抗HER3单克隆抗体的人源化及成药性初步评价

2023-11-11

诊断试剂

中文摘要目的构建人源化抗人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3，HER3）单克隆抗体（单抗）并对其成药性进行初步评估。方法通过互补决定区（complementarity-determining region，CDR）移植对鼠抗HER3单抗进行人源化，然后对骨架区一些位点氨基酸进行回复突变以恢复人源化抗体的亲和力。对重组表达的人源化抗体用聚乙二醇沉淀法检测其在不同缓冲液中的溶解度，并通过测定内源荧光评估其高级结构。结果经CDR移植及回复突变的抗HER3人源化抗体具有与嵌合抗体相当的亲和力，且人源化抗体具有较好的溶解度及典型的抗体内源荧光特性。结论成功人源化了鼠抗HER3单抗，人源化后的抗体具有开发成临床药物的潜力。正文人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER）3在肿瘤的发生、进展等方面起重要的作用。HER3通常与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）或HER2形成异二聚体而发挥作用，在癌症病理组织中，EGFR、HER2过表达常常伴随着HER3的过表达，并且HER3过表达被认为对EGFR、HER2靶向治疗产生耐药性起到重要作用。目前已有多种靶向HER3的抗体类药物进入临床研究，显示了良好的治疗潜力。HER3与配体神经调节蛋白（heregulin，HRG）结合后构象发生变化，暴露出与EGFR、HER2结合的位点，进而与EGFR、HER2形成异二聚体，激活细胞内信号，促进肿瘤细胞增殖。我们前期筛选出抗HER3鼠单克隆抗体（单抗）1044，发现该单抗可阻断HER3与其配体HRG的结合，从而抑制其与HER家族其他分子形成异二聚体，该抗体可以和肿瘤表面HER3结合，并抑制人表皮鳞状细胞癌A431细胞的增殖，具有治疗多种HER3过表达肿瘤 HER3过表达肿瘤的潜力。由于鼠单抗在临床治疗时会引起人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）反应，因此在临床治疗中受到限制。目前，鼠单抗人源化已成为成熟的技术，可以很大程度地降低鼠单抗的免疫原性，已有很多人源化鼠单抗成功上市。本研究拟对抗HER3鼠单抗1044进行人源化改造，并对人源化后的抗体进行成药性初步评价。1材料与方法1.1菌株、细胞及质粒FreeStyle 293-F细胞及表达培养基购自美国Gibco公司，pSGHV0真核表达质粒由美国约翰霍普金斯大学医学院生物物理系Leahy博士惠赠。1.2主要试剂及设备定点突变试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司；Mabselect Sure亲和介质购自美国GE公司；利妥昔单抗（批号 H0709）、曲妥珠单抗（批号 N3674）购自上海罗氏制药有限公司；HER3胞外区重组蛋白由本研究室制备；羊抗人抗体购自美国Jackson ImmunoResearch 公司；聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI ）25000购自美国Polysciences公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000购自美国西格玛奥德里奇公司；聚山梨酯80购自艾万拓化工产品贸易（上海）有限公司；柠檬酸三钠、氯化钠购自德国默克公司；组氨酸、盐酸组氨酸购自上海协和氨基酸有限公司；α，α-双羧海藻糖购自美国Pfanstiehl公司；聚山梨酯20购自美国J. T. Baker公司；SDS-MW Analysis Kit购自美国贝克曼库尔特公司；SpectraMax M5酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司；7100毛细管电泳系统购自美国安捷伦公司；GLM芯片、ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统购自美国伯乐公司。1.3人源化抗体构建用MaXFlow3.6.4软件对鼠单抗1044可变区进行建模。将鼠单抗1044的互补决定区（complementarity determining region，CDR）移植到人抗体骨架区后，由上海钳尚生物技术有限公司合成人源化抗体可变区基因序列，然后将重链、轻链可变区（VH、VL）基因分别构建到含人IgG1重链恒定区及κ链恒定区的pSGHV0载体上。用定点突变试剂盒对人源化后的抗体骨架区VH38、VH48、VH67、VL64等位点进行回复突变并经测序确认。1044人鼠嵌合抗体及各回复突变人源化抗体在293F细胞中用PEI进行瞬时转染，瞬时转染的细胞培养上清液1 500×g离心后用ProteOn XPR36测定亲和力。最终选择的人源化抗体序列由上海奥浦迈生物科技有限公司进行CHO-K1稳定细胞株的构建，用稳定细胞株表达该人源化抗体，然后经Mabselect Sure Protein A亲和介质纯化得到人源化抗体，浓缩到60 mg/ml。1.4ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统测定抗体亲和力GLM芯片横向6个通道标记羊抗人抗体，将通道旋转90°变成纵向捕获293F细胞表达的嵌合抗体或人源化抗体，通道再转到横向，1一5号通道分别进样20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 nmol/L 的HER3胞外区蛋白，6号通道进样缓冲液，得到5个动力学反应曲线，分别代表不同浓度的抗原与捕获抗体的反应结果，用Langmuir模式计算嵌合抗体及各人源化抗体突变体的亲和力常数（KD）。1.5PEG沉淀法测抗体溶解度配置利妥昔单抗商业化产品制剂缓冲液FB1（90 g氯化钠、73.5 g柠檬酸三钠、7 g聚山梨酯80溶于1 L注射用水中，pH6.5）和曲妥珠单抗商业化产品制剂缓冲液FB2（0.3 g组氨酸、0.5 g盐酸组氨酸、0.08 g聚山梨酯20、18.9 g海藻糖溶于1 L注射用水中，pH6.0）。用去离子水配置2份质量分数40%的PEG 8000，pH分别调至6.5和6.0，然后分别用FB1和FB2稀释至不同的浓度。将60 mg/ml的抗HER3人源化抗体用超滤管分别超滤置换到100倍体积FB1和FB2中，终浓度均为20 mg/ml。然后将利妥昔单抗（FB1）、曲妥珠单抗（FB2）、抗HER3人源化单抗（FB1）、抗HER3人源化单抗（FB2）分别用对应的缓冲液（括号内）稀释至10 mg/ml，各取100 μl抗体与100 μl质量分数5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的PEG 8000在96孔板中混匀，反应10 min。1.6毛细管电泳检测抗体纯度取100 μg样品，加入70 μl样品缓冲液，使最终体积为95 μl，再加入250 mmol/L的碘乙酰胺5 μl混匀，4 500×g离心1 min，65 °C水浴4 min，冷却到室温后，4 500×g离心1 min，取100 μl加入到毛细管电泳进样瓶中进行分析。采用非涂层-熔融石英毛细管（内径50 μm），有效长度为24.5 cm。5 kV反相极性电动进样20 s，分离电压15 kV，分离时间40 min，检测波长220 nm。1.7内源荧光检测抗体结构将样品分别用各自对应缓冲液稀释至1.0 mg/ml，加入比色皿中在SpectraMax M5上进行检测，激发波长295 nm，发射波长从310 nm扫描到450 nm，扫描步进为1 nm。2结果2.1抗体人源化将鼠单抗VH、VL氨基酸序列在人抗体库中进行Blast比对，分别选择与鼠抗体VH、VL相似度较高，同时在人体中分布比例较高，并且可变区无潜在糖基化修饰位点的人抗体种系序列为模板进行CDR移植。除了鼠单抗CDR-H1按照Chothia以结构建立的方法定义外，其他5个CDR区按照Kabat以序列变化性方法进行定义。人IGKV3-20*01氨基酸序列与鼠单抗1044 VL相似度为56.8%，该轻链在人体中分布比例较高，选择作为轻链人源化模板。人IGHV1-69*01氨基酸序列与鼠单抗1044 VH相似度为64.3%，该重链在人体中分布比例较高，选择作为重链人源化模板。将鼠单抗1044轻、重链CDR移植到人模板骨架区，人Jκ1序列替换鼠单抗Jκ区，人JH4序列替换鼠单抗JH区。人源化抗体构建制备流程见图1，鼠单抗及人种系骨架区序列对比见图2，鼠单抗可变区模拟结构见图3。在抗体结构中，VL1位点靠近轻链CDR-L3，可能会影响CDR-L3空间结构；VL2位点位于CDR-L1和CDR-L3之间，可能会对CDR-L1和CDR-L3空间结构产生影响；VH73位点靠近重链CDR-H1和CDR-H2，潜在地影响抗体重链CDR-L1和CDR-L2结构。因此在CDR移植过程中将这3个位点保留原鼠单抗氨基酸，得到人源化抗体Hum1044。CDR移植后的人源化抗体与HER3的KD值约为嵌合抗体的8倍，见表1，说明抗体人源化后与HER3的亲和力较嵌合抗体有所降低。VL64位点在抗体中非常保守，绝大部分抗体该位点为Gly，VL64与VL48、50、51、52位点形成CDR-L2标准结构，由于鼠单抗1044的VL64位点为Ser，为非标准结构，因此将VL64位点氨基酸回复突变为鼠单抗氨基酸。VH38位于VHβ折叠结构之间，可能会影响VH结构稳定性，因此将VH38位点回复突变为鼠单抗氨基酸。VH48、VH67位点靠近CDR-H2区，将这2个位点分别回复突变为鼠单抗氨基酸。VL64位氨基酸由Gly突变回鼠源Ser后，亲和力相比Hum1044有所提高，但比嵌合抗体亲和力依然低1/2，在此基础上对VH38或VH67位点回复突变后人源化抗体亲和力基本接近嵌合抗体，KD值相差在2倍以内，见表2。此外对其他一些位点也进行了回复突变研究，未发现对人源化抗体亲和力有明显提升。VL64、VH38回复突变后的序列作为最终的人源化抗体。2.2人源化抗体在不同缓冲液中的溶解度分析用PEG沉淀法来检测蛋白的溶解度。VL64、VH38回复突变后的人源化抗体在CHO-K1细胞进行重组表达，经Protein A亲和层析后，超滤置换入不同的缓冲体系中。PEG沉淀法结果表明（图4），在FB1中，5%PEG条件下人源化抗体开始出现沉淀，在FB2中，10% PEG条件下人源化抗体开始出现沉淀。相比FB1，在FB2中抗HER3人源化抗体溶解度明显较好。在毛细管电泳中，抗HER3人源化抗体在FB1中超滤置换后明显纯度降低，聚合体增加，而在FB2中超滤置换后纯度未发生明显变化，进一步证实在FB2中抗HER3人源化抗体溶解度较好，见表3。2.3人源化抗体内源荧光分析蛋白分子中的色氨酸、酪氨酸在合适的激发光下会发射荧光，尤其是色氨酸具有强的自发荧光。色氨酸、酪氨酸对蛋白微环境的变化比较敏感，当色氨酸、酪氨酸由蛋白疏水中心暴露于蛋白表面时，荧光图谱会发生红移现象。检测蛋白内源荧光可以判断蛋白结构的稳定性。对抗HER3人源化抗体及曲妥珠、利妥昔单抗的内源荧光检测分析发现，抗HER3人源化单抗最大发射波长（λmax）为335 nm，曲妥珠单抗λmax为337 nm，利妥昔单抗λmax为348 nm，抗HER3人源化抗体与曲妥珠单抗λmax相近，具有较稳定的空间结构，利妥昔单抗λmax较大，结构稳定性稍差（图5）。3讨论抗体人源化中人骨架区的选择通常有2种：已知的成熟抗体和人种系序列。已知的成熟抗体骨架区通常含有体细胞突变位点，可能带来潜在的免疫原性。相比成熟抗体，人种系序列骨架区理论上免疫原性更低，而且结构更灵活，可塑性强，容易移植不同的CDR区。本研究选择了人种系序列骨架区进行人源化。由于人抗体种系基因在人体中的使用频率具有一定的偏向性，选择使用频率高的种系骨架区人源化后的抗体具有免疫原性低、表达量高、结构稳定等优点，因此本研究在人源化时并未选择与鼠源抗体相似度最高的种系序列，而是兼顾相似性及人体使用频率，选择了IGKV3-20*01和IGHV1-69*01两个序列的骨架区进行人源化。最终获得的抗HER3人源化抗体与嵌合抗体具有相近的亲和力，证实选用的骨架区是合适的。CDR移植后的抗体通常会丧失抗原结合能力或者结合力降低，需要对骨架区的一些关键位点进行回复突变以恢复其抗原结合能力。本研究在对抗HER3鼠单抗及人源化序列骨架区的比对中发现VL64位氨基酸在人源化中发生了改变，该位点通常参与CDR-L2标准结构的构成，该位点回复突变后亲和力明显提升，已接近嵌合抗体亲和力。在此基础上经过一些位点的回复突变，最终抗HER3人源化抗体的KD恢复到嵌合抗体KD的2倍以内。一般抗体药物在人体使用的剂量相对较大，抗体具有较高的溶解度才可能具备一定的成药性。溶解度既与抗体的物理化学性质，如等电点、表面疏水性、轻重链之间的结合力等相关，又与抗体所在的缓冲液体系有关。抗HER3人源化抗体在不同的缓冲体系中表现出不同的溶解度，在组氨酸缓冲液中溶解度优于柠檬酸缓冲液，针对抗HER3人源化抗体的制剂缓冲液尚未优化筛选，后续随着制剂缓冲体系的进一步优化，抗HER3人源化抗体可能表现出更优的溶解度。抗体内源荧光λmax可以反映抗体分子中色氨酸、酪氨酸的空间分布情况，抗HER3人源化抗体λmax与曲妥珠单抗相似，抗体中色氨酸、酪氨酸包埋较好，未暴露于溶剂中，证实人源化过程所选的人VH、VL骨架区模板结构稳定，与鼠单抗CDR区适配较好，且VH、VL能较好地配对在一起。本研究对抗HER3鼠单抗成功进行了人源化改造，人源化后的抗体达到与嵌合抗体相近的亲和力，通过对该人源化抗体溶解度及内源荧光的研究初步评价了其成药性，后续仍需对该人源化抗体的稳定性、体内外活性及安全性等进行深入研究，完善其成药性评价，支撑该抗HER3人源化抗体的进一步开发。作者梁红远李翱翔张坤明祝婧烨张琳邱建华赵鑫宋效飞瞿爱东上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室，上海 200051通信作者：瞿爱东，Email：quaidong1@sinopharm.com引用本文：梁红远, 李翱翔, 张坤明, 等. 抗HER3单克隆抗体的人源化及成药性初步评价 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 247-252. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230627-00056