组织蛋白酶

聚焦共价 早研早聊 学以致用  侃侃而言 DOI: 10.1016/j.rechem.2024.101615 共价药物具有丰富的历史，一度因为安全性的担忧而被边缘化，而靶向共价抑制剂（TCI）概念的出现又赋予了共价药物新生。 近期，Results in Chemistry刊载了一篇文章，从靶蛋白的角度对当前共价抑制剂研究进行分类分析，包括EGFR、BTK、SARS-CoV-2、KRAS、AChE、CatK等。并讨论了共价药物的优势和存在的局限性 01 靶向共价抑制剂（TCI） 小分子抑制剂通过可逆、或不可逆的方式，在特定情况下抑制功能失调的靶标。其中非共价相互作用主要包括盐桥、疏水相互作用、范德华力、静电相互作、氢键等。而这些非共价键只能在原子靠近时形成，并随着距离的增加相互作用强度降低。可逆性非共价药物依靠着与靶标不断地结合，再结合等发生相互作用；而不可逆共价药物特异性地精准靶向靶标，并永久性地结合发挥调控作用。 不可逆共价抑制剂的概念尽管很理想，但现实中设计共价抑制剂却非常具有挑战性。需要发现可逆性抑制剂作为亲电元件，需要优化亲电弹头，需要鉴定靶标特异性地邻近配体功能性亲核性残基，等，都是在开发共价药物中必需地步骤。    1.1、靶向共价抑制剂（TCI）的概念 靶向共价抑制是一种独特的治疗策略，靶向共价抑制剂（TCIs）被定义为具有可与靶标蛋白质残基非催化性成键的低反应性功能基团的配体（或抑制剂）。 TCIs通过两步机制，实现蛋白质靶标“沉默”，如下图。 第一步：抑制剂（I）与靶标受体或酶（E）非共价结合，产生热力学平衡的非共价抑制复合物，使抑制剂亲电部分靠近靶标蛋白质上亲核性残基的位置。 第二步：当共价分子接近并与特定残基精准对齐时，形成不可逆共价键，发生不可逆抑制。 第二步是共价抑制剂区别于可逆抑制剂的关键。这种药物发现依赖于基于结构的药物设计原则。 共价弹头的插入可显著提高药物分子的亲和力和特异性，但选择和设置共价弹头具有一定挑战性。    1.2、TCIs的共价弹头 可共价靶向的靶标首选在合适的位置需要具有功能性亲核侧链，如半胱氨酸（Cys）、赖氨酸（Lys）、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr)、组氨酸（His）、或天门冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）等。其中被开发最多的则是半胱氨酸和丝氨酸。而为了完成蛋白质靶标的共价修饰，必须在抑制剂中加入与靶标活性位点氨基酸残基具有反应性的亲电弹头。而一般这种亲电弹头是弱亲电性官能团。 共价弹头的反应性取决于几个关键因素：如，靶标氨基酸残基；启动初始非共价结合相互作用和靶标选择性的识别基序，即亲和性元件等；共价弹头的方向，影响与蛋白质残基的反应速度。共价弹头的选择、亲电基团的功能、大小、反应性对共价药物的设计都很重要，它们会影响残基的环境及其靶向特定氨基酸的能力。 以下是一些已经用于获批共价药物中的比较流行的几类共价弹头。 1.2.1、α,β-不饱和酰胺 α,β-不饱和酰胺型Micheal受体是TCIs中应用最多的共价弹头，尤其是在癌症治疗中的激酶抑制剂。这是一种软亲电试剂，主要与Cys残基相互作用。而当烯烃上取代基不同时，丙烯酰胺表现出高度可调的硫醇反应性。 一般在α位置引入氟原子，丙烯酰胺的反应性降低；而比较典型的是在β位氨基亚甲基取代，质子化的氨基亚甲基取代基能够增加不包含双键的亲电反应性；而通过α,β-不饱和醛或酯提高反应速率，也可能导致致突变性、皮肤致敏或肝中毒等风险增加。 1.2.2、酰胺、酯、脲、氨基甲酸酯类 如传统共价药物阿司匹林、β-内酰胺抗生素等，通过将蛋白质靶标的氨基酸残基酰化阻断酶活性。其中使用多种具有酰化潜力的共价弹头，包括脲、氨基甲酸酯、酰胺和酯，靶向蛋白质Lys残基、Ser残基等。。 1.2.3、酮、醛、腈类 醛、酮主要作用于丝氨酸、半胱氨酸残基，形成（羟基/硫硫醇）半缩醛或半缩酮的络合物，作为丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶的可逆性共价抑制剂弹头。 1.2.4、硫化合物 硫（VI）氟交换（SuFEx）是一组新型“点击化学”反应，氟硫酸芳基酯可以靶向蛋白质表面，与Ser、Thr、Tyr发生反应，（而Lys相对的亲核性较差）进而可能阻碍蛋白质蛋白质相互作用。氟硫酸芳基酯比芳基磺酰氟反应性更弱，只在蛋白质靶标的结合口袋中表现出反应活性。 1.2.5、硼酸类 另一类可逆共价弹头则是硼酸和硼酸酯，它们主要与丝氨酸、苏氨酸的羟基残基可逆性形成一种四面体中间体。    1.3、共价药物的发展历史 阿司匹林是第一款进入药物市场的共价药物，是20世纪初针对其作用机制研究偶然发现的。 阿司匹林是一种非甾体抗炎药，通过使活性位点附近的丝氨酸529残基乙酰化而共价改变环加氧酶1，从而干扰其底物花生四烯酸产生前列腺素。 青霉素是一类β-内酰胺类抗生素，它与参与细胞壁合成的青霉素结合蛋白相互作用，是活性部位Ser残基酰化，进而使细胞膜破裂。 随后更多的共价药物被批准上市，它们绝大多数的共同特定是，通过机制研究发现其共价作用的模式，而非从头设计而来。 其中，部分药物对靶标的共价修饰需要代谢后激活而表现出来，如阿司匹林、青霉素、奥美拉唑、氯吡格雷，如下图。 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。市场上约28%的共价抑制剂用于癌症相关靶点、23%用于中枢神经系统、21%用于抗感染（主要来自β-内酰胺类抗生素）、约11%用于胃肠道疾病。 02 靶向共价药物的复兴 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。    2.1、EGFR受体共价抑制剂 对于靶向抑制，当前大多数可用的TCIs均是靶向酶活性位点或变构口袋内的残基。而表皮生长因子受体（EGFR）是共价抑制剂研究最多的靶点之一，一种膜上酪氨酸激酶受体，通过与表皮生长因子结合导致细胞分裂和酪氨酸自磷酸化。EGFR是癌症，如非小细胞肺癌治疗的关键靶点。 图. 各种EGFR抑制剂的化学结构，其中蓝色突出部分为弹头 Gefitinib（吉非替尼）、Erlotinib（厄洛替尼）是一代可逆EGFR抑制剂。然而，一种称之为“看门人突变”的T790M，导致EGFR对ATP结合力增加，而许多可逆的EGFR抑制剂的结合力降低，导致了60%的患者有了新的病情。 为了解决这种突变型耐药性问题，研究人员将丙烯酰胺Michael受体片段安装在可逆配体上，开发了二代抑制剂。这类抑制剂与EGFR半胱氨酸残基反应，使部分恢复了对T790M突变体的活性，表现出延长EGFR抑制的信号，表明他们可能比一代可逆抑制剂更有效。 2013年，FDA批准了新一代EGFR突变转移性非小细胞肺癌的一线治疗药物Afatinib（上图c，阿法替尼），其与突变EGFR结合的分子晶体结构如下图a。 除此之外，还有二代共价抑制剂Netatinib、Dacomitinib分别于2017、2018年获批。用于治疗非小细胞肺癌和HER2+乳腺癌。 三代EGFR共价抑制剂，如WZ4002、Osimertinib、Rociletinib，用嘧啶取代了原来的喹唑啉部分，以增加选择性，同时仍然保留了共价结合所需要的丙烯酰胺弹头。 2018年Osimertinib获得了FDA加速批准，作为转移性非细胞肺癌的一线治疗药物。 目前仍有一些三代 EGFR抑制剂在开发中，如PF-06459988、Avitinib。 EGFR三代共价抑制剂的成功，证明了共价药物开发中，通过优化改善最初的可逆配体的效力，进而改变药效学的策略的可行性；二代药物的成功，也证明了通过针对可逆性配体的共价改造，可以提高药效，延长抑制时间。    2.2、BTK受体共价抑制剂 Bruton's酪氨酸激酶（BTK）是非受体蛋白酪氨酸激酶家族的一员，是B细胞系肿瘤的相关靶点；BTK突变会引起遗传性免疫缺陷疾病，如X-连锁无球蛋白血症（XLA)。 2013年，FDA批准Ibrutinib用于治疗巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病、和套细胞淋巴瘤，是一种BTK共价抑制剂。然而，该抑制剂与EGFR和其它Tec家族蛋白可以脱靶结合，因此，可能产生出血、腹泻、皮疹、和心房颤动等不良反应。 因此，也开发出了二代BTK抑制剂，如Acalabrutinib、Zanubrutinib，用于解决副作用问题，并分别于2017、2019年获FDA批准上市。 两个二代BTK共价抑制剂相比于一代，均具有更好的效力、口服吸收快、半衰期短、并减少于EGFR获其它Tec家族蛋白大的脱靶结合。 尽管早期人们很担心共价药物可能具有脱靶毒性，事实上也的确如此，但BTK二代成功改善了共价药物的脱靶效应，这表明合理设计共价药物，通过提高亲电配体的亲和力，改造亲电弹头的反应性，可以获得可接受的安全性。    2.3、KRAS共价抑制剂 RAS癌基因属于小GTPases家族，是癌症研究领域中研究最多的基因。过度活跃的RAS信号会导致细胞分裂和生长，从而增加患癌症的风险。人类最常见的致癌基因是三种RAS基因：HRAS、KRAS、NRAS。据统计，约60%的肺癌、34%的直肠癌、60%的胰腺癌都有两种KRAS亚型突变。而KRAS12、13、61的三个残基是经常发生突变的位点。 ARS-853是最早报道的KRASG12C共价抑制剂，具有较强的细胞活性。2021年，FDA加速批准了首个靶向KRASG12C的共价药物Sotorasib，用于成人非小细胞肺癌患者。 随后Adagrasib获得FDA批准，被指定为具有突破性疗法，是KRASG12C突变的非小细胞肺癌患者的潜在治疗选择。 自此，KRAS“不可成药”被打破！然而，最典型的KRAS G12D（尤其是在胰腺癌中最常见）仍未得到解决，目前有几款共价药物处于临床研究阶段，最主要的原因是共价靶向天冬氨酸非常具有挑战性。    2.4、SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂 对比COVID-19的全球快速传播主要是由SARS-CoV-2病毒引起的，开发疫苗和社会控制措施是科学界建议的控制感染的方法。然而，病毒家族突变的速度之快，迫切需要考虑疫苗的长期安全性和有效性。 开发有效的抗SARS-CoV-2治疗方法，其中一种策略则是共价药物分子。SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒，具有两种多蛋白（pp1a、pp1ab）多蛋白，以及结构蛋白和辅助蛋白。病毒复制依赖于Mpro（也称3CLpro），一种半胱氨酸蛋白酶，能够将pp1a切割成功能性病毒蛋白。 Nirmatrelvir是一种开发的高强度SARS-CoV-2可逆共价抑制剂，对所有人类冠状病毒都有很强的抑制作用。2021年，FDA紧急批准Paxlovid（利托那韦）上市，是由Nirmatrelvir和Ritonavir的组合，用于治疗成人和某些儿童患者的轻度中度SARS-CoV-2引起的COVID-19。    2.5、AChE共价抑制剂 在大脑中的化学突触中，乙酰胆碱，一种神经递质，激活胆碱能受体，而阿尔兹海默症患者的体内，这些受体较少。对抗这种情况的一种方法是通过阻断控制内源性乙酰胆碱水平的乙酰胆碱酯酶（AChE），来提高乙酰胆碱水平。 最近，Rivastigmine获得批准，这是一种新型乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过氨基甲酸酯部分将抑制剂嵌入酶的活性位点，抑制AChE约10小时。另一种共价抑制剂三氟磷酸盐对乙酰胆碱的抑制作用更强，2,2-二氯乙烯基二甲基膦酸（DDVP）与乙酰胆碱酯酶的位点结合，使活性位点的丝氨酸磷酸化。    2.6、CatK共价抑制剂 一类被称为组织蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶负责调节不同的细胞信号通路和溶酶体蛋白水解。人类有11种组织蛋白酶；其中，CatK因其参与骨重塑和骨吸收而引起特别关注。 Balicatib是一种对CatK表现出良好选择性的药物，然而，其在二期临床阶段被停止了，这是因为另一种非溶酶体性共价抑制剂，Odonacatib进入了三期临床。Odonacatib已经显示出减少髋部或锥体骨析和增加骨密度的功效，然而，受试者中心血管事件（包括中风）的增加，三期临床也突然终止。    2.7、其它激酶共价抑制剂 除了EGFR和BTK，共价抑制剂也可以用于特异性靶向在ATP结合位点附近具有非保守Cys残基的激酶。非受体酪氨酸激酶Janus激酶3（JAK3）就是其一，主要出现在白细胞，参与细胞因子信号传导。 Ritlecitinib是一款JAK3共价抑制剂，在二期临床，对类风湿性关节炎具有积极的效果。 成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶对于细胞分裂和增殖至关重要，被认为与肝细胞癌、肺癌、结肠癌和肾癌有关。Fisogatinib是一种FGFR4选择性共价抑制剂，正在二期临床试验。 03 共价药物的优势和缺陷    3.1、共价药物的优势 共价抑制剂与目标蛋白的化学结合能力在很多方面都是有利的。与可逆性药物相比，共价药物在药理学上有许多积极的方面，如增强的效力、选择性和延长的作用时间等。    3.2、共价药物的缺陷 早些年，蛋白质共价结合一直被认为是药物毒性的一种机制。尽管当前共价药物的进展，在安全性和有效性方面做了不少的改善，但在共价药物开发过程中，这仍是一个不可忽视的缺陷。 共价药物脱靶会产生一系列潜在的不良反应，对此，一般选用低反应活性的共价弹头，提高非共价核心的亲和力和选择性（保持低剂量），减少获杜绝反应性代谢物生成，等，来降低共价药物的毒性风险。 往期相关精彩回顾 JMC：西安交通大学发表一种靶向赖氨酸残基的共价抑制剂发现策略，原位氢键作用升级为共价键 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DOI: 10.1016/j.rechem.2024.101615 共价药物具有丰富的历史，一度因为安全性的担忧而被边缘化，而靶向共价抑制剂（TCI）概念的出现又赋予了共价药物新生。 近期，Results in Chemistry刊载了一篇文章，从靶蛋白的角度对当前共价抑制剂研究进行分类分析，包括EGFR、BTK、SARS-CoV-2、KRAS、AChE、CatK等。并讨论了共价药物的优势和存在的局限性 01 靶向共价抑制剂（TCI） 小分子抑制剂通过可逆、或不可逆的方式，在特定情况下抑制功能失调的靶标。其中非共价相互作用主要包括盐桥、疏水相互作用、范德华力、静电相互作、氢键等。而这些非共价键只能在原子靠近时形成，并随着距离的增加相互作用强度降低。可逆性非共价药物依靠着与靶标不断地结合，再结合等发生相互作用；而不可逆共价药物特异性地精准靶向靶标，并永久性地结合发挥调控作用。 不可逆共价抑制剂的概念尽管很理想，但现实中设计共价抑制剂却非常具有挑战性。需要发现可逆性抑制剂作为亲电元件，需要优化亲电弹头，需要鉴定靶标特异性地邻近配体功能性亲核性残基，等，都是在开发共价药物中必需地步骤。    1.1、靶向共价抑制剂（TCI）的概念 靶向共价抑制是一种独特的治疗策略，靶向共价抑制剂（TCIs）被定义为具有可与靶标蛋白质残基非催化性成键的低反应性功能基团的配体（或抑制剂）。 TCIs通过两步机制，实现蛋白质靶标“沉默”，如下图。 第一步：抑制剂（I）与靶标受体或酶（E）非共价结合，产生热力学平衡的非共价抑制复合物，使抑制剂亲电部分靠近靶标蛋白质上亲核性残基的位置。 第二步：当共价分子接近并与特定残基精准对齐时，形成不可逆共价键，发生不可逆抑制。 第二步是共价抑制剂区别于可逆抑制剂的关键。这种药物发现依赖于基于结构的药物设计原则。 共价弹头的插入可显著提高药物分子的亲和力和特异性，但选择和设置共价弹头具有一定挑战性。    1.2、TCIs的共价弹头 可共价靶向的靶标首选在合适的位置需要具有功能性亲核侧链，如半胱氨酸（Cys）、赖氨酸（Lys）、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr)、组氨酸（His）、或天门冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）等。其中被开发最多的则是半胱氨酸和丝氨酸。而为了完成蛋白质靶标的共价修饰，必须在抑制剂中加入与靶标活性位点氨基酸残基具有反应性的亲电弹头。而一般这种亲电弹头是弱亲电性官能团。 共价弹头的反应性取决于几个关键因素：如，靶标氨基酸残基；启动初始非共价结合相互作用和靶标选择性的识别基序，即亲和性元件等；共价弹头的方向，影响与蛋白质残基的反应速度。共价弹头的选择、亲电基团的功能、大小、反应性对共价药物的设计都很重要，它们会影响残基的环境及其靶向特定氨基酸的能力。 以下是一些已经用于获批共价药物中的比较流行的几类共价弹头。 1.2.1、α,β-不饱和酰胺 α,β-不饱和酰胺型Micheal受体是TCIs中应用最多的共价弹头，尤其是在癌症治疗中的激酶抑制剂。这是一种软亲电试剂，主要与Cys残基相互作用。而当烯烃上取代基不同时，丙烯酰胺表现出高度可调的硫醇反应性。 一般在α位置引入氟原子，丙烯酰胺的反应性降低；而比较典型的是在β位氨基亚甲基取代，质子化的氨基亚甲基取代基能够增加不包含双键的亲电反应性；而通过α,β-不饱和醛或酯提高反应速率，也可能导致致突变性、皮肤致敏或肝中毒等风险增加。 1.2.2、酰胺、酯、脲、氨基甲酸酯类 如传统共价药物阿司匹林、β-内酰胺抗生素等，通过将蛋白质靶标的氨基酸残基酰化阻断酶活性。其中使用多种具有酰化潜力的共价弹头，包括脲、氨基甲酸酯、酰胺和酯，靶向蛋白质Lys残基、Ser残基等。。 1.2.3、酮、醛、腈类 醛、酮主要作用于丝氨酸、半胱氨酸残基，形成（羟基/硫硫醇）半缩醛或半缩酮的络合物，作为丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶的可逆性共价抑制剂弹头。 1.2.4、硫化合物 硫（VI）氟交换（SuFEx）是一组新型“点击化学”反应，氟硫酸芳基酯可以靶向蛋白质表面，与Ser、Thr、Tyr发生反应，（而Lys相对的亲核性较差）进而可能阻碍蛋白质蛋白质相互作用。氟硫酸芳基酯比芳基磺酰氟反应性更弱，只在蛋白质靶标的结合口袋中表现出反应活性。 1.2.5、硼酸类 另一类可逆共价弹头则是硼酸和硼酸酯，它们主要与丝氨酸、苏氨酸的羟基残基可逆性形成一种四面体中间体。    1.3、共价药物的发展历史 阿司匹林是第一款进入药物市场的共价药物，是20世纪初针对其作用机制研究偶然发现的。 阿司匹林是一种非甾体抗炎药，通过使活性位点附近的丝氨酸529残基乙酰化而共价改变环加氧酶1，从而干扰其底物花生四烯酸产生前列腺素。 青霉素是一类β-内酰胺类抗生素，它与参与细胞壁合成的青霉素结合蛋白相互作用，是活性部位Ser残基酰化，进而使细胞膜破裂。 随后更多的共价药物被批准上市，它们绝大多数的共同特定是，通过机制研究发现其共价作用的模式，而非从头设计而来。 其中，部分药物对靶标的共价修饰需要代谢后激活而表现出来，如阿司匹林、青霉素、奥美拉唑、氯吡格雷，如下图。 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。市场上约28%的共价抑制剂用于癌症相关靶点、23%用于中枢神经系统、21%用于抗感染（主要来自β-内酰胺类抗生素）、约11%用于胃肠道疾病。 02 靶向共价药物的复兴 据2022年的数据显示，FDA已批准55款共价药物。TCI治疗策略已被广泛用于治疗肥胖症、丙型肝炎、和癌症等适应症。    2.1、EGFR受体共价抑制剂 对于靶向抑制，当前大多数可用的TCIs均是靶向酶活性位点或变构口袋内的残基。而表皮生长因子受体（EGFR）是共价抑制剂研究最多的靶点之一，一种膜上酪氨酸激酶受体，通过与表皮生长因子结合导致细胞分裂和酪氨酸自磷酸化。EGFR是癌症，如非小细胞肺癌治疗的关键靶点。 图. 各种EGFR抑制剂的化学结构，其中蓝色突出部分为弹头 Gefitinib（吉非替尼）、Erlotinib（厄洛替尼）是一代可逆EGFR抑制剂。然而，一种称之为“看门人突变”的T790M，导致EGFR对ATP结合力增加，而许多可逆的EGFR抑制剂的结合力降低，导致了60%的患者有了新的病情。 为了解决这种突变型耐药性问题，研究人员将丙烯酰胺Michael受体片段安装在可逆配体上，开发了二代抑制剂。这类抑制剂与EGFR半胱氨酸残基反应，使部分恢复了对T790M突变体的活性，表现出延长EGFR抑制的信号，表明他们可能比一代可逆抑制剂更有效。 2013年，FDA批准了新一代EGFR突变转移性非小细胞肺癌的一线治疗药物Afatinib（上图c，阿法替尼），其与突变EGFR结合的分子晶体结构如下图a。 除此之外，还有二代共价抑制剂Netatinib、Dacomitinib分别于2017、2018年获批。用于治疗非小细胞肺癌和HER2+乳腺癌。 三代EGFR共价抑制剂，如WZ4002、Osimertinib、Rociletinib，用嘧啶取代了原来的喹唑啉部分，以增加选择性，同时仍然保留了共价结合所需要的丙烯酰胺弹头。 2018年Osimertinib获得了FDA加速批准，作为转移性非细胞肺癌的一线治疗药物。 目前仍有一些三代 EGFR抑制剂在开发中，如PF-06459988、Avitinib。 EGFR三代共价抑制剂的成功，证明了共价药物开发中，通过优化改善最初的可逆配体的效力，进而改变药效学的策略的可行性；二代药物的成功，也证明了通过针对可逆性配体的共价改造，可以提高药效，延长抑制时间。    2.2、BTK受体共价抑制剂 Bruton's酪氨酸激酶（BTK）是非受体蛋白酪氨酸激酶家族的一员，是B细胞系肿瘤的相关靶点；BTK突变会引起遗传性免疫缺陷疾病，如X-连锁无球蛋白血症（XLA)。 2013年，FDA批准Ibrutinib用于治疗巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病、和套细胞淋巴瘤，是一种BTK共价抑制剂。然而，该抑制剂与EGFR和其它Tec家族蛋白可以脱靶结合，因此，可能产生出血、腹泻、皮疹、和心房颤动等不良反应。 因此，也开发出了二代BTK抑制剂，如Acalabrutinib、Zanubrutinib，用于解决副作用问题，并分别于2017、2019年获FDA批准上市。 两个二代BTK共价抑制剂相比于一代，均具有更好的效力、口服吸收快、半衰期短、并减少于EGFR获其它Tec家族蛋白大的脱靶结合。 尽管早期人们很担心共价药物可能具有脱靶毒性，事实上也的确如此，但BTK二代成功改善了共价药物的脱靶效应，这表明合理设计共价药物，通过提高亲电配体的亲和力，改造亲电弹头的反应性，可以获得可接受的安全性。    2.3、KRAS共价抑制剂 RAS癌基因属于小GTPases家族，是癌症研究领域中研究最多的基因。过度活跃的RAS信号会导致细胞分裂和生长，从而增加患癌症的风险。人类最常见的致癌基因是三种RAS基因：HRAS、KRAS、NRAS。据统计，约60%的肺癌、34%的直肠癌、60%的胰腺癌都有两种KRAS亚型突变。而KRAS12、13、61的三个残基是经常发生突变的位点。 ARS-853是最早报道的KRASG12C共价抑制剂，具有较强的细胞活性。2021年，FDA加速批准了首个靶向KRASG12C的共价药物Sotorasib，用于成人非小细胞肺癌患者。 随后Adagrasib获得FDA批准，被指定为具有突破性疗法，是KRASG12C突变的非小细胞肺癌患者的潜在治疗选择。 自此，KRAS“不可成药”被打破！然而，最典型的KRAS G12D（尤其是在胰腺癌中最常见）仍未得到解决，目前有几款共价药物处于临床研究阶段，最主要的原因是共价靶向天冬氨酸非常具有挑战性。    2.4、SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂 对比COVID-19的全球快速传播主要是由SARS-CoV-2病毒引起的，开发疫苗和社会控制措施是科学界建议的控制感染的方法。然而，病毒家族突变的速度之快，迫切需要考虑疫苗的长期安全性和有效性。 开发有效的抗SARS-CoV-2治疗方法，其中一种策略则是共价药物分子。SARS-CoV-2是一种单链RNA病毒，具有两种多蛋白（pp1a、pp1ab）多蛋白，以及结构蛋白和辅助蛋白。病毒复制依赖于Mpro（也称3CLpro），一种半胱氨酸蛋白酶，能够将pp1a切割成功能性病毒蛋白。 Nirmatrelvir是一种开发的高强度SARS-CoV-2可逆共价抑制剂，对所有人类冠状病毒都有很强的抑制作用。2021年，FDA紧急批准Paxlovid（利托那韦）上市，是由Nirmatrelvir和Ritonavir的组合，用于治疗成人和某些儿童患者的轻度中度SARS-CoV-2引起的COVID-19。    2.5、AChE共价抑制剂 在大脑中的化学突触中，乙酰胆碱，一种神经递质，激活胆碱能受体，而阿尔兹海默症患者的体内，这些受体较少。对抗这种情况的一种方法是通过阻断控制内源性乙酰胆碱水平的乙酰胆碱酯酶（AChE），来提高乙酰胆碱水平。 最近，Rivastigmine获得批准，这是一种新型乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过氨基甲酸酯部分将抑制剂嵌入酶的活性位点，抑制AChE约10小时。另一种共价抑制剂三氟磷酸盐对乙酰胆碱的抑制作用更强，2,2-二氯乙烯基二甲基膦酸（DDVP）与乙酰胆碱酯酶的位点结合，使活性位点的丝氨酸磷酸化。    2.6、CatK共价抑制剂 一类被称为组织蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶负责调节不同的细胞信号通路和溶酶体蛋白水解。人类有11种组织蛋白酶；其中，CatK因其参与骨重塑和骨吸收而引起特别关注。 Balicatib是一种对CatK表现出良好选择性的药物，然而，其在二期临床阶段被停止了，这是因为另一种非溶酶体性共价抑制剂，Odonacatib进入了三期临床。Odonacatib已经显示出减少髋部或锥体骨析和增加骨密度的功效，然而，受试者中心血管事件（包括中风）的增加，三期临床也突然终止。    2.7、其它激酶共价抑制剂 除了EGFR和BTK，共价抑制剂也可以用于特异性靶向在ATP结合位点附近具有非保守Cys残基的激酶。非受体酪氨酸激酶Janus激酶3（JAK3）就是其一，主要出现在白细胞，参与细胞因子信号传导。 Ritlecitinib是一款JAK3共价抑制剂，在二期临床，对类风湿性关节炎具有积极的效果。 成纤维细胞生长因子受体（FGFR）激酶对于细胞分裂和增殖至关重要，被认为与肝细胞癌、肺癌、结肠癌和肾癌有关。Fisogatinib是一种FGFR4选择性共价抑制剂，正在二期临床试验。 03 共价药物的优势和缺陷    3.1、共价药物的优势 共价抑制剂与目标蛋白的化学结合能力在很多方面都是有利的。与可逆性药物相比，共价药物在药理学上有许多积极的方面，如增强的效力、选择性和延长的作用时间等。    3.2、共价药物的缺陷 早些年，蛋白质共价结合一直被认为是药物毒性的一种机制。尽管当前共价药物的进展，在安全性和有效性方面做了不少的改善，但在共价药物开发过程中，这仍是一个不可忽视的缺陷。 共价药物脱靶会产生一系列潜在的不良反应，对此，一般选用低反应活性的共价弹头，提高非共价核心的亲和力和选择性（保持低剂量），减少获杜绝反应性代谢物生成，等，来降低共价药物的毒性风险。 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关注小药说药，一起成长！ 前言 由于有效载荷、连接子和偶联方法的改进，抗体偶联药物（ADC）的发展在过去十年中取得了显著进展。特别是，连接子设计在调节ADC在体循环中的稳定性和肿瘤中的有效载荷释放效率方面起着关键作用，从而影响ADC的药代动力学（PK）、疗效和毒性特征。 一些关键的连接子参数，如偶联化学、连接子长度和连接子空间位阻都会对ADC药物的PK和功效产生影响。理想的连接子应在循环系统中保持稳定，并在肿瘤中释放细胞毒性有效载荷。然而，现有的连接子通常会非特定地释放有效载荷，并不可避免地导致脱靶毒性。 因此，在ADC药物的设计中，正确调整连接子的这些重要参数，从而实现ADC稳定性和有效载荷释放效率之间的平衡，才能达到ADC药物预期的效果。在过去几年中，人们开发了许多新的连接子，包括组织蛋白酶可切割连接子、酸可切割连接子、GSH可切割连接子、Fe(II)可切割连接子、新型酶可切割连接子、光响应可切割连接子和生物正交可切割连接子。其中，组织蛋白酶、GSH和酸可切割连接子已被充分研究并应用于经批准的ADC中。连接子设计取得了许多重要进展，这些工作将有助于指明连接子未来的发展方向。 组织蛋白酶可切割连接子 2017年，Caculitan等人发现缬氨酸瓜氨酸（Val-Cit）连接子对多种组织蛋白酶表现出广泛的敏感性，包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L等。为了提高选择性，Wei等人设计了一种使用环丁烷-1,1-二甲酰胺（cBu）结构的连接子，该结构主要依赖于组织蛋白酶B。 在细胞内，组织蛋白酶B抑制剂能够有效地抑制（超过75%）含cBu-Cit连接子的药物释放，而组织蛋白酶K抑制剂没有显著的效果。相反，传统的含Val-Cit的连接子似乎对所有单一蛋白酶抑制剂耐受（组织蛋白酶B、L和K的抑制剂均小于15%）。同时，与含有Val-Cit连接子的ADC相比，含有cBu-Cit连接子的ADC在体外表现出更大的肿瘤抑制作用。 此外，肽连接子的优化不仅限于开发新的结构，肽连接子可以通过最小的结构变化进行优化，如氨基酸的类型和结构化学。一些研究将Val-Cit和Val-Ala二肽结构与MMAE的有效载荷连接进行了比较。在非内化抗体的情况下，结合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala连接子都表现出类似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg类似物表现出更好的性能。在使用随机半胱氨酸结合的抗Her2 ADC的情况下，与Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR结构中显示出较少的聚集性。另一方面，两种连接子显示出相似的缓冲稳定性、组织蛋白酶B释放效率、细胞活性和组织病理学特征。 四肽Gly-Gly-Phe-Gly显示出稳定和有效的可切割连接子的所有特性，已上市的ADC药物Enhertu使用了此类连接子。第一三共的Enhertu是一种血浆稳定的ADC，DAR为7.7，在溶酶体中发生蛋白酶降解，释放DX-8951f，这是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，来源于exatecan。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的DAR是非常可观的，因为它与广泛确立的原理相矛盾，即高DAR结合物可能具有较差的药代动力学特征。这里使用的自降解间隔子是简单和紧凑的半胺化，而不是Val-Cit连接子使用的PABC。 酸可切割连接子 酸切割连接子利用肿瘤组织（4.0–5.0）和血浆之间的pH差(∼7.4）选择性地向肿瘤组织释放有效载荷。这种策略在Mylotarg获得了最早的临床成功，后来也在Besponsa中得到应用。然而，酸切割连接子的稳定性不足严重限制了其在ADC中的应用，苯酮衍生的腙连接子在人和小鼠血浆中以2天的半衰期水解，Sacituzumab-govitecan（Trodelvy）的血清稳定性也不令人满意，其半衰期为36小时。 因此，酸裂解ADC需要更稳定的连接子，或者只能使用中度细胞毒性的有效载荷。2019年，一种新型的硅醚基酸裂解ADC被开发出来，携带高细胞毒性的单甲基auristatin E（MMAE）。这种设计极大地提高了酸裂解连接子的稳定性，此外，这种使用新型硅醚连接子的ADC在人血浆中的半衰期超过7天，并且在小鼠异种移植模型中显示出良好的治疗效果。 GSH可切割连接子 与血浆(∼5μmol/L）中相比，GSH切割的连接子依赖于细胞质中较高水平的谷胱甘肽（1–10 mmol/L）。二硫键在这些连接子中最常用，然而，目前的二硫键结构无法实现高循环稳定性和高效细胞内释放的完美结合。 2017年，Thomas等人试图通过将小分子药物直接连接到硫单抗中的工程化半胱氨酸来解决这个问题。通过直接连接抗体，抗体的空间保护将提高循环稳定性。 体内稳定性研究表明，当DM1通过二硫键连接到单抗的K149C上时，超过50%的药物即使在七天后仍保持连接。体内药效研究表明，在人类淋巴瘤-肿瘤异种移植小鼠模型中，这种新型抗CD22-DM1-ADC可诱导肿瘤消退。 同年，这种新策略被用于PBD作为有效载荷的ADC。与马来酰亚胺肽（Val-Cit）-PBD-ADC相比，在人类非霍奇金淋巴瘤异种移植小鼠模型中，新型二硫键的ADC表现出类似的活性。同时，这种新型二硫键ADC的MTD高于Val-Cit ADC（10 vs2.5 mg/kg）。 Fe(II)可切割连接子 铁代谢异常可提高游离亚铁的水平，基于这一策略，增加未结合的亚铁浓度已用于前药设计。2018年，Spangler等人报告了一种Fe(II)反应性1,2,4-三氧烷骨架的（TRX）连接子，并将这种连接子用于ADC。 通过TRX和Fe(II)的O–O键之间的Fenton反应裂解连接子，提供羰基中间体并通过β-消除释放有效载荷。 在体外细胞毒性研究中，含有TRX连接子的ADC在抗原阳性细胞中的活性与含有Val-Cit连接子的经典ADC相似。然而，在抗原阴性的MDA-MB-468细胞系中，含有TRX连接子的ADC仍然显示出显著的毒性。这种不稳定性是由金刚烷部分和抗体上附近位点之间的非特异性相互作用引起的。 新型的酶可切割连接子 与组织蛋白酶一样，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶体中选择性表达的水解酶。2016年，默克公司的研究人员设计了含有磷酸和焦磷酸的连接子与组织蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在传递糖皮质激素。这种亲水性和永久性带电基团的优点是溶解性，不仅能够与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，而且促进ADC纯化， ADC中的残余连接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在体外都具有活性。 默克公司的同一组研究人员还开发了一种独特的基于焦磷酸酶的连接子，用于释放含羟基有效载荷地塞米松和丙酸氟替卡松。 两种ADC在体外均表现出良好的稳定性，对肿瘤细胞系具有较强的活性。  除了2006年为ADC开发的经典β-葡萄糖醛酸酶可切割连接子外，还发现β-半乳糖苷酶在肿瘤细胞中过度表达并具有水解活性。最近报道了一种使用β-半乳糖苷酶裂解连接子的ADC，其中包含PEG10间隔子。间隔子被硝基取代，以提高自降解速率。类比β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它赋予化学前体亲水性。另一个优势是β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中表达，也在实体瘤的微环境中表达。研究证明，在抗HER2-ADCs释放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶连接子的 ADC在体外和体内均比T-DM1更为有效。 最近，还出现了硫酸酯酶裂解的连接子，硫酸酯酶在几种癌症类型中过度表达，表现出潜在的选择性。研究涉及以MMAE为有效载荷的抗Her2抗体，与经典的可切割Val-Cit和Val-Ala连接子相比，硫酸酯酶连接子对Her2+细胞系显示出相似的效力。 光响应可切割连接子 近年来，基于光响应切割的有效载荷释放策略逐渐出现。光响应可切割具有以下优点，包括低毒性、快速反应、高灵敏度和特异性。 2015年，Nani等人首次对ADC采用近红外（NIR）光照锁定策略。光响应切割基于七甲川菁荧光团骨架。在用NIR光（λ=650–900nm）照射后，ADC以位点特异性方式在受照肿瘤区域有效释放小分子细胞毒素CA-4。 在体外细胞毒性实验中，含有NIR光裂解连接子的ADC在EGFR+细胞系中经辐射后表现出相当于CA-4的活性，而未经辐射时表现出低活性。然而，这种连接子的自聚集和光不稳定特性限制了其作为药物的进一步开发应用。 最近，有研究报告了一种新型的紫外（UV）光控ADC。连接子引入了紫外光控制的邻硝基苄基作为切割触发。在稳定性和释放研究中，这种含有MMAE的连接子在自然光下6天内释放<1%，在辐照后10分钟内显示MMAE的快速释放，并达到最高平台。在体外细胞毒性实验中，用365nm（40W）紫外光照射后，含有邻硝基苄基连接子的ADC的活性显著增加，比未经照射的ADC高50倍。 2019年，报道了一种光响应、自断裂的连接子，使用光笼C40氧化碱性位点（PC4AP）。与前面提到的两个ADC相比，这种连接子在设计上具有“双重保险”。在365 nm辐射下，PC4AP的羟基与其自身抗体上附近的胺发生分子内加成反应，随后的消除反应导致裂解和有效载荷释放。含有肽-PC4AP-DOX的ADC在阳性细胞中显示出与有效载荷DOX相当的毒性，并且在没有辐射的情况下没有细胞毒性。 生物正交可切割连接子 生物正交化学具有选择性高、加工快速简便、副产物无毒等特点。2019年，Wang等人开发了一种生物正交可切割连接子，该连接器使用了经典的生物正交切割对Cu(I)-BTTAA和dsProc。 然而，生物正交可切割连接子目前主要集中在体外探索上。在反应效率、反应速率、底物稳定性、生物相容性和操作方便性方面仍存在问题，离临床应用还很远。 小结 在过去的几年里，ADC的结构优化和机制扩展方面取得了许多进展。新的可切割连接子已经被开发出来，以获得对肿瘤的更高选择性。尤其新型光响应可切割连接子和生物正交可切割连接子可以打破传统ADC的细胞内药物释放限制。这些新型连接子的初步数据令人鼓舞，未来将极大地促进ADC药物的迅猛发展。 参考文献： 1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442. 2. Antibody-drugconjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021Dec;11(12):3889-3907. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。