靶向多次跨膜蛋白药物开发难？高活性多次跨膜蛋白来助力

2023-07-20

细胞疗法

跨膜蛋白简介跨膜蛋白（TP），也称为整合膜蛋白，占膜蛋白总量的70%~80%。其主要特征是不溶于水，其氨基酸组成疏水性强，也有亲水性氨基酸，由疏水性氨基酸组成的部分，深入脂双层的疏水区，与脂肪酸链共价结合，它们可分布在脂双分子层中或跨越全膜。跨膜蛋白在基本生理过程中起着重要作用，包括分子运输、信号转导和能量利用等。一方面，它们可用于向细胞传递外部环境的信号。另一方面，它们充当接收器收集有关外部环境信号。跨膜蛋白分类跨膜蛋白按功能可以分为多种类型，其中包括G蛋白偶联受体（GPCR）、离子通道、转运蛋白以及其他类型受体等。这些蛋白在细胞内发挥着不同的作用，例如在信号传递、物质转运和细胞通讯等方面。GPCR的胞外区介导受体与配体相互作用，激活的受体将信号传递到细胞内并招募下游效应蛋白。离子通道在细胞膜上形成一个孔道，疏水性氨基酸面向磷脂双层，离子可以通过这个通道穿过细胞膜的疏水核心。这些跨膜蛋白虽然功能不同，但是在生物体中发挥着各自独特和不可或缺的作用。跨膜蛋白作为药物靶点跨膜蛋白是目前最主要的药物靶点，占现阶段已知药物靶点的60%以上，而针对抗体药靶点，膜蛋白几乎占90%以上。以跨膜蛋白为靶点的创新药研发一直是医药领域的研究热点，其中离子通道、转运蛋白、GPCR和激酶是药物研发中最大的一类药物靶点[1,2]。它们参与调解许多重要的细胞生物学效应，其功能异常与多种疾病有关。因此，以它们为靶点开发的抗体在治疗和预防相关疾病方面有独特的优势。抗体靶向不同类型跨膜蛋白的作用机制不同[3]，如下图所示：（a）抗体激活GPCR，作为配体活化或促二聚化；抗体抑制GPCR，如与配体竞争位点。（b）促进内化是抗体靶向离子通道的一种方式。（c）靶向特定功能状态的特异性抗体，靶向细胞摄取葡萄糖的向内和向外开放状态。（d）左侧图表示抗体针对MMP-14的结合部位，右侧图为通过稳定无活性的构象（如CD73二聚体）来抑制酶的活性。图1：选择针对膜蛋白的抗体路径[3]多次跨膜蛋白开发技术难点抗原制备是研发抗体药候选分子的首要条件，理想的抗原应该包含与靶蛋白功能相关的所有关键位点。因此，膜蛋白抗原需具有相关作用的完整构象和转录后修饰；然而跨膜蛋白的制备面临着许多制约的瓶颈，包括膜蛋白表达量少，稳定性差，溶解度低及纯化中遇到的问题。• 表达量低：相较于单次跨膜蛋白或分泌蛋白，多次跨膜蛋白通常表达量较低，需要嵌入细胞膜磷脂双分子层中才能发挥其正常功能，而过表达的跨膜蛋白对细胞却有损伤。• 纯化困难：多次跨膜蛋白具有疏水结构域，在溶液中的溶解度往往较低，且容易形成聚集和失去活性，增加了跨膜蛋白提取和纯化的难度。• 结构复杂：多次跨膜蛋白的结构复杂，包含多个跨膜区域、环状结构和糖基化修饰等，这些都增加了跨膜蛋白的制备难度。近岸蛋白多次跨膜蛋白开发平台1. ECL技术平台膜蛋白抗原需具有相关作用的完整构象和转录后修饰；表达胞外N端或Loop区结构域的方法简单，并且相对而言有较高的表达量，是行之有效的方法之一。近岸蛋白采用哺乳动物细胞表达系统，能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然高等生物蛋白质分子。技术路线多次跨膜蛋白ECL方案设计→质粒构建与抽提→表达方案筛选→蛋白纯化→活性检测&质量检测2. 去垢剂技术平台多次跨膜蛋白在细胞膜上多次穿越，在胞外会形成多个ECLs（Extracellular loops），比如Claudin18.2、CD20都具有两个ECLs，每个ECL都有特定功能甚至会相互影响。只表达ECL较难模拟蛋白的天然构象，可能会造成一些抗原构象表位的丢失，例如CD20治疗性抗体Rituximab和Ofatumumab结合CD20抗原表位就有所不同。全长多次跨膜蛋白可以保证蛋白完整的天然构象，而且ECL完全展现，对于筛选理想的靶向多次跨膜蛋白抗原的治疗性抗体是一种非常好的选择。然而跨膜蛋白具有疏水结构域，跨膜蛋白与脂膜的结合紧密，需要用去垢剂（detergent）才能从膜上洗涤下来，去垢剂同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团，在溶液中为去膜状态下的膜蛋白提供疏水环境，维持膜蛋白的疏水跨膜结构。近岸蛋白以哺乳动物细胞表达技术为基础，搭建了全长多次跨膜蛋白的表达平台和纯化平台，并且已筛选出几种效果很好的去垢剂，能够增溶和纯化跨膜蛋白，并在含有去垢剂的溶液中维持天然正确的构象。技术路线多次跨膜全长蛋白方案设计→质粒构建与抽提→表达方案筛选→蛋白纯化→活性检测&质量检测3. VLP技术平台VLP是Virus Like Particle的简称，VLP来源于病毒的外层衣壳蛋白，由一种或者多种衣壳蛋白组分自动组装形成的纳米级别的微小颗粒。由于VLP颗粒由病毒衣壳蛋白自组装而成，因此不含有病毒基因组，而其特殊的空间结构能够引起强烈的免疫应答反应，这样的特性使得VLP可以作为重组亚单位疫苗[4]。VLP主要分为eVLP和非包膜VLP，在VLP由包膜病毒的衣壳蛋白组装时，通过从宿主细胞出芽，VLP被细胞膜包裹，能够使细胞膜上的跨膜蛋白展示在VLP上。基于VLP高效地激活机体体液和细胞免疫反应应答的效果，使得免疫原性弱的抗原/多肽免疫动物时都能够得到有效的抗体。技术路线多次跨膜全长蛋白方案设计→质粒构建与抽提→VLP表达展示→VLP富集→活性检测&质量检测表1：不同技术平台优劣势对比多次跨膜蛋白产品试用/定制，欢迎咨询！相关产品简介1. Claudin18.2Claudin18.2 (CLDN18.2)是Claudin蛋白质家族的一员，位于细胞膜表面，由两个细胞外环(ECLs)、四个跨膜结构域和一个细胞质结构域组成。CLDN18的C端和N端都位于细胞质中。正常情况下仅低水平表达于胃粘膜分化上皮细胞，但在病理状态下，Claudin18.2在多种肿瘤中有的表达显著上调。此外，Claudin18.2在胃食管癌、胰腺癌、肺癌和其他实体瘤中通常过度表达，因此是具有潜力治疗癌症的热门靶点。据药渡数据库统计，目前全球在研CLDN18.2药物约97款，涉及到单抗、双/多抗、细胞疗法、ADC等不同的药物类型。图2：Claudin18.2结构示意图[5]Cat. No.Product Name蛋白结构技术平台C17DRecombinant Human CLDN18.2 (N-Twin strep-Flag)全长去垢剂技术部分数据展示Immobilized Human CLDN18.2-Twin strep-Flag (Cat#C17D) at 5μg/ml (100 μl/well) can bind Anti-Human Claudin18.2 mAb (Cat#NC004). The ED50 of Anti-Human Claudin18.2 mAb (Cat#NC004) is 29.75 ng/ml.Loaded Anti-Human Claudin18.2 mAb (Cat#NC004) on AHC Biosensor, can bind Human Claudin18.2-Flag (Cat#C17D) with an affinity constant of 6.76 nM as determined in BLI assay.2. Napi2bNaPi2b(2b型钠依赖性磷酸盐转运体)是一种多通道的膜蛋白，是溶质载体SLC34家族的成员，该家族由NaPi-IIa（SLC34A1）、NaPi-IIb（SLC34A2）和NaPi-IIc（SLC34A3）构成。其中NaPi-IIb蛋白通过钠离子共转运介导无机磷酸盐进入上皮细胞，负责维持全身的磷酸盐平衡。NaPi2b在卵巢癌和非小细胞肺癌腺癌中广泛表达，但在正常组织中较少表达。代表性在研药物：Mersana的upifitamab rilsodotin（XMT-1536，UpRi）图3：Napi2b结构示意图[6]目录号产品名称蛋白结构技术平台C27GRecombinant Human NaPi2b ECL2 (C-Fc)ECL2ECL技术C27K‍Recombinant Human NaPi2b (C-6His-Flag)全长去垢剂技术C27WRecombinant Mouse NaPi2b (C-Flag)全长去垢剂技术C27X‍Recombinant Cynomolgus NaPi2b (C-Flag)全长去垢剂技术预售‍Recombinant Human NaPi2b (VLP)VLPVLP技术部分数据展示Immobilized Human NaPi2b ECL2-Fc (Cat#C27G) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody(7C9)*(Cat#NC091).*: Biotinylated by NHS-biotin prior to testing. The ED50 of Human NaPi2b Antibody(7C9) (Cat#NC091) is 50.90 ng/ml. Immobilized Recombinant Human NaPi2b (VLP) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091). The ED50 of Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091) is 41.35ng/ml. Immobilized Recombinant Human NaPi2b-6His-Flag (Cat#C27K) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Anti-Human NaPi2b Antibody (Cat#NC091). The ED50 of Anti-Human NaPi2b Antibody is 15.35ng/ml.Immobilized Recombinant Mouse NaPi2b-Flag (Cat#C27W) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091). The ED50 of Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091) is 1.65ng/ml. Immobilized Recombinant Cynomolgus NaPi2b-Flag (Cat#C27X) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091). The ED50 of Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091) is 3.61ng/ml.3. CD20CD20是位于B细胞上的一种非糖基化磷蛋白，属于MS4A蛋白家族（四次跨膜蛋白家族A），主要在前B细胞到成熟B细胞阶段表达。CD20蛋白由四个疏水跨膜结构域组成，一个胞内结构域和两个胞外结构域（大环和小环），N端和C端均位于胞质内。CD20在正常和恶性B淋巴细胞表面表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。因此，CD20 被认为是一个治疗B细胞恶性肿瘤及自体免疫疾病的重要靶点。据药渡数据库统计，国内外多家企业展开针对CD20靶点的药物研发，涉及到单抗、双/多抗、细胞疗法、ADC等不同的药物类型，超150多个研究管线处于临床前期或已进入临床阶段，超50款药物已经批准上市。图4：CD20结构示意图[7]目录号产品名称蛋白结构技术平台C17GRecombinant Human CD20 (C-Flag)全长去垢剂技术C20PRecombinant Human CD20 (C-6His-Flag)全长去垢剂技术预售Recombinant Human CD20 (VLP)VLPVLP技术部分数据展示Immobilized Human CD20-Flag (Cat#C17G) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Anti-Human CD20 mAb (Cat#NC071) . The ED50 of Anti-Human CD20 mAb (Cat#NC071) is 11.09 ng/ml.Loaded Anti-Human CD20 mAb (Cat#NC071) on AHC Biosensor, can bind Human CD20-Flag (Cat#C17G) with an affinity constant of 3.47 pM as determined in BLI assay.参考文献【1】Yang, Dehua et al. “G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery.” Signal transduction and targeted therapy vol. 6,1 7. 8 Jan. 2021, doi:10.1038/s41392-020-00435-w【2】Bagal, Sharan K et al. “Ion channels as therapeutic targets: a drug discovery perspective.” Journal of medicinal chemistry vol. 56,3 (2013): 593-624. doi:10.1021/jm3011433【3】Georgina To'a Salazar et al. “Antibody Therapies Targeting Complex Membrane Proteins.” Engineering vol. 7,11 (2021) : 1541-1551. doi: 10.1016/j.eng.2020.11.013【4】Mohsen, Mona O, and Martin F Bachmann. “Virus-like particle vaccinology, from bench to bedside.” Cellular & molecular immunology vol. 19,9 (2022): 993-1011. doi:10.1038/s41423-022-00897-8【5】Chen, Jinxia et al. “Targeting CLDN18.2 in cancers of the gastrointestinal tract: New drugs and new indications.” Frontiers in oncology vol. 13 1132319. 10 Mar. 2023, doi:10.3389/fonc.2023.1132319【6】Fenollar-Ferrer, Cristina, and Lucy R Forrest. “Structural models of the NaPi-II sodium-phosphate cotransporters.” Pflugers Archiv : European journal of physiology vol. 471,1 (2019): 43-52. doi:10.1007/s00424-018-2197-x【7】Klein, Christian et al. “Anti-CD20 treatment for B-cell malignancies: current status and future directions.” Expert opinion on biological therapy vol. 21,2 (2021): 161-181. doi:10.1080/14712598.2020.1822318苏州近岸蛋白质科技股份有限公司（简称近岸蛋白）深耕重组蛋白行业十余年，是一家专注于蛋白质技术与应用解决方案的高新技术企业，主营业务为生物药、体外诊断、mRNA疫苗药物、生命科学基础研究等领域的原料与技术解决方案，包括靶点及因子类蛋白、重组抗体、酶及试剂的研发、生产和销售及相关技术服务。公司在上海、苏州和菏泽建有研发、生产基地。访问www.novoprotein.com.cn或致电400-600-0940。