19 nmol/L)，10 mg/kg 相应的 ADC 在卵巢癌(SKOV3)和胃癌(NCIeN87)异种移植模型中表现出明显的抗肿瘤活性，为基于 cryptophycin-55 和 cryptophycin-52 的 ADC 抗肿瘤药物的开发提供了思路。 3.1.6. EG5抑制剂 驱动蛋白(Kinesin) (KSP/EG5/KIF11) 是一种 ATP依赖性蛋白，参与细胞周期 G2/M 期着丝粒的分离和双极纺锤体的产生，在有丝分裂中起重要作用。EG5 在血液肿瘤(例如AML 母细胞和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL))和实体肿瘤(例如乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌)中的高表达与其预后不良有关，使其成为一个有吸引力的癌症治疗靶点。几种 EG5抑制剂，如 SB-715992 (Ispinesib) (41) 和 Filanesib (ARRY-520) (42)，已在临床试验中(图 8A)。然而，EG5 抑制剂最常见的副作用，如中性粒细胞减少症、粘膜炎和口腔炎，以及其狭窄的治疗窗口，限制了它们的治疗效果。然而，通过利用 ADC，可以保护健康组织免受细胞毒性化合物的侵害，从而可能降低其总体毒性副作用并扩大化合物的治疗窗口。Dimitrios A. Skoufias 的团队将Eg5 Arry-520 复合物的结构与 Eg5 ispinesib 复合物的结构进行了比较 (图 8B)，两种复合物的叠加表明ispinesib的喹唑啉酮与Arry-520的二氟苯环占据相似的位置，并具有相似的相互作用。在ispinesib中，两个芳香族取代基对甲苯和苄基相互堆叠，与Glu118，Arg119以及Arg119，Trp127和Asp130侧链进一步堆叠来稳定骨架。然而，在Eg5 Arry-520复合物中，这种骨架堆叠要弱得多。此外，对于Arry-520，二氟苯基和异丁基侧链残基之间存在直接的疏水堆叠相互作用，而在ispinesib复合物中，侧链移动2 Å以容纳苄基和对甲苯和苄基-甲苯，从而完全削弱或失去这种相互作用。Arry-520与ispinesib通过Gly117的伯胺与主链氧和Glu116的侧链之间形成氢键相互作用，Arry-520中甲氧基的氧可能与Tyr211(3.63 Å)的羟基发生微弱的相互作用。另外，苯环上的一个氟与Gly217的主链NH(3.03 Å)相互作用，与Arg221(3.69 Å)的侧链发生微弱的相互作用。总的来说，Arry-520的紧密结合是通过一系列与抑制剂结合袋中氨基酸侧链的强或弱的氢键相互作用和疏水相互作用实现的。此外，Eg5变构结合位点的D130A和L214A突变均可使Array-520产生耐药性，而ispinesib对L214A突变体仍然敏感。 图 8. EG5 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) EG5抑制剂41–45的化学结构；(B) ispinesib (41) 与 EG5复合的结合模式。 诺华公司开发了 EG5 抑制剂43、44，作为有效载荷与抗体结合，使用不可切割的连接子靶向 HER2 (图 8A)。在 HER2 表达的小鼠异种移植模型 (SK-OV-3ip) 中，单剂量静脉 ADC (5 mg/kg) 可使肿瘤生长停止 3 周，效果优于 Kadcyla (5 mg/kg)。使用非细胞渗透性 EG5 吡啶抑制剂作为有效载荷，Anette Sommer开发了一种新型 IL3RA 靶向 ADC，该 ADC 显示出有效和选择性的抗增殖作用。Carsten Terjung研究了一种新的EG5 吡咯亚类抑制剂45作为 ADC 新型有效载荷的适用性，在尿路上皮细胞癌 (UCC) 异种移植模型中，这种 ADC 显示出高效，可完全根除肿瘤。 微管破坏可诱导细胞周期停滞在 G2/M 期，这使得微管成为药物发现的一个有吸引力的靶点。在许多情况下，治疗窗口狭窄和缺乏肿瘤特异性可能导致强效微管蛋白抑制剂单独作为抗癌剂失败。然而，使用 ADC 作为靶向疗法可能是解决微管蛋白抑制剂单一疗法局限性的一种有前途的方法。目前处于临床开发阶段的 ADC 中有一半以上以微管蛋白抑制剂(auristatins和 maytansinoids)作为有效载荷。虽然微管蛋白抑制剂作为 ADC 有效载荷取得了一些商业成功，但它们受到开发过程中各种缺点的限制，例如，它只能靶向处于分裂期的肿瘤细胞，而不能靶向处于非分裂期和静止期的细胞。此外，肿瘤细胞中的微管蛋白抑制剂靶点较多，这意味着需要更大剂量的药物才能阻止微管蛋白的激活，因此这些以微管蛋白抑制剂为有效载荷的ADC药物还远未达到理想的靶向治疗理念。 3.2. DNA 靶向有效载荷 相比于微管蛋白抑制剂，DNA抑制剂能够通过双链断裂、烷基化、嵌合、交联等方式破坏DNA，作用于整个细胞周期，产生细胞毒作用，对实体肿瘤有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管蛋白抑制剂，当ADC携带相同数量的载荷进入细胞时，DNA抑制剂能够表现出更好的杀伤效果。此外，以DNA抑制剂为载荷的ADC可以靶向抗原表达较低的肿瘤细胞，这也是为什么在许多下一代ADC中都选择DNA抑制剂作为载荷的原因。 3.2.1. 烯二炔(Enediyne) 从细菌来源分离的烯二炔是迄今为止发现的最具细胞毒性的天然产物之一，其摄取会通过破坏活细胞中的单链或双链DNA而导致细胞死亡，同时它还对各种细菌和肿瘤细胞具有极强的活性。烯二炔可分为两个亚家族：钙样烯二炔和蒽醌融合烯二炔。剧毒的烯二炔化合物并不适合直接用作抗癌剂，但这些抗肿瘤抗生素的效力和作用机制使它们成为有吸引力的ADC有效载荷。天然烯二炔产物最常用的ADC有效载荷是来自 Cal烯二炔类的钙血霉素(Calicheamicin)γI1(46)和蒽醌稠合烯二炔 Uncialamycin (47) (图 9A)。 图 9. 烯二炔的设计和 SAR 分析。 (A) 烯二炔46-52的化学结构；(B) 卡奇霉素γI1(46) 与 DNA 复合物的结合模式。 Calicheamicin靶向与 DNA 结合的小沟，特异性诱导 DNA 双链断裂，导致细胞凋亡。尽管最初的实验显示出很强的活性，但Calicheamicin对正常细胞 DNA 的破坏阻碍了其临床进展。尽管如此，高细胞毒性、小分子大小和明确的作用机制使Calicheamicin成为有吸引力的 ADC 有效载荷，Calicheamicin γI1(46) 是目前研究最多的Calicheamicin。Dinshaw J. Patel 和他的团队研究了Calicheamicin γI1的高分辨率结构-DNA 双链复合物，并发现Calicheamicin的芳基四糖在以寡嘧啶寡嘌呤束为中心的小沟深处的定向排列，反过来又使附着的烯二炔环定向跨越双链的两条链，在复合物的强度精细结构中(图 9B)。相对于螺旋轴倾斜的烯二炔环在小沟深处取向，允许DNA糖磷酸骨架质子被暴露的三硫键触发物和环芳构化激活后被提取，最终导致DNA链断裂。药物与DNA小沟之间的界面具有紧密的互补性，该界面跨越复合物精细结构中的整个结合位点。该研究提供了一个数据库来解决与Calicheamicin类DNA的鉴定和切割相关的两个问题。Calicheamicin γI1(46)具有强大的细胞作用，以Mylotarg为代表的ADC的出现很大程度上依赖于Calicheamicin γI1(46)的发现，其N-乙酰基衍生物成为Mylotarg的有效载荷。Nicolaou等合成了Calicheamicin γI1的类似物Calicheamicin θI1 (48)，其对多种肿瘤细胞的IC50值<1 pmol/L，也适合作为ADC有效载荷。此外， FDA批准的Inotuzumab Ozogamicin(Besponsa)也是以Calicheamicin作为有效载荷。 Uncialamycin 是从地衣中分离出来的天然烯二炔产物，能引起 DNA 切割，表现出很强的细胞活性。Uncialamycin 强效类似物的共同结构特征之一是 A 环上存在一级或二级苯胺基团，如果将胺转化为相应的苯甲酰胺，并引入末端芳胺，则可以解决不稳定性问题，同时保持活性。Sanjeev Gangwar采用苯酚烷基化法，设计了一种高效且化学稳定的 Uncialamycin 类似物49 (图 9A)。所得 ADC 通过将有效载荷与抗间皮素 (meso) 抗体结合，在 H226 细胞中的IC50为 0.2 nmol/L，在耐受剂量下表现出特异性和持久的肿瘤生长抑制作用。Julia Gavrilyuk 等选择甲胺类似物50作为 uncialamycin ADC 有效载荷，靶向 TL 和 CD46 的 ADC 在 HEK293T 细胞中表现出低皮摩尔效力。Emmanuel N. Pitsinos修饰uncialamycin，从分子的芳香部分去除一个碳，得到化合物51(待测细胞系：IC50 (H226 细胞) = 28 pmol/L； IC50 (N87 细胞) = 11 pmol/L； IC50 (OVCAR3 细胞) = 316 pmol/L； IC50 (Adr 细胞) = 20 pmol/L)。Sanjeev Gangwar将uncialamycin 类似物52与抗间皮素 (meso)抗体结合，所得 ADC 在 H226 肺癌细胞中的 IC50值为 0.98 nmol/L，IC50值为 0.88 nmol/L。 3.2.2. 拓扑异构酶 I 抑制剂(Topoisomerase I inhibitors) 拓扑异构酶 I (TOPO-I) 是一种重要的核酶，对基因组稳定性和 DNA 结构保存至关重要，已成为 ADC 的热门靶点。TOPO-I 抑制剂与先天性和适应性免疫反应有关，这表明针对 TOPO-I 的 ADC 也可能有助于抗肿瘤免疫治疗。Lance Stewart 等报道了 TOPO-I 与双链 DNA 共价连接并与临床批准的抗癌药物拓扑替康(topotecan) (53)联合使用的 X 射线晶体结构(图 10A)，拓扑替康 (53)和人类 TOPO I-DNA 共价复合物表明，拓扑替康是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导的缺口处在两条 DNA 链之间插入碱基来与酶-底物复合物结合。拓扑替康的结合模式是与 DNA 的堆积相互作用、与 Asp-533 接触的氢键以及与磷酸酪氨酸和 Asn-722 之间的活性位点的水桥接触。天然五环产物喜树碱 (camptothecin, CPT) (54) (图 10B)是拓扑替康 (53)的类似物，是一类特别有吸引力的 ADC 有效载荷，它通过与 TOPO-I 和 DNA 结合形成稳定的复合物，诱导 S 期细胞中的双链 DNA 断裂，从而导致细胞凋亡。然而，喜树碱的溶解度极低，阻碍了其作为癌症治疗药物的广泛使用。SN-38 (56) 是伊立替康(irinotecan) CPT-11 (55)的有效成分，是一种半合成喜树碱，尽管 SN-38 具有所需的效力，但由于其高度疏水性和可用的结合位点数量有限，活性结合物的制备具有挑战性。尽管如此，SN-38 已与针对滋养层细胞表面抗原 2 (Trop-2) 的人源化抗体结合，从而产生 ADC sacituzumab govitecan，该药物正在临床研究中。甲磺酸依沙替康 (DX-8951f) (57) 是一种水溶性 CPT 衍生物，与其他 CPT 类似物相比，具有更强的 TOPO-I 抑制和抗肿瘤活性。DXd (DX-8951 衍生物) (58) 是一种新型、高度膜通透性的拓扑异构酶 I 抑制剂，细胞 IC50为2.05-17.88 nmol/L，可克服P-糖蛋白介导的多药耐药性，对各种肿瘤移植模型有更强的疗效，包括体内CPT-11耐药肿瘤。 图 10. 拓扑异构酶 I 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) 拓扑替康 (53) 与 TOPO I-DNA复合物的结合模式； (B) 拓扑异构酶 I 抑制剂53-60的化学结构。 DXd (58) 有一个包含第二个手性中心的 F 环，使其合成和衍生化变得复杂。为了简化其结构，Wayne C. Widdison 的SAR 研究表明，C11 位氟取代通常会使细胞毒性增加数倍，而 C20 中心必须处于S构型才能使分子保持活性，依沙替康内酯稳定性的提高归因于 C11 氟取代基和 F 环的作用。衍生自喜树碱衍生物58和59 的ADC能有效释放部分含硫化物或硫醇的喜树碱代谢物，这些代谢物对靶向的抗原阳性细胞有较强的抑制作用，在HSC-2和H1703 EGFR+异种移植模型中均表现出相似的剂量依赖性抗肿瘤活性。有效载荷59中没有F环，但其结合物在体外和体内的药效与含DXd的结合物相似，这种简化使喜树碱A环和B环的衍生化更易于用于构效关系研究和有效载荷优化。余东科通过将DXd与曲妥珠单抗偶联，获得了一种新型的HER2靶向ADC DS-8201a。SAR显示C-10的羟基取代可以增强CPT的抗肿瘤活性，而C-7和C-10的脱取代可以稳定内酯环并提高分子生物学活性。DXd在C-7和C-9位点环化，从而增加了抑制活性。DS-8201a避免了耐药性，并且通过旁观者杀伤效应在治疗异质性肿瘤方面非常有效。Scott C. Jeffrey开发了一种新型亲水性和蛋白酶溶解性谷氨酸三肽配体，使用具有高细胞毒性的7-氨基甲基-10, 11-亚甲基二氧CPT类似物60作为有效载荷，缀合的ADC在CD30高表达菌株和MDR阳性的786-O肾细胞癌裸鼠中均表现出有效的抗肿瘤活性。 3.2.3. PBD 链霉菌中发现的吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮卓类 (PBD) (61)是一类具有抗肿瘤活性的天然产物(图 11)，该类化合物由一个芳香族A环、一个1-4-二氮杂-5-1B环和一个吡咯烷C环组成，其作用方式是在DNA小沟内选择性烷基化，鸟嘌呤的N2与PBD的亲电性N10/C11亚胺形成共价键，DNA链间交联造成持续的DNA损伤，导致细胞周期停滞在G2/M期，引起细胞凋亡，从而表现出强大的细胞毒作用。Klaus Weisz团队的NMR结构数据证实了PBD杂合子与DNA双链小沟的强结合，PBD部分与外环鸟嘌呤氨基之间形成共价键。 图 11. PBD 类似物的设计和 SAR 分析61-72。 PBD二聚体具有作为ADC载荷的潜力，例如以PBD为载荷设计的靶向ROR1的ADC CS5001，在多种表达ROR1的肿瘤细胞系中表现出很强的选择性，并在血液和实体瘤异种移植小鼠模型中表现出显著的体内抗肿瘤活性，目前正在进行临床试验。为了进一步扩展更多PBD类化合物作为ADC载荷，Rahman等对PBD的C8位置进行了修饰，得到化合物62，其偶联物具有临床前活性。基于化合物62，Khondaker Miraz. Rahman合成了PBD核心，并利用苯并呋喃和N-甲基吡咯的组合构建了C8杂化物63(图 11)。随后，通过系统地缩短含有吡咯苯并呋喃结构域的C8连接单体，获得了一系列化合物(例如，化合物64的C8连接单体通过去除酰胺而缩短)。研究发现，PBD在C8位置的相对较短的侧链足以赋予细胞毒性，因此缩短的PBD单体可以用作新的ADC有效载荷。二氢苯并呋喃化合物64在原发性CLL细胞中毒性较大，而打开呋喃环在原发性CLL细胞和JN-3细胞系中也保持较低的纳摩尔活性。苯并呋喃中苯元素的变化对细胞毒性影响更显著，去除环的芳香性后细胞毒性明显降低。Jagath R. Junutula鉴定出一种异喹啉苯并二氮卓类 (IQB) 有效载荷65，其 (S, S) 立体化学在 C6a 位对于最佳 IQB 活性至关重要，这是一类新的 PBD二聚体 DNA 损伤有效载荷，在 HEPG2 A704 细胞系中表现出高活性，细胞毒性吡咯并苯二氮卓 (PBD)-二聚体分子经常用作 ADC 的有效载荷。为了进一步探索这种 ADC 有效载荷类别，Peter S. Dragovich通过系统地将酸性和碱性部分引入其化学结构中来修改其物理化学性质，结果表明，含有酸性官能团(包括高度可电离的部分，例如化合物66中存在的磺酸)的PBD-二聚体有效载荷) 能够在抗体介导的递送后有效地从细胞溶酶体转运到细胞质和/或细胞核。修饰的 PBD 二聚体化合物66与 CD22 抗体偶联，得到针对 BJAB 细胞的 IC50为 12 nmol/L 的 ADC，显著提高了未偶联 PBD 二聚体的抗增殖活性。PBD 二聚体有效载荷66将有助于设计出具有更高治疗潜力的新型ADC。Peter S. Dragovich探索了含二硫键前药的PBD二聚体作为抗体-药物偶联物的有效载荷，发现许多含二硫键前药的PBD单体对细胞内GSH水平相对较高的细胞(如KPL-4细胞)表现出较强的抗增殖活性。多种二硫键前体在生理浓度的Cys下稳定，但在肿瘤细胞中存在GSH的情况下不稳定。增加化合物67和68的端隙体积可显著提高其稳定性，例如，得到的化合物69和70含有两个甲基的 PBD 二聚体对 GSH 和 Cys 都具有高度稳定性，噻吩衍生的二硫化物在体内的稳定性得到了改善。在这些常见的 PBD 有效载荷中，PBD 二聚体上的结合位点分为两类：C2 和 N10。C2 结合的一个例子是有效载荷71，它包含一个连接到 PBD C2 位的苯环。靶向 CD19 的 ADCT-402 的有效载荷 SG3199 (72) 通过其 N10 位点进行结合，由于 PBD B 环上的 N10 位点参与与 DNA 的共价结合，因此连接子与 N10 位点的结合比与 C2 位点的结合更安全。在PBD载荷的后续工作中，其共轭位点也可作为影响修饰方向的一个因素。 3.2.4. 多卡米星(Duocarmycin) Duocarmycin A (73) 是从链霉菌中分离出来的一种强效 DNA 烷基化剂，由 DNA 烷基化部分和结合部分组成 (图 12A)。第一个发现的天然多卡米星成员 CC-1065 (74) 通过其高活性的丙烷环与 DNA 微沟结合，并在 N3 位烷基化腺嘌呤，最终导致细胞死亡。尽管 CC-1065 (74)在体外具有很强的效力，但在动物模型中仅显示出中等体内活性和不可逆的肝毒性。为了改善这些化合物的生物学特性，将它们用于 ADC 可能是一个可行的选择。Walter J. Chazin 等描述了 duocarmycin SA 的非天然对映体和 DNA 加合物的结构，发现 duocarmycin SA 的两种对映体可以在 AATTA 双链上共享相同的结合位点和相同的结合方向，但烷基化不同的位点(图 12B)。两种对映体对互补链的烷基化发生在相同的结合方向，但非天然对映体偏移一个碱基对。这种差异对两种加合物的结构具有重要意义，因此会影响它们的相对烷基化效率。对这种与相同 AATTA 双链结合的新结构的分析解释了天然和天然 DNA 位点选择性的相似性和差异性非天然对映体。在duocarmycin/CC-1065 家族的 DNA 加合物的所有结构中都观察到了亚基间扭曲，由于 DNA 具有左手螺旋扭曲，因此 DSA 的三甲氧基吲哚亚基在小沟中结合时相对于烷基化亚基自然倾向于以逆时针方式扭曲。因此，DNA 分子本身的手性对 (+) 对映体药剂施加了重要的限制，而 (-) 对映体药剂则不存在这种限制。两种 DSA 对映体的庞大 C24 甲氧基位于小沟底部的大致相同位置，位于 A16 和 T17 碱基之间的裂缝中。这项研究为控制这些化合物的DNA烷基化率的因素以及DNA结合诱导的烷基化反应激活的重要性提供了新的认识。 图 12. 多卡米星类似物的设计和 SAR 分析。 (A)多卡米星类似物73-80的化学结构； (B) 多卡米星 A (73) 与 DNA 复合物的结合模式。 Patrick H. Beusker开发了一种基于多卡米星的用于还原链间二硫键的新型有效载荷，它与抗 HER2 抗体曲妥珠单抗结合，产生具有良好体内和体外特性的 ADC SYD985。多卡米星 DUBA (75) 具有咪唑 [1, 2-a] 吡啶基，以其无活性的前药形式seco-DIBA (76)掺入结合药物中(75通过76的自发螺环化形成) (图 12A)。化合物76含有两个羟基，每个羟基都可以通过连接子与抗体偶联。Moana Tercel 采用 Pd 催化胺化法将seco-CBI(seco-1,2,9,9a-四氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮，一种合成的duocarmycin 天然产物烷基化亚基的类似物)从苯酚转化为氨基形式，然后得到苯酚 CBI 类似物77, 78和氨基 CBI 类似物79, 80。化合物77对6种人类肿瘤细胞系的IC50在 0.1-2 pmol/L 范围内，更换化合物77或78苯酚 CBI 与相应的化合物79和80氨基 CBI 结合可显著降低药效，且对 P-gp 过度表达的敏感性更高。尽管如此，化合物79在大多数测试细胞系中保持了显著较低的皮摩尔细胞毒性，并且与化合物77、78和80一样，在足够高的浓度下完全抑制了所有细胞系的增殖。 ADC领域的一个明显趋势是治疗靶点从血液肿瘤转向实体肿瘤，这一趋势可能将有效载荷的选择从微管靶向抑制剂转向DNA损伤剂，DNA损伤剂通常表现出更高的效力，并符合新一代有效载荷要求比当前有效载荷具有更高治疗指数的标准。此外，使用DNA损伤剂作为有效载荷可以靶向相对低表达水平的肿瘤特异性/相关表面受体。DNA损伤剂作为ADC的有效载荷的使用已经很成熟，但由于DNA损伤难以修复，这可能导致潜在的毒副作用，目前仅有一款以PDB为有效载荷的ADC在临床上使用，因此其安全性/耐药性问题仍需进一步研究，未来还需要研制更多新一代ADC有效载荷。 3.3. RNA 靶向有效载荷 仍有许多肿瘤对 ADC 不产生反应或产生耐药性，生长缓慢的肿瘤细胞通常不像快速分裂细胞那样依赖微管蛋白介导的细胞过程。因此，为了进一步扩大 ADC 有效载荷的范围并识别出对快速和慢速增殖细胞均有效且可以逃避 MDR 介导的耐药性的其他类型 ADC 有效载荷，人们将注意力转向了靶向 RNA 的小分子有效载荷。靶向 RNA 的小分子抑制剂可以杀死分裂和休眠的肿瘤细胞，用作 ADC 有效载荷有望解决无效肿瘤休眠细胞引起的肿瘤耐药性和肿瘤复发和扩散问题。目前可用于ADC有效载荷的RNA抑制剂主要有两种：RNA剪接抑制剂(Thailanstatin及其类似物)和RNA聚合酶II抑制剂(Amatoxins)。 3.3.1. 泰兰他汀(Thailanstatin) RNA剪接主要通过切除负责将RNA转化为mRNA的复杂细胞机制的内含子和外显子来控制代谢、血管生成、癌细胞增殖和转移，它们还可以直接控制转录的起始、延长和终止，这是癌症抑制的生物学靶点。Abdel-Wahab等研究发现在RNA剪接调控药物的干扰下，肿瘤细胞可以产生新抗原，这些新抗原可以通过MHC I类分子以新抗原表位的形式呈递，从而激发抗肿瘤免疫，表明RNA剪接调控可以作为肿瘤抗原的潜在来源，具有应用于肿瘤免疫检查点治疗的潜力。剪接体抑制剂是强效的抗增殖药物，能够靶向活跃分裂和静止的细胞，因此RNA剪接体抑制剂是一类很有前途的ADC有效载荷。Thailanstatin是一种天然产物，最初从泰国布鲁氏菌msmb43中分离得到，通过与剪接体U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基结合而被激活。Thailanstatin 家族通过抑制真核生物的 mRNA 剪接途径，对剪接体具有很强的结合和抑制作用，导致低纳摩尔 IC50 个值适用于多种癌细胞系，可用作 ADC的潜在有效载荷。 Yi-Qiang Cheng报道了从MSMB43 中分离得到的三种新的 thailanstatin 化合物：thailanstatin A (81)、thailanstatin B (82) 和 thailanstatin C (83) (图 13)。Thailanstatin A(81)是一种潜在的天然抗癌药物候选物，Thailanstatin药物整体结构与剪接体抑制剂候选物FR901464 (84)相似，不同之处在于Thailanstatin的C1位缺少一个不稳定的羟基，而C17位则多了一个羧基部分，因此Thailanstatin具有更好的稳定性。Thailanstatin A(81)和FR901464 (84) C3位的高活性环氧物对抑制前mRNA剪接和癌细胞增殖至关重要，通过卤化修饰Thailanstatin B(82)和Thailanstatin C(83)可降低化合物的生物活性) 对环氧物的作用，向 Thailanstatin C (83)添加甲基(与 Thailanstatin B (82)相比)对化合物的生物活性没有显著影响。Stephan Rigol合成了 Thailanstatin 类似物85和86，它们的 IC50值为皮摩尔。辉瑞首次探索了 RNA 剪接抑制剂作为抗体药物偶联物的有效载荷，将含羧酸的Thailanstatin 半合成类似物87直接与曲妥珠单抗表面赖氨酸偶联，得到非常有效的 Thailanstatin ADC。化合物87其对应的ADC在HER2高表达的胃癌细胞株N87和MDR1过表达的细胞株中均有效(化合物87在N87细胞中的IC50为1.8 nmol/L)，此外该ADC在胃癌异种移植模型中，低至1.5 mg/kg剂量暴露即可产生优异的药效，优于临床批准的ADC T-DM1。 图 13. 泰兰他汀类似物的设计和SAR分析81-87。 3.3.2. 鹅膏毒素(Amatoxins) 鹅膏毒素于1941年由Heinrich Wieland和Rudolf Hallermayer首次分离出来，鹅膏毒素是由核糖体合成的有毒双环八肽，是真核RNA聚合酶II的选择性抑制剂，可导致细胞凋亡。鹅膏毒素含有八个l构型氨基酸的大环，色氨酸和半胱氨酸残基通过亚砜部分连接，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。对鹅膏毒素研究最深入的是α-鹅膏毒素(88)，含有6-羟色氨酸(Htp)、反式-4-羟脯氨酸(Hyp)和(3R, 4R)-4,5-二羟基亮氨酸(Dhil)，是迄今为止已知的最有效、最特异的RNA聚合酶II抑制剂，具有突破耐药性或摧毁静息期肿瘤细胞的潜力，有效阻止肿瘤转移和复发(图 14A)。 Roger D. Kornberg团队分析了RNA聚合酶II- α-鹅膏蕈碱的晶体结构，发现抑制剂的位置与Bridge Helix相邻，而Trigger Loo在远离添加位点处主要处于稳定构象(图 14B)。α-鹅膏毒肽环肽骨架形成一个口袋，允许特定的互补氢键与Rpb1 His1085侧链咪唑环结合，为Trigger Loo形成一个约束点，α-鹅膏毒肽口袋对咪唑的特异性主要通过Gly7的酰胺NH与Rpb1 His1085 N(D1)的相互作用以及Asn1的羰基与Rpb1 His1085 NH(E2)的相互作用实现。研究表明，α-鹅膏毒肽通过直接干扰RNA聚合酶II的Trigger Loo来抑制RNA聚合酶II的延伸，并表现出缓慢降低的底物选择性。 图 14. 鹅膏毒肽的设计和 SAR 分析。 (A) 鹅膏毒肽 88、89 的化学结构； ( B ) α-鹅膏毒肽 (88) 与 RNA 复合物的结合模式。 鹅膏毒素引起的细胞凋亡、坏死等毒性阻碍了其临床应用，但由于其分子量小、在水溶液中溶解性好、能抑制RNA聚合酶Ⅱ，近年来作为抗体-药物偶联物的有效载荷在癌症研究中受到越来越多的关注。α-鹅膏毒素ADC很可能同时作用于增殖细胞和静止期肿瘤细胞，在ADC领域，使用鹅膏毒素作为有效载荷是一种比较新的方法。HDP-101，一种由海德堡制药公司开发的以鹅膏毒素为载荷的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的ADC，目前正处于I/IIa期临床试验，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤，并于2022年2月15日完成首例患者给药。HDP-102是一种靶向CD37的ADC药物，靶向治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。HDP-103靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)，靶向适应症为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。Steffen Goletz113将β-鹅膏毒肽(89)的羧基与IgG赖氨酸的氨基偶联，得到一种具有良好血浆稳定性和高细胞毒性的ADC(图 14A)。 以泰兰他汀(thailanstatin)和鹅膏毒素为载荷的ADC能够避免耐药性，有效对抗休眠肿瘤细胞，而现有的标准疗法很难达到这一效果，常常导致肿瘤复发和耐药。因此，除了微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂作为载荷外，新一代RNA抑制剂作为ADC载荷也越来越受到关注。虽然目前还没有RNA载荷的ADC上市，但其巨大的潜力值得进一步挖掘。 3.4. 免疫 ADC 有效载荷 最初ADC 仅限于肿瘤学，然而它们的临床成功鼓励了 ADC 在其他治疗领域的应用，最引人注目的是免疫学。肿瘤免疫涉及 T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们通过免疫调节将冷肿瘤转化为热肿瘤，最终增强免疫治疗的效果，免疫检查点抑制剂通过消除肿瘤对 T 细胞的抑制来增强 T 细胞的抗癌免疫反应。然而，对于没有自发性 T 细胞反应和肿瘤周围 T 细胞浸润的癌症患者(其肿瘤通常称为冷肿瘤)，免疫检查点抑制剂效果不佳。因此，免疫疗法研发的重点之一是开发能够刺激患者先天免疫反应并促进肿瘤特异性 T 细胞募集的抗癌疗法。与传统ADC不同，免疫刺激抗体偶联物(immune-stimulating antibody conjugates, ISAC)结合了抗体导航靶向的精准性和基于小分子调节先天和适应性免疫系统的强大功能。一方面，抗体偶联免疫激动剂类型的小分子，起到增强免疫反应的作用；另一方面，抗体的肿瘤靶向性降低了小分子免疫激动剂的毒性。在靶标选择方面，传统ADC由于载荷毒性必须严格限制肿瘤特异性抗原，而免疫调节ADC可以拓展更多的肿瘤相关抗原。在内吞作用方面，传统ADC是靶向抗原介导的内吞作用，直接杀死癌细胞，而免疫调节ADC通过免疫细胞表面的FcγR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，多种免疫调节ADC药物正在开发中，新的有效载荷主要包括Toll样受体(TLR)激动剂和干扰素基因刺激剂(STING)激动剂，该领域具有巨大的发展潜力。 3.4.1. Toll 样受体激动剂 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLR)是一类重要的参与先天免疫的蛋白质分子，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR 受体的激活能够改善肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递，促进 CD8+ T细胞。Toll样受体激动剂作为免疫增强剂，在肺癌、黑色素瘤、白血病、胶质瘤等肿瘤中直接或间接诱导增强的抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制肿瘤生长。因此，将TLR激动剂应用于肿瘤免疫治疗，有望激活先天免疫反应，介导获得性免疫反应，使冷肿瘤变热，解决单一免疫检查点抑制剂应答率低的问题，提高免疫治疗的有效性，达到重塑肿瘤微环境的目的。目前，TLR已成为免疫治疗领域的研究热点之一，而在TLR家族成员中，研究者较多关注的是TLR7、TLR8、TLR9。TLR8激动剂(90) (91)激活DC细胞并增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤(图 15)，然而免疫治疗往往伴随副作用，如细胞因子释放综合征，这是一种常见的引起全身炎症的疾病。TLR8激动剂的全身给药也存在相关的毒性，限制了患者可以服用的TLR8激动剂的数量。因此，将TLR8激动剂应用于ADC，可以同时结合抗体的靶向作用和TLR8的免疫调控作用，减少毒副作用。Toshiyuki Shimizu团队发现TLR7 TM螺旋与TLR7-TLR信号调节剂(UNC93B1) TM3和TM6螺旋及近膜区对齐，LRR-CT基序与UNC93B1 N末端六螺旋束的腔侧相互作用。TLR7–UNC93B1复合物的二聚化由TLR7-TLR7和UNC93B1-UNC93B1相互作用介导，它们分别发生在2：2复合物的顶部和底部区域。LRR11从TLR7 ECD中部区域突出的环区主要有助于TLR7的二聚化，而UNC93B1两个原体TM6和TM7连接区域的胞内螺旋以反向平行的方式相互作用，该研究阐明了TLR'的结构基础与 UNC93B1 的相互作用并促进了随后设计针对自身免疫疾病的化合物。 图 15. TLR激动剂的设计和SAR分析90-92。 Silverback 的 SBT6050是一种抗 HER2 抗体结合物，含有 TLR8 激动剂91作为其有效载荷，在体外以HER2依赖的方式驱动多种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中表现出良好的抗肿瘤作用(图 15)。一类新的TLR7/8双重激动剂已被报道能促进肿瘤对免疫检查点抗体的反应，尤其在冷性肿瘤中。虽然该团队发现的小分子具有显著的抗肿瘤作用，且与PD-1和PD-L1抗体联合使用可观察到显著的协同作用，但与其他已报道的TLR激动剂类似，小分子在外周血中仍然过度暴露，导致更明显的免疫相关不良反应(immune-related adverse reactions, irAE)，如体重减轻和流感样症状。为了避免直接服用TLR7/8激动剂可能引起的不良反应，团队于2015年开始尝试抗体偶联药物策略，经过数年探索，成功构建了一类新型免疫调节抗体偶联药物HE-S2，其以TLR7激动剂 (92)为靶点为有效载荷，动物实验结果显示，HE-S2(150μg/小鼠)具有非常显著的抗肿瘤作用，给药后大部分结肠癌小鼠肿瘤基本消失，而在黑色素瘤模型中，HE-S2治疗效果也优于对照组。重要的是，HE-S2治疗组小鼠没有出现明显的体重下降。此外，给药后小鼠肿瘤虽然有所萎缩，但肿瘤微环境中肿瘤细胞表面及免疫细胞PD-L1表达明显增高，这可能有利于提高后续HE-S2给药的靶向性。新型ADC HE-S2不仅通过阻断PD-1/PD-L1相互作用、激活TLR7/8信号通路诱导强大的抗肿瘤免疫反应，而且还通过表观遗传调控和 IFN-γ，从而赋予 PD-1/PD-L1 阻断更高的敏感性。 Michael N. Alonso团队将 TLR7/8 激动剂与 HER2 抗体偶联，得到一种 ADC 药物，该药物通过识别 FcγR依赖的吞噬作用和 TLR 介导的肿瘤抗原激活，驱动髓系细胞肿瘤杀伤和随后的 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，适合全身给药，安全有效。此外，越来越多的公司开始将 TLR激动剂用于抗体药物偶联： Bolt 公司的 BCC-1001，用于治疗 HER2+ 阳性实体瘤，源自 HER2 的 TLR7/8 激动剂偶联，已进入临床研究；Sutro 的 IADC 技术可用于将抗体与 TLR 激动剂偶联；Tallac 的 TRAAC 技术用于位点特异性抗体与 TLR9 激动剂的偶联；ALX Oncology 的 SIRP α与Tallac合作开发的抗体可与TLR9激动剂偶联，恒瑞医药采用TLR7激动剂，百济神州采用TLR7/8激动剂，信达生物引入Bolt技术，采用TLR7/8激动剂进行偶联，Silverback公司的ImmunoTAC技术选择TLR8激动剂作为有效载荷。这些研究提供了一种增强免疫检查点阻断疗法抗肿瘤免疫应答的新型ADC策略，同时该策略也为解决直接使用免疫激动剂导致药物质量不佳的问题提供了一种思路。 3.4.2. STING 激动剂 干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)是天然免疫信号通路中的关键调控因子，具有启动机体天然免疫防御反应、促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是天然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。激活STING通路可诱导I型干扰素及多种其他细胞因子的表达和分泌，激活天然免疫反应，促进抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。STING激动剂广泛应用于多种研究领域，除了诱导天然免疫反应外，还参与其他DNA或RNA传感信号通路、自噬、ER应激和细胞凋亡。STING激动剂凭借抗肿瘤和免疫原性的特点，也成为新型免疫治疗试验药物和疫苗佐剂。现有的临床研究数据初步证明STING激动剂与免疫检查点抑制剂联合使用可显著增强免疫治疗疗效，有望成为一种创新疗法。非核苷小分子STING激动剂具有良好的稳定性，可以在动物模型中口服或注射给药，并显示出良好的抗癌活性。但由于STING蛋白也存在于健康细胞中，因此系统性STING激动剂需要解决的问题之一是如何刺激抗肿瘤免疫反应，而不会引起健康细胞过度的炎症反应。如果这些激动剂能够进一步优化，它们有可能彻底改变免疫治疗领域。 考虑到游离型STING激动剂的全身给药可能受毒性限制，且广泛的生物分布可能并不理想，可以考虑通过ADC实现STING激动剂的肿瘤靶向递送，以降低毒性。环状二核苷酸(CDN)(93)作为STING蛋白的天然配体已被广泛研究(图 16A)。顾立川团队确定了猪STING复合物的CBD(CDN结合位点)，该复合物含有4种CDN：2, 3 cGAMP；3, 3 cGAMP；c-di-GMP和c-di-AMP。其中，不对称配体2, 3 cGAMP与STING的结合亲和力最高(图 16B)。对猪 STING CBD 2′, 3′-cGAMP复合物进行结构分析，发现不对称单元包含两个 STING CBD 分子(原体 A 和 B)，形成二聚体。各个原体通过 α1、α2、α3 和中心β-片层区域相互作用，形成深 U 形裂口。2′, 3′-cGAMP 配体位于裂口处，嘌呤向上，核糖环向下(与膜相关)，碱基、磷酸和核糖基团均有助于与 STING 结合；2′,3′-cGAMP 的嘌呤环与两个启动子的 Tyr167 和 Arg238 堆叠；2′,3′-cGAMP 的磷酸部分通过静电相互作用和氢键被 Arg238 识别，Arg238 还在核苷部分的 Hoogsteen 边缘形成氢键。除了堆叠相互作用外，腺苷和鸟苷部分与 STING 具有不同的相互作用模式。对于两者，相互作用都涉及它们的 Watson-Crick、Hoogsteen 和糖边缘，嘌呤中的所有氮原子(9 位氨基除外)和氧原子都直接或间接(水介导)与 STING 蛋白相互作用，这些广泛的相互作用与配体和猪 STING CBD 之间的高结合亲和力一致。猪 STING CBD-2′, 3′-cGAMP复合物的一个显著特征是两个原体采用不同的构象，从而形成不对称的配体结合口袋。因此，同样不对称的 2′, 3′-cGAMP 在配体结合口袋中保持一种明确的构象。这种独特的结合模式与之前涉及其他物种的 STING 蛋白的结构中看到的结合模式形成鲜明对比，其中 2′, 3′-cGAMP 以两种替代模式与对称 STING 二聚体结合，腺苷和鸟苷部分互换位置。总之，研究发现猪 STING 采用不对称构象与 CDN 结合，对这种不对称构象的分析揭示了 STING 的配体识别和识别机制。 图 16. STING 激动剂的设计和 SAR 分析。 (A) STING 激动剂93-96的化学结构；(B) CDN (93) 与 STING 复合的结合模式。 以CDN作为ADC有效载荷，CDN与抗体可以通过磷酸酯、糖环、碱基等偶联，SPEROVIE将CDN中的硫代磷酸酯或甲酸酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联形成ADC药物；Immunesensor从CDN 3′位核糖上引出氨基或巯基，再通过氨基甲酸酯或二硫键与抗体偶联形成ADC药物；MIT和Millennium创新性地将磷脂分子偶联到CDN的磷酸酯上，所得缀合物还可进一步形成脂质体结构，提高其与细胞膜的融合能力。北京宣仪药将TLR9激动剂CpG-DNA与CDN连接形成融合分子，可同时激活TLR和STING免疫信号通路，增强免疫活性。然而，CDN结构中的二磷酸酯会导致药物的生物利用度降低。因此，随着苯并咪唑类化合物的发现，非核酸结构的STING激动剂的研究已经开始。基于二聚苯并咪唑的ADC药物也被设计和合成。Mersana使用STING激动剂94作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056已经进入临床前研究阶段(图16A)，其目的是通过刺激肿瘤组织免疫细胞和肿瘤细胞中的STING信号来激活先天免疫系统。与STING激动剂相比，XMT-2056的效力增加了100倍以上。在临床前模型中，XMT-2056在HER2高表达和低表达的模型中均显示出强大的抗肿瘤活性，当与多种批准的药物(包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、抗PD-1 mAb或DS-8201)联合使用时，其疗效得到增强。临床前数据表明，XMT-2056具有实现免疫记忆以延长抗肿瘤活性的潜力。今年5月，美国食品和药物管理局授予该药物治疗胃癌的孤儿药称号。Mersana计划在今年晚些时候启动XMT-2056的I期临床试验，以研究其在一系列HER2阳性肿瘤(如乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌)中的治疗潜力；日本小野制药开发了一种非核酸STING激动剂95作为有效载荷，通过药物结构中的吡唑环与连接剂偶联，RYVU是基于公司开发的一类与抗体形成ADC药物的硝基杂环胺STING激动剂96。 3.4.3. 糖皮质激素受体调节剂(GRM) 糖皮质激素受体调节剂 (Glucocorticoid receptor modulator, GRM) 通常用于治疗与各种疾病相关的炎症，有可能在保持 GR 逆转录效应(被认为是预期的抗炎作用的原因)的同时，将 GR 逆转录效应(被认为是不良副作用的原因)降至最低。然而，GRM 还会引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道副作用以及其他毒性，从而限制其治疗效果(尤其是长期使用时)。使用 GRM 作为免疫型 ADC 的有效载荷可能是一种理想的选择，因为靶向给药将最大限度地减少全身对 GRM 有效载荷的暴露，从而可以在不引起有害副作用的剂量下提供显着的疗效，并能够实现慢性给药。这种 ADC将结合单克隆抗体(针对炎症靶点)和选择性糖皮质激素受体调节剂的功效，糖皮质激素有效载荷含有胺基官能团，可用于结合溶酶体可切割抗体连接子。首次报道 GRM 作为 ADC有效载荷时使用了已知的地塞米松(dexamethasone) (97) (图 17A)，GRM ADC抗体组分选择了α-TNF，连接子则连接在地塞米松的C21羟基上。艾伯维正在开发的ABBV-3373也是由α-TNF和GRM组成的ADC药物，可以精准靶向调控活化免疫细胞，调节TNF介导的炎症信号通路，显著降低糖皮质激素相关的全身副作用，并有望治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)。近期，Adrian D. Hobson启动了α-TNF-GRM ADC项目，并获得了α-TNF-GRM ADC (DAR=4)，使用马来酰亚胺-Gly-Ala-ALA 作为连接子。P1NP 和皮质酮生物标志物的分析表明，ADC 在疗效和不良反应之间具有足够的治疗窗口。在慢性小鼠关节炎模型中，α-TNF-GRM ADC 比具有相同 GRM 有效载荷的α-TNF 单克隆抗体和同型对照更有效。 图 17. 糖皮质激素受体调节剂 (GRM)的设计和 SAR 分析。 (A) GRM 97-102的化学结构； (B) 化合物97与 GR 复合的结合模式； (C) 化合物98与 GR 复合的结合模式。 Victor Gualla研究小组确定了 GR 与地塞米松(97) 和98 (前体药物环索奈德的活性代谢物) 的晶体结构，GR 和地塞米松(97) 的结构采用开放构象，GR 在 H6–H7 区域表现出较高的突变频率。对 PDB 共晶体结构进行评估，其中配体在 GR 的配体结合域 (残基 500–777) 中复合，揭示了与 GR 复合的去异丁酰环索奈德的结构 (图 17B 和 C)。Peter S. Dragovich合成测试了多种含有不同胺取代缩醛基团的类似物，其中哌嗪化合物99表现出与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 33 nmol/L) 相似的细胞活性。然而，化合物99的渗透性较差，这可能是由于化学结构中存在碱性胺，从而削弱了其细胞功效。化合物99使用二肽基蛋白酶 (Ala-Ala) 可切割连接子与抗 TNF mAb 结合，所得结合物在基于细胞的评估中活性较弱 (IC50 = 8.1 μmol/L)。进一步研究发现含苯胺的化合物100比化合物99更有效，且其 GR 结合和细胞活性与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 =4.0 nmol/L) 相似或更好。随后，通过将化合物100通过含有蛋白酶可切割的二肽部分但缺少氨基苄氧羰基间隔基的连接子与抗 TNF 单克隆抗体结合，所得结合物在含有膜结合 TNF 的细胞中表现出强的 GR 活性，而在外部缺乏该蛋白质的细胞中表现出最小的活性(GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 0.44 μmol/L；GRE细胞，mTNF，IC50>50 μmol/L)。在胶原诱导性关节炎 (CIA) 模型中，以 1、3 和 10 mg/kg 的剂量对小鼠进行腹膜内注射，在 21 天内爪肿胀程度呈剂量依赖性下降。重要的是，这种结合物具有较低的毒副作用。因此，通过抗体结合物靶向递送糖皮质激素可以最大限度地减少不良副作用，同时提高未结合化合物的抗炎活性。 William Olson团队描述了新的糖皮质激素类药物，他们开发 GC 结合物 (GC-ADC) 的策略是确定布地奈德(budesonide)中可以进行修改的区域，以提高结合物对新游离有效载荷的稳定性和滴度。然后评估了两种布地奈德的修饰方法：首先，用胺或苯胺取代 C21 羟基，其次，用氟取代 C9 和 C6 氢。含有胺和苯胺的有效载荷可以通过氨基甲酸酯键与抗体结合，氨基甲酸酯键比羟基提供的碳酸酯或磷酸酯键更稳定。该团队获得了两种先导化合物101和102，通过对布地奈德分子的SAR分析和分子模拟。化合物101、102的功效测试发现，这两种化合物对糖皮质激素受体(GR)的选择性高于其他核激素受体，在细胞试验中具有与布地奈德更好或相同的效力，在hERG中没有心脏毒性，在Ames中没有遗传毒性，并在体内促炎小鼠模型中表现出效力。在脂多糖(LPS)刺激的小鼠中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放) 显著降低。随后通过组氨酸蛋白酶可切割连接子获得的 GC-ADC 在血浆中高度稳定，并特异性地在抗原阳性细胞中释放 GC，这表明这些新型 GC 可以作为 ADC 有效载荷来治疗自身免疫和炎症疾病。 免疫激动剂全身给药时会激活非特异性免疫反应，严重时可引发致命的细胞因子风暴。将免疫激动剂与肿瘤靶向抗体偶联，可将免疫激动剂递送至肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫刺激剂全身给药的严重毒性，有助于避免抗肿瘤治疗中的全身副作用。然而，虽然通过诱导免疫机制发挥抗肿瘤作用的免疫刺激ADC药物思路非常清晰，临床前数据也相对较好，但在临床试验中剂量依赖性毒性问题却难以解决。激动剂疗效提升的同时，毒性也会随之提升，难以确保疗效提升的方式能够安全可靠，例如在小鼠肿瘤模型中展现出良好抗肿瘤效果的SBT6050，目前因毒性问题，在临床研究中效果不佳，因此后续研究最重要的考量就是毒性与疗效的平衡，重新设计以减弱毒性、改善给药窗口也是非常有利的。 3.5. 新型潜在 ADC 有效载荷 3.5.1. Bcl-xL 抑制剂 Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和耐药性中起重要作用，理论上，阻断 Bcl-xL 上 BH3 结合域的药物可以引发癌细胞凋亡。然而，Bcl-xL 对血小板存活至关重要，而 Bcl-xL 的泛抑制剂可能会产生血小板毒性。将 Bcl-xL 视为 ADC 药物有效载荷的靶点，可以保留 Bcl-xL 抑制剂的活性，同时降低其对血小板的毒性。Tomoyasu Ishikawa 对 Bcl-xL 抑制剂 ABT-737 (103) 与 Bcl-xL 共结晶，结果表明，化合物的联苯部分(单元 W)在由 Phe146、Leu130、Leu108 和 Phe105 组成的口袋中形成亲脂性相互作用(西部区域；h1 H2)，而化合物的烷基磺酰胺部分(单元 E)在由 Phe97、Tyr195 和 Tyr101 组成的另一个口袋中形成亲脂性相互作用(东部区域；h4)(图 18)。单元E中三个芳香环形成分子内π-π相互作用，形成独特的刚性U型构象，该构象可能增强ABT-737(103)与Bcl-xL的分子间结合。此外，研究了一系列小分子抑制剂的构效关系，发现单元E对Bcl-xL的抑制作用比单元W更重要，尤其是B环。晶体结构和构效关系分析将为设计更有效的抑制剂进行ADC载荷鉴定提供基础。 2017年，AbbVie首次将Bcl-xL抑制剂104与Bcl-xL偶联，作为有效载荷以 ADC 的形式传递给抗 B7H3 抗体，得到针对 EGFR 的 ABBV-155，该药物仍处于临床试验阶段(WO2017214301A1、WO2017214282Al)。 图 18. Bcl-xL 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) Bcl-xL 抑制剂103、104 的化学结构；( B) ABT-737 (103) 与 Bcl-xL复合的结合模式。 3.5.2. NAMPT 抑制剂 烟酰胺磷酸核糖转移酶 (Niacinamide phosphate ribose transferase, NAMPT) 可将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸，是一种控制细胞内 NAD+ 浓度的限速酶。当 NAMPT 受到抑制时，NAD+ 水平会降至代谢所需的水平以下，从而导致能量危机并最终导致细胞死亡。尽管 NAMPT 抑制剂是有效的细胞毒性分子，但由于其毒性，它们在癌症治疗中用作化疗药物受到阻碍。几种NAMPT 抑制剂，如 FK-866 (105) (图 19A)因剂量依赖性毒性而停止临床试验。但 NAMPT 抑制剂结构简单、药效强，且其激活机制不同于目前的 ADC 有效载荷，因此 NAMPT 抑制剂可作为具有良好活性和耐受性的 ADC 有效载荷，有望改善 NAMPT 抑制剂的治疗窗口，进而应用于临床环境。Chris Tse 及其团队发现了新型非底物 NAMPT 抑制剂，它们具有强大的临床前疗效和药代动力学特性，可实现口服给药，该系列的先导分子A-1293201 (106)，含有异吲哚啉“头部基团”，可有效抑制重组人 NAMPT。通过 X 射线晶体学检查 A-1293201 与 NAMPT 之间的相互作用，发现了几个不同的协同相互作用位点(图 19B)。这些位点包括 PRPP 结合亚位点 A，其本质上是亲水性的，未被烟酰胺占据；烟酰胺结合亚位点 B，在此与烟酰胺进行重要的 pi 堆积和氢键相互作用；系链亚位点 C，其狭窄、亲脂性，未被结合烟酰胺占据；以及远端开口亚位点 D，其加宽并提供多个结合水分子和疏水表面。与 FK866 类似，A-1293201 的异吲哚啉脲部分参与亚位点 B 中的重要 pi 堆积相互作用以及亚位点 C 中的氢键和疏水相互作用。与 FK866 以及最近的第二代 NAMPT 抑制剂相比，异吲哚啉脲化合物是第一种已知的强效非磷酸核糖基化 NAMPT 抑制剂。Carl Uli Bialucha设计的新型 NAMPT 抑制剂107在 nmol/L 范围内对 NCI-H526、MDA-MB453 和 NCI-N87 等多种细胞系有效，构效关系表明吡啶氮可被 NAMPT 酶磷酸化，是药效团的重要组成部分。此外，整个 3-吡啶 (S, S) 环丙基甲酰胺基团对于高水平的细胞活性至关重要。R3 区域可以容忍多种取代基，乙基取代基化合物108是通过替换更刚性的未取代苯环获得的，其对 A2780 和 CORL23 细胞系的作用与化合物107相似。苯环可进一步衍生化，以提供最佳的连接载体，在苯环对位添加哌嗪取代基是耐受性良好的化合物109，哌嗪基团上的游离二级胺可作为连接子的结合点与抗体结合。R3处的苯基哌嗪取代以及R1和R2分别被F和H取代，得到略有改善的类似物110 ，其在nmol/L浓度下对C-Kit和HER2表达细胞系有效。使用不可切割连接子与有效载荷110获得的抗c-Kit缀合物不仅具有低聚集性，而且具有最佳的抗CKIT活性(IC50分别为 9 和 40 pmol/L)，并被证明是 c-Kit 阳性胃肠道间质瘤 GIST-T1 异种移植模型的靶向药物。ADC 的有效载荷需要包含活性杂原子才能结合可切割的连接子，而 FK-866 缺乏氨基、羟基或巯基官能团。为了获得易于集成并保持效力的有效载荷，Peter D. Senter制备了一系列 FK-866 类似物，在芳香尾部的不同位置进行苯胺取代。进一步评估了这些化合物对 L540cy、A549 和 HepG2 细胞系的细胞毒性。化合物111在两种测定中都表现出与 FK-866 相似的效力，NAMPT 和化合物111的晶体结果表明，新加入的苯胺基团通过氢键与 Glu376 的主链酰胺相互作用，可能抵消了添加极性官能团所导致的任何去溶剂化损失。用吡啶基氰基胍基团中发现的强效抑制剂 chs-828 制备的化合物112和用吡啶基方酰胺基团制备的化合物113保留了与NAMPT 的强结合力并具有强细胞毒性，这些化合物已作为 ADC 药物有效载荷进入评估阶段。在耐受性良好的剂量下，在几种肿瘤模型中显示出显著的活性水平。 图 19. NAMPT 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A)NAMPT抑制剂105-113的化学结构；(B)A-1293201(106)与 NAMPT 复合的结合模式。 3.5.3. 卡马霉素(Carmaphycins) 蛋白酶体活性抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有超强的细胞毒性，环氧酮蛋白酶体抑制剂carmaphycins就是此类的代表。从海洋蓝藻Symploca sp.中分离鉴定出的carmaphycins A(114)和B(115) ，其α，β-环氧酮直接与甲硫堇亚砜或甲硫堇砜结合，在低纳摩尔浓度下抑制蛋白酶体的β5亚基，对多种癌细胞系有效(图 20)。但由于其选择性较差，常常表现出毒副作用。使用剧毒的carmaphycins衍生物作为ADC有效载荷，既能保持所需的效力，又能获得更好的耐受性。carmaphycins可分为四个不同的部分(P1-P4)，William H. Gerwick通过替换6-氨基己酸链，合成了第一代类似物116，其P4末端带有胺基，这显著降低了对NCI-H460细胞的杀伤作用(IC50 = 860 nmol/L)。第二代carmaphycins类似物在P2处含有2-氨基乙基同型半胱氨酸残基，直链烷基链被芳香族苯基或吡啶环取代，得到类似物117，其对HCT116和NCI-H460的细胞杀伤作用低于carmaphycins B(115)，因为P2的脂肪胺在生理pH下呈碱性且带正电荷，降低了其细胞通透性。为了降低P2处的碱性，该团队将carmaphycin B(115)的P2甲基砜部分替换为4-硫代苯胺或4-磺酰基苯胺，得到化合物118或119。化合物119比118更有效，这意味着碱性胺的效力越少越好。此后，合成了在P1和P2处含有两个亮氨酸-环氧酮药物簇的类似物120，其IC50在HCT116和NCI-H460细胞系中的IC50 分别为0.2和5.4 nmol/L，P1处的环氧酮对化合物120的强效细胞毒活性至关重要。类似物121含有含苯胺的P3侧链，对SKBR3细胞的IC50为21 nmol/L。与化合物121相比，将苯胺官能团置于类似物122的P4位置可更有效地抑制细胞生长。类似物系列中的化合物119保持了较高的细胞效力，但与游离抗体相比，其目前的偶联ADC对所测试的癌细胞系并未表现出更优异的细胞杀伤能力。 图 20. 卡马霉素类似物114–122的设计。 3.6. 新型ADC有效载荷 3.6.1. 以PROTAC分子为有效载荷的ADC ADC 开发的主要挑战与剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity, DLT) 有关，这表明很难平衡药物治疗的疗效和脱靶毒性。ADC 实际输送到肿瘤的药物剂量非常小，这意味着药物分子必须具有极强的细胞毒性，尽管这会导致毒性副作用。PROTAC 是一组双功能化合物，由靶向目标蛋白 (POI)的配体、E3 连接酶的配体和连接子组成。PROTAC 将 POI 和 E3 连接酶拉近，用泛素化标记 POI，然后将其由蛋白酶体降解。PROTAC 具有催化作用，因此可以在较低剂量下有效降解目标蛋白。PROTACs可能是ADC理想的有效载荷，将抗体与PROTAC分子偶联形成的抗体PROTAC偶联物可以在特定细胞中特异性降解靶蛋白，实现PROTAC技术在细胞或组织水平的选择性。抗体-PROTAC偶联物将PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性相结合，从而克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性，具有靶向新靶点的巨大潜力。 将靶向BRD4蛋白的PROTAC 123与HER2抗体连接，可形成分子量约为150kD的抗体PROTAC偶联物，平均每个抗体分子上有4个PROTAC分子(图 21)。抗体PROTAC偶联物能有效降解HER2高表达细胞SK-BR-3中的BRD4蛋白，而对HER2低表达细胞MCF-7中的BRD4蛋白无降解作用。BRD4抑制剂124通过基于马来酰亚胺的偶联反应与HER2靶向mAb的链间Cys残基偶联，得到可降低BT-474(HER2阳性)细胞系中BRD4水平的ADC偶联物。两种降解ERα的ADC最近也在专利文献中被描述，第一种是将基于VHL的PROTAC 125通过以下方式连接到HER2靶向mAb上碳酸盐部分；第二个 ADC 使用含酶可切割的焦磷酸连接子连接到同一 PROTAC 的 VHL 结合区。在 MCF7-neo/HER2 细胞中，两种结合物均表现出有效的抗原依赖性 ERα降解，并且两种结合物在小鼠稳定性和药代动力学试验中均表现出可接受的结果。PROTAC 126具有 CRBN 作为 E3 连接酶并靶向 TGF-β R2 蛋白，可通过不可切割的连接子与抗 HER2 抗体偶联。在转染 HER2 受体的 HEK293 细胞中，0.5 和 1.0 μmol/L 的 ADC 在 24 和 48 h后降解了 TGF-β R2 蛋白。此外，使用PROTAC 127单次静脉注射 1 mg/kg ADC，一种基于 VHL 的可降解 BRM 蛋白，作为有效载荷，在已知表达高 CD22 表面受体的 BJAB 淋巴瘤异种移植肿瘤中实现了 BRM 蛋白的强效、抗原依赖性还原。该结合物在体内表现出所需的生物活性，并进一步多样化了可通过 ADC 模式成功调节的靶蛋白，扩大了将 PROTAC 靶向表达该表面蛋白的细胞的可能性。 图 21. PROTAC 分子123–127的化学结构。 尽管抗体-PROTAC 偶联物领域仍处于起步阶段，但已经创建了一组多样化的此类实体，其成员随后已显示出有意义的体外和/或体内生物活性。与大多数已知的细胞毒性 ADC (DAR=2-4)相比，许多这些新实体采用了更高的有效载荷有效载荷(DAR=6)，但对于典型的抗体-PROTAC 偶联物应用，这种增加是否通常是必需的仍有待确定。在体内和体外都实现了抗原依赖性活性的多个例子抗体-PROTAC 结合物与所述结合物进行了比较，这些结果证明了抗体-PROTAC 结合物能够将其各自的 PROTAC 有效载荷递送至特定肿瘤和/或目标细胞。鉴于这些有希望的初步结果，抗体-PROTAC 结合物似乎为未来的发展和应用做好了准备，预计未来抗体-PROTAC 结合物将应用于组织或生物体，为药物治疗或生物学研究提供新思路。 3.6.2. 以NIR-PIT药物为有效载荷的ADC 近红外光免疫治疗(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)药物一般由靶向肿瘤的肿瘤特异性单克隆抗体和光激活化学物质通过连接子组成，本质上是ADC药物。NIR-PIT药物可以与照射红外光到肿瘤部位的装置一起，形成一个新的靶向抗癌平台。该平台使抗体介导的靶向递送达到高度的肿瘤特异性，同时利用红外光激活药物的生物物理机制，精准诱导癌细胞快速死亡，而不伤害周围的正常组织。NIR-PIT药物诱导的多克隆免疫反应可以消灭在NIR-PIT药物第一步中存活下来的肿瘤细胞，即使NIR-PIT药物不足、递送不均匀，或由于靶抗原表达不均匀导致剂量不足，因为后续的第二步多克隆免疫反应也会杀死残留的肿瘤细胞。此外，NIR-PIT 药物还可以作为先前存在的 PD-1 单克隆抗体、PD-L1 单克隆抗体或 CTLA-4 单克隆抗体的有益补充，增强其肿瘤免疫反应。NIR-PIT 药物中的有效载荷不是细胞毒性物质，而是水溶性酞菁衍生物(例如硅酞菁衍生物 IR700 (IRDye700DX)(128)(图 22A)。IR700是一种小的光活化分子，可被近红外光激发，无光毒性或生物毒性。当抗体与肿瘤表面抗原结合时，在近红外光的刺激下，IR700发生光诱导配体释放反应，释放亲水侧链，导致剩余部分的疏水性显著增加。这反过来会破坏细胞膜，引发针对癌细胞的快速、高选择性免疫原性细胞死亡(ICD)(图 22B)。NIR-PIT诱导的ICD在直接杀伤癌细胞的同时，可以导致癌细胞接近死亡的未成熟树突状细胞快速成熟，启动宿主的抗癌免疫反应，促进针对死亡癌细胞释放的抗原的CD8+ T细胞重新形成，进一步放大NIR-PIT的治疗效果。 图 22. IRDye700DX (128)的设计与分析。 (A) IRDye700DX (128) 的化学结构；(B) NIR-PIT ADC 的作用机理。 乐天医疗的西妥昔单抗沙罗他洛康于2020年以商品名Akalux获得PMDA加速批准，是一种由西妥昔单抗和水溶性硅酞菁衍生物IRDye700DX组成的抗体偶联药物，靶向表皮生长因子受体，用于治疗无法切除的局部晚期或局部复发性头颈癌，是全球首个获批的光免疫治疗药物。给药24h后，该药物可特异性聚集在EGFR阳性肿瘤细胞表面。使用690nm波长的近红外光照射肿瘤部位，诱导西妥昔单抗沙罗他洛康杀死癌细胞并激活免疫反应，在NIR-PIT药物研究中进展最快的是乐天医疗的ASP-1929(又名RM-1929)。ASP-1929是西妥昔单抗与IR700的结合药物，靶向表皮生长因子受体EGFR，可用于治疗无法切除的局部晚期或复发性头颈癌。除了ASP-1929，乐天医疗还有一款NIR-PIT药物，在临床前研究中与PD-1单克隆抗体联合在晚期肿瘤动物模型中表现出优异的抗肿瘤活性。其他一些NIR-PIT药物研究，包括131I(PcMAb)(CD38单克隆偶联NIR-PIT药物)、TROP-2-IR700、雷莫芦单抗-IR700、偶联物AvIR介导的PIT、抗TF抗体1849-ICG偶联物、MN-14-700DX、Avelumab-IR700等均以IR700为有效载荷。 作为ADC领域的“冷门赛道”，光免疫ADC的临床和市场前景尚需经过时间的考验，但基于相关原理开发新靶点和新型光激活效应分子或将成为ADC赛道新的突破点。 3.6.3. 双载荷ADC 随着 ADC 治疗耐药性的出现，将一种抗体与两种甚至多种不同的细胞毒性有效载荷结合为开发下一代 ADC 提供了一个有吸引力的选择。为了证明双有效载荷药物 ADC 的可能优势，Levengood 等在 2017 年制备了一类含有两种不同微管蛋白聚合抑制剂的 ADC，该团队将具有不同物理和化学性质的 MMAE 和 MMAF 与同一种抗 CD30 抗体结合，以发挥互补的抗癌活性。这项工作清楚地展示了一种构建强效双药 ADC 的潜在有效方法，以及如何递送多种细胞毒性有效载荷来提高 ADC 活性。后来，Kumar 等开发了一种异质三功能连接子，该连接子结合 MMAE 和 PBD二聚体有效载荷以产生双有效载荷药物 ADC。Nilchan 等使用双抗体结合方法，通过在工程硒化半胱氨酸和半胱氨酸残基位点特异性结合HER2 抗体，生成含有靶向微管蛋白有效载荷 MMAF 和 DNA 拓扑异构酶 II 抑制剂 PNU-159682 的双有效载荷 ADC。PNU-159682 由于其 DNA 损伤活性而导致 S 期细胞周期停滞，而 MMAF 同时抑制微管蛋白聚合并导致 G2/M 期细胞周期停滞。双药物 ADC 对 HER2 表达细胞系表现出选择性和强效细胞毒性，并表现出与所连接药物一致的双重作用机制。 ADC药物经常会遇到肿瘤内异质性的问题，例如乳腺癌通常由多种具有不同基因表达谱的细胞组成，其异质性是化疗后产生耐药、复发和转移的主要因素。为了解决这一问题，Kyoji Tsuchikama通过化学酶联法高效构建了一系列具有明确药物抗体比(DAR)的双有效载荷ADC(DAR组合分别为2+2、4+2和2+4)，并且DAR调节的灵活性有利于根据疾病靶点和有效载荷组合精细调节ADC的理化性质、疗效和毒性(图 23)，其中DAR为(4+2)的MMAE/MMAF双药ADC比DAR为4或6的MMAE单药ADC疗效更佳，且具有特异性的HER2细胞杀伤能力、理想的药代动力学性质、最小的炎症反应、治疗剂量下的边缘毒性。此外，在HER2异质性及T-DM1耐药性增加的JIMT-1/MDA-MB-231混合异种移植瘤小鼠模型中，双药有效载荷ADC比两种单药组合有更好的治疗效果和生存获益。原因可能是更强的MMAF分子杀死JIMT-1细胞，有助于结合的MMAE分子有效发挥对邻近的MDA-MB-231细胞的旁观者效应。重要的是，这种显著的疗效无法单独通过MMAF ADC和MMAE ADC的1：1组合来实现。双有效载荷 ADC 的增强疗效还在另一种乳腺癌的 hCC1954-TDR 异种移植小鼠模型中得到证实，这种乳腺癌具有低 HER2、肿瘤内异质性和 T-DM1 耐药性。结果凸显了双有效载荷 ADC 克服乳腺癌异质性和耐药性的潜力，表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有希望的 ADC 治疗方法，可用于治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症，这表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有前途的方法。 剑桥大学的研究人员利用他们的Synthemer平台设计了一种双有效载荷ADC，它结合了MMAF羟丙基酰胺(AF-HPA)和DNA单烷基化剂(I-BiP)，表现出很强的细胞毒性，可以发挥两种作用机制。然而，虽然多有效载荷ADC药物可以提高疗效，降低耐药性的可能性，但它们治疗引起的副作用也值得考虑。例如，Mersana开发的靶向NaPi2b的新型ADC药物Upifitamab Rilsodotin(UpRi，XMT-1536)通过抗HER2单抗HT-19的切割连接子与MMAF结合(DAR=12)。XMT-1536具有极强的抗肿瘤活性，尤其是对HER2低表达的癌症，但卵巢癌中期I期临床数据显示，XMT-1536可引起严重的治疗相关副作用，发生率高达48% (47/97)，最常见的副作用为胃肠道梗阻(7%)，发热、肺炎、腹痛发生率为5%。虽然Mersana尝试降低剂量，但治疗窗选择范围较窄，前景不容乐观。因此，对于多有效载荷ADC，安全性控制是进行多类有效载荷组装时需要注意的重要问题，关键是找到并解决治疗窗口狭窄的原因，未来的研究也应继续朝着疗效和毒副作用之间的平衡方向发展。 图 23. 双有效载荷药物 ADC 的模式图(红色和绿色形状表示不同的有效载荷)。 3.6.4. PDC 的有效载荷 肽药物偶联物(Peptide drug conjugates, PDC)是一种新型靶向治疗方法，由连接子、归巢肽和细胞毒性有效载荷组成。与ADC药物相比，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透力强、免疫原性低、可采用固相合成大规模合成、生产成本低、药代动力学相对较好、批次产品相对均匀等优势，是继小分子靶向药物、单克隆抗体、ADC之后的新一代靶向抗肿瘤药物。但PDC作为治疗药物的应用也存在一定的局限性，如口服生物利用度低、半衰期短、部分有效载荷切割不完全导致生物活性与原型药物相比明显降低、靶向性可能不如ADC等。PDC的作用机制根据连接子和归巢肽的不同而不同，一种是PDC被内化并在细胞内释放有效载荷，另一种是在肿瘤微环境中PDC被切割，有效载荷被内化并发挥作用(图 24A)。大多数载荷不仅可以杀死靶标高表达的肿瘤细胞，还可以通过肿瘤微环境中的旁观者效应杀死周围靶标低表达或不表达的肿瘤细胞。多肽可影响PDC内化的效率，理想的PDC多肽应具有靶标结合亲和力强、稳定性高、免疫原性低、内化率高、血浆半衰期相对较长等特点。连接子的选择是PDC设计的关键因素之一，连接子需要平衡稳定性和释放效率，可切割的连接子释放效率较高，不可切割的连接子稳定性较高。载荷的毒性和理化性质可直接影响药物杀伤肿瘤的能力，从而影响其疗效，理想的载荷应具有细胞毒性高(通常IC50较低) 、免疫原性低、稳定性高、疏水性适宜、溶解性好等特点。 图 24. PDC 的关键结构和作用机制。 (A) PDC的一般作用机制；(B) 常见 PDC 有效载荷的化学结构。 PDC有效载荷可分为化学药物(图 24B)、蛋白质类药物、多肽类药物等，其中以化学药物和蛋白质类药物较为常见。常用的化学药物有DM1(2)、MMAE(8)、KSP抑制剂(45)、喜树碱(54)、阿霉素(129)、紫杉醇(130)、甲氨蝶呤(131)、柔红霉素(132)、吉西他滨(133)等；蛋白质类药物主要有干扰素和肿瘤坏死因子；放射性同位素也是PDC常用的有效载荷。PDCs用于癌症诊断时，可用正电子发射放射性同位素(氟-18(18F)、铜-64(64Cu)、镓-68(68Ga))标记，产生PET显像，通过与肿瘤细胞上的靶向受体结合，准确定位恶性组织；放射性同位素标记的PDC也可用于治疗。肽受体放射性核素治疗(PRRT)根据肿瘤细胞过表达的受体，对肿瘤细胞进行靶向和组织特异性放射，最常用的放射性同位素是铟-111(111In)、钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。 截至2023年4月，全球获批上市的PDC药物仅有两种，分别是Lutathera®和Pepaxto®。Lutathera®是诺华公司旗下Advanced Accelerator Applications SA开发的靶向生长激素抑制激素受体的PDC，进入细胞后释放放射性同位素177Lu，通过辐射损伤肿瘤细胞，于2017年9月首次获欧洲药品管理局(EMA)批准。在晚期神经内分泌肿瘤患者中，与高剂量长效奥曲肽相比，Lutathera®具有更长的无进展生存期和更高的反应率，于2018年1月26日获FDA批准。Pepaxto®是Oncopeptides公司开发的靶向氨基肽酶的PDC，由DNA烷化剂Melflufen(134)与氨基肽酶靶向肽共价连接。Melflufen 具有高亲脂性，可被骨髓瘤细胞快速吸收。一旦进入细胞，Melflufen 的结合肽立即被氨基肽酶切割，释放出亲水性烷化剂美法仑(Melphalan) (135)，造成肿瘤细胞DNA损伤，导致肿瘤细胞死亡。Pepaxto®于2021年2月首次获得FDA批准，与地塞米松联合使用，用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤。但同年10月，Oncopeptides公司宣布将Pepaxto®撤出美国市场，主要原因是验证性OCEAN研究中死亡率增加。2022年8月，Pepaxto®获得EMA批准。目前，全球共有17个PDC药物处于临床开发中，其中3个处于III期，9个处于II期，5个处于I期。PDC 是一种等效抗体-药物偶联物，克服了 ADC 的部分局限性，具有许多独特的优势。虽然目前上市的 PDC 药物较少，但曾出现过因严重安全性问题而退市的案例。但随着相关技术问题的解决和配套技术的突破，相信 PDC 药物也将成为未来十年拥挤赛道上研究和投资的热点。 4.结论 ADC药物开发前景广阔，因为它整合了特异性抗体以选择性靶向肿瘤细胞，结合了多种强效的细胞毒性有效载荷，并采用多样化的连接子技术来产生有效的癌症治疗药物。从技术角度来看，ADC药物至今已经历三代变革，在抗体、药物载体、连接子等方面均有突破，尤其是在有效载荷的使用上。 虽然新一代ADC载荷的特异性和细胞毒性比早期表现出了明显提升的特性，但目前的载荷仍然存在一些局限性： 首先，它们普遍对实体瘤的通透性和毒性有限，限制了它们在实体瘤中的应用。 其次，部分肿瘤对目前的ADC药物不敏感。 第三，载荷药代动力学的复杂性、肿瘤靶向性和释放不充分都会影响ADC药物的疗效。 第四，和其他抗肿瘤药物一样，ADC药物也会出现耐药性。 最后，早期的载荷选择往往是有毒但有效的药物，但它们较高的毒性限制了载荷的系统应用。 虽然抗体-药物偶联物在治疗中显示出有效性，与高毒性载荷的联用并不一定是极好的，因此其他类型的载荷如RNA抑制剂、免疫激动剂、促凋亡的Bcl-xL抑制剂等正在被开发。尤其是随着免疫检查点阻断疗法被FDA批准，肿瘤免疫治疗时代开始了。免疫激动剂ADC也被开发出来，其可以利用抗体将免疫激动剂运送到肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫激动剂全身给药带来的严重毒性问题。免疫激动剂(如Toll样受体、STING激动剂等)作为新型载荷在ADC中也越来越受欢迎，免疫调节ADC有望进一步增强免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫应答。虽然免疫ADC尚处于发展初期，尚未取得满意的临床效果，但免疫调节ADC有可能大大拓宽ADC的治疗窗口，提高其抗肿瘤活性，并具有理想的安全性和有效性。相信通过免疫调节载荷修饰设计靶向肿瘤微环境的ADC仍是未来研究领域的热点，尤其是使用对细胞不直接有毒性的载荷(例如可以引导免疫系统攻击癌细胞的载荷)。此外，使用PROTAC分子作为ADC载荷，可以充分结合PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性优势，并克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性(如耐药性、毒副作用等)。鉴于其良好的效果，PROTAC-ADC是未来ADC药物开发的重要方向。抗体结合载荷还包括来自植物的蛋白衍生酶(例如皂苷、蓖麻毒素A链)或细菌毒素(PE、假单胞菌外毒素、DT、白喉毒素)，通过催化不可逆地抑制蛋白质合成来诱导细胞死亡。新型载荷类别还包括寡核苷酸、siRNA、蛋白质等。为了解决传统ADC载荷的不足，除了开发和修改传统和新型的潜在载荷外，ADC设计也出现了许多新策略。例如，通过将同一抗体与具有不相关机制的不同载荷相结合来设计ADC药物，可以通过最小化耐药性的可能性并同时针对不同的靶点实现协同效应，这为治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症开辟了新途径，这对于实体瘤尤为重要。此外，在设计混合载荷时，应强调疗效和毒性之间的平衡。此外，通过使用抗体介导的靶向递送，由光激活化学物质作为载荷与特异性单克隆抗体组成的ADC可以实现较高的肿瘤特异性并能利用激光激活的生物物理机制精准诱导癌细胞快速死亡，避免对周围正常组织的伤害，实现精准治疗的要求，也是未来值得探索和期待的发展方向。 ADC虽然发展至今，但其可用的载荷骨架种类并未增加，大部分细胞毒性药物均为前核心骨架的衍生物，目前仅有有限数量的高细胞毒性天然化合物、衍生物或合成类似物有潜力作为ADC的载荷进入临床。虽然新颖的ADC载荷和指导ADC构建的新策略不断涌现，但这些还处于发展的初级阶段，未来的方向还需要通过更多的实验来验证。因此，在下一代ADC中，需要开发结构新颖的高效载荷(例如通过筛选天然产物库、化学合成、天然产物直接衍生化等方法提高活性和耐受性，有望获得结构简单、活性高、作用机制特殊的NAMPT抑制剂(具有多种作用机制、更高疗效和更少副作用的NAMPT抑制剂)。但新的骨架化合物的发现具有挑战性，需要在天然产物鉴定、高通量筛选或基于结构的药物设计等方面进行大量工作。相比之下，对已经获批或研究充分的有效载荷进行结构修改可以更快地识别新型有效载荷。在获得母核化合物后，应充分利用构效关系和晶体学技术，探索靶标与母核化合物的结合方式以及化合物的有效作用位点和有效功能团，才能高效地进行后续母核化合物的优化改造。在修饰有效载荷分子时，调整其理化性质，特别是极性，可以解决ADC制备和应用中的一些难题。连接过多的疏水性有效载荷分子会改变抗体的构象稳定性，增加其聚集沉淀的倾向，最终影响其最大DAR、血浆稳定性、旁观者效应等。疏水性有效载荷分子很容易穿透细胞膜，通过旁观者效应杀死周围的抗原阴性肿瘤细胞，而亲水性有效载荷分子从癌细胞中扩散出来的速度较慢。此外，大部分ADC面临的一大问题是毒副作用较大，其中载荷引起的毒副作用主要体现在对快速增殖的健康细胞的损伤，如淋巴细胞减少、胃肠道反应等。因此可以选择分子量小、组织穿透性好、半衰期短的载荷，释放后可以在靶位快速富集，快速发挥杀伤癌细胞的功能，同时在血液中药物分子可以被快速清除，有利于降低全身毒副作用。也可以对靶点的重要位点进行突变，进而修饰筛选出耐受性更好的化合物。 综上所述，新型ADC有效载荷与传统有效载荷存在一些区别： 1)传统ADC有效载荷多选择药理作用强但毒副作用也较大的小分子，例如PBD，而新型ADC有效载荷则倾向于选择药理作用中等、毒副作用较小的小分子，例如Dxd。 2)传统ADC有效载荷主要以微管抑制剂和DNA损伤剂为主，而新型ADC有效载荷相比传统有效载荷靶点类型更加丰富，选择更多，作用机制也不同，例如使用免疫刺激剂作为ADC有效载荷。 3)传统ADC小分子有效载荷结构一般复杂，合成难度大，新型ADC有效载荷倾向于选择结构简单、分子量较小的小分子，大大降低了合成难度，拓展了ADC有效载荷的应用市场。 4)传统ADC有效载荷一般采用单一类型的小分子化合物通过连接子直接连接抗体，而新型ADC可以组合不同类型的有效载荷，达到1+1>2的效果。除传统小分子化合物外，新型有效载荷还选取PROTAC、光活化分子等新型类型作为有效有效载荷。 虽然ADC药物发展至今，疗效也有了很大的提高，但仍然存在耐药性、不良反应、血液稳定性不够等问题亟待解决。有效载荷在ADC药物的疗效中占有重要的地位，因此结合相关的晶体结构和构效关系研究，对ADC小分子有效载荷及其未来趋势进行综述，旨在为ADC药物有效载荷的未来发展方向以及后续的优化改造提供更多新的参考，从而构建更多的ADC药物，提高其治疗效果，克服耐药性，减少不良反应，促进ADC药物研究的发展。 原文链接 Antibody–drug conjugates: Recent advances in payloads. Acta Pharm Sin B. 2023, 13(10): 4025-4059. doi: 10.1016/j.apsb.2023.06.015 免责声明：公众号推文基于已公开的资料信息撰写，用于传递最新热点资讯，在任何情况下，本文中信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

摘要：化学免疫疗法和细胞疗法是复发/难治性（R/R）淋巴瘤治疗的主要手段。这些治疗中出现的耐药性和常见毒性限制了它们在实现期望的响应率和持久缓解方面的作用。抗体-药物偶联物（ADC）是一种新型靶向疗法，已证明在治疗包括淋巴瘤在内的各种癌症中具有显著的疗效。迄今为止，已有三种ADC药物被批准用于不同类型的淋巴瘤，这标志着该领域取得了重大进展。在本文中，我们旨在回顾ADC的概念及其在淋巴瘤治疗中的应用，分析目前批准的药物，并讨论ADC开发正在进行的进展。 1.引言 淋巴瘤是一组来自不同类型淋巴细胞（B细胞、T细胞或自然杀伤（NK）细胞）在不同成熟阶段的克隆性增殖的恶性肿瘤。过去几十年来，不同类型淋巴瘤的发病率一直在增加。化学免疫疗法和细胞疗法仍然是不同亚型淋巴瘤常用的治疗手段。大多数化疗方案的治疗效果指数较窄，导致广泛的毒性。此外，耐药性的出现是最常见的原因之一，阻碍了它在复发和难治性（R/R）情况下的使用。针对表面抗原的单克隆抗体，如利妥昔单抗和奥比妥珠单抗，已经彻底改变了淋巴瘤的治疗。抗体-药物偶联物（ADCs）是一种高度靶向的药物，将针对特定表面抗原的单克隆抗体（mAb）与细胞毒素分子连接起来。毒素只传递给表达表面抗原的细胞，具有高度的肿瘤特异性和有限的系统暴露。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了三种用于治疗淋巴瘤的ADC药物，分别是本妥昔单抗、波拉图单抗和洛卡图单抗。 在本文中，我们将回顾ADC的概念，重点关注它们的结构、工程和在淋巴瘤治疗中的作用。此外，我们将提供目前批准的ADC在这一设置中的综合分析，以及正在进行的进展的概述。这包括突出来自临床前和临床试验的有希望的结果，以及讨论下一代ADC开发的未来方向。 2.ADC的基本结构  ADC由抗体、药物（有效载荷或细胞毒素）和连接子组成。抗体结合恶性细胞表面表达的特定抗原。一旦结合，ADC被内化，细胞毒素有效载荷释放到细胞内，导致细胞周期终止和凋亡。在周围目标阴性细胞中也可以看到细胞毒性效应，当药物扩散到它们中并引起“旁观者杀伤”时，这是一种当有效载荷从被内化和降解的ADC释放或当药物释放到细胞外空间后从目标细胞释放时发生的细胞死亡。值得注意的是，为了获得更好的结果和更少的副作用，抗原和抗体之间的结合需要尽可能特异性。有效载荷的内化率、连接子的稳定性和相应抗体的选择是影响ADC在临床实践中使用的一些变量。 2.1. 单克隆抗体 选择合适的抗体是ADC工程中的关键步骤；它通常被设计为特异性结合癌细胞表面表达的目标抗原。理想的单克隆抗体应具有低免疫原性、低交叉反应性、长的血浆半衰期，以及对肿瘤细胞表面抗原的高结合亲和力。最常用的类别是免疫球蛋白G（IgG），更具体地说是IgG1亚型，因其血清稳定性。在ADC开发的早期阶段，主要使用小鼠来源的抗体。然而，这些抗体报告有很高的失败率，可能归因于它们缺乏临床效益，同时引起严重的免疫原性相关的不良效应。这些ADC也被人类抗小鼠抗体迅速清除，限制了它们的疗效。此外，这些早期ADC中使用的连接子在人体循环中不稳定，导致有效载荷过早释放，大大降低了效果并增加了毒性。自从出现显著降低免疫原性的人源化小鼠单克隆抗体以来，已经取代了小鼠抗体，导致更优化的设计，如2000年FDA批准的针对CD33阳性急性髓系白血病患者的首个ADC药物吉妥单抗奥佐米星。迄今为止，已有十四种ADC获得FDA市场批准，其中三种如前所述已获批准用于治疗淋巴瘤。其中，只有本妥昔单抗使用嵌合抗体。嵌合抗体是通过融合不同物种的域（例如，整个小鼠或兔的可变区与人类来源的恒定域）设计的。相比之下，人源化抗体含有嵌入人类来源的Fab区和恒定区的外来氨基酸段。因此，它们较少免疫原性，是更安全的选择。在全人抗体中，没有一部分是小鼠来源的，与人类化抗体相比，它们在免疫反应中的发生率更低；例如FDA批准的enfortumab vedotin。 2.2. 有效载荷 ADC的理想有效载荷应具有低免疫原性、长半衰期、小分子量、在抗体的水性环境中良好的溶解度、在循环和溶酶体中的高稳定性、体外亚纳摩尔半最大抑制浓度（IC-50）以及有助于与抗体结合的官能团，同时保持ADC的内化特性。每个抗体平均结合两到四个强效的细胞毒素分子。目前，ADC设计中最受欢迎的两类有效载荷是微管破坏剂和DNA靶向剂（图1）。 图1. 设计ADC时常用的十种不同有效载荷的分子结构 微管抑制剂可以根据它们的作用机制分为两大类。第一组包括微管稳定剂。这些药物通过抑制微管解聚和促进聚合来增强丝状体的稳定性，使丝状体功能降低。第二组由破坏微管的物质组成，阻止微管蛋白组装和成熟微管的发展。在ADC开发中使用和研究的主要微管抑制剂包括长春碱类、紫杉醇类、auristatins、美登素类、隐孔菌素、海葵素和圆盘菌素。auristatins如单甲基auristatin E (MMAE)通过阻止α-和β-微管蛋白单体聚合并触发凋亡来破坏微管并阻止细胞分裂。结合区域位于两个纵向排列的微管二聚体的β1-微管蛋白和α2-微管蛋白亚基之间。根据体外研究结果，auristatin-微管蛋白键合形成环状或螺旋形聚集体，改变微管的功能。长春碱类如长春新碱或长春碱，以及隐孔菌素和多拉斯他汀，诱导微管形成类似的弯曲结构构象。 在细胞周期的任何阶段，DNA损伤剂通过双链断裂、烷基化、插入和交联四种主要机制可以杀死癌细胞。最常用的DNA损伤有效载荷是卡利烯胺、二酮霉素、吡咯并苯并二氮杂环（PBD）、多柔比星和喜树碱类似物。针对BCL-2抑制剂、剪接体抑制剂和针对RNA聚合酶II的转录抑制剂等靶向药物是具有不同作用机制的额外有效载荷。 值得注意的是，根据FDA对15种含有PBD有效载荷的ADCs的肿瘤学分析，PBD有效载荷的毒性概况更高，这表明常见的不良事件包括可能的血管渗漏综合征、转氨酶升高、骨髓抑制、胃肠事件、代谢效应、肌肉骨骼事件、神经病变、呼吸困难和肾损伤，所有这些都源于PBD的非靶向输送；该分析表明，2013年至2017年间47%的PBD偶联ADCs的新药申请被中止。这些高效ADCs发生危及生命的毒性的更高发生率是一个限制。 目前减轻PBD毒性的机制包括药物-连接子组分的聚乙二醇化，这显著提高了ADC的耐受性。另一种机制是使用对氨基苄氧羰基（PABC）自毁间隔基，在连接臂-药物中；该间隔基具有稳定的二硫键，允许在细胞内快速释放自由有效载荷，从而实现更好的血浆稳定性和与可裂解连接臂相比提高的毒性。后一项研究认为，肽连接的和二硫键连接的PBD ADC在两种不同的淋巴瘤模型中提供了相似的疗效，并且二硫键连接的PBD ADC具有更好的安全性。第三种机制是通过减少PBD结构中的一个亚胺官能团进行化学修饰，从而将DNA交联的PBD二聚体转变为DNA烷基化代谢物，称为吲哚喹喔啉二聚体（IGN），这在小鼠肿瘤模型中实现了更有效的载荷释放，其中小鼠能够耐受更高剂量的IGN偶联ADC。 近期在有效载荷方面也取得了进展。主要的进展是免疫调节ADC，如干扰素基因刺激剂（STING）激动剂、Toll样受体（TLR）激动剂和使用蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）策略的目标蛋白降解剂（TPD）。STING激动剂激活干扰素和其他细胞因子的产生，从而增强免疫和抗肿瘤反应。将STING激动剂作为有效载荷纳入ADC可以实现其向肿瘤目标的传递，具有更高的疗效和由于免疫激活导致的过度炎症反应而减少的毒性。STING激动剂的例子包括DMXAA、c-di-AMP、c-di-GMP、cGAMP、ADU-S100、MK-1454、SB11285、BMS-986301、E7766、MSA-1和MSA-2；它们主要在乳腺癌中被探索。TLR激动剂通过增强肿瘤微环境中抗原呈递细胞的抗原呈递，改善先天和适应性抗肿瘤免疫，从而促进更多细胞毒性T细胞的促进和活性。它们在局部癌症中发挥作用，例如，BCG（TLR2/4激动剂）用于膀胱非浸润性癌，AS04（TLR4激动剂）用于宫颈癌，以及咪喹莫特（TLR7激动剂）用于表皮基底细胞癌。目前，许多TLR激动剂正在作为ADC中的有效载荷在癌症免疫疗法中进行研究。一个例子是BDC-1001（TLR7/TLR8激动剂与抗HER2抗体偶联的ADC），在临床前模型中显示出有希望的结果。目前正在进行一项I/II期临床试验，该试验正在招募表达HER2的晚期实体瘤患者（NCT04278144）。PROTAC是一种催化作用于小剂量的催化剂，它通过泛素化介导的蛋白水解作用靶向特定的蛋白质。当PROTAC有效载荷与抗体偶联时，它会产生PROTAC催化行为和抗体的组织特异性的新型组合，具有更好的疗效和更少的限制。在表达HER2的细胞中存在成功的例子。这些在ADC设计中的微妙改进具有巨大的潜力，通过不断的研究可以为肿瘤学带来更好的结果，并为包括淋巴瘤在内的其他癌症类型的发展打开大门。 2.3. 化学连接臂 连接臂是成功开发ADC的最重要和最复杂的部分，因为它们形成了治疗和抗体之间的联系。它们的结合机制、稳定性和化学性质对于防止意外释放药物进入血流以及在癌细胞内吞后促进容易裂解至关重要，允许有效载荷仅在预期的地点释放。它们在确定ADC的药代动力学、药效学和治疗窗口方面至关重要。目前FDA批准的ADC使用两类连接臂，它们在有效载荷释放机制上有所不同：可裂解和不可裂解连接臂。最常用的四种可裂解连接臂是β-葡萄糖醛酸酶敏感连接臂、谷胱甘肽（GSH）敏感二硫键连接臂、卡他蛋白B敏感连接臂和腙连接臂。前面描述的旁观者效应，它影响肿瘤微环境中的正常细胞和没有或低目标表达的肿瘤细胞，更有可能发生在使用可裂解连接臂的ADC中。 不可裂解连接臂与可裂解连接臂相比，具有更好的血浆稳定性、较低的非目标毒性和抗蛋白水解降解的能力，因为它们与抗体的氨基酸残基具有不可还原的键。通常，不可裂解连接臂由硫醚或马来酰亚胺己酰基团形成。附着在由降解的抗体衍生的氨基酸残基上的不可裂解连接臂必须在ADC内化后，由细胞质和溶酶体蛋白酶完全分解抗体部分才能释放有效载荷。图2展示了一般的基本结构。 图2. ADC的一般基本结构。ADC由一个嵌合或人源化（免疫原性较低）的抗体组成，该抗体对淋巴瘤癌细胞表面表达的抗原具有强烈的结合活性。抗体应在循环中具有较高的半衰期，以便被输送到目标细胞表面。抗体与不同结构的有效载荷（主要是微管抑制剂或DNA相互作用）相连，这些是具有理想药物/抗体比例的高效药物。抗体与有效载荷之间的连接是通过可裂解或不可裂解的连接臂实现的，这些连接臂应具有精确的结合、在循环中的稳定性，并确保在目标处有效分配有效载荷。 3.FDA批准用于淋巴瘤的ADC  截至2023年，已有三种ADC获得了FDA对各种类型淋巴瘤的批准，分别是Brentuximab Vedotin（BV）、Polatuzumab Vedotin（PV）和Loncastuximab Tesirine（LT），如表1所示。 Brentuximab Vedotin（BV）由针对CD30的IgG1嵌合单克隆抗体“cAC10”和细胞毒素MMAE组成，它们通过一个稳定的连接臂（Cathepsin可裂解连接臂和对氨基苄基-羰基间隔基）结合在一起。嵌合单克隆抗体cAC10与CD30结合，随后通过内吞作用和随后与溶酶体的囊泡融合，在溶酶体中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶裂解连接臂，释放MMAE直接进入癌细胞内，从而导致癌细胞毒性。抗体和MMAE之间的连接系统设计为在循环中稳定，由马来酰亚胺己酰基间隔基、蛋白酶敏感的二肽Val-Cit、自毁PABC基团以及二肽和药物之间的附加间隔基组成。后者具有自裂解的能力，并有助于卡他蛋白B进入其裂解序列。马来酰亚胺部分与抗体重链和轻链中的半胱氨酸残基的末端硫醇形成硫醚键，将连接臂连接到抗体。由蛋白酶裂解Cit-PABC酰胺键产生的不稳定PABC取代的MMAE中间体，通过自发的1,6-消除反应，产生自由的MMAE分子、CO2和对氨基苄基醇。值得注意的是，CD30在恶性淋巴瘤细胞上表达非常强，在正常组织上表达较少。与单独的抗体相比，BV可以使CD30+细胞系的生长停滞高达340倍。BV的结构和作用机制如图3所示。cHL的恶性Reed-Sternberg细胞以表达CD30为特征，CD30是肿瘤坏死因子超家族的成员，鉴于其对一小部分活化的B细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞的表达限制，它代表了单克隆抗体治疗的理想靶点。BV在未经治疗的cHL患者和R/R疾病中表现出显著的活性，导致在这些情况下获得FDA批准。 图3. BV的结构和作用机制。它由一个针对淋巴瘤细胞上CD30抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被细胞内运输到溶酶体，在那里释放MMAE（有效载荷），干扰细胞核中的微管结构，导致细胞周期停滞和凋亡。 ECHELON-1 III期试验将1334名未经治疗的III期或IV期cHL患者随机分配接受BV-AVD（Brentuximab Vedotin、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）或ABVD（Adriamycin、Bleomycin、Vinblastine、Dacarbazine）。试验显示BV-AVD组的2年修正无进展生存期（PFS）为82%，而ABVD组为77%，风险比（HR）为0.77，6年总生存期（OS）分别为93.9%和89.4%，HR为0.59。基于ECHELON-1的结果，FDA批准BV与化疗联合用于成人未经治疗的III期或IV期cHL的治疗。最近，SWOG S1826试验被开发出来，比较BV-AVD与N-AVD（Nivolumab、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）对儿童和成人新诊断的晚期cHL（III期或IV期）患者的疗效。S1826研究表明，Nivo-AVD的1年PFS（94%）优于BV-AVD（86%），HR为0.48，并且两组的不良事件（AE）概况相当，因此它目前是未经治疗的cHL的一线治疗的首选方案。 尽管年轻患者更容易耐受多药化疗方案，但由于多种因素，包括合并症、身体状况差、无法耐受全剂量化疗以及治疗相关AEs增加，老年cHL人群的治疗结果较差。一项多中心II期研究评估了60岁及以上患者的序贯BV方案，随后进行AVD化疗，并在随后进行BV维持治疗。研究报告了84%的2年PFS率和93%的2年OS率。这种序贯方法提高了这一脆弱人群中cHL的治愈率，是新诊断cHL老年人的首选方案。 在R/R cHL环境中，BV最初在自体造血干细胞移植（ASCT）失败的患者中进行了研究。BV单药治疗显示总响应率（ORR）为75%，完全缓解（CR）为34%，中位无进展生存期（mPFS）为5.6个月。值得注意的是，CR患者的中位持续响应时间（mDOR）为20.5个月。这些结果导致BV首次获得FDA批准，用于治疗ASCT失败或至少两个先前的多药化疗方案失败的cHL患者。随后，AETHERA III期试验包括了接受过ASCT并具有以下不利风险之一的cHL复发难治性疾病患者，例如原发性难治性HL、初次缓解<12个月的复发HL，或一线治疗后复发时的结外受累。AETHERA研究表明，ASCT后早期巩固使用BV将mPFS提高到42.9个月，而对照组为24.1个月，HR为0.57。基于AETHERA试验，FDA随后扩大了BV的批准范围，用于治疗ASCT巩固后有高复发或进展风险的cHL患者。 除了前述的FDA批准外，BV还根据CheckMate 744 II期研究的结果，被国家综合癌症网络（NCCN）指南推荐与Nivolumab联合用于复发或难治性cHL患者的二线或后续治疗。该研究评估了涉及Nivolumab加BV，随后对次优反应患者使用BV加Bendamustine的风险分层响应适应方法。CheckMate 744研究表明，59%接受BV和Nivolumab治疗的患者，以及94%随后接受BV和Bendamustine治疗的患者，实现了完全分子反应（CMR）。这些结果明显优于历史上60至70%的CMR率，为R/R环境中的更高治愈率奠定了基础。 正在进行的BV在cHL的试验如图2所示。 BV在CD30阳性T细胞淋巴瘤中的作用 系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）中CD30的普遍表达，以及在外周T细胞淋巴瘤-未另行指明（PTCL-NOS）、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）和成人T细胞白血病或淋巴瘤（ATLL）等亚型中的高表达，为在T细胞淋巴瘤中靶向CD30提供了强有力的理由。 一项针对至少一种联合化疗方案失败后的R/R ALCL患者的II期研究显示，86%的患者实现了客观反应，其中57%为CR，mDOR为12.6个月。这项研究的结果导致FDA批准BV用于R/R PTCL。ECHELON-2试验旨在比较BV与环磷酰胺、多柔比星和泼尼松（A+CHP）联合使用与标准CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）治疗未经治疗的CD30阳性PTCL患者的疗效和安全性。A+CHP显示出48.2个月的mPFS，与CHOP的20.8个月相比，具有可比的安全性概况。5年PFS分别为A+CHP的51.4%和CHOP的43%（HR 0.7），5年OS分别为A+CHP的70.1%和CHOP的61%（HR 0.72），两组之间的安全性概况相当。随后的亚组分析显示，S-ALCL主要从A+CHP中受益，而AITL和PTCL-NOS亚组的益处尚不明确。 除了PTCL，BV在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中的作用也得到了探索。ALCANZA III期试验包括了接受过一线系统治疗的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（pcALCL）或表达CD30的蕈样真菌病（MF）的患者。在平均45.9个月的随访中，试验偏爱BV组，ORR为54.7%对12.5%，mPFS为16.7对3.5个月。同样，与医生选择相比，BV组的下一次治疗的中位时间显著更长（14.2对5.6个月；HR 0.27）。基于ALCANZA试验的结果，FDA批准BV用于治疗接受过先前系统治疗的pcALCL或表达CD30的MF患者。目前，BV正在许多早期阶段的试验中进行评估，这些试验包括在表2中。 波拉图珠单抗（PV）由一种抗CD79B的人源化IgG1单克隆抗体组成，通过一个可被蛋白酶裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC肽段连接臂与MMAE结合。一旦波拉图珠单抗与CD79b结合，它就会被内吞并通过内质网运输到溶酶体，在那里发生连接臂裂解，导致有效载荷释放到细胞内诱导凋亡。PV的结构和作用机制如图4所示。 图4. PV的结构和作用机制。PV由一个针对淋巴瘤细胞上的CD79b抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被内吞到内质体，并与溶酶体融合。然后连接臂被裂解以释放MMAE（有效载荷），这反过来导致细胞核中的有丝分裂停止和细胞死亡。 5.1. PV在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的形式。虽然利妥昔单抗的加入显著提高了CHOP化疗的治愈率，但大约40-50%的患者最初反应后会出现难治性疾病或复发。 POLARIX是一项具有里程碑意义的III期研究，评估了PV加入R-CHP（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松）在DLBCL一线治疗中的疗效，并与R-CHOP进行了比较。POLARIX证明了pola-R-CHP组2年PFS为76.7%对70.2%，（分层HR 0.73）。两组的整体安全性概况相似。值得注意的是，pola-R-CHP的益处在60岁以上的患者、国际预后指数（IPI）在3到5之间的患者以及具有活化B细胞样亚型的DLBCL患者中观察到。相反，在60岁或以下的患者、有大量疾病、较低IPI评分或滤泡中心B细胞样亚型的DLBCL患者中没有明显益处。基于POLARIX试验，pola-R-CHP是第一个在DLBCL一线治疗中证明比R-CHOP具有更好PFS的方案，并获得了FDA对先前未经治疗的DLBCL、未另行指明（NOS）、高级别B细胞淋巴瘤（HGBL）或IPI评分为2或更高的患者的批准。 POLAR BEAR III期试验比较了mini-R-CHOP与pola-mini-R-CHP作为老年DLBCL患者的一线治疗。初步安全性数据显示，两种方案在老年人（69%在80至90岁之间）和脆弱人群中（16%脆弱，12%的ECOG表现状态为3）都是可耐受的，用波拉图珠单抗替代长春新碱并没有导致3到4级血液学毒性或神经病变的发生率更高。值得注意的是，pola-mini-R-CHP组的胃肠道不良事件频率更高（31%对16%）。基于POLARIX试验的结果，人们倾向于假设pola-mini-R-CHP可能显示出比mini-R-CHOP更好的PFS。因此，这项研究的结果备受期待。 在R/R DLBCL环境中，评估PV安全性和有效性的第一项试验是Ib/II期试验，该试验比较了PV与利妥昔单抗（R）和苯达莫司汀（B）联合使用与单独BR对不适合移植的R/R DLBCL的疗效。pola-BR组显示更高的CR（40%对17.5%），更长的mPFS（9.5对3.7个月，HR 0.36），以及更高的mOS（12.4对4.7个月，HR 0.42）。然而，它导致了更高比例的3到4级中性粒细胞减少症（46.2%对33.3%）、贫血（28.2%对17.9%）和血小板减少症（41%对23.1%），尽管3到4级感染的发生率相似（23.1%对20.5%）。与PV相关的周围神经病变在43.6%的患者中观察到，但大多数是1到2级并解决了。这项试验导致了2019年6月pola-BR的初步批准及其在这种情况下的广泛使用。 波拉图珠单抗的另一个有希望的组合在Ib/II期试验中得到证明，该试验结合了Mosunetuzumab，一种针对CD20和CD3的人源化IgG1双特异性抗体，在R/R DLBCL、HGBCL、转化的FL或3b级FL中。在平均23.9个月的随访中，59.2%的患者对波拉图珠单抗加Mosunetuzumab有反应，45.9%的患者达到了CR。mPFS为11.4个月，mOS为23.3个月。这种方案被良好耐受，最常见的AE是25%患者的中性粒细胞减少症。总的来说，这些结果表明波拉图珠单抗和Mosunetuzumab的组合可以在不适合移植的R/R LBCL中带来具有临床意义的反应和有利的安全性概况。 5.2. PV在其他B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中的应用 除了DLBCL，包括PV的联合疗法也在惰性B-NHL中进行了探索。在Ib/II期试验中，评估了波拉图珠单抗、奥比妥珠单抗（G）和来普尼（Len）联合治疗R/R FL的安全性和有效性。在平均27个月的随访后，结果显示ORR为76%，CR率高达63%，尽管没有达到预先设定的活性阈值。在平均43.3个月的随访后，mPFS和mOS尚未达到，而4年的里程碑PFS为53%。这些结果与R/R FL的现有标准化疗选择相当，并支持在FL中进一步研究Pola-G-Len方案。 PV的疗效也在套细胞淋巴瘤（MCL）中进行了研究。在一项针对R/R MCL的II期研究中，PV与Mosunetuzumab联合用于先前接受过两线或以上治疗的患者，包括布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi），并显示出75%的高ORR和70%的CR。然而，需要更多的结果数据来评估其在MCL中的作用，对于对化疗免疫疗法和BTKi耐药的患者迫切需要新的方案。 6.隆卡图珠单抗  CD19是一种在B细胞分化的最早阶段直到浆细胞发育过程中表达的表面糖蛋白。除了正常的B细胞，CD19也在大多数B细胞淋巴瘤中表达。与CD20相比，CD19表现出更均匀的表达，并在抗CD20靶向治疗后的小部分CD20阴性肿瘤中保留，使其成为免疫疗法和联合疗法的选择性靶点。隆卡图珠单抗（LT，ADCT-402）是一种ADC，由一种人源化抗CD19单克隆抗体组成，通过一个可被卡他蛋白裂解的连接臂与高度细胞毒性的DNA小沟交叉链接吲哚喹喔啉二聚体毒素（PBD二聚体）结合。由于其快速的内吞动力学、运输到溶酶体和在循环中的稳定性，LT是针对CD19最有效的ADC。LT的结构和作用机制如图5所示。 图5. LT的结构和作用机制。LT由单克隆抗体Loncastuximab通过可裂解连接臂(统称为Tesirine)与PBD二聚体(有效载荷)相连。该抗体与淋巴瘤细胞上的CD19抗原结合，之后整个复合物被内吞并合并到溶酶体中。接着，PBD被释放到细胞质中，它移动到细胞核，在那里发生DNA交叉链接，导致细胞死亡。 6.1. LT在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 LT在人体I期研究中显示出对R/R NHL具有临床意义的活性，这导致了LOTIS-2研究，该研究评估了其在R/R DLBCL中的疗效。LT显示出48.3%的ORR，其中50%的应答者达到了CR。虽然mPFS为4.9个月，但达到CR者的mDOR为13.4个月。它展示了通常被良好耐受的安全概况，中性粒细胞减少症是最常见的3级AE（26%），其次是血小板减少症（18%）和γ-谷氨酰转移酶升高（17%）。显著的抗肿瘤活性、持久的反应和可接受的安全概况导致了2021年FDA批准用于治疗经过两线或以上系统治疗后的R/R大B细胞淋巴瘤。批准包括那些有DLBCL NOS、由低级别淋巴瘤引起的DLBCL和HGBL。 在具有里程碑意义的LOTIS-2研究之后，LT与其他靶向疗法的组合，如LOTIS-3中的ibrutinib和LOTIS-5中的单克隆抗CD20抗体rituximab对R-GemOX（利妥昔单抗、吉西他滨和奥沙利铂）进行了评估，但目前尚不清楚这些组合是否会进入临床应用（表2）。 6.2. LT在滤泡性淋巴瘤中的应用 LT在复发/难治性非霍奇金淋巴瘤(R/R NHL)的I期研究中进行了评估，其中在滤泡性淋巴瘤(FL)中显示了78.6%的客观反应率(ORR)。在2023年美国血液学会(ASH)会议上，最近展示了将LT与利妥昔单抗联合应用于R/R FL的II期试验的非常鼓舞人心的结果。该试验显示了95.2%的客观反应率，其中包括66.7%的完全缓解(CR)和28.6%的部分缓解(PR)的比率。 7.其他正在研究、开发和评估用于治疗淋巴瘤的抗体药物偶联物  7.1 针对CD19的抗体药物偶联物  7.1.1 科尔图珠单抗拉伐坦辛  科尔图珠单抗拉伐坦辛（SAR3419）是一种IgG1抗体（huB4），通过二硫键交联剂SPDB与细胞毒素药物DM4相连，靶向CD19。CD19是一种在血液形成分化过程中的B淋巴细胞系高度表达的蛋白，从早期B细胞到成熟B细胞，并在大多数B细胞恶性肿瘤中保持表达。两项II期试验已经研究了科尔图珠单抗拉伐坦辛作为单药或联合用药的使用。一项正在进行的试验正在检查其在R/R DLBCL患者中单药治疗的使用，初步数据显示ORR为44%；然而，mPFS、mOS和DOR尚未得出。它具有可接受的安全性概况，药物在41名患者中有4名因不良事件而中断。另一项试验检查了科尔图珠单抗拉伐坦辛与利妥昔单抗联合用于DLBCL患者，显示出ORR为31.1%，在复发疾病患者中疗效最高（ORR 58.3%），与难治疾病（ORR 43%）或一线治疗（ORR 15.4%）形成对比。总体而言，它显示出mPFS为3.9个月，mOS为9个月，DOR为8.6个月。 7.1.2 德尼珠单抗马佛多汀 德尼珠单抗马佛多汀（SGN-19A或SGN-CD19A）是另一种针对CD19的ADC。它是一种抗体（hBU12-491），通过不可裂解的马来酰亚胺己酰基连接臂与MMAF偶联。一项主要纳入了B-ALL患者（n = 59）的I期试验，以及侵袭性B细胞淋巴瘤（n = 6）和伯基特白血病/淋巴瘤（n = 6），显示DOR为27个月。每3周给药一次，在B-ALL中显示CRc（CR+CRi+CRp）为35%。在六名伯基特白血病/淋巴瘤患者和六名B-LBL患者中，每组只有一名达到CR。最常见的AEs是发热（54%）和恶心（52%）。另一项主要纳入了R/R DLBCL（n = 53），以及MCL（n = 5）和FL（n = 3）的I期试验，与前一次试验相比，在DLBCL中显示出略高的活性，ORR为33%，CR为22%，复发病例的DOR为39周，难治病例为41周。最常见的AEs与眼睛相关：视力模糊（65%）和干眼（52%）。德尼珠单抗马佛多汀在两项II期试验中进一步与化疗联合研究，一项将其与RICE化疗联合用于R/R DLBCL或3B级FL，与单独RICE进行比较，而另一项研究了其与R-CHOP或R-CHP联合对照R-CHOP单独作为DLBCL或3B级FL的一线治疗；然而，这两项试验都被赞助商终止。 7.2 针对CD22的抗体药物偶联物 7.2.1 伊诺珠单抗奥佐加霉素 CD22是一种135 kDa的I型跨膜糖蛋白，是一种在未成熟和成熟B细胞上表达的B细胞系特异性蛋白。它在B细胞恶性肿瘤包括大多数淋巴瘤和白血病中上调表达。目前有两种针对CD22的ADC正在淋巴瘤中进行研究。第一种是伊诺珠单抗奥佐加霉素（CMC-544），一种IgG4 kappa单克隆抗体，带有N-乙酰-γ-卡利奇霉素二甲基肼，一种卡利奇霉素的半合成衍生物，通过4'-乙酰苯氧基丁酸连接，于2017年8月获得FDA批准用于R/R B细胞ALL。一项I期试验研究了其在R/R B细胞NHL患者中的应用，显示79名入组患者的ORR为39%，在FL中为68%，在DLBCL中为15%。然而，DOR很短，DLBCL的mPFS为10.4个月，FL为49天。患者中有90%出现最常见的AE，即血小板减少。一项针对顽固性B细胞NHL（n = 81）的II期试验显示了类似的结果，ORR为67%，CR为31%，mPFS为12.7个月。 7.2.2 匹那珠单抗韦德汀 匹那珠单抗韦德汀（Pina，DCDT2980S，RG-7593）是一种抗CD22的单克隆IgG1抗体，通过可裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC连接臂与MMAF偶联。一项I期试验显示，与利妥昔单抗联合使用相比，作为单药治疗使用时显示出更高的疗效，DLBCL组的ORR分别为25%和17%。在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中未见客观反应。在II期试验ROMULUS中进一步检查了其与利妥昔单抗的联合使用，与R-pola相比，在DLBCL患者中显示出更优越的反应，但在FL患者中没有；DLBCL队列在R-Pina（n = 42）上显示ORR为60%，CR为26%，而R-Pola（n = 39）上为ORR 54%，CR 21%。在这项试验中，两者的AEs相当，R-pina组DLBCL队列的3-5级AEs为79%，R-Pola为77%。在FL队列中，AEs略低，R-Pina和R-Pola的3-4级AEs分别为62%和50%。 7.3 针对CD25的抗体药物偶联物 卡米达卢单抗特西林 CD25是一种I型跨膜蛋白，是白细胞介素-2受体α链，是一种在活化的B细胞、活化和调节性T细胞以及髓系前体上表达的蛋白，在包括淋巴瘤和白血病在内的各种肿瘤中过度表达。卡米达卢单抗特西林（ADCT-301，HuMax-TAC）是一种IgG1单克隆抗体，通过可被卡他蛋白裂解的缬氨酸-丙氨酸二肽连接臂与PBD二聚体弹头（SG3199）偶联。一项I期试验检查了其在R/R cHL（n = 133）和R/R NHL（n = 56）中的疗效，其中在cHL患者中显示出71%的优越ORR和42%的CR，与R/R NHL相比（ORR 38%和CR 9%）。3级及以上AEs包括GGT水平升高（15%）、皮疹（12%）和贫血（11%）。更重要的是，3.8%的患者出现了严重的神经系统事件，包括吉兰-巴雷综合征（GBS）/多神经根病变，27.4%的患者因不良反应而中断治疗。尽管研究报告的CR令人鼓舞，但FDA建议不要提交用于治疗R/R HL的批准文件，因此其未来仍不明朗。 7.4 针对CD37的抗体药物偶联物 纳拉图珠单抗艾美曲辛 CD37是一种参与细胞膜组织和共刺激信号的跨膜蛋白，主要在成熟B细胞上表达，在T细胞、巨噬细胞/单核细胞和粒细胞上表达较少。它在成熟的B细胞恶性肿瘤中高度表达，如CLL，在DLBCL中表达不一，CD37阳性范围从40%到90%的病例，而在急性淋巴细胞性白血病（ALL）和HL中低表达或缺失。纳拉图珠单抗艾美曲辛（IMGN529）是一种IgG1单克隆抗体，通过硫醚连接臂N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)与美登木素DM1偶联，靶向CD37。 纳拉图珠单抗艾美曲辛最初在R/R B细胞淋巴瘤的I期试验中研究，结果显示最小的效果，总有效率（ORR）为13%。然而，纳拉图珠单抗艾美曲辛与利妥昔单抗联合的II期试验结果显示，在DLBCL中ORR更高，达到44.7%，完全缓解（CR）为31.6%，在FL中的响应率略高，ORR为57%，CR为36%。在中位随访15个月和21.8个月时，DLBCL和FL亚组的中位持续缓解时间（mDOR）尚未达到。治疗总体上被良好耐受，如在FACT-Lym QoL的淋巴瘤子量表上平均提高了三点的生命质量（QoL）测量所示。总体而言，目前尚不清楚它是否会进入III期研究。 7.5 针对CD70的抗体药物偶联物 Vorsetuzumab Mafodotin CD70是一种共刺激分子，也是肿瘤坏死因子超家族的成员，它在抗原激活的B细胞、T细胞、NK细胞和成熟的树突状细胞上短暂表达。它在实体瘤和血液学恶性肿瘤中异常表达。Vorsetuzumab Mafodotin (SGN-75)是一种ADC，靶向CD70分子和微管毒素分子，连接到单甲基奥瑞斯他汀F（MMAF）。在R/R CD70+ NHL的I期试验中显示出不可接受的毒性，主要是血小板减少症。此外，SGN-CD70A是一种通过稳定、可被蛋白酶裂解的肽基连接臂与PBD二聚体偶联的工程半胱氨酸单克隆抗体（EC-mAb），靶向CD70。同样，它也与不可接受的毒性相关，并且只有适度的活性。 7.6 针对ROR1的抗体药物偶联物 7.6.1. Zilovertamab Vedotin ROR1是一种酪氨酸激酶跨膜受体，表达在未成熟的B淋巴细胞、内分泌腺和小肠上。它在血液学恶性肿瘤中高度表达，尤其是B细胞淋巴瘤。Zilovertamab Vedotin (MK 2140或VLS-101)是一种针对ROR1的人源化IgG1单克隆抗体，通过可被蛋白酶裂解的连接臂与MMAE偶联。在一项具有里程碑意义的I期试验中，Zilovertamab Vedotin在R/R MCL患者中显示出47%的ORR，CR为20%，在R/R DLBCL患者中ORR为60%。II期waveLINE-004研究，将Zilovertamab Vedotin作为R/R DLBCL的单药治疗，显示出略低的疗效，ORR为30%，有10%的患者实现了CR。最常见的3-4级AEs是中性粒细胞减少症（18%），其次是贫血（15%）。目前有额外的研究正在进行招募；一项是将Zilovertamab Vedotin与R-CHP联合用于DLBCL的前线治疗的II期试验，另一项是评估其与R-GemOX联合对照R-GemOX单独用于R/R DLBCL的II/III期研究。 7.6.2. Cirmtuzumab-ADC-7 另一种针对ROR1的ADC是Cirmtuzumab，一种针对ROR1的单克隆抗体，通过UC-961连接臂与MMAE偶联。在I/II期，Cirmtuzumab与ibrutinib联合用于R/R MCL或治疗未经验（TN）或R/R CLL的管理。在MCL队列中，Cirmtuzumab显示出80%的ORR，35%的患者实现了CR。值得注意的是，在中位随访14.9个月时，mPFS尚未达到。在CLL队列中，结果随着成熟仍然令人鼓舞，TN和R/R CLL患者的mPFS在中位随访14个月和7个月时也未达到。总体而言，该研究正在进行中，结果看起来很有希望。 7.7 临床前开发中的ADCs 7.7.1. 新型CD30靶向ADC：SGN-35C SGN-35C在组成上与BV相似，都是抗CD30抗体，但在连接臂上有所不同，它连接的是一种新型的喜树碱衍生的拓扑异构酶1抑制剂有效载荷。在CD30阳性ALCL和HL细胞系上进行的体外和体内研究，包括那些对BV有抗性的细胞系，显示出治疗诱导的细胞毒性。值得注意的是，这种效果扩展到了CD30阴性细胞，表明了旁观者效应。非人灵长类动物模型也证实了其安全性。下一步是人类临床试验，目前正在计划中。 7.7.2. CD19靶向ADC：IKS03 IKS03由一种针对CD19的人源化抗体组成，设计用于位点特异性结合PBD前药有效载荷。它通过生物结合激活，产生一种药物与抗体比率为2的偶联物。体外和体内研究已经证明了其在多种CD19阳性淋巴瘤细胞系中的有效细胞毒性，最值得注意的是在含有经常在R/R NHL中观察到的遗传异常的MCL和DLBCL异种移植模型中，如CCND1 t(11;14)易位和三重打击淋巴瘤，涉及BCL-2、BCL-6和c-MYC的基因重排。此外，与其他使用PBD前药的ADC相比，它展示了更低的非特异性有效载荷从偶联物中的释放率，包括LT。目前正在进行I期临床试验NCT05365659，以评估其在晚期B细胞NHL患者中的安全性。 7.7.3. CXCR5靶向ADC：VIP924 VIP924是一种首创的ADC，靶向CXCR5，由一种可被legumain裂解的连接臂和一种微管蛋白抑制剂（KSPi）有效载荷组成。CXCR5是一种趋化因子受体，在B细胞和T细胞来源的淋巴瘤上高度表达，并参与调节肿瘤细胞侵袭、生长和迁移的途径。一项体内研究比较了VIP924与PV和LT在MCL的人性化小鼠模型中的效果。结果表明VIP924在抑制肿瘤生长、提高存活率和耐受性方面的优势。值得注意的是，与LT不同，VIP924组的动物没有经历细胞减少症。这些有希望的结果支持在人类临床试验中进行进一步研究的需求。 8.ADCs的未来发展方向 最近在设计位点特异性ADCs、利用双特异性抗体以及修改可裂解连接臂方面取得了进展，以期使ADCs更有效、更高效，同时最小化毒性。一种新颖的偶联化学方法涉及位点特异性附着，其中一些技术利用抗体中的天然链间二硫键，而其他技术则需要生物工程将酶促偶联标签整合到抗体序列中。尽管在淋巴瘤中尚未探索，但位点特异性偶联已在实体恶性肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌）中得到评估。其中一种应用是ThioMab技术，它涉及使用工程化半胱氨酸进行位点特异性偶联。使用这种技术生产的ADC包括抗MUC16 ADC，它由在曲妥珠单抗的轻链和重链的特定位置插入半胱氨酸残基组成，然后与MMAE上的硫醇基团结合。此外，pClick技术提供位点特异性偶联；然而，它使用天然抗体和近距离激活的交联剂，不涉及任何生物工程。ThioBridge技术包括一种可裂解的连接臂，也使用天然抗体，并由三碳桥接附着提供增强的稳定性。此外，最近创新的AJICAP第二代技术通过利用硫酯化学的选择性裂解反应，实现了无聚集挑战的位点特异性ADC的生产，并有望成为无需抗体工程的位点特异性ADC。最后，通过不同的方法（如糖基重塑、转谷氨酰胺酶或脂酸连接酶方法）对天然抗体进行无标签酶促修饰，作为推进ADC发展的潜在工具具有潜力。 一类有前景的ADCs由双价双特异性抗体组成，如在HER-2靶向ADC中所示。双特异性抗体靶向两个不重叠的表位，随后诱导受体聚集和内化。这类ADCs已在乳腺癌中显示出疗效，并且在临床前研究中检查了MET过表达肿瘤，提供了有效的细胞毒性。 关于连接臂的最新进展，工作集中在制造稳定以避免非目标有效载荷释放的连接臂，但也容易在目标部位裂解以有效传递。这导致制造具有pH和微环境依赖性裂解的连接臂，允许ADCs在细胞内释放有效载荷。 这些进展正处于开发或临床前阶段研究中，有望提高下一代ADCs在包括淋巴瘤在内的各种癌症中的治疗效果。 9.结论  ADCs是革新了霍奇金和非霍奇金淋巴瘤治疗的新方法。抗体、连接臂和有效载荷的进步将导致ADCs的进一步发展，对淋巴瘤具有更高的特异性和细胞毒性。虽然获得抗性将是一个限制因素，但与其他新型药物的联合疗法，如单克隆抗体、分子靶向疗法和双特异性抗体，将为新的突破性治疗铺平道路。我们迫切需要创新的I期研究，以更好地理解ADCs在不同疾病环境中的作用，因为我们的目标是提高淋巴恶性肿瘤的治愈率。