Biotin

引言 我们对癌症的理解，时常陷入一种“盲人摸象”的困境。肿瘤并非一个均质的邪恶肿块，而是一个高度复杂的、动态演化的生态系统。在显微镜下，它如同一个充斥着不同“方言”的巴别塔，由无数基因背景（Genotype）各异的亚克隆（subclones）与各种被裹挟的非癌细胞共同组成。这种“肿瘤内部异质性” (Intra-tumor heterogeneity, ITH) 是癌症治疗失败（如耐药和复发）的根源。要真正理解这座巴别塔是如何拔地而起，又是如何维持运转的，我们必须回答两个终极问题：第一，癌症的“第一颗种子”（细胞起源，cell of origin）究竟是什么细胞？第二，在进化过程中，细胞的“设计蓝图”（DNA基因组）与其“功能状态”（RNA转录组）之间的关系究竟遵循怎样的法则？ 几十年来，我们试图通过分别读取这两份“手稿”来拼凑答案。我们有了scDNA-seq来绘制基因组的蓝图（主要是拷贝数变异，Copy-Number Alterations, CNAs），也有了scRNA-seq来解读细胞的功能（基因表达程序）。但问题在于，这两份手稿来自不同的细胞。我们得到的只是群体的平均印象，却丢失了最关键的联系：到底是哪个基因型导致了哪个表型？为了攻克这一难题，研究人员必须开发一种能在同一个细胞内同时读取这两份手稿的“罗塞塔石碑”。 9月4日，《Cell》的研究报道“Coalescing single-cell genomes and transcriptomes to decode breast cancer progression”，研究人员成功开发了一项名为wellDR-seq的新技术，以前所未有的规模和分辨率，实现了单细胞基因组和转录组的联合分析，为我们揭开了乳腺癌起源的神秘面纱，并改写了我们对癌症进化中“基因剂量效应”的传统认知。 工程师的巧思：如何构建“DNA与RNA的双重阅读器” 同时捕获基因组DNA和转录组mRNA，为什么如此困难？这首先是一个物理化学上的挑战。 在单个细胞内，DNA被紧密地包裹在细胞核的染色质（chromatin）结构中，受到组蛋白的严密保护；而我们关心的信使RNA (mRNA) 则主要分布在细胞质中，结构脆弱且易于降解。传统的基因组测序（scDNA-seq）需要严苛的细胞裂解条件来释放并纯化DNA，这个过程足以将RNA彻底摧毁。反之，转录组测序（scRNA-seq）采用温和的裂解方式以保护RNA，但这又远远不足以打开染色质的枷锁，导致绝大多数基因组DNA无法被捕获。 现有的多组学技术往往顾此失彼。例如，一些方法依赖物理分离细胞核和细胞质，操作繁琐且通量极低，仅限于几十个细胞；另一些方法试图在核内同时捕获DNA和RNA（如DEFND-seq），但它们不可避免地丢失了细胞质中占绝大多数的成熟mRNA，导致RNA数据质量严重受损。 我们需要一种巧妙的化学方法，在同一个微小的反应孔中，让DNA和RNA“和平共处”并被分别标记。wellDR-seq（基于纳米孔的单细胞DNA和RNA测序）正是为此而生。 研究人员使用了一个包含5184个纳米反应孔（nanowell）的芯片。当单个细胞被分配到这些微孔中后，真正的“魔法”开始了。 第一步：彻底解放。 研究人员没有使用常规的裂解液，而是加入了一种关键的蛋白酶（protease）。这种酶如同一种万能溶剂，它会消化掉细胞膜、核膜以及所有束缚DNA的组蛋白。其结果是，细胞内的一切蛋白质结构都被清除了，只剩下纯粹的核酸，基因组DNA和细胞内的所有RNA，完全裸露地释放到纳米孔的微小反应体系中。这是实现双重捕获的化学基础。 第二步：分轨标记。 既然DNA和RNA都已可用，研究人员使用了一种“分而治之”的策略同时给它们打上标签。对于DNA，使用Tn5转座酶（Tagmentation）将其切割成片段并连接接头。对于RNA，使用经典的Poly-dT引物特异性抓取mRNA，并通过逆转录（RT）将其转化为cDNA。 第三步：巧妙的“生物素开关”。 在逆转录过程中，研究人员加入了一个巧妙设计的模板转换寡核苷酸（Template Switch Oligonucleotide, TSO）。这个TSO除了完成cDNA的合成外，还携带了一个关键的“货物”——生物素（biotin）标签。这意味着，细胞中所有由mRNA逆转录而来的cDNA分子，都被悄悄地打上了一个生物素标记。而基因组DNA碎片则没有这个标记。 第四步：统一的细胞条码。 接下来，通过几轮精心设计的PCR反应，研究人员为来自同一个纳米孔的所有cDNA和DNA碎片，都连接上独一无二的细胞条码（cell barcodes）。例如，来自A1孔的细胞，其cDNA和gDNA都会被标记上“A1”这个地址。 第五步：捕捞与分离。 当所有反应完成后，研究人员将5184个孔中的所有产物混合在一起，形成了一个包含数千个细胞的DNA和cDNA的“大汤锅”。此时，生物素标签派上了用场。研究人员加入了链霉亲和素磁珠（Streptavidin beads），如同钓鱼一般，所有携带生物素的分子（即全部的cDNA）都被磁珠“钓”了上来。而那些没有被钓上来的、漂浮在“汤”里的，自然就是所有的基因组DNA。 通过这一系列巧妙的步骤，wellDR-seq成功地从同一个细胞群体中获得了两个独立的文库：一个代表功能（转录组），一个代表蓝图（基因组），而它们可以通过细胞条码被完美地一一对应。严苛的基准测试：新的阅读器超越了“专科医生”吗？ 一项多组学技术最大的风险在于“贪多嚼不烂”，试图同时做两件事，结果可能两件都做不好。wellDR-seq是否在捕获RNA的同时牺牲了DNA的质量？或者反之？研究人员使用乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行了一场严苛的“性能摸底测试”。 评估DNA：高覆盖率与低噪音 研究人员将wellDR-seq与四种专攻DNA的单细胞测序技术（包括Arc-well, 10X CNV, DLP+, DOP-PCR）以及另一种多组学技术（DEFND-seq）进行了正面比较。评估scDNA-seq质量有两个核心指标：过离散度（Overdispersion），代表技术噪音，越低越好；以及覆盖广度（Breadth of coverage），代表能看到多少基因组区域，越高越好。 数据显示，wellDR-seq在噪音控制上与表现最好的Arc-well技术相当，同时显著优于其他所有方法。更重要的是，在覆盖广度上，wellDR-seq完胜了10x CNV, DLP+, DOP-PCR, 和 DEFND-seq。这证明wellDR-seq的DNA数据质量是顶级的。光有质量还不够，它读得“准”吗？研究人员进一步将其与单细胞数据的“金标准”——来自同种细胞系的克隆群体全基因组测序（bulk WGS）——进行对比。结果令人振奋：wellDR-seq生成的假体细胞（pseudobulk）CNA图谱与WGS数据的相关性达到了惊人的 r = 0.965；而在更精细的单个亚克隆水平上，平均相关性也达到了 r = 0.966。 这表明，wellDR-seq在读取DNA蓝图方面，表现如同一位经验丰富的专科医生。 评估RNA：读到我们真正想要的（外显子） 那么RNA呢？研究人员将wellDR-seq与三种主流scRNA-seq方案在相同的测序深度下（约每细胞26,000条读数）进行了比较。wellDR-seq的表现非常出色，平均检测到约2,650个基因，与专攻转录组的Takara平台旗鼓相当。然而，关键在于读到的序列“是什么”。研究人员分析了这些RNA读数在基因组上的分布。结果显示，wellDR-seq有高达92.0%的读数精确地映射到了外显子（Exons）区域，这正是真正编码蛋白质的功能序列。相比之下，10x Genomics的外显子映射率仅为76.4%，而DEFND-seq更只有9.1%。 结论是明确的：wellDR-seq不仅能检测到高数量的基因，而且它检测到的是高质量的、具有真正生物学意义的成熟转录本。 最后的论证：为什么我们不能“猜”？ 此时，一个关键问题浮出水面：我们能否利用计算工具，直接从RNA的表达量“推断”出DNA的拷贝数（CNA）呢？为了回答这个问题，研究人员使用了两种最先进的推断工具（CopyKAT和inferCNV），并将它们应用于wellDR-seq产生的高质量RNA数据上，试图“重建”这些细胞的CNA图谱。然后，他们将“推断”出的CNA图谱与他们手中“实测”到的DNA图谱（来自同一个细胞）进行比较。 结果是毁灭性的。计算推断出的CNA图谱与真实的DNA图谱几乎完全不同，相关性分别仅有 r = 0.52 和 r = 0.49。 这些计算工具不仅完全漏掉了肿瘤中关键的亚克隆结构，还“凭空捏造”了大量根本不存在的CNA事件。 这项对比提供了强有力的证据：推断不能替代检测。 在复杂的癌症生物学中，试图用一份手稿（RNA）去猜测另一份手稿（DNA）的内容，是一种极其不可靠的策略。我们必须，也只能，在同一个细胞中同时阅读这两份手稿。癌症侦探：揪出乳腺癌的“第一颗种子” 有了这把利器，研究人员立即投身于临床实践，他们分析了来自12名ER+（雌激素受体阳性）乳腺癌患者的样本。他们的第一个目标，就是利用wellDR-seq的双重数据，去追捕那个难以捉摸的癌症“起源细胞”。 P1号患者的离奇案件与“c2”亚克隆 在P1号患者的2,901个单细胞中，一场精彩的侦探故事上演了。通过对DNA蓝图进行聚类，研究人员发现了22个截然不同的基因亚群。其中，c1集群是完全正常的二倍体细胞。而c3到c22集群，则是基因组的“重灾区”，是构成肿瘤主体的“邪恶军团”。 然而，c2集群成了一个异类。它只占细胞总量的一小部分，其基因组上唯一的、清晰的异常是丢失了整条22号染色体（chr22 loss）。 当研究人员构建这些亚克隆的进化树（Phylogenetic tree）时，整个故事线清晰了：正常的c1细胞发生了突变，变成了c2细胞。在某个时间点，c2细胞又经历了一次全基因组加倍（WGD）事件，并以此为起点，最终“进化”并分化出了c3到c22这20个不同的癌症亚克隆。这意味着，c2就是这个肿瘤的“祖先亚克隆”（ancestral subclone），是那颗埋藏在正常组织中的“第一颗种子”。 连接蓝图与身份：“祖先”究竟是谁？ 这个祖先细胞，在它癌变之前，究竟是一种什么类型的正常细胞？这是只有wellDR-seq才能回答的问题。研究人员立刻调取了这些DNA集群对应的RNA数据。正常的c1细胞是混合体，晚期的癌症军团（c3-c22）则完全一致地聚集在一个独特的“癌症”RNA集群中。 令人惊讶的是，那颗神秘的种子（c2亚克隆）的RNA身份并不在“癌症”集群里。它隐藏在正常细胞中。数据显示，c2细胞的转录组特征，与正常的管腔激素反应细胞（Luminal Hormone-Responsive, LumHR）完全吻合。在另外三名患者中，研究人员也发现了同样的模式，他们找到的祖先亚克隆，无一例外，全部指向LumHR细胞。 这一系列证据共同构筑了一个清晰的癌症起源模型：至少对于这部分ER+乳腺癌而言，癌症的“第一颗种子”来自一种已经分化的、响应激素的LumHR细胞。这个正常的LumHR细胞首先遭受了第一次基因打击（如chr22 loss），变成了“祖先亚克隆”。这个“受伤”的细胞群体可能潜伏了很长时间，直到某个契机触发了第二次打击，导致其基因组彻底失稳，最终演化为侵袭性癌症。为了给这个结论钉上最后一颗钉子，研究人员甚至在祖先c2细胞中找到了12个在正常细胞中不存在，却在所有癌细胞中100%存在的点突变。证据链形成了完美的闭环。改写剂量法则：当10份拷贝不等于10倍产出 如果说找到癌症的“种子”是wellDR-seq的第一个重大贡献，那么它接下来的发现，则从根本上挑战了我们对癌症进化驱动力的理解，即经典的“基因剂量效应”（gene-dosage effect）。 这个经典法则非常直观：基因的拷贝数决定了基因的表达水平。更多的DNA拷贝 = 更多的RNA产出。而现在，wellDR-seq可以在同一个细胞里，同时手握“拷贝数”（因）和“表达量”（果）。 宏观尺度（染色体片段）：法则成立 首先，研究人员在宏观尺度上检验了这一法则。他们分析了所有发生CNA的染色体大片段。结果呈现出一条近乎完美的线性相关曲线（R = 0.93）。随着DNA拷贝数从1份攀升到惊人的13份，对应片段上的RNA平均表达量也随之线性飙升。在整个研究队列中，高达56%的CNA片段都显示出与其基因表达水平相一致的变化。这证实了我们的传统认知：在宏观平均水平上，基因剂量法则是成立的。 微观尺度（单个基因）：法则崩溃 然而，当研究人员将镜头推向单个基因时，这个简单的图景瞬间崩溃了。他们发现，基因对拷贝数变化的反应并非铁板一块，而是呈现出截然不同的两种命运： 1. 剂量敏感型（Dosage-sensitive）基因： 这些基因是“守法公民”，其RNA表达水平与DNA拷贝数严格相关。许多关键的乳腺癌相关基因都属于此类，例如PGR、AURKA和RB1。 2. 剂量不敏感型（Dosage-insensitive）基因： 这些基因则是“规则豁免者”。无论它们所在的DNA片段如何疯狂扩增或丢失，它们自身的RNA表达水平都“岿然不动”。令人震惊的是，这份“豁免名单”上赫然列着几个乳腺癌中“鼎鼎大名”的驱动基因：PIK3CA、BRCA1和TP53。 这是一个极其深刻的发现。它告诉我们，肿瘤的进化远比我们想象的要复杂。对于像PIK3CA这样的超级致癌基因，它的失调依赖于其他更精巧的机制（例如点突变）。这些关键基因，已经进化到可以“无视”基因组剂量效应。 涟漪效应：31%的“本地（Cis）”行动 vs 69%的“跨区（Trans）”混沌 如果说“剂量不敏感”基因揭示了法则的例外，那么wellDR-seq的下一个发现则揭示了CNA驱动癌症的真正威力——跨区域的涟漪效应。传统观点认为“本地效应”应该是主导。但wellDR-seq的数据彻底颠覆了这一点。 研究人员在所有患者的亚克隆进化对中进行了统计，结果令人瞠目：在所有导致功能差异的差异表达基因（DE genes）中，平均只有31%的基因是“本地（in-cis）”的——即它们确实位于那些新发生拷贝数变化的区域。这意味着，平均有高达69%的功能变化，发生于“跨区（in-trans）”！ 换言之，当肿瘤获得一个新的CNA时，其最主要的后果，不是让本地基因的产出增加，而是像一块石头砸入平静的湖面，激起的“涟漪”扩散到了整个基因组，导致了其他所有“基因组稳定”的染色体上发生了大规模的功能（表达）海啸。被解码的双重手稿 这项研究，为我们提供了一块破解癌症复杂性的“罗塞塔石碑”。wellDR-seq这项技术用数据证明（例如r=0.49的推断失败案例），我们不能再满足于猜测一份手稿的内容；我们必须同时、同地、同细胞地阅读这两份手稿。 通过这块石碑，该研究重写了乳腺癌生物学的两个关键篇章： 第一，癌症的起源故事。研究首次将“祖先基因型”（如c2亚克隆的chr22 loss）与其“细胞身份”（LumHR表型）直接锁定在同一个细胞中，为ER+乳腺癌的“管腔细胞起源说”提供了迄今为止最直接的证据。癌症的种子并非凭空产生，而是潜伏在那些看似正常的、响应激素的细胞中。 第二，癌症的进化法则。研究彻底解构了简单粗暴的“基因剂量效应”。癌症进化不是简单的DNA加减法，而是一个交织着“剂量敏感”与“剂量不敏感”基因的复杂系统。肿瘤每一次基因组的变动（CNA），其最主要的驱动力甚至不是本地基因的改变（仅占31%），而是它所激发的覆盖全基因组的“跨区（trans）”功能涟漪（占69%）。 这为我们开辟了全新的视野：未来我们评估一个基因是否为驱动基因，或许不再仅仅看它是否被扩增或删除，而是要看它是否“剂量敏感”；我们理解癌症的进化，也必须从线性的“CNA累积”转向非线性的“跨区网络调控”。这正是解读癌症双重手稿的真正意义所在。 参考文献 https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell/abstract/S0092-8674(25)00926-2 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ 往期热文： Science | 细胞“内战”打响：线粒体上演“坚壁清野”，饿死入侵的寄生虫！ Nature Medicine | 病毒“沉睡”之后：解码HIV感染者体内的“炎症风暴”与“未老先衰”之谜 Nature Biotechnology | AI 的“完形填空”，解锁“不可成药”靶点：PepMLM 为多肽药物设计开启新纪元 Nature | 秩序的边缘：免疫系统竟靠“制造噪音”来识别敌我？ Cell | 后抗生素时代“破局者”：从“黄金碎片”拼接到自由创造，两种模式开启抗生素AI设计新纪元 Cell | 脱发治疗的“底层逻辑”被发现？调控成纤维细胞生物电或可逆转

在肿瘤药理学与精准治疗领域，天然产物因其结构多样性和生物活性广谱性，始终是创新药物研发的核心领域之一。然而，天然产物作用靶点模糊、机制解析困难的问题，长期制约着其从“传统应用”向“现代精准药物”的转化。与此同时，雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌作为女性发病率最高的恶性肿瘤亚型（占比70%-80%），虽以内分泌治疗为基石，但约30%患者会发展为他莫昔芬耐药，复发后肿瘤侵袭性显著增强，成为临床治疗的“卡脖子”难题。 近期，中南大学药学院联合中南大学湘雅医院、中南大学湘雅二医院、四川大学华西医院等团队发表于《Nature Communications》的研究论文“Harnessing artificial intelligence to identify Bufalin as a molecular glue degrader of estrogen receptor alpha”，通过AI驱动的靶点预测-多维度实验验证-分子机制解析-临床前疗效评估的系统研究框架，首次揭示传统中药活性成分蟾毒灵（Bufalin）作为“分子胶”降解ERα的全新机制，并证实其可有效逆转他莫昔芬耐药，为ER+乳腺癌治疗提供了兼具“传统智慧”与“现代科技”的新策略。 一、研究设计：破解天然产物靶点难题的“AI+实验”双轮驱动体系 天然产物的靶点鉴定是药物研发的关键瓶颈，传统实验筛选方法存在周期长、成本高、通量低的局限。本研究创新性地构建了“计算预测-实验验证-机制深挖”的三阶研究体系，核心在于将AI技术与分子生物学实验深度融合，实现靶点的精准定位与机制的系统解析。图1. 基于组合靶点筛选策略探索蟾毒灵的药理机制。该图系统展示了蟾毒灵潜在靶点的筛选流程，包含五个核心部分：a 概述了靶点预测的完整流程，从初始预测到最终验证形成闭环；b 呈现 FMBS 方法与 Swiss Target Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL33 四个平台预测靶点的交集，通过交集筛选初步获得 53 个候选靶点；c 是 53 个候选靶点的 KEGG 富集分析气泡图，以 - log (pvalue) 和计数为维度，突出与癌症相关的显著通路；d 可视化 KEGG 分析筛选出的癌症相关通路及其对应靶点，最终确定 11 个关键靶点；e 展示基于 11 个关键靶点构建的多任务神经网络模型，通过该模型筛选出 CYP17A1、ESR1、mTOR、AR、PRKCD 5 个高置信度潜在靶点，为后续实验验证指明方向。（一）AI介导的多维度靶点预测：从“广谱筛选”到“精准聚焦” 研究团队首先针对蟾毒灵的靶点预测设计了整合式多策略模型，以解决单一预测平台的局限性： 1. 初始靶点池构建：采用融合多生物特征（FMBS）策略，结合Swiss Target Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL33四大主流靶点预测平台，利用不同算法的互补性生成初始靶点数据集，通过交集筛选获得53个高可信度候选靶点，初步缩小研究范围； 2. 通路富集优化：对53个候选靶点进行KEGG通路富集分析，聚焦与肿瘤发生发展直接相关的信号通路（如乳腺癌通路、癌症中的胆碱代谢、PI3K-AKT通路等），通过弦图可视化通路-靶点关联关系，进一步筛选出11个关键靶点； 3. 多任务QSAR模型验证：基于Chemprop框架构建多任务定量构效关系（QSAR）神经网络模型，以11个关键靶点的1187个化合物结合数据为训练集（80%训练/20%测试），模型ROC-AUC达0.94，具备高预测准确性。以0.8为概率阈值，最终确定CYP17A1、ESR1（编码ERα）、mTOR、AR、PRKCD为5个核心潜在靶点。 该预测体系的优势在于：通过“多平台整合-通路过滤-AI建模验证”的层层递进，既避免了单一算法的偏差，又通过生物学意义筛选确保靶点与肿瘤的关联性，为后续实验验证提供了明确方向。（二）实验验证：从“体外结合”到“细胞功能”的全维度确认 针对AI预测的5个靶点，研究团队通过阶梯式实验验证，明确ERα为蟾毒灵的核心作用靶点： 1. 亲和力排序（SPR实验）：采用表面等离子体共振（SPR）技术检测蟾毒灵与重组CYP17A1、ESR1、PRKCD蛋白的结合能力，结果显示ERα与蟾毒灵的解离常数（KD=5.42×10⁻⁶ M）远低于CYP17A1（2.94×10⁻² M）和PRKCD（1.29×10⁻² M），证实ERα是三者中结合亲和力最强的靶点； 2. 特异性验证（Biotin pulldown实验）：合成生物素标记的蟾毒灵（Biotin-Bufalin），在293T细胞（过表达ERα）和MCF-7细胞（内源性ERα）中进行下拉实验，结果显示Biotin-Bufalin可特异性捕获ERα，且结合具有剂量依赖性，游离蟾毒灵可竞争性抑制该结合，排除非特异性相互作用； 3. 功能相关性验证（CETSA与共定位实验）：热位移实验（CETSA）显示蟾毒灵可使ERα的熔解温度（Tm）升高2.17℃，表明其可稳定ERα蛋白构象；免疫荧光实验观察到蟾毒灵（FITC标记）与ERα在MCF-7细胞核内共定位，进一步证实两者在细胞内的直接相互作用。 这一系列实验从“体外分子结合”到“细胞内定位与构象影响”，形成了完整的证据链，明确ERα是蟾毒灵在ER+乳腺癌中的关键作用靶点，为后续机制研究奠定基础。图2. 蟾毒灵与雌激素受体 α（ERα）的直接相互作用验证。该图通过一系列实验证实蟾毒灵与 ERα 的特异性结合，a、b、c 分别为表面等离子体共振（SPR）实验结果，显示蟾毒灵与重组 ESR1（ERα 编码基因产物）、PKC delta（PRKCD 编码蛋白）、CYP17A1 蛋白的结合信号，数据表明蟾毒灵与 ESR1 的结合亲和力最强（KD=5.42E-06 M）；d、e 为生物素 - 蟾毒灵（Biotin-Bufalin）下拉实验结果，分别在转染 ERα 质粒的 293T 细胞和内源性表达 ERα 的 MCF-7 细胞中，证实 Biotin-Bufalin 可特异性捕获 ERα；f 显示 Biotin-Bufalin 与 ERα 的结合具有剂量依赖性；g 表明游离蟾毒灵可竞争性抑制 Biotin-Bufalin 与 ERα 的结合；h 为热位移实验（CETSA）结果，显示蟾毒灵可提高 ERα 的热稳定性（ΔTm=2.17℃）；i 为免疫荧光染色结果，观察到蟾毒灵（FITC 标记）与 ERα 在 MCF-7 细胞内共定位，从多维度证实两者直接且特异性的相互作用。二、核心机制：蟾毒灵作为“分子胶”促进ERα泛素-蛋白酶体降解的全新范式 明确ERα为靶点后，研究团队围绕“蟾毒灵如何调控ERα功能”展开深入探究，最终揭示其作为分子胶增强ERα与E3泛素连接酶STUB1相互作用、诱导ERα降解的全新机制，这也是本研究最核心的科学突破。（一）ERα降解的调控方式：泛素-蛋白酶体途径的特异性激活 首先，研究通过剂量/时间依赖性实验与通路抑制剂干预，明确蟾毒灵对ERα的调控为“转录后降解”： 1. 降解特征：Western blot显示，蟾毒灵以剂量（0-100 nM）和时间（0-48 h）依赖性方式降低MCF-7、T47D细胞中ERα蛋白水平，但qPCR结果显示ERα mRNA表达无显著变化，排除转录抑制机制； 2. 降解途径确认：环己酰亚胺（CHX，蛋白合成抑制剂）追踪实验显示，蟾毒灵可加速ERα蛋白降解速率；蛋白酶体抑制剂MG-132可完全逆转蟾毒灵诱导的ERα下调，而溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）无明显作用；泛素激活酶抑制剂MLN4924同样可减弱ERα降解，提示降解依赖泛素-蛋白酶体途径； 3. 泛素化水平验证：共免疫沉淀（Co-IP）实验显示，蟾毒灵处理后，ERα的泛素化修饰水平显著升高（以HA-Ub或Flag-ERα为靶点检测），直接证实其通过促进ERα泛素化实现降解。图3. 蟾毒灵诱导 ERα 降解并抑制其转录活性。该图围绕蟾毒灵对 ERα 的调控效应展开，a 为 Western blot 结果，显示 MCF-7 和 T47D 细胞经不同浓度蟾毒灵处理 48 小时后，ERα 蛋白水平呈剂量依赖性降低；b 显示同一细胞系经 50 nM 蟾毒灵处理不同时间后，ERα 蛋白水平呈时间依赖性降低；c 为环己酰亚胺（CHX）追踪实验结果，证实蟾毒灵可加速 ERα 蛋白降解；d、e 表明蛋白酶体抑制剂 MG-132 和泛素激活酶抑制剂 MLN4924 可逆转蟾毒灵诱导的 ERα 下调，而 f 显示溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）无此效应，提示 ERα 降解依赖泛素 - 蛋白酶体途径；g、h 为共免疫沉淀（Co-IP）实验结果，证实蟾毒灵可增强 ERα 的泛素化水平；i 为 ERE 荧光素酶报告基因实验结果，显示蟾毒灵可抑制 ERα 的转录活性；j 为 qPCR 结果，表明蟾毒灵可下调 ERα 下游靶基因（AGR2、CCND1、GREB1 等）的 mRNA 表达，全面揭示蟾毒灵对 ERα 的降解作用及对其功能的抑制。（二）分子胶作用的结构基础：Arg394为核心结合位点 为明确蟾毒灵与ERα的结合细节，研究通过分子对接与突变实验，锁定Arg394为关键结合残基： 1. 分子对接与MD模拟：采用Glide SP协议将蟾毒灵对接至ERα结合口袋（PDB ID: 3ERT），经100 ns分子动力学（MD）模拟与MM-GBSA能量计算，发现Leu354、Leu387、Arg394、Met528、Ala350为能量贡献＞-1 kcal/mol的关键残基； 2. 丙氨酸扫描突变验证：构建ERα单点突变体（Leu354A、Leu387A、Arg394A、Met528A、Ala350Q），在293T细胞中进行Biotin pulldown实验，结果显示仅Arg394A突变完全丧失与Biotin-Bufalin的结合能力；进一步的降解实验显示，Arg394A突变体的ERα降解效率显著降低，泛素化水平也随之下降。 这一结果表明，Arg394是蟾毒灵与ERα结合的“不可替代位点”，其突变会完全阻断蟾毒灵的后续调控作用，为后续结构优化提供了明确的分子靶点。图4. 蟾毒灵选择性结合 ERα 的 Arg394（R394）残基。该图聚焦蟾毒灵与 ERα 的结合位点解析，a 展示采用 Glide SP 协议将蟾毒灵对接至 ESR1 结合口袋的分子对接结果；b 为对接形成的 ESR1 - 蟾毒灵复合物经 100 ns 分子动力学（MD）模拟后，通过 MM-GBSA 能量计算和残基能量分解得到的前 10 个关键作用残基；c 为对这 10 个残基进行丙氨酸扫描突变的设计方案；d 为下拉实验结果，在转染 ERα 野生型（WT）或突变体质粒的 293T 细胞中，仅 Arg394A 突变体丧失与 Biotin-Bufalin 的结合能力；e 为 Western blot 结果，显示 Arg394A 突变体的 ERα 降解效率显著降低；f 为 Co-IP 实验结果，证实 Arg394A 突变体在蟾毒灵处理下泛素化水平下降，明确 Arg394 是蟾毒灵与 ERα 结合及诱导 ERα 降解的关键残基。（三）分子胶功能的关键效应：增强ERα与STUB1的相互作用 分子胶的核心功能是“诱导靶点蛋白与E3泛素连接酶的 proximity”，本研究通过MD模拟与功能实验，证实蟾毒灵可增强ERα与STUB1的相互作用： 1. E3连接酶筛选：基于已有研究，选择与ERα降解相关的E3连接酶（TRIM56、RNF181、RNF2、STUB1）进行MD模拟，结果显示：蟾毒灵存在时，ERα与STUB1的结合自由能从-4.9455 kcal/mol降至-58.1918 kcal/mol，而与其他E3连接酶的结合能无显著变化，提示STUB1是蟾毒灵作用的特异性E3连接酶； 2. 相互作用增强的结构证据：200 ns MD模拟显示，蟾毒灵结合ERα后，会诱导ERα构象发生细微改变（如Arg394形成氢键），使ERα与STUB1的结合表面积增加、氢键数量增多（模拟后期氢键数达3-4个），且ERα-STUB1复合物的RMSD值更稳定（＜3.5 Å），表明复合物构象更稳定； 3. 功能验证（STUB1沉默实验）：在MCF-7、T47D细胞中沉默STUB1后，蟾毒灵诱导的ERα降解效率显著降低，ERα泛素化水平也随之下降；Co-IP实验进一步证实，蟾毒灵可显著增强ERα与STUB1的相互作用。 这些结果清晰揭示：蟾毒灵通过“分子胶”机制，一方面与ERα的Arg394结合，另一方面诱导ERα构象改变以增强其与STUB1的相互作用，最终促进ERα泛素化降解——这是天然产物中罕见的分子胶作用模式，为分子胶药物的研发提供了新的天然模板。图5. 蟾毒灵通过增强 ERα 与 E3 连接酶 STUB1 的相互作用促进 ERα 降解。该图揭示蟾毒灵作为分子胶的作用机制，a 展示 ERα 与 STUB1 在有无蟾毒灵存在时的结合构象，其中品红色为蛋白对接结果，绿色为加蟾毒灵后 200 ns MD 模拟聚类构象，蓝色为不加蟾毒灵的模拟构象，黄色棍状结构为蟾毒灵；b 显示 200 ns 模拟时 ERα- 蟾毒灵 - STUB1 复合物的构象变化，蟾毒灵与 ERα 的 Arg394 形成氢键；c 为 ERα-STUB1 复合物的 RMSD 曲线，表明加蟾毒灵后复合物构象更稳定；d 为结合表面积分析，显示蟾毒灵可增加 ERα 与 STUB1 的结合表面积；e 为 RMSF 曲线，表明蟾毒灵可降低 ERα 和 STUB1 结合界面残基的灵活性；f 显示模拟过程中 ERα 与 STUB1 之间氢键数量的变化，加蟾毒灵后氢键数量增多；g 为 Western blot 结果，显示沉默 STUB1 可升高 ERα 水平；h 为 Co-IP 实验结果，证实蟾毒灵可增强 ERα 与 STUB1 的相互作用；i 表明沉默 STUB1 可减弱蟾毒灵诱导的 ERα 降解，证实 STUB1 在蟾毒灵介导的 ERα 降解中不可或缺。三、功能价值：从“细胞活性”到“临床前疗效”的全场景验证 机制解析后，研究团队通过ERα依赖性验证与耐药模型评估，全面证实蟾毒灵的抗肿瘤活性及逆转他莫昔芬耐药的潜力，为临床转化提供了扎实证据。（一）ERα依赖性：蟾毒灵抗肿瘤活性的核心前提 为明确ERα降解与抗肿瘤活性的因果关系，研究通过ERα沉默/过表达实验进行验证： 1. 增殖抑制与凋亡诱导：CCK-8和集落形成实验显示，蟾毒灵可显著抑制MCF-7、T47D细胞增殖（IC50分别为20 nM、30 nM）；Annexin V-PI染色显示，50 nM蟾毒灵处理48 h可使凋亡率提升至25%-30%，且凋亡标志物（切割型PARP）表达升高； 2. ERα依赖性验证：siRNA沉默ERα后，蟾毒灵诱导的细胞凋亡率下降50%以上，增殖抑制效应显著减弱；而过表达ERα的293T细胞对蟾毒灵的敏感性显著增强（IC50降至10 nM）。 这一结果证实：蟾毒灵的抗肿瘤活性完全依赖于ERα的存在，ERα降解是其发挥疗效的核心机制，排除了其他非特异性作用的干扰。图6. 蟾毒灵对 ER + 细胞的抗肿瘤活性依赖于 ERα。此图验证 ERα 在蟾毒灵抗肿瘤效应中的核心作用，a 为集落形成实验结果，显示不同浓度蟾毒灵可抑制 MCF-7 和 T47D 细胞的集落形成能力；b 为 CCK-8 实验结果，表明蟾毒灵以剂量依赖性方式降低两株细胞的活力；c 为 Annexin V-FITC/PI 染色结果，显示蟾毒灵可诱导 MCF-7 细胞凋亡；d、e 为沉默 ERα（siESR1）后，MCF-7 细胞对蟾毒灵诱导的凋亡敏感性降低；f 为 Western blot 结果，显示沉默 ERα 可减弱蟾毒灵诱导的 PARP 切割（凋亡标志物）；g 为 CCK-8 实验结果，表明沉默 ERα 可降低 T47D 细胞对蟾毒灵的敏感性；h 显示过表达 ERα（Flag-ERα）可增强 293T 细胞对蟾毒灵的敏感性；i 为集落形成实验结果，进一步证实沉默 ERα 可减弱蟾毒灵对 MCF-7 细胞增殖的抑制，明确蟾毒灵的抗肿瘤活性依赖 ERα。（二）他莫昔芬耐药逆转：从“细胞系”到“PDO”的全维度疗效 针对临床核心需求，研究团队在耐药细胞系、动物模型、患者来源类器官（PDO） 中系统评估蟾毒灵的疗效： 1. 耐药细胞系（LCC2）中的活性：LCC2细胞是经典的他莫昔芬耐药细胞系，Western blot显示蟾毒灵仍可有效降解LCC2中的ERα；CCK-8、集落形成、EdU实验证实，蟾毒灵以剂量依赖性方式抑制LCC2增殖（IC50=40 nM），且疗效优于氟维司群（IC50=80 nM）；凋亡实验显示，100 nM蟾毒灵可使LCC2凋亡率达35%，显著高于氟维司群（20%）；（图7） 2. 体内疗效与安全性：在LCC2裸鼠皮下移植瘤模型中，腹腔注射蟾毒灵（0.5 mg/kg、1.0 mg/kg）可使肿瘤体积缩小40%-60%，肿瘤重量降低50%-70%，且肿瘤组织中ERα蛋白水平下降、Ki67（增殖标志物）表达降低；血清生化指标（ALT、AST、BUN、CREA）检测显示，治疗剂量的蟾毒灵对小鼠肝肾功能无显著影响，安全性良好；（图8） 3. 患者来源类器官（PDO）验证：从8例他莫昔芬复发患者的肿瘤组织中构建PDO模型，结果显示：蟾毒灵（50-200 nM）可使PDO体积缩小50%-80%，细胞活力降低60%-90%；Calcein-AM/PI染色显示，蟾毒灵处理后PDO内死细胞（PI阳性）比例显著升高，证实其在临床样本中的疗效。（图9） 这一系列实验从“体外耐药细胞”到“体内动物模型”，再到“临床患者样本衍生的PDO”，形成了完整的临床前疗效证据链，充分证实蟾毒灵可有效逆转他莫昔芬耐药，且安全性良好，具备极高的临床转化价值。图7. 蟾毒灵在体外逆转他莫昔芬耐药。该图在他莫昔芬耐药模型中评估蟾毒灵的活性，a 为免疫组化（IHC）结果，显示 8 例他莫昔芬复发患者的肿瘤组织中仍高表达 ERα；b 为 Western blot 结果，显示蟾毒灵可在他莫昔芬耐药细胞 LCC2 中降解 ERα；c 为 CCK-8 实验结果，表明蟾毒灵以剂量依赖性方式降低 LCC2 细胞活力；d 为集落形成实验结果，显示蟾毒灵可抑制 LCC2 细胞集落形成；e 为 EdU 实验结果，显示蟾毒灵可减少 LCC2 细胞的 DNA 合成（增殖指标）；f 为 Western blot 结果，显示蟾毒灵可诱导 LCC2 细胞中 PARP 切割并下调 Bcl-2（抗凋亡蛋白）；g 为 Annexin V-FITC/PI 染色结果，证实蟾毒灵可诱导 LCC2 细胞凋亡；h、i 分别通过集落形成和 CCK-8 实验，表明蟾毒灵对 LCC2 细胞的抑制效应优于氟维司群，证实其在体外可逆转他莫昔芬耐药。图8. 蟾毒灵在体内逆转他莫昔芬耐药。此图在动物模型中验证蟾毒灵的体内疗效与安全性，a 为 LCC2 裸鼠皮下移植瘤实验中，不同处理组（溶剂对照、0.5 mg/kg 蟾毒灵、1.0 mg/kg 蟾毒灵、2.0 mg/kg 氟维司群）的肿瘤实物图；b 图为肿瘤体积生长曲线，显示蟾毒灵可显著抑制肿瘤生长，且高剂量组效果更优；c 为实验终点肿瘤重量统计，证实蟾毒灵可降低肿瘤重量，疗效优于氟维司群；d 为 IHC 结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤组织中 Ki67（增殖标志物）表达降低；e 为 H&E 染色结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤细胞排列松散、细胞核缩小，提示细胞增殖受抑；f 为 IHC 结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤组织中 ERα 表达降低；g 为 Western blot 结果，进一步证实蟾毒灵可在体内降低 ERα 蛋白水平；h、i 为小鼠血清生化指标（肝肾功能相关）检测结果，显示治疗剂量的蟾毒灵对小鼠肝肾功能无显著影响，安全性良好。图9. 蟾毒灵在他莫昔芬耐药患者来源类器官（PDO）中具有显著抗肿瘤活性。该图在临床相关模型中验证蟾毒灵的疗效并总结作用机制，a 为他莫昔芬复发患者来源 PDO 经蟾毒灵处理后的代表性图像；b 为 PDO 体积统计结果，显示蟾毒灵以剂量依赖性方式缩小 PDO 体积；c 为 PDO 活力检测结果，表明蟾毒灵可降低 PDO 细胞活力；d 为 Calcein-AM/PI 荧光染色结果，显示蟾毒灵处理后 PDO 内死细胞（PI 阳性）比例显著升高，证实其对 PDO 的杀伤效应；e 为机制示意图，总结本研究发现：通过 AI 结合分子对接预测，蟾毒灵可结合 ERα 的 Arg394 残基，作为分子胶增强 ERα 与 E3 连接酶 STUB1 的相互作用，促进 ERα 泛素 - 蛋白酶体降解，进而在体外、体内及 PDO 模型中逆转他莫昔芬耐药，为 ER + 乳腺癌治疗提供新策略。四、研究的科学价值与未来展望 本研究不仅为ER+乳腺癌耐药治疗提供了新的候选药物，更在天然产物机制解析、AI辅助药物研发等领域具有重要的科学意义： 1. 天然产物靶点解析的范式创新：首次将AI多任务模型与分子生物学实验结合，建立了“预测-验证-机制”的系统框架，解决了天然产物靶点模糊的难题，为其他天然产物的机制研究提供了可推广的方法学参考； 2. 分子胶药物的新发现：蟾毒灵是首个被证实具有ERα分子胶功能的天然产物，其作用模式（结合Arg394增强ERα-STUB1相互作用）为分子胶药物的设计提供了新的结构模板，突破了传统分子胶多为合成小分子的局限； 3. 临床转化的明确方向：基于Arg394结合位点，可进一步开展蟾毒灵的结构优化，开发亲和力更强、毒性更低的衍生物；同时，可探索蟾毒灵与CDK4/6抑制剂、免疫检查点抑制剂的联合治疗策略，进一步提升ER+乳腺癌的治疗效果。 综上，该研究通过AI技术赋能天然产物机制解析，不仅揭示了蟾毒灵作为ERα分子胶降解剂的全新作用模式，更为他莫昔芬耐药乳腺癌患者提供了新的治疗希望，是“传统中药现代化”与“精准肿瘤治疗”交叉融合的典范之作。参考文献 Jiang, S., Liu, K., Jiang, T. et al. Harnessing artificial intelligence to identify Bufalin as a molecular glue degrader of estrogen receptor alpha. Nat Commun 16, 7854 (2025). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41467-025-62288-7 代码：https://github.com/wei-xiao-ya/multi_task-NNhttps://github.com/LiHui-CADD/pro1-pro2-lig/tree/master