环状RNA(circRNA)序列设计、体外制备与纯化新技术

2024-02-24

核酸药物基因疗法

导读：环状RNA（circRNA）被认为是RNA的一种新疗法，与线性RNA相比，它具有抗核酸酶和高效核糖体回收等优势。此外，circRNA不需要进行5'加帽和核苷酸修饰，进而规避了大量潜在的知识产权费用。同时，除了通过直接瘤内给药调节抗肿瘤免疫反应，circRNA还有多种生物及医学价值，包括作用于腺苷脱氨酶，对神经系统功能、造血和先天免疫起到调控等。这些都使得circRNA备受研究人员和资本的关注和青睐。关于circRNA的序列设计和体外制备方法，菌菌检索到2篇高实用性的文章。其一为2018年麻省理工学院Daniel G. Anderson发表在Nature Communication的文章，基于I型内含子自环化体外制备circRNA。随后于2023年9月12日，韩国生物制药公司Rznomics在Molecular Therapy Nucleic Acids上发表题目为《Efficient circular RNA engineering by end-to-end self-targeting and splicing reaction using Tetrahymena group I intron ribozyme》的文章。研究者们开发了一种 “端到端自靶向和剪接的circRNA”的新型平台技术，能够高效简便地生成circRNA并克服现有技术的局限性，已获韩国专利。这篇文章是继NC文章后的另一篇circRNA高实用性文章，下文中菌菌对其进行了详细解读，以分享circRNA序列设计、体外制备与circRNA纯化的新策略。一、环状RNA(circRNA)的序列设计体外制备一直是限制circRNA技术发展的关键。与化学法和酶法相比，利用核酶合成的方法则由于其相对简单的生成过程、更易实现放大、长RNA的高环化效率以及环化过程中分子间相互作用较少而更具优势。但现有的核酶方法，由于其不可避免地引入外源片段，会引发机体不必要的免疫反应。在这项研究中，作者开发了一种新的体外circRNA合成方法，利用反式剪接核酶—四膜虫I型内含子核酶，使其特异性与互补碱基配对形成螺旋结构，通过一个 RNA 分子内的自催化端到端自靶向和剪接（STS）反应产生 circRNA。这种新的体外制备方法可用于获得各种用于细胞和体内的circRNA，且不会引入其他任何酶或蛋白因子。为了使用四膜虫 I 型内含子核酶生成 circRNA，作者将核酶的靶序列放置在目的基因（gene of interest, GOI）的3' 端，遵循 I 型内含子序列，以允许通过两次连续的酯交换反应进行端到端的 STS。STS 反应切割靶位点的 3' 端，并将 GOI 的 5' 端连接到切割的 3' 端，类似于用于 RNA 替代目的的反式靶向和剪接反应。由于扩展的P1、P10螺旋和反义序列（AS）/反义结合序列（ABS）可能影响剪接反应的特异性和有效性，设计的起始自环化RNA构建体时包括上述元件。图1 基于四膜虫I型内含子的端到端STS自环化构建体二、环状RNA(circRNA)的体外制备和鉴别为了验证体外circRNA的产生情况，作者仅进行了体外转录（IVT）实验，无进一步的化学或酶处理。与预期一致，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）出现了一个比完整RNA前体更大的条带，猜测其由自环化而产生且该条带对RNase R酶具有抗性。同时，PAGE中观察到了nicked circRNA，通过对其进行额外的STS反应后并未观察到自环化的有显著改善，这表明端到端STS反应可以在IVT期间完成（图2A）。根据RT-PCR 结果，无论 RNase R 酶切如何，该引物只能扩增环状 RNA，而没有其他任何无关序列（图2B）。通过测序分析也进一步确认了circRNA的特异性连接（图2C）。此外，根据图2D和2E结果显示，在探针存在下RNase H的特异性切口和用Mg2+加热的非特异性切口中，circRNA条带的量减少，而线性条带的预期大小分别增加或维持。这些都说明即使在IVT反应管中存在高度浓缩RNA的前提条件下，也不发生分子间反应、产生聚体。图2 circRNA的体外制备和鉴别三、环状RNA(circRNA)的序列优化3.1 反义序列（AS）与poly(A)间隔区的影响为了优化自环化结构，作者在I型内含子的(IGS)上游添加了50~300 nt长度的AS。根据图3（左）所示的灰度分析结果，AS50、100、150在对circRNA的生成上差异不大，而AS150由于其在转录效率上的优势得以成为优选。此外，由于核酶和内部核糖体进入位点（IRES）序列的高度结构化，因此二者之间需要保留有polyA 间隔区。根据实验结果（图3左），10~50 nt 的polyA对于自环化没有显著差异，为保证结构灵活性作者在此处保留了A10和A30进行进一步研究。图3 自环化结构的优化结果3.2 P1 螺旋结构的影响如下实验结果显示，在自环化 RNA 构建体中，没有 P10 螺旋和 AS/ABS，仅有P1 螺旋能够在体外产生circRNA，反而没有AS/ABS 的 P1 和 P10 螺旋产生的circRNA 量最少（图4B）。P1 RNA构建体产生的特异性circRNA也通过RT-PCR和测序分析（图4C）得到证实。这些结果表明，仅有I型内含子核酶与靶位点相互作用的 P1 螺旋足以通过体外端到端 STS 反应产生 circRNA。图4 P1 RNA构建体的自环化，无需P10螺旋和AS/ABS3.3 富AU靶位点的影响根据对几种 P1 RNA 构建体进行比对，作者发现富含 AU 靶序列和 IGS 的 P1 RNA 构建体显示出更好的环化效率（图 5B）。RT-PCR和测序分析也证实，具有富含AU的靶序列的P1 RNA构建体可以产生具有保真度的特异性circRNA（图4C）。而富含GC的靶标/IGS的P1 RNA构建体的效率则较低。图5 各种P1 RNA构建体自环化的特异性和效率四、环状RNA(circRNA)的色谱纯化为监测蛋白表达，文章构建了柯萨奇病毒B3（CVB3）IRES并在其下游放置了超文件夹绿色荧光蛋白（sGFP）编码序列。circRNA样品经IVT方法使用端到端STS反应制备得到，后通过离子对反相高效液相色谱（IP-RP HPLC）完成纯化（图6A）。纯化后的样品中不含dsRNA等污染物。同时，作者发现当在IP-RP HPLC纯化之前进行RNase R酶切时，circRNA更容易分离（图6B），同时可以提供更好的峰分辨率。图6 经IP-RP HPLC纯化的circRNA五、环状RNA(circRNA)的体外表达验证根据在HEK293A细胞中的转染情况，可以明显制备的circRNA在荧光强度测量中显示出高效的sGFP表达，高于置换的内含子和外显子 (PIE) 法制备的对照circRNA（图7A）。在定量RT-PCR结果中，通过STS方法制备的circRNA也与PIE方法制备的circRNA蛋白表达效率相当。且荧光强度在转染后2天达到峰值，并维持更长的时间（图7A），而线性RNA则在转染后24小时开始降低（图7B）。同时，制备得到的circRNA经IP-RP HPLC纯化后，在A549细胞（图7C）中未观察到显著的先天免疫反应。图7 蛋白表达及稳定性和免疫原性结果六、结论本文通过设计 RNA 构建体，开发了一种新的体外circRNA工程化设计策略，以实现基于四膜虫I型内含子核酶的自催化端到端STS反应，反应无需进一步处理即反应完全且不易产生聚体。制备得到的circRNA中不包含任何外来片段，可以实现有效翻译。因此，作者认为该种新策略，可以提供比其他方法更简便、步骤更优化、产品更纯的选择，很好的弥补了市场上现有的化学法和酶法制备circRNA的不足，可以用于满足不同应用的circRNA体外制备。同时，作者发现P1螺旋的形成已经足以完成circRNA在体外的自环化，而富含AU的靶序列可以提高环化效率。而且，通过端到端STS反应得到的circRNA经由IP-RP HPLC纯化后具有高表达能力、高稳定性及极低的免疫原性等诸多优点。参考文献：Lee KH, Kim S, Song J, et al. Efficient circular RNA engineering by end-to-end self-targeting and splicing reaction using Tetrahymena group I intron ribozyme. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Aug 1;33:587-598. doi: 10.1016/j.omtn.2023.07.034.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。