中国之声：流感疫苗研究及通用疫苗进展

2023-02-18

疫苗

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道感染，严重危害人类和动物健康，严重者导致死亡。自20世纪以来，人类历史上发生了几次流感大流行，最具灾难性的是1918-1919年的“西班牙流感”，导致全球约5000万人死亡，以及1957-1958年的“亚洲流感”，1968-1969年的“香港流感”，1976年的“猪流感”，1977年的“俄罗斯流感”，以及2009年的甲型流感，也造成数百万人死亡。大流行性流感和季节性流感在世界范围内造成相当大的发病率和死亡率，对公共卫生和全球经济构成严重威胁，世界卫生组织（WHO）估计季节性流感每年造成约300-500万例严重病例和29万至65万人死亡。孕妇、婴幼儿、老年人和患有慢性基础疾病的患者患流感严重疾病和死亡的风险较高。中国人口超过14亿，流感发病率和死亡率负担沉重，但流感疫情发展还不够清晰。中国流感流行病学我国流感病毒研究始于1952年，1957年成立了国家流感中心，随后于2000年建立了流感监测网络，以流感样病例报告和病毒分离为重点，全面提升了我国流感监测的整体能力。2009年以来，我国流感监测网络逐步扩大完善，目前已建成554家哨点医院和410个网络监测实验室，覆盖中国大陆全国各省、市、自治区。哨点医院向中国国家流感监测信息系统（CNISIS）报告流感样疾病（ILI）病例并收集呼吸道样本。网络实验室使用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来确定收集的样本是否为流感病毒阳性。中国大陆总人口超过14亿，流感发病率和死亡率负担很高。根据国家卫健委疾病预防控制局2009年3月至2022年8月（截至2022年11月17日）中国大陆流感感染和死亡数据，流感流行和流感相关死亡主要集中在冬季（1月至3月和11月至12月），据报道，7-10月期间流感发病率最低。2019年流感疫情严重且持续时间最长，分别在2月至6月和11月至12月，12月流感病例最多，约为120万人。次年1月的死亡人数最高，为108人。图1.2009年3月至2022年8月每月流感感染情况和2009年至2021年年度流感感染情况分析在2009-2017年期间，每年的流感感染和死亡人数相对较低，发病率和死亡率较低，但在2018-2020年期间，流感感染和死亡人数大幅增加，死亡率也大幅增加，这可能是由于流感监测网络的扩大以及更及时准确地报告流感病例。随后，除了11月至12月期间的轻微流行外，2021年的流感病例数较低。目前，中国引起季节性流感的主要流感病毒亚型是甲型H1N1/pdm09流感、甲型H3N2流感和乙型流感病毒。我国高纬度省份流感流行的特点是冬季流行，持续时间短，流行强度强，而中低纬度省份流行较弱但持续时间长，如半年流行（如浙江和安徽省）或全年流行（如海南省）。除了给人们的生命和健康带来严重负担外，流感还会给个人和国家造成巨大的经济损失，全球每年的间接经济损失达到数百亿美元。中国是一个流感易发地区，大多数关于流感相关经济负担的研究都集中在经济较发达的地区;例如，北京、上海和天津的ILI负担最高，青海、甘肃和宁夏的ILI负担最低。中国流感疫苗和疫苗接种状况流感疫苗接种是预防和减少流感相关严重疾病和死亡，以及减少与流感相关疾病相关的健康风险和利用卫生保健资源的有效手段。三价疫苗包括甲型H1N1流感、甲型H3N2和乙型流感病毒Victoria或Yamagata毒株之一，而四价疫苗包括甲型H1N1流感、H3N2和乙型流感病毒Victoria和Yamagata毒株，覆盖范围很广。世卫组织根据北半球生产的鸡胚胎推荐了2022-2023年的三价流感疫苗成分：A/Victoria/2570/2019（H1N1）pdm09亚型、A/Darwin/9/2021（H3N2）亚型和B/奥地利/1359417/2021（Victoria），四价流感疫苗成分包含两种B毒株。目前获准在中国上市的流感疫苗有三价灭活流感疫苗（IIV3）、四价灭活流感疫苗（IIV4）和三价减毒活疫苗（LAIV3）。IIV3包括灭活疫苗和亚单位疫苗;IIV4是一种灭活疫苗;LAIV3是一种减毒疫苗。截至2022年8月11日，已有11家厂家供应流感疫苗，具体流感疫苗生产企业及其产品信息见表1。 2015-2020年中国流感疫苗行业批次发放量统计如图所示。2018年我国流感疫苗批发行量为1612.39万剂，为近年来最低水平。我国四价流感疫苗于2018年首次获批上市，据统计，2018年、2019年和2020年分别获批512.25万剂、971.05万剂和3358.23万剂。四价流感疫苗自推出以来逐年增加，2020年超过三价流感疫苗的比例达到58.38%。图2.我国流感疫苗行业近年来批发行量据统计，2014年至2020年中国流感疫苗平均接种率为2.43%，2018年最低，为1%，2020年为4%，而根据疾病控制和预防中心的数据，2020年流感季节美国分发了1.75亿剂流感疫苗，成人疫苗接种率约为48.4%，而中国不到十分之一。疫苗接种率低的可能原因是，中国尚未将流感疫苗纳入国家免疫规划，实施免费疫苗接种政策的地区覆盖面有限，人群对流感和流感疫苗的认识不足，疫苗供应不足，现有流感疫苗品种单一，需要每年重新接种。由于目前我国流感疫苗接种率低，群体免疫屏障保护脆弱，在一定程度上，流感流行很容易发展成流行趋势。我国流感疫苗接种率仍需进一步提高，可采取措施：一是逐步将特定高危人群流感疫苗接种纳入国家免疫规划规划和地方公共卫生规划。其次，应增加对儿童、老年人和医务人员等目标群体的疫苗接种。第三，努力推动联合疫苗接种，积极优化流感疫苗和其他疫苗的联合疫苗接种程序，以提高免疫服务效率。开发通用流感疫苗现有的流感疫苗流感疫苗接种保护率仅为40-60%、流感病毒容易发生突变、当出现与疫苗毒株不匹配的新流感病毒株时，疫苗的有效性会进一步降低。以便有效预防流感。流感疫苗的生产过程至少需要6个月，目前获得许可的疫苗大多是在鸡胚中生产的，这有时会导致病毒的适应性突变，从而降低疫苗效力。因此，开发通用流感疫苗对于预防多种流感病毒株及其引起的全球大流行非常重要。利用病毒亚型中高度保守的病毒蛋白区域作为潜在的靶抗原是目前开发和设计通用流感疫苗的主要途径，主要靶点包括HA、NA、M2e和NP。血凝素（HA）作为通用疫苗设计的免疫原血凝素（HA）是流感病毒表面最丰富的糖蛋白，在病毒入侵和感染过程中起着关键作用。在空间构象方面，每个HA单体由两部分组成：球状头部由HA1和杆状茎组成，HA1允许病毒通过与唾液酸受体结合而吸附到宿主细胞上，杆状茎由HA2和HA1的一部分组成，并锚定在病毒衣壳的脂质双层中。由于HA头部含有抗原决定簇和受体结合位点，是疫苗开发的重要靶抗原，目前的季节性疫苗也主要触发针对HA头部结构域的抗体;然而，该位点容易发生抗原漂移和转化，导致疫苗保护有限。高度保守的HA茎产生保护性抗体，在不抑制血凝作用的情况下中和病毒感染性，是开发通用流感疫苗更具吸引力的目标。许多研究表明，该位点含有许多结合广谱中和抗体（bnAbs）的抗原表位，并且在抑制病毒进入细胞中具有重要作用。HA2区是通用流感疫苗的潜在研究靶点，但由于HA茎的抗原表位经常被其头部阻断，疫苗设计需要增加HA茎对宿主免疫系统的暴露，例如通过使用茎结构域中的某些短肽表位与载体蛋白结合以增加HA茎的免疫暴露和帮助抗原呈递到茎的结构域，从而增强免疫作用。图3. 开发基于HA的流感疫苗的策略神经氨酸酶（NA）作为广泛保护的候选免疫原神经氨酸酶是流感病毒表面的另一种主要糖蛋白，通过切割宿主细胞膜上的病毒唾液酸受体来促进病毒颗粒的释放并防止后代病毒在细胞表面的积累，从而在病毒传播中起重要作用。NA从N端到C端可分为四个主要区域：细胞质区、跨膜区、茎区和头部区。Kim等人构建了针对流感病毒H1N1 pdm09的NA VLP疫苗，该疫苗在小鼠免疫后诱导病毒特异性抗体反应并产生针对不同流感病毒的交叉保护免疫，并进一步发现免疫该疫苗的小鼠血清在年轻小鼠中具有交叉保护作用。Strohmeier等人使用麻疹病毒磷酸蛋白的四聚化，用麻疹病毒磷蛋白的四聚结构域替换NA的细胞质区、跨膜区和茎区，设计重组疫苗N1-MPP。该疫苗保留了NA的抗原性，活性和结构完整性，并为小鼠的致命病毒攻击提供了强有力的保护，当与不同配方的季节性疫苗混合时，导致NA反应降低，但单独给予时诱导强烈的抗体反应;因此，这种重组NA疫苗可以增强和扩大对季节性流感病毒的保护。此外，Skarlupka等人使用COBRA方法生产了含有四种甲型流感病毒NA活性的N1疫苗抗原，当受到四种流感病毒的攻击时，免疫小鼠免受死亡保护，肺病毒滴度低，体重减轻变化不大。膜蛋白（M2）细胞外区（M2e）作为疫苗设计的候选通用免疫原膜蛋白（M2）是由96个氨基酸组成的跨膜蛋白，分为细胞外、跨膜和细胞质区域，通常以四聚体的形式存在于流感病毒囊泡膜表面。由于M2e在不同毒株和亚型流感病毒中高度保守，因此它可以诱导交叉保护性免疫反应，使其成为通用流感疫苗开发过程中有吸引力的目标。先前的实验已经证明，抗M2e抗体与宿主细胞表面结合的M2e强烈结合，抑制病毒复制和生长，从而在动物中产生保护作用。由于M2e本身的免疫原性较弱，许多策略已被用于增强基于M2e的疫苗的免疫原性。例如，通过增加疫苗中M2e表位的密度以显着提高免疫原性和有效性，Krishnavajhala等人在Sindbis病毒上高密度表达M2e肽，并用M2e特异性抗体免疫小鼠，保护它们免受甲型流感病毒的致命毒力攻击。此外，他们将M2e的多个串联重复序列自组装成M2e VLP，然后将其掺入聚合物递送系统AS04和皮下免疫小鼠中，显示出免疫原性潜力。此外，Xu等人将M2e与交叉反应物质（CRM197）偶联，合成了一种新型疫苗M2e-CRM197，该疫苗在小鼠免疫后诱导抗M2e抗体，诱导效率高于单独使用M2e组，表现出更高的免疫原性。核蛋白（NP）作为通用疫苗的保守免疫原核蛋白（NP）是核衣壳的主要成分，与病毒基因组RNA和病毒聚合酶形成核糖核蛋白复合物（RNP），参与病毒转录、复制和组装。由于NP基因高度保守，其诱导的CTL反应可以对纯合子和不同亚型的病毒株产生交叉反应，从而诱导更广泛和更持久的保护性免疫。因此，流感病毒NP作为下一代替代疫苗靶标也备受关注。广谱流感疫苗的设计目前通用流感疫苗的基本要求是对甲型和乙型流感病毒引起的流感症状具有≥75%的保护作用，疫苗在所有年龄组至少有效一年。HA，NA，M2e和NP作为疫苗免疫原具有不同的优势，并且可以诱导互补免疫应答。串联蛋白免疫广谱流感疫苗设计的基本方法是串联或融合表达病毒蛋白的不同保守表位，与针对病毒单一抗原肽的疫苗相比，这不仅提高了疫苗功效，而且减少了生产时间和成本。Golchin等人设计合成了串联抗原蛋白M2e-HA2，该蛋白在小鼠免疫后显着诱导对流感病毒的体液免疫应答，病毒激发证明串联蛋白保护小鼠免受H9N2流感病毒的侵害。纳米平台递送使用纳米平台递送相关抗原是开发新型流感疫苗的一种有前途的方法。纳米颗粒中抗原的高密度和结构顺序促进了B细胞受体的抗原识别，并触发了有效的细胞和体液免疫反应。此外，纳米颗粒已被证明可以保护抗原免受蛋白水解降解，改善抗原递送并延长抗原呈递细胞（APC）的抗原呈递。例如，Wei等人以载铁蛋白（AFt）纳米笼为载体，用内部包裹的NP蛋白和表面偶联的HA蛋白构建了一种仿生流感疫苗，在小鼠免疫后产生了对同源和异源病毒致命感染具有完全保护作用的HA和NP特异性抗体，该仿生疫苗提出了疫苗开发新策略。病毒样颗粒（VLP）组合疫苗VLP 是通过将编码病毒结构蛋白的基因插入质粒载体中，然后将其转化或转染到靶表达系统中而产生的。由于产生的VLP不含病毒核酸，因此它们不具有传染性或致病性，具有很强的免疫原性，可以刺激体内强烈的体液和细胞免疫反应。通常选择昆虫细胞杆状病毒表达系统来产生流感VLP，并且产生的VLP在形态上与天然流感病毒相似。例如，Zhang等人通过昆虫细胞杆状病毒表达系统制备了含有H3N8马流感病毒（EIV）HA、NA和M1蛋白的VLP，并将用VLPs免疫马产生的超免疫血清注射到小鼠中，然后进行攻击，表明马超免疫血清对H3N8 EIV感染具有良好的预防和治疗效果。DNA疫苗DNA疫苗是利用重组技术将靶基因克隆到真核表达载体中，并引入体内表达相应的抗原，诱导保护性免疫应答进行防治的疫苗。DNA疫苗的免疫原性和保护效力较低，这需要设计优化的抗原序列或外源修饰来改善。Guilfoyle等人设计了一种多价流感 DNA疫苗，编码来自H1N1（2009）和H3N2（1968）毒株的HA和NA，以及来自H1N1（1918）毒株的NP，M1和M2。用这种DNA疫苗对雪貂进行免疫，不仅可以保护它们免受H1N1 pdm09的同源攻击，还可以保护它们免受异源流感病毒H5N1的侵害，证明了这种DNA疫苗对异源病毒的有效性。mRNA疫苗mRNA疫苗是通过将含有编码抗原蛋白的mRNA引入体内而生产的，这些mRNA被转录和翻译以产生相应的抗原蛋白并诱导特异性免疫应答。例如，Zhuang等人构建了H1N1-HAmRNA疫苗，并通过鼻内给药对小鼠进行免疫，结果表明mRNA疫苗引起体液和细胞免疫反应，并保护小鼠免受致命流感病毒的侵害。亚单位疫苗亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗的进一步纯化抗原成分，具有更高的安全性，但免疫原性较低。免疫原性的改善通常是通过添加合适的佐剂、融合多种病毒蛋白和改变疫苗接种策略来实现。例如，Saleh等人在小鼠模型中评估了甲型流感病毒H1N1嵌合亚单位疫苗（3M2e-HA2-NP）的免疫原性和保护特性，发现接种这种嵌合亚单位疫苗的小鼠产生特异性抗体反应并刺激细胞因子，用于产生记忆CD4细胞以及Th1和Th2细胞，显示出75%的流感病毒致命攻击保护作用。结论流感继续对公众健康构成重大威胁，疫苗接种是目前对抗流感的最有效措施。虽然目前我国有几家流感疫苗生产企业，但产品成分均质，主要由裂解疫苗组成，在鸡胚中生产。除了生产时间长外，另一个缺点是适应性突变可能会发展，从而改变流感疫苗的保护作用。基于MDCK细胞的流感疫苗可以预防这个问题，尽管这些基于细胞系的疫苗目前在中国还处于起步阶段。此外，与发达国家相比，中国的疫苗接种率较低。许多因素影响疫苗接种率，包括疫苗接种政策、疫苗接种史以及对流感和疫苗接种的知识和态度。为了解决这些问题，需要提出提高疫苗接种覆盖率的措施。为了更好地控制季节性流感和未来可能的流感大流行，迫切需要设计和开发一种通用流感疫苗，该疫苗可以应对所有类型和亚型的流感病毒并产生持久的免疫力。部分候选疫苗已进入临床阶段，并表现出良好的免疫原性和安全性，但尚未批准上市的通用流感疫苗，这可能与流感病毒类型的多样性和持续变异以及疫苗的最终疗效有关。参考文献：Li J, Zhang Y, Zhang X, Liu L. Influenza and Universal Vaccine Research in China. Viruses. 2022 Dec 30;15(1):116. doi: 10.3390/v15010116. PMID: 36680158; PMCID: PMC9861666.