柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

2023-02-24

疫苗临床研究

中文摘要目的建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10，CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法，用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体（单抗）细胞株，以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水，羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体，进行配对筛选研究，建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA；对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证，并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对，其中5株单抗配对成功，选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立；对检测方法进行优化，确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1∶5 000~1∶10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1∶2 000~1∶4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42~10.00 U/ml，线性决定系数≥0.99；该方法仅能特异性检测CV-A10抗原，与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应；对高、中、低浓度样品进行测定，测定值/理论值在95%~110%之间，相对标准偏差在15%以内。结论建立了CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA，该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好，可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制，为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。正文手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）由20多种肠道病毒引起，其中肠道病毒71型（enterovirus A71，EV-A71 ）、柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CV-A16），CV-A6 和 CV-A10为引起HFMD暴发流行的主要病原体[1-5]。随着EV-A71灭活疫苗的上市，由EV-A71引起的HFMD明显减少[6]。近年来，CV-A10在全球广泛流行，尤其是在中国已引起多次HFMD暴发，在个别地区已取代EV-A71和CV-A16成为HFMD的主要病原体[7-8]。CV-A10属于A组肠道病毒，作为引发HFMD的相关病原，对全球婴幼儿的健康具有严重威胁。除在患儿手、足、口处引起红色疱疹外，CV-A10的感染还可能导致发热、疱疹性咽峡炎，严重者甚至引发病毒性脑膜炎等。但由于目前尚无可预防多种HFMD病原感染的多价疫苗上市，对CV-A16、CV-A6和CV-A10等引起的HFMD尚无有效的预防手段，因此多价HFMD疫苗的研制具有重要意义，建立CV-A10抗原检测方法对于四价HFMD疫苗研制中工艺和质量的评价至关重要。本研究旨在建立CV-A10抗原测定方法，为CV-A10生产工艺和质量评价提供方法学支持。1材料与方法1.1材料人横纹肌肉瘤（human rhabdomyosarcoma，RD）细胞由美国典型培养物保藏中心提供，CV-A10由国药中生生物技术研究院有限公司第二研究室（第二研究室）分离。CV-A10（含量 12 536 U/ml）、CV-A6、CV-A16、EV-A71（纯度均在95%以上）抗原和CV-A10抗原参考品（批号 20210823，2 000 U/ml）由第二研究室制备，绵羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单克隆抗体（单抗）10-1、10-2、10-4、10-6、10-7、CY166-13、CY166-14R纯化由第二研究室完成（纯度均在95%以上），Vero细胞蛋白由第二研究室提供，CV-A10收获液、浓缩液、纯化样品（GF、IEC）、单价原液、成品均由第二研究室制备。小鼠抗CV-A10单抗委托北京博奥森生物技术有限公司制备，羊抗CV-A10血清委托北京佑科生物科技有限公司制备。辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗小鼠IgG购自美国Southern Biotech公司，M199、DMEM培养基购自天信和（苏州）生物科技有限公司，牛血清由浙江天杭生物科技股份有限公司提供。MULTISKAN ASCENT酶标仪由美国Thermo公司提供。无特定病原体级雌性BALB/c小鼠60只，18~22 g，6~8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物使用许可证号SCXK（京）20160006。1.2方法1.2.1 抗体制备、活性检测以及亚型鉴定以纯化的CV-A10抗原多次免疫小鼠和绵羊，待抗体ELISA效价达到106以上获得羊免疫血清，并制备小鼠单抗，以亲和层析法纯化羊多抗和小鼠单抗。采用间接ELISA对多抗和单抗进行ELISA效价检测和单抗亚型鉴定：包被CV-A10抗原1 μg/ml，100 μl/孔，2~8 °C包被16~18 h，洗板并封闭后加入系列稀释的待测抗体，37 ℃水浴1.5 h后洗板，加入酶标抗体，37 ℃水浴1 h后洗板，四甲基联苯胺显色液显色10 min终止反应，读取450和620 nm吸光度（A）值，以2.1倍空白A值为cut-off值计算ELISA效价。采用微量细胞病变法检测中和抗体效价：将待测抗体进行4倍稀释，然后于96孔板内进行2倍系列稀释，共8个稀释度，每孔50 μl，共2个复孔，每孔加入50 μl含100 CCID50的CV-A10病毒液，37 ℃ CO2培养箱中和3 h，加入浓度为1×105 ml-1的RD细胞悬液，100 μl/孔，35 ℃、5% CO2培养7 d，观察细胞病变，将能抑制50%细胞病变的抗体稀释倍数判定为中和效价。1.2.2 双抗体夹心ELISA抗体配对筛选按照一定稀释倍数用0.05 mmol/L碳酸盐缓冲液稀释纯化的羊多抗，100 μl/孔，2~8 ℃孵育16~18 h，用含Tween的PBS（PBST）洗板后以1%牛血清白蛋白封闭液37 ℃水浴中封闭至少1 h；将梯度稀释的CV-A10抗原加入板中，100 μl/孔，37 ℃水浴1.5 h；PBST洗板3次，加入一定比例稀释的小鼠单抗，100 μl/孔，37 ℃水浴1.5 h；PBST洗板3次，加入羊抗小鼠IgG-HRP，37 ℃水浴1.0 h；PBST洗板3次，室温显色10 min后终止反应。读板：检测波长450 nm，参比波长620 nm。根据抗原-抗体反应的A值以及线性情况确定包被抗体和检测抗体。1.2.3 双抗体夹心ELISA实验条件优化分别以1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000 稀释包被羊多抗，以1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000稀释检测单抗CY166-14R，设计方阵实验，对系列梯度稀释的CV-A10抗原进行检测；加入1∶4 000稀释羊抗小鼠IgG-HRP；四甲基联苯胺显色液显色后终止反应。读板：检测波长450 nm，参比波长620 nm。根据抗原抗体反应的A值以及线性情况确定最佳包被抗体和检测抗体稀释倍数。1.2.4 CV-A10抗原检测方法的验证按照中国药典2020年版三部（药典三部）等标准对CV-A10抗原检测方法进行验证，主要包括方法的线性、专属性、准确度、精密度（重复性、中间精密度）、范围[9-11]。1.2.4.1 线性将CV-A10抗原参考品稀释至不同浓度（20.00、13.33、10.00、6.67、5.00、3.33、2.50、1.67、1.25、0.83、0.63、0.42、0.31、0.21 U/ml），对抗原浓度和两个波长的读数比值（A450/620值）分别取对数后进行直线回归，根据回归值/理论值和线性决定系数（R2）确定方法最佳检测范围，并对范围内的线性和平行性进行评价。1.2.4.2 专属性考虑到该方法用于多价HFMD疫苗的抗原检测，专属性主要包括对该多价疫苗其他病毒型别抗原（CV-A6、CV-A16和EV-A71）的交叉反应能力以及生产过程中存在的M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清对方法的干扰能力进行验证。1.2.4.3 准确度选取高浓度（＞75%检测范围上限，8.0 U/ml）、中浓度（检测范围中间段，4.0 U/ml）、低浓度（＜3倍检测范围下限，0.5 U/ml）CV-A10抗原样品进行检测，计算测定值与理论值的比值。1.2.4.4 精密度同1.2.4.3选取高、中、低浓度CV-A10抗原样品进行检测，计算多次测定值的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。1.2.4.5 范围根据线性、准确度和精密度验证结果确定范围，即能满足一定线性R2、准确度和精密度要求的测定浓度范围。1.2.5 CV-A10抗原检测方法的初步应用对多价HFMD疫苗生产过程中CV-A10收获液、浓缩液、纯化样品（GF、IEC）、单价原液以及成品进行检测，对该方法进行初步应用研究。2结果2.1抗体活性检测和亚型鉴定共获得7个具有中和抗体活性的小鼠单抗，ELISA效价为 1.00×105 ~1.00×106，羊多抗ELISA效价为105；7个单抗中和抗体滴度在1∶256~1∶1 024，均具有一定的中和抗体活性，羊多抗中和抗体活性较高，滴度大于1∶16 384；7个单抗中除CY166-13为IgG3亚型外，其他均为IgG2a亚型，见表1。2.2抗体配对筛选和实验浓度优化2.2.1 抗体配对筛选以羊多抗作为包被抗体，小鼠单抗作为检测抗体进行配对实验，结果表明，10-1、10-2、10-4、10-6 和 CY166-14R单抗A450/620值较高，均可与羊多抗进行配对；单抗10-7和CY166-13的 A450/620值较低，配对失败。10-1、10-2、10-4、10-6和CY166-14R均可用于方法的建立，选择线性范围较广的CY166-14R作为检测抗体进行实验条件的优化，见图1。2.2.2 抗体使用浓度的优化包被抗体稀释比例为1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000，随包被抗体稀释比例的增大，A450/620值降低，包被抗体稀释比例1∶20 000时，A450/620值较低，稀释比例1∶5 000~1∶10 000时，A450/620值较为理想；不同稀释比例的检测抗体对A450/620值影响较小，见图2。由结果可知，包被抗体稀释比例1∶5 000~1∶10 000、检测抗体稀释比例1∶2 000~1∶4 000时较合适。2.3方法验证2.3.1 线性以双对数法进行标准曲线拟合，CV-A10抗原浓度在0.31~13.33 U/ml时，线性回归值与理论值比值在85%~115%之间，线性R2大于0.85；在抗原浓度为0.42~10.00 U/ml时，该范围内线性较好，线性R2可达0.99以上。2.3.2 专属性用该方法对CV-A6、CV-A16和EV-A71抗原样品进行检测，均未检测到3种抗原，即该方法对CV-A6、CV-A16和EV-A71抗原均无交叉反应；在CV-A10抗原中加入DMEM培养基、M199培养基、Vero细胞蛋白和牛血清进行检测，CV-A10测定值与理论值一致，即DMEM培养基、M199培养基、Vero细胞蛋白和牛血清对该方法测定无干扰；该方法特异性良好。2.3.3 准确度 4次实验结果见表2，高、中、低3个浓度测定值与理论值比值分别为99%、106%和97%，均在95%~110%之间。2.3.4 精密度2.3.4.1 重复性 4次实验结果见表3，高、中、低3个浓度测定RSD分别为4%、2%和5%，均在15%以内，该方法重复性较好。2.3.4.2 中间精密度高、中、低3个浓度同一日期4次实验测定RSD分别为7%、9%和10%；3个浓度不同日期4次实验测定RSD分别为2%、2%和3%；3个浓度不同检测人员3次实验测定RSD分别为3%、4%和2%。该方法日内精密度、日间精密度、人员测定精密度RSD均在15%以内，见表4—6。2.3.5 范围综合线性、准确度和精密度验证结果，在范围0.42~10.00 U/ml时，线性R2≥0.99，抗原测定准确度测定值/理论值在95%~110%之间，抗原测定精密度RSD均低于15%。因此确定该CV-A10抗原检测方法范围为0.42~10.00 U/ml。2.4初步应用采用所建立的CV-A10抗原检测方法对CV-A10抗原生产过程中的收获液、浓缩液、纯化样品（GF、IEC）进行检测，比活值（抗原/蛋白）依次增加，灭活后单价原液抗原比活有一定程度的下降，可有效反映工艺过程中抗原纯度和回收率变化趋势；在成品测定中，2个剂量、各3批次四价HFMD疫苗解离后测定CV-A10抗原回收率在90%~115%之间，提示该方法可适用于四价HFMD疫苗CV-A10抗原工艺过程和成品的质量控制。结果见表7、8。3讨论CV-A10体外效力的检测直接关乎疫苗的免疫原性，抗原测定是四价HFMD疫苗生产工艺和成品质量控制中最重要的质控指标。本研究通过对抗CV-A10羊多抗和小鼠单抗的配对研究，筛选出具有中和活性的抗CV-A10单抗7株，其中5株可与羊多抗配对并呈现良好的线性关系。在对单抗特性的研究中，我们发现CY166-14R株单抗具有良好的中和抗体活性，同时为了防止该细胞株由于传代不稳定等导致抗体丢失，我们完成了对该细胞株单抗的可变区测序，且完成该株单抗的克隆表达。研究结果表明，CY166-14R在中国仓鼠卵巢细胞中可稳定高效表达，表达单抗与腹水制备单抗在亲和力、中和抗体效价等方面无明显差别。因此我们选择CY166-14R单抗作为检测抗体建立双抗体夹心ELISA并对该方法进行验证[9]，结果显示所建立的方法在一定范围内的线性、准确度、精密度以及特异性良好，对CV-A6、CV-A16、EV-A71抗原均无交叉反应，工艺过程中的各种添加成分对该方法无检测干扰。对建立的方法进行应用研究，显示该方法对工艺过程中间样品的测定具有较好的适用性，对不同剂量成品解吸附后抗原测定回收率可达90%以上，提示该方法可用于CV-A10抗原的工艺评价和质控检测。现有的研究关于CV-A10抗原表位的报道较少，对于所筛选出的单抗识别的抗原表位尚不清楚，接下来将对其进一步研究。同时该方法也有一定的局限性，由于单抗作为检测抗体识别位点的单一性，在疫苗生产过程中样品的纯化、灭活等处理方式以及在成品的放置过程中，抗原结构可能会发生一定的变化，该方法能否准确评价疫苗的抗原稳定性以及体外相对效力还有待进一步深入研究。因此，对于体外-体内效力的相关性评价还需要积累更多的研究数据，进一步验证体内效力与抗原测定之间的相关性。作者鲁卫卫1 郭会杰1 刘善茹1 郝春生1 杨永娟1 张中洋1 李秀玲21国药中生生物技术研究院有限公司第二研究室，北京 101111； 2上海生物制品研究所有限责任公司，上海 200051通信作者：李秀玲，Email：lixiuling@sinopharm.com；张中洋，Email：yy_saturn@163. com引用本文：鲁卫卫, 郭会杰, 刘善茹, 等. 柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用[J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(6): 310-315. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220321-00018